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1、(10)申请公布号 CN 103146631 A (43)申请公布日 2013.06.12 CN 103146631 A *CN103146631A* (21)申请号 201310083773.6 (22)申请日 2013.03.15 C12N 1/21(2006.01) C12N 15/66(2006.01) C12N 15/63(2006.01) C12P 21/02(2006.01) A61K 38/21(2006.01) A61P 31/12(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (71)申请人 江苏恒丰强生物技术有限公司 地址 226100 江苏省南通市海门市三厂镇。
2、青 龙港园区北京东路 2666 号 (72)发明人 龙谭 汪正华 吴自荣 郗洪生 王滨坤 (74)专利代理机构 上海麦其知识产权代理事务 所 ( 普通合伙 ) 31257 代理人 董红曼 (54) 发明名称 一种表达可溶性猪-干扰素PoIFN-的基 因工程菌及其构建方法和应用 (57) 摘要 本发明属于基因工程技术领域， 具体公开了 一种表达可溶性猪 - 干扰素 PoIFN- 的基因 工程菌及其构建方法和应用。本发明的表达可 溶性猪 - 干扰素 PoIFN- 的基因工程菌是 同时携带重组质粒 pET-32a(+)-PoIFN- 和质 粒 pTf16-ParaB-tig 的 大 肠 杆 菌 BL。
3、21(DE3)。 其 中， 所 述 重 组 质 粒 pET-32a(+)-PoIFN- 中 的 PoIFN- 基因序列是 SEQ ID NO.4 ； 所述质粒 pTf16-ParaB-tig 可表达分子伴侣 tig。本发明方 法提高了猪 - 干扰素的可溶性及产量， 工艺简 单且成本低， 具有良好的工业应用价值。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 序列表 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书6页 序列表2页 (10)申请公布号 CN 103146631 A CN 103146631 A *CN103146631A* 。
4、1/1 页 2 1. 一种表达可溶性猪 - 干扰素 PoIFN- 的基因工程菌， 其特征在于， 所述基因 工程菌是同时携带重组质粒 pET-32a(+)-PoIFN- 和质粒 pTf16-ParaB-tig 的大肠杆菌 BL21(DE3)。 2.如权利要求1所述基因工程菌， 其特征在于， 所述重组质粒pET-32a(+)-PoIFN-中 的 PoIFN- 基因序列是 SEQ ID NO.4 ； 所述质粒 pTf16-ParaB-tig 可表达分子伴侣 tig。 3. 如权利要求 2 所述基因工程菌， 其特征在于， 所述 PoIFN- 基因 (SEQ ID NO.4) 的 5端为 SEQ ID 。
5、NO.2， 3端为 SEQ ID NO.3， 中间为猪 - 干扰素成熟肽基因 (SEQ ID NO.1)。 4. 如权利要求 1 或 2 所述基因工程菌的构建方法， 其特征在于， 其步骤为 ： 将所述重组 质粒 pET-32a(+)-PoIFN- 和质粒 pTf16-ParaB-tig 分别转入大肠杆菌 BL21(DE3) 中， 得到 如权利要求 1 或 2 所述的基因工程菌。 5. 如 权 利 要 求 4 所 述 基 因 工 程 菌 的 构 建 方 法， 其 特 征 在 于， 所 述 重 组 质 粒 pET-32a(+)-PoIFN-的构建方法为 ： 首先人工合成所述PoIFN-基因(SEQ。
6、 ID NO.4)， 用 KpnI/BamHI对所述PoIFN-基因(SEQ ID NO.4)和质粒pET-32a(+)进行双酶切， 连接、 转 化大肠杆菌 DH5， 再挑取重组子并提取所述重组质粒 pET-32a(+)-PoIFN-。 6. 如 权 利 要 求 5 所 述 基 因 工 程 菌 的 构 建 方 法， 其 特 征 在 于， 所 述 重 组 质 粒 pET-32a(+)-PoIFN- 经测序鉴定， 证实其含有所述 PoIFN- 基因 (SEQ ID NO.4)。 7.应用如权利要求1或2所述基因工程菌制备可溶性猪-干扰素PoIFN-的方法， 其特征在于， 其步骤为 ： 将所述表达可。
