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1、(10)申请公布号 CN 103275968 A (43)申请公布日 2013.09.04 CN 103275968 A *CN103275968A* (21)申请号 201310163082.7 (22)申请日 2013.05.06 C12N 15/10(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人 山东棉花研究中心 地址 250100 山东省济南市工业北路 202 号 (72)发明人 刘国栋 王芙蓉 张军 张景霞 张传云 (74)专利代理机构 北京路浩知识产权代理有限 公司 11002 代理人 王朋飞 (54) 发明名称 一种快速提取棉花单粒种子 DNA 的方法 。
2、(57) 摘要 本发明提供了一种快速提取棉花单粒种子 DNA 的方法, 属于分子生物技术领域。本发明选用 萌动的单粒棉种种仁作为 DNA 提取材料, 直接在 裂解液中打碎、 裂解, 经过多次离心、 沉淀, 提取得 到棉花种子 DNA。该方法操作简便, 可快速进行大 批量 DNA 提取, 耗时少、 提取过程中减少化学试剂 的使用, 减少了污染, 适用于利用 SSR 标记快速鉴 定棉花品种纯度过程中 DNA 样品的获得。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 附图1页 (10。
3、)申请公布号 CN 103275968 A CN 103275968 A *CN103275968A* 1/1 页 2 1. 一种提取棉花单粒种子 DNA 的方法, 其特征在于, 包括以下步骤 : 1) 将棉花种子于水中浸泡至种仁松软后, 剥掉种皮, 得到萌动的松软种仁 ; 2) 将步骤 1) 得到的种仁加入裂解缓冲液中, 粉碎 ; 3) 水浴、 离心、 取上清液, 加入异丙醇, 混匀 ; 4) 离心, 用乙醇洗涤沉淀, 干燥 ; 5) 加双蒸水溶解, 再次离心, 取上清液, 得到。 2. 如权利要求 1 所述的方法, 其特征在于, 步骤 2) 的裂解缓冲液, 其成分为 2%CTAB, 0.0。
4、2mol/L EDTA, 1.4mol/L NaCl, 0.1mol/LTri-HCl, pH=7.5, 2%PVP, 1%- 巯基乙醇。 3. 如权利要求 1 所述的方法, 其特征在于, 步骤 2) 的裂解缓冲液的加入量为 700l。 4. 如权利要求 1 所述的方法, 其特征在于, 步骤 3) 60-65水浴 10-30min, 期间振荡 2-3 次。 5. 如权利要求 1 所述的方法, 其特征在于, 步骤 3) 离心条件为 10000-12000r/min离心 5-10min。 6. 如权利要求 1 所述的方法, 其特征在于, 步骤 3) 上清液中加 0.6-1 倍体积预冷的异 丙醇。 。
5、7. 如权利要求 1 所述的方法, 其特征在于, 步骤 4) 12000r/min 离心 2min, 倒掉上清液, 沉淀中加入 1ml70% 乙醇洗涤沉淀, 空气中干燥。 8. 如权利要求 1 所述的方法, 其特征在于, 步骤 5) 中加入 200l 双蒸水。 9. 如权利要求 1 所述的方法, 其特征在于, 步骤 5)中加入双蒸水溶解 30min-2h, 12000r/min 离心 1min。 10. 权利要求 1 9 任一所述的方法在棉花品种分子标记中的应用。 权 利 要 求 书 CN 103275968 A 2 1/4 页 3 一种快速提取棉花单粒种子 DNA 的方法 技术领域 0001。
6、 本发明涉及生物技术领域, 特别涉及一种快速提取棉花单粒种子 DNA 的方法。 背景技术 0002 近年来, 分子标记技术越来越广泛地应用于作物种子纯度及品种真实性检测研究 中, 而影响分子标记鉴定效率的瓶颈是 DNA 的提取。棉花分子纯度检测中, 一般是从棉株叶 片中提取DNA样品, 由于棉花幼苗培养周期较长, 所以利用叶片提取DNA的方法不能满足于 商业化生产中棉花种子纯度快速鉴定的要求。而直接利用种子提取 DNA 无疑将会缩短种子 纯度检测的时间, 但作物种子中富含蛋白、 淀粉等物质, 因而增加了 DNA 提取的困难。棉花 种子除富含蛋白外, 还含有棉酚、 多糖、 单宁等次生代谢物, 这。
