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1、(10)申请公布号 CN 103146764 A (43)申请公布日 2013.06.12 CN 103146764 A *CN103146764A* (21)申请号 201210314546.5 (22)申请日 2012.08.30 C12P 7/10(2006.01) C12R 1/865(2006.01) (71)申请人 南京林业大学 地址 210037 江苏省南京市龙蟠路 159 号 (72)发明人 勇强 余世袁 储秋露 马斌 徐勇 朱均均 李鑫 (74)专利代理机构 南京苏高专利商标事务所 ( 普通合伙 ) 32204 代理人 邱兴天 (54) 发明名称 一种变温发酵制取乙醇的方法 。
2、(57) 摘要 本发明公开了一种变温发酵制取乙醇的方 法， 包括纤维原料预处理、 酶水解、 水解物固液分 离、 清液浓缩发酵和酶解渣发酵步骤 ； 在所述的 酶解渣发酵步骤中， 酶解渣不经过洗涤分离糖， 直 接用酿酒酵母固体变温发酵成乙