7、溶性猪-干扰素PoIFN-的基因工程菌于LB液体 培养基中进行培养后， 转接入自诱导培养基继续培养， 然后离心收集菌体 ； 重悬所述菌体， 搅拌过夜后， 将其超声破碎并离心收集上清， 经镍离子亲和层析并脱盐、 浓缩得到纯化的猪 - 干扰素融合蛋白， 将其酶解后再次经镍离子亲和层析并脱盐、 浓缩， 得到所述猪 - 干 扰素 PoIFN-。 8. 如权利要求 7 所述方法， 其特征在于， 所述自两导培养基的配方为 ： 甘油 0.1-2 v/ v、 胰蛋白胨 0.1-2 w/v， 酵母提取物 0.1-2 w/v， 乳糖 0.1-2 w/v， 葡萄糖 0.01-0.2 w/v， NaCl0.1-2 w。
8、/v， Na2HPO45-100mM， KH2PO45-100mM， (NH4)2SO45-100mM， MgSO41-20mM。 9. 如权利要求 7 所述方法， 其特征在于， 所述菌体的重悬使用破菌缓冲液， 其配方为 ： Tris10-100mM、 溶菌酶 0.01-0.2 w/v、 TritonX-1000.1-1 v/v。 10. 一种用于治疗猪病毒性疾病的组合物， 其特征在于， 所述组合物含有有效量的按权 利要求 7 所制备的可溶性猪 - 干扰素 PoIFN-， 以及药学可接受成分。 权 利 要 求 书 CN 103146631 A 2 1/6 页 3 一种表达可溶性猪-干扰素PoI。
9、FN-的基因工程菌及其 构建方法和应用 技术领域 0001 本发明属于基因工程技术领域， 具体涉及一种表达可溶性猪 - 干扰素 PoIFN- 的基因工程菌及其构建方法和应用。 背景技术 0002 猪 - 干扰素 (porcine interferon gamma， PoIFN-) 也称猪 II 型干扰素， 是一 类由活化的 T 淋巴细胞、 巨噬细胞和 NK 细胞等分泌的细胞因子， 具有抗病毒、 抗肿瘤、 激活 淋巴细胞和免疫调节等功能。 实际应用中， 将猪干扰素作为疫苗佐剂， 与治疗不同疾病的疫 苗联合使用， 研制出免疫效果更好的新型疫苗， 对猪病防治具有积极的影响。 0003 目前猪干扰素的。
10、批量生产主要有细胞诱导培养法和以毕赤酵母、 大肠杆菌为表达 系统的基因重组法。前一种方法以动物细胞为原料， 生产工艺复杂， 成本高， 且产品有携带 外源病毒和其他病原微生物的危险。以毕赤酵母为表达系统的基因重组法虽较前一种先 进， 生产成本大大降低， 但其工艺还是相对较复杂且表达量有限。 而以大肠杆菌为表达系统 的基因重组法， 虽能提高其表达量， 但产物为无活性的包涵体， 需经繁琐低效、 代价昂贵的 复性过程才能获得生物学功能。因此， 如何获得高表达量的活性猪 - 干扰素成为近年来 学者们广为研究的热点。 0004 本发明克服了上述现有技术制备猪 - 干扰素表达量低、 产物为无活性包涵体、 制。
11、备工艺复杂繁琐等缺陷， 提出了一种表达可溶性猪 - 干扰素的基因工程菌及其构建方 法， 以及利用该基因工程菌进行猪 - 干扰素的高效制备方法 ； 通过采用自诱导培养基发 酵表达猪-干扰素， 省去了监测菌体密度和添加IPTG诱导剂等步骤， 使操作简洁易行， 同 时避免了 IPTG 对菌体的毒害作用。利用本发明方法制备猪 - 干扰素， 成本低、 易操作、 产 量高且活性好。 发明内容 0005 本发明提出一种表达可溶性猪 - 干扰素 PoIFN- 的基因工程菌， 所述基因 工程菌是同时携带重组质粒 pET-32a(+)-PoIFN- 和质粒 pTf16-ParaB-tig 的大肠杆菌 BL21(D。