7、些代谢物在细胞破裂时容易 氧化, 且氧化后与蛋白质、 核酸等发生不可逆反应, 形成棕色胶状复合物, 因此棉花种子 DNA 提取的步骤较其他作物更为复杂。随着植物 DNA 提取技术的不断发展, 种子 DNA 提取技术 也在逐步完善。传统的棉花种子 DNA 提取方法包括组织破碎、 细胞裂解、 去除蛋白质及 RNA 等杂质、 沉淀 DNA、 漂洗 DNA 和溶解等六个步骤。该方法应用于棉花种子纯度的快速鉴定尚 存在以下不足之处 :(1) 传统方法破碎种子主要通过液氮研磨、 粉碎器粉碎等方法, 由于种 子器官较叶片硬, 破碎比较困难, 而且一次只能处理一粒种子, 操作时间较长, 且易交叉污 染 ;(2。
8、) 细胞裂解环节一般包括提取缓冲液预处理和裂解缓冲液裂解两个步骤, 过程繁琐 ; (3) 去除蛋白等杂质过程中选用苯酚和氯仿等有机溶剂, 易造成环境污染并且有损操作者 健康。 0003 种子商业化生产需要对种子纯度进行快速准确地鉴定, 分子标记技术为实现种子 纯度的快速检测提供了技术支撑。而分子检测中简化 DNA 提取过程是快速鉴定种子纯度的 关键, 目前适合于棉花种子纯度检测的 DNA 快速提取方法研究还未见报道。 发明内容 0004 本发明的目的在于提供一种简单、 安全、 快速的提取棉花种子 DNA 的方法, 以解决 传统方法中棉花种子 DNA 提取过程繁琐、 耗时较长的问题, 满足种子纯。
9、度快速鉴定的需要。 0005 本发明提供一种提取棉花单粒种子 DNA 的方法, 包括以下步骤 : 0006 1) 将棉花种子于水中浸泡至种仁松软后, 剥掉种皮, 得到萌动松软的种仁 ; 0007 2) 将步骤 1) 得到的种仁加入裂解缓冲液中, 粉碎 ; 0008 3) 水浴、 离心、 取上清液, 加入异丙醇, 混匀 ; 0009 4) 离心, 用乙醇洗涤沉淀, 干燥 ; 0010 5) 加双蒸水溶解, 再次离心, 取上清液, 得到。 0011 其中, 步骤 2) 的裂解缓冲液, 其成分为 2%CTAB, 0.02mol/L EDTA, 1.4mol/L NaCl, 0.1mol/LTris-。
10、HCl(pH=7.5) , 2%PVP, 1%- 巯基乙醇。 0012 步骤 2) 的裂解缓冲液的加入量为 700l。 0013 本发明方法中, 步骤 3) 60-65水浴 10-30min, 振荡 2-3 次。 说 明 书 CN 103275968 A 3 2/4 页 4 0014 步骤 3) 离心条件为 10000-12000r/min 离心 5-10min。 0015 步骤 3) 上清液中加 0.6-1 倍体积预冷的异丙醇。 0016 本发明方法中, 步骤 4) 12000r/min 离心 2min, 倒掉上清液, 沉淀中加入 1ml70% 乙 醇洗涤沉淀, 空气中干燥。 0017 步骤。
11、 5) 中加入 200l 双蒸水。 0018 步骤 5) 中, 加入双蒸水溶解 30min-2h, 12000r/min 离心 1min。 0019 步骤 5) 中, 取 150l 上清液, 得到 DNA 提取样品。 0020 本发明提供了上述方法在棉花品种分子标记中的应用。 0021 本发明 DNA 提取材料选用萌动的种仁。种仁直接在裂解液中打碎、 裂解, 省去了提 取液预处理。裂解离心后直接用异丙醇沉淀 DNA, 省略了苯酚 : 氯仿 : 异戊醇去除蛋白质步 骤, 不使用有毒试剂, 既保护了操作者又降低了实验成本, 最主要的是大大提高了 DNA 提取 速度。 本发明方法提取棉花种子DNA,。
12、 所用时间短, 操作简单, 且提取效率高。 与现有的棉花 种子 DNA 提取方法相比, 本发明提供的方法能快速的提取 DNA, 能同时满足快速和高效两个 方面, 因此能够更好的配合分子标记技术进行棉花种子纯度检测。 附图说明 0022 图 1 为提取 DNA 时 DNA 溶解时间对 PCR 扩增产物的影响 ; 其中 1-3 : DNA 样品溶解 10min ; 4-6 : DNA 样品溶解 30min ; 7-9 : DNA 样品溶解 2h ; 10-12 : DNA 样品溶解 24h。 0023 图 2 为 DNA 稀释倍数对 PCR 扩增产物的影响 ; 其中, 1-4 : DNA 样品稀释。
13、 20 倍 ; 5-8 : DNA 样品稀释 30 倍 ; 9-12 : DNA 样品稀释 35 倍 ; 13-16 : DNA 样品稀释 40 倍 ; 17-20 : DNA 样 品稀释 45 倍 ; 21-24 : DNA 样品稀释 50 倍 ; 25-28 : DNA 样品稀释 80 倍 ; 29-32 : DNA 样品稀释 100 倍。 0024 图 3DNA 样品溶解 30min 和 DNA 样品稀释 35 倍时的 PCR 扩增产物 ; 其中 1-24 : 鲁 6269 单粒种子 DNA 溶解 30min、 稀释 35 倍。 具体实施方式 0025 以下实施例进一步说明本发明的内容,。