12、E3)。其中， 所述重组质粒 pET-32a(+)-PoIFN- 中的 PoIFN- 基因序列是 SEQ ID NO.4 ； 所述质粒 pTf16-ParaB-tig 可表达分子伴侣 tig。 0006 其中， 所述 PoIFN- 基因 (SEQ ID NO.4) 的 5端为 SEQ ID NO.2( 含肠激酶和 KpnI 酶切位点 )， 3端为 SEQ ID NO.3( 含终止密码子和 BamHI 酶切位点 )， 中间为经优化 的猪 - 干扰素成熟肽基因 (SEQ ID NO.1)。 0007 本发明还提出了所述基因工程菌的构建方法， 其步骤为 ： 将所述重组质粒 pET-32a(+)-Po。
13、IFN- 和质粒 pTf16-ParaB-tig 分别转入大肠杆菌 BL21(DE3) 中， 得到所述 基因工程菌。 0008 其中， 所述重组质粒 pET-32a(+)-PoIFN- 的构建方法为 ： 首先人工合成所述 说 明 书 CN 103146631 A 3 2/6 页 4 PoIFN- 基因 (SEQ ID NO.4)， 用 KpnI/BamHI 对所述 PoIFN- 基因 (SEQ ID NO.4) 和质 粒 pET-32a(+) 进行双酶切， 连接、 转化大肠杆菌 DH5， 再挑取重组子并提取得到所述重组 质粒pET-32a(+)-PoIFN-。 所述重组质粒pET-32a(+)。
14、-PoIFN-经测序鉴定， 证实其含有 所述 PoIFN- 基因 (SEQ ID NO.4)。 0009 本发明还提供一种应用所述基因工程菌制备可溶性猪 - 干扰素 PoIFN- 的方 法， 其步骤为 ： 将所述表达可溶性猪 - 干扰素的基因工程菌于 LB 液体培养基中进行培养 后， 转接入自诱导培养基继续培养， 然后离心收集菌体 ； 重悬所述菌体， 搅拌过夜后， 将其超 声破碎并离心收集上清， 经镍离子亲和层析并脱盐、 浓缩得到纯化的猪 - 干扰素融合蛋 白， 将其酶解后再次经镍离子亲和层析并脱盐、 浓缩， 得到所述猪 - 干扰素。 0010 其中， 所述自诱导培养基的配方为 ： 甘油 0.。
15、1-2 v/v、 胰蛋白胨 0.1-2 w/v， 酵母提取物 0.1-2 w/v， 乳糖 0.1-2 w/v， 葡萄糖 0.01-0.2 w/v， NaCl0.1-2 w/v， Na2HPO45-100mM， KH2PO45-100mM， (NH4)2SO45-100mM， MgSO41-20mM。 0011 其中， 所述菌体的重悬使用破菌缓冲液， 其配方为 ： Tris10-100mM、 溶菌酶 0.01-0.2 w/v、 TritonX-1000.1-1 v/v。 0012 本发明还提供了一种用于治疗猪病毒性疾病的组合物， 其含有有效量的可溶性猪 - 干扰素， 以及药学可接受成分。 001。
16、3 本发明的目的在于构建一种表达可溶性猪 - 干扰素的基因工程菌， 用于生产可 溶性且成本低的猪 - 干扰素。 0014 本发明要解决的一个技术问题是构建一种可溶性表达猪 - 干扰素的基因工 程菌。其特征在于， 该基因工程菌是同时携带重组质粒 pET-32a(+)-PoIFN- 和质粒 pTf16-ParaB-tig 的大肠杆菌 BL21(DE3)。 0015 所述的基因工程菌的进一步特征在于， 所述的重组质粒是 pET-32a(+)-PoIFN-， 能够高效表达猪 - 干扰素， 其中， PoIFN- 基因具有如下本发明设计的 SEQ ID NO.4 所 示的核苷酸序列 ： 0016 GGGG。
17、TACCGACGACGACGACAAGCAGGCGCCGTTTTTTAAAGAAATTACCATTCTGAAAGATTATTTTA ATGCGAGCACCAGCGATGTGCCGAATGGCGGCCCGCTGTTTCTGGAAA TTCTGAAAAATTGGAAAGAAGAAAGCGA TAAAAAAATTATTCAGAGCCAGATTGTGAGCTTTTATTTTAAATTTTTTGAAATTTTTAAAGATAATCAGGCGATTC AGCGCAGCATGGATGTGATTAAACAGGATATGTTTCAGCGCTTTCTGAATGGCAGCAGCGGCAAACTGAATGATTTT 。
18、GAAAAACTGATTAAAATTCCGGTGGATAATCTGCAGATTCAGCGCAAAGCGATTAGCGAACTGATTAAAGTGATGAA TGATCTGAGCCCGCGCAGCAATCTGCGCAAACGCAAACGCAGCCAGACCATGTTTCAGGGCCAGCGCGCGAGCAAAT AATAAGGATCCG 0017 该基因工程菌的另一特征在于， 所述的质粒 pTf16-ParaB-tig 能够表达分子伴侣 tig， 其中， ParaB是质粒 pTf16 的启动子。 0018 本发明要解决的另一个技术问题是提供一种表达可溶性猪 - 干扰素的基因工 程菌的构建方法。本。
19、发明通过采用以下技术方案解决以上技术问题 ： 首先对天然猪 - 干 扰素核苷酸序列进行优化， 得到既不改变天然猪 - 干扰素的氨基酸序列， 又能在大肠杆 菌 BL21(DE3) 中高效率表达的基因， 人工合成后插入到质粒 pET-32a(+) 中， 构建成重组质 粒 pET-32a(+)-PoIFN-， 再将质粒 pTf16-ParaB-tig 和重组质粒 pET-32a(+)-PoIFN- 分 别转入大肠杆菌 BL21(DE3) 中， 即获得表达可溶性 PoIFN- 的基因工程菌。具体操作步骤 说 明 书 CN 103146631 A 4 3/6 页 5 如下 ： 0019 第一步 ： Po。
20、IFN- 基因 (SEQ ID NO.4) 的合成 0020 参照大肠杆菌 BL21(DE3) 对氨基酸密码子的偏爱性、 碱基 GC 含量、 mRNA 二级结构 等综合因素对天然猪 - 干扰素基因序列进行优化， 得到既不改变天然猪 - 干扰素的氨 基酸序列， 又能在大肠杆菌 BL21(DE3) 中高效率表达的猪 - 干扰素成熟肽基因 (SEQ ID NO.1)， 其序列如下 ： 0021 CAGGCGCCGTTTTTTAAAGAAATTACCATTCTGAAAGATTATTTTAATGCGAGCACCAGCGATGTGCCG AATGGCGGCCCGCTGTTTCTGGAAATTCTGAAAA。
21、ATTGGAAAGAAGAAAGCGATAAAAAAATTATTCAGAGCCAGAT TGTGAGCTTTTATTTTAAATTTTTTGAAATTTTTAAAGATAATCAGGCGATTCAGCGCAGCATGGATGTGATTAAAC AGGATATGTTTCAGCGCTTTCTGAATGGCAGCAGCGGCAAACTGAATGATTTTGAAAAACTGATTAAAATTCCGGTG GATAATCTGCAGATTCAGCGCAAAGCGATTAGCGAACTGATTAAAGTGATGAATGATCTGAGCCCGCGCAGCAATCTG CGCAAACGCAAACGCAGCCAG。
22、ACCATGTTTCAGGGCCAGCGCGCGAGCAAA。 0022 为方便克隆和表达， 在 SEQ ID NO.1 的 5端添加 GGGGTACCGACGACGACGACAAG( 其 中 GG 为保护碱基， GGTACC 为 KpnI 酶切位点， GACGACGACGACAAG 编码肠激酶酶切位点 )， 在 SEQ ID NO.1 的 3端添加 TAATAAGGATCCCG( 其中 TAA 编码终止密码 子， GGATCC 为 BamHI 酶切位点， CG 为保护碱基 )， 得到 PoIFN- 基因 (SEQ ID NO.4)， 优化后委托上海捷瑞生物 工程有限公司合成。 0023 第二。
23、步 ： 构建含 PoIFN- 基因 (SEQ ID NO.4) 的重组质粒 pET-32a(+)-PoIFN- 0024 将 人 工 合 成 的 PoIFN- 基 因 (SEQ ID NO.4) 用 KpnI/BamHI 双 酶 切，回 收大片段并与用同样的酶双酶切的克隆载体 pET-32a(+) 连接， 构建重组表达载体 pET-32a(+)-PoIFN-。将重组质粒 pET-32a(+)-PoIFN- 转化大肠杆菌 DH5a。筛选重组 质粒的转化子并提取重组质粒。酶切鉴定后， 阳性克隆送上海美吉生物医药科技有限公司 进行测序分析， 证实该重组表达载体含有正确的 PoIFN- 基因序列。 0。