14、 但不应理解为对本发明的限制。在不背离 本发明精神和实质的情况下, 对本发明方法、 步骤或条件所作的修改或替换, 均属于本发明 的范围。 0026 若未特别指明, 实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段, 实施例中所用的生化试剂均为市售。 0027 以棉花品种鲁棉研 37 号和鲁 6269 为实验材料, 通过具体实例对本发明做进一步 的描述。具体实例统一采用 10l PCR 扩增体系, 具体组分及程序如下。取 1.2l PCR 扩 增后产物, 用浓度为 8% 的非变性 PAGE(聚丙烯酰胺凝胶) 电泳检测。 0028 PCR扩增反应体系 : 10PCR Buffer1l, 10。
15、mM dNTP Mix0.2l, SSR正、 反向引物 (10mol/L) 各 0.6l, 5U Taq DNA 聚合酶 0.1l, 待测样品 DNA2l, ddH2O6.6l。 0029 PCR反应程序 : 94预变性5min ; 94变性40s, 55退火45s, 72延伸50s, 循环 35 次 ; 72延伸 5min ; 4保存。 0030 实施例 1 本发明方法提取 DNA 的溶解时间对 PCR 扩增的影响 说 明 书 CN 103275968 A 4 3/4 页 5 0031 (1) DNA 提取 0032 将鲁棉研 37 号种子室温条件下浸泡 20 小时待种仁松软后, 选取 12。
16、 粒浸泡后的种 子, 剥掉种皮, 将萌动的种仁放入 12 个 2ml 离心管中, 每管再加入 700l 裂解缓冲液。 0033 裂 解 缓 冲 液 (组 成 成 分 : 2%CTAB, 0.02mol/L EDTA, 1.4mol/L NaCl, 0.1mol/ LTris-HCl(pH7.5) , 2%PVP, 1%- 巯基乙醇) , 使用组织研磨仪进行粉碎。65水浴 20min, 间隔 10min 轻摇一次。12000r/min 离心 8min, 取 500l 上清液, 加入 0.7 倍体积预冷的异 丙醇, 混合均匀, 12000r/min 离心 2min, 倒掉上清液, 加入 1ml70。
17、% 乙醇洗涤沉淀, 空气中干 燥 30min 后, 加入 200l 双蒸水, 用枪头搅匀使 DNA 溶解, DNA 的溶解时间设定 4 个梯度, 分别为 : 10min、 30min、 2h、 24h。然后 12000r/min 离心 1min, 取 150l 上清液, 上清液即为 DNA 提取样品。 0034 (2) PCR 扩增 0035 将上述 DNA 提取样品稀释 35 倍后, 选用 SSR 引物 NAU1048, 取 2l DNA 样品进行 PCR 扩增 (PCR 反应程序 : 94预变性 5min ; 94变性 40s, 55退火 45s, 72延伸 50s, 循 环 35 次 ;。
18、 72延伸 5min ; 4保存) , 用浓度为 8% 的非变性 PAGE(聚丙烯酰胺凝胶) 电泳检 测 PCR 扩增产物。 0036 (3) 结果检测 0037 由图 1 可知, PCR 扩增产物受到 DNA 溶解时间的影响, DNA 溶解时间在 30min 以内 时, 样品的目标带较弱, DNA溶解时间在30min-2h之间时, 样品有清晰的目标带, DNA溶解时 间在 24h 后, 样品的目标带不清晰。说明该方法提取 DNA 的质量受 DNA 溶解时间的影响较 大, 其 PCR 扩增产物在 DNA 溶解 30min-2h 之间时目标带最清晰。 0038 实施例 2 本发明方法提取的 DN。
19、A 样品的稀释倍数对 PCR 扩增的影响 0039 (1) DNA 提取 0040 将鲁棉研 37 号的干种子泡在水中, 室温条件下浸泡 20 小时种仁松软后, 选取 12 粒种子, 剥掉种皮, 将萌动的种仁放入 12 个 2ml 离心管中, 每管再加入 700l 裂解缓冲液 (组成成分 : 2%CTAB, 0.02mol/L EDTA, 1.4mol/L NaCl, 0.1mol/LTris-HCl, 2%PVP,1%- 巯 基乙醇) , 粉碎。 60水浴25min, 间隔10min左右轻摇一次。 10000r/min离心9min, 取500l 上清液, 加入0.8倍体积预冷的异丙醇, 混合。