24、025 第三步 ： 构建表达可溶性猪 - 干扰素的基因工程菌 0026 将上一步制得的重组质粒 pET-32a(+)-PoIFN- 转入大肠杆菌 BL21(DE3) 中， 再 将含有分子伴侣tig基因的质粒pTf16-ParaB-tig转入含pET-32a(+)-PoIFN-的大肠杆菌 BL21(DE3) 中， 即得表达可溶性猪 - 干扰素的分子伴侣共表达基因工程菌。 0027 本发明再一目的在于提供一种利用上述基因工程菌制备可溶性猪 - 干扰素的 方法， 具体操作步骤如下 ： 0028 第一步 ： 菌体收集 0029 将上述构建好的表达可溶性猪 - 干扰素 PoIFN- 的基因工程菌在 LB。
25、 液体培养 基中37， 210rpm培养12小时， 并按1(v/v)的比例转接入自诱导培养基中27， 210rpm 培养 18 小时。最后离心收集菌体。 0030 其中， 自诱导培养基配方如下 ： 0031 甘油 0.1-2 (v/v)、 胰蛋白胨 0.1-2 (w/v)， 酵母提取物 0.1-2 (w/v)， 乳 糖 0.1-2 (w/v)， 葡 萄 糖 0.01-0.2 (w/v)， NaCl0.1-2 (w/v)， Na2HPO45-100mM， KH2PO45-100mM， (NH4)2SO45-100mM， MgSO41-20mM。 0032 第二步 ： 制备猪 - 干扰素融合蛋白 。
26、0033 将第一步收集的菌体用破菌缓冲液重悬， 4搅拌过夜。次日超声破碎后， 离心收 说 明 书 CN 103146631 A 5 4/6 页 6 集上清， 进行镍离子亲和层析， 收集猪 - 干扰素融合蛋白组分， 用截留分子量为 30KD 的 MilliporeAmicon Ultra-15超滤管将蛋白脱盐和浓缩， 得到纯化的猪-干扰素PoIFN- 融合蛋白。 0034 其中， 破菌缓冲液配方如下 ： 0035 Tris10-100mM、 溶菌酶 0.01-0.2 (w/v)、 TritonX-1000.1-1 (v/v)。 0036 第三步 ： 制备猪 - 干扰素 0037 用肠激酶酶解上述。
27、纯化的猪 - 干扰素融合蛋白， 30酶解 10-16 小时后再次进 行镍离子 亲和层析， 收集穿透峰， 用截留分子量为10KD的Millipore Amicon Ultra-15超 滤管将蛋白脱盐和浓缩， 得到纯化的猪 - 干扰素。 0038 本发明提供了一种猪 - 干扰素的基因序列及高效表达、 纯化可溶性猪 - 干扰 素的新技术方法， 克服了现有技术的不足。 其优点在于 ： 对天然猪-干扰素核苷酸序列进 行全面优化， 大大提高了表达量 ； 利用分子伴侣共表达系统发酵表达猪 - 干扰素， 可有效 提高其可溶性、 活性及产量。 采用自诱导培养基发酵表达目的蛋白， 省去了监测菌体密度和 添加 IP。
28、TG 诱导剂等步骤， 使实验操作变得更加简洁易行 ； 其次， 避免了 IPTG 对细菌的毒害 作用。自诱导方法得到的菌体的生物量高， 猪 - 干扰素融合蛋白产量也高。进行两次亲 和层析， 便可从发酵液中获得较纯的猪 - 干扰素， 纯化步骤简便， 比传统技术的多次层析 更易于操作。因此应用分子伴侣共表达系统和自诱导途径有利于猪 - 干扰素的大规模工 业化生产。 0039 本发明对天然猪 - 干扰素核苷酸序列进行全面优化， 设计序列 SEQ ID NO.4， 大 大提高了猪 - 干扰素的表达量 ； 通过自诱导培养基和分子伴侣共表达系统发酵基因工程 菌， 大大提高了菌体的生物量和蛋白产量， 且共表达。
29、分子伴侣可促进猪 - 干扰素融合蛋 白的正确折叠， 提高其可溶性， 通过这种方法可获得高表达量的可溶性猪 - 干扰素融合 蛋白。融合蛋白经两次镍离子亲和层析即可得到较纯的猪 - 干扰素， 本发明纯化工艺简 单， 易于操作， 生产成本低且表达量高， 为工业化生产猪 - 干扰素提供了新的参考。 具体实施方式 0040 结合以下具体实施例和附图， 对本发明作进一步的详细说明， 本发明的保护内容 不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下， 本领域技术人员能够想到的变 化和优点都被包括在本发明中， 并且以所附的权利要求书为保护范围。说明书及实施例中 未注明具体条件的实验方法， 可按常规条件进行。
30、。 0041 实施例 1 构建表达可溶性猪 - 干扰素的基因工程菌 0042 第一步 ： PoIFN- 基因 (SEQ ID NO.4) 的人工合成 0043 参照大肠杆菌 BL21(DE3) 对氨基酸密码子的偏爱性、 碱基 GC 含量、 mRNA 二级结 构等综合因素对天然猪 - 干扰素核苷酸序列进行优化， 本发明设计得到既不改变天然猪 -干扰素的氨基酸序列， 又能在大肠杆菌BL21(DE3)中高效率表达的猪-干扰素成熟肽 基因， 其序列 (SEQ ID NO.1) 如下 ： 0044 CAGGCGCCGTTTTTTAAAGAAATTACCATTCTGAAAGATTATTTTAATGCGAG。
31、CACCAGCGATGTGCCG AATGGCGGCCCGCTGTTTCTGGAAATTCTGAAAAATTGGAAAGAAGAAAGCGATAAAAAAATTATTCAGAGCCAGAT TGTGAGCTTTTATTTTAAATTTTTTGAAATT TTTAAAGATAATCAGGCGATTCAGCGCAGCATGGATGTGATTAAA 说 明 书 CN 103146631 A 6 5/6 页 7 CAGGATATGTTTCAGCGCTTTCTGAATGGCAGCAGCGGCAAACTGAATGATTTTGAAAAACTGATTAAAATTCCGGT GGATAATCTGCAGATTCA。
32、GCGCAAAGCGATTAGCGAACTGATTAAAGTGATGAATGATCTGAGCCCGCGCAGCAATC TGCGCAAACGCAAACGCAGCCAGACCATGTTTCAGGGCCAGCGCGCGAGCAAA。 0045 为方便克隆和表达， 在 SEQ ID NO.1 的 5端添加 GGGGTACCGACGACGACGACAAG( 其 中 GGTACC 为 KpnI 酶切位点， GG 为其保护碱基， GACGACGACGACAAG 编码肠激酶酶切位点 )， 在SEQ ID NO.1的3端添加TAATAAGGATCCCG(其中TAA编码终止密码子， GGATCC为BamHI 酶。
33、切位点， CG 为其保护碱基 )， 得到 PoIFN- 基因 (SEQ ID NO.4)， 优化后委托上海捷瑞生 物工程有限公司合成。 0046 第二步 ： 构建含 PoIFN- 基因 (SEQ ID NO.4) 的重组质粒 pET-32a(+)-PoIFN- 0047 将 人 工 合 成 的 PoIFN- 基 因 (SEQ ID NO.4) 用 KpnI/BamHI 双 酶 切，回 收大片段并与用同样的酶双酶切的克隆载体 pET-32a(+) 连接， 构建重组表达载体 pET-32a(+)-PoIFN-。 将重组质粒pET-32a(+)-PoIFN-转化大肠杆菌DH5a， 筛选重组质 粒的转。
34、化子并提取重组质粒， 酶切鉴定后， 阳性克隆送上海美吉生物医药科技有限公司进 行测序分析， 证实该重组表达载体含有正确的 PoIFN- 基因序列。 0048 第三步 ： 构建表达可溶性猪 - 干扰素的基因工程菌 0049 将 阳 性 重 组 质 粒 pET-32a(+)-PoIFN- 转 入 大 肠 杆 菌 BL21(DE3) 中， 得 到 pET-32a(+)-PoIFN-/BL21(DE3) 基因工程菌。取 1ml 该菌液接种于含氨苄青霉素的新鲜 LB 培养基中培养， 并制成 pET-32a(+)-PoIFN-/BL21(DE3) 基因工程菌的感受态细胞。再 将含有分子伴侣 tig 基因的。
35、质粒 pTf16-ParaB-tig 转入该感受态细胞中， 即可得到表达可溶 性猪-干扰素的pET-32a(+)-PoIFN-/pTf16-ParaB-tig/BL21(DE3)共表达基因工程菌。 0050 实施例 2 制备猪 - 干扰素 0051 本实施例中所用菌种为 ： pET-32a(+)-PoIFN-/pTf16-ParaB-tig/BL21(DE3) 共表 达基因工程菌。 0052 本实施例中所用自诱导培养基的配方为 ： 甘油 0.5 (v/v)， 胰蛋白胨 1 (w/ v)， 酵母提取物 0.5 (w/v)， 乳糖 0.2 (w/v)， 葡萄糖 0.05 (w/v)， NaCl0.。