20、均匀, 12000r/min离心2min, 倒掉上清液, 加入 1ml70% 乙醇洗涤沉淀, 空气中干燥 30min 后, 加入 200l 双蒸水, 用枪头搅匀使 DNA 溶解, DNA 溶解 30min 后。12000r/min 离心 1min, 取 150l 上清液, 上清液即为 DNA 提取样品。 0041 (2) PCR 扩增 0042 将上述 DNA 提取样品分别稀释 : 20 倍、 30 倍、 35 倍、 40 倍、 45 倍、 50 倍、 80 倍和 100 倍。 (用倍数表示浓度就是为了省掉检测浓度这个步骤, 从而提高PCR检测的速度。 ) 取2l 上述不同稀释倍数的 DNA 。
21、样品进行 PCR 扩增, 选用 SSR 引物 NAU1048, 用浓度为 8% 的非变 性 PAGE(聚丙烯酰胺凝胶) 电泳检测 PCR 扩增产物 (PCR 反应程序 : 94预变性 5min ; 94 变性 40s, 55退火 45s, 72延伸 50s, 循环 35 次 ; 72延伸 5min ; 4保存) 。 0043 (3) 结果检测 0044 由图 2 可知, PCR 扩增产物受 DNA 样品稀释倍数的影响较小, DNA 样品的稀释倍数 从 20 倍到 100 倍均能得到较好的目标带, 且 DNA 样品的稀释倍数为 30-40 倍时, 目标带最 清晰。DNA 样品的稀释倍数在 20-。
22、100 倍时, PCR 扩增产物在样品间的差异不显著, 稀释倍数 说 明 书 CN 103275968 A 5 4/4 页 6 为 30-40 倍时样品目标带最清晰, 稀释倍数为 20-100 倍时, 均能得到较好的目标带。因此, 说明该方法提取的 DNA 有很宽的浓度适应范围 (稀释 20 倍 -100 倍) , 足以保证该方法的实 用性和可行性。 0045 实施例 3 本发明方法在 PCR 检测中的应用 0046 (1) DNA 提取 0047 将鲁 6269 的干种子室温条件下浸泡 20 小时, 选取 24 粒种子, 剥掉种皮, 将萌动 的种仁放入 24 个 2ml 离心管中, 再加入 。
23、700l 裂解缓冲液 (组成成分 : 2%CTAB, 0.02mol/L EDTA, 1.4mol/L NaCl, 0.1mol/LTris-HCl, 2%PVP, 1%- 巯基乙醇) , 在组织研磨仪上粉碎。 65水浴 20min, 间隔 10min 左右轻摇一次。12000r/min 离心 6min, 取 500l 上清液, 加 入 0.7 倍体积预冷的异丙醇, 混合均匀, 12000r/min 离心 2min, 倒掉上清液, 加入 1ml70% 乙 醇洗涤沉淀, 空气中干燥 30min 后, 加入 200l 双蒸水, 用枪头搅匀使 DNA 溶解, DNA 溶解 30min 后, 1200。
24、0r/min 离心 1min, 取 150l 上清液, 上清液即为 DNA 提取样品。 0048 (2) PCR 扩增 0049 将上述 DNA 提取样品稀释 35 倍后, 取 2l DNA 模板进行 PCR 扩增, 选用 SSR 引物 NAU1048, 用浓度为 8% 的非变性 PAGE(聚丙烯酰胺凝胶) 电泳检测 PCR 扩增产物 (PCR 反应 程序 : 94预变性 5min ; 94变性 40s, 55退火 45s, 72延伸 50s, 循环 35 次 ; 72延伸 5min ; 4保存。 ) 。 (根据前面确定的步骤提取的 DNA 稀释 35 倍时, PCR 扩增效果较好。 ) 0050 (3) 结果检测 0051 由图 3 可知, 所有 PCR 扩增产物均显示很清晰的目标带。所有 DNA 样品的 PCR 扩 增产物均较清晰, DNA 样品溶解 30min, DNA 样品稀释 35 倍, 能保证得到较好的 PCR 扩增产 物。 0052 以上所述仅是本发明的优选实施方式, 应当指出, 对于本技术领域的普通技术人 员来说, 在不脱离本发明技术原理的前提下, 还可以做出若干改进和润饰, 这些改进和润饰 也应视为本发明的保护范围。 说 明 书 CN 103275968 A 6 1/1 页 7 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 103275968 A 7 。