36、5 (w/v)， Na2HPO450mM， KH2PO450mM， (NH4)2SO425mM， MgSO42mM。 0053 培养发酵的具体过程是 ： 先将保存菌株 pET-32a(+)-PoIFN-/pTf16-ParaB-tig/ BL21(DE3) 画线接种于含氨苄青霉素和氯霉素的 LB 平板上， 37恒温过夜培养， 再从平板 上挑出单菌 落， 接种于含氨苄青霉素和氯霉素的自诱导培养基中， 27， 210rpm 培养 18h， 离心收集菌体。 0054 制备猪 - 干扰素融合蛋白 ： 将上一步收集的菌体用破菌缓冲液重悬， 4搅拌过 夜。 次日超声破碎后， 离心收集上清。 取镍离子亲和层。
37、析柱， 将破菌上清缓慢加入层析柱中， 再分别用 5 倍体积的 IDA-0， IDA-40， IDA-80， IDA-200， IDA-1000 溶液洗脱， 并收集各个组 分的洗脱液， 用 SDS-PAGE 分析蛋白质洗脱情况。SDS-PAGE 分析后， 将含有猪 - 干扰素融 合蛋白的洗脱液用截留分子量为 30KD 的 Millipore Amicon Ultra-15 超滤管将蛋白脱盐 和浓缩， 得到纯化的猪 - 干扰素融合蛋白。 0055 其中， 破菌缓冲液配方如下 ： 0056 Tris50mM、 溶菌酶 0.01 (w/v)、 TritonX-1000.4 (v/v)。 0057 洗脱。
38、液配方如下 ： 说 明 书 CN 103146631 A 7 6/6 页 8 0058 IDA-0 ： Tris-HCl(pH7.4)20mM， 0.5M NaCl。 0059 IDA-40 ： Tris-HCl(pH7.4)20mM， 0.5M NaCl， 40mM 咪唑。 0060 IDA-80 ： Tris-HCl(pH7.4)20mM， 0.5M NaCl， 80mM 咪唑。 0061 IDA-200 ： Tris-HCl(pH7.4)20mM， 0.5M NaCl， 200mM 咪唑。 0062 IDA-1000 ： Tris-HCl(pH7.4)20mM， 0.5M NaCl， 1。
39、M 咪唑。 0063 制备猪 - 干扰素 ： 用肠激酶酶解上述所得的猪 - 干扰素融合蛋白， 30酶解 10-16 小时后再次进行镍离子亲和层析， 收集穿透峰和 IDA-0 的洗脱液， 合并两者， 用截留 分子量为 10KD 的 Millipore Amicon Ultra-15 超滤管将猪 - 干扰素脱盐和浓缩， 即得到 所需要的纯化的猪 - 干扰素。 0064 实施例 3 包含猪 - 干扰素的组合物的配制 0065 配制 0.9 (w/v)NaCl 溶液， 取 1mg 纯化的猪 - 干扰素 PoIFN- 溶于 0.5ml NaCl 溶液中 ； 另取 50mg 甘露醇， 溶解于 0.5ml 。
40、NaCl 溶液中 ； 将二者混匀即为猪 - 干扰素 PoIFN- 与甘露醇的组合物， 其中含 1mg/ml 的 PoIFN- 及 50mg/ml 的甘露醇。 0066 实施例 4 所得猪 - 干扰素的组合物的检测 0067 以上方法制备的猪 - 干扰素组合物， 经检测结果如下 ： 0068 样品纯度蛋白浓度pH比活无菌检内毒素 猪 - 干扰素组合物97.6972mg/L6.81.16103符合规定符合规定 0069 纯度 ： 用 HPLC 检测按实施例 2 所制备的猪 - 干扰素的纯度， 结果大于 97 ； 0070 蛋白浓度 ： 用 BCA 法测定猪 - 干扰素组合物中蛋白含量， 结果大于 970mg/L。 0071 活性 ： 用常规的细胞病变抑制法 WISH/VSV 检测该猪 - 干扰素组合物的活性， 结 果大于 1.10103IU/mg ； 0072 比活性 ： 生物学活性与蛋白质含量之比。 说 明 书 CN 103146631 A 8 1/2 页 9 0001 0002 序 列 表 CN 103146631 A 9 2/2 页 10 序 列 表 CN 103146631 A 10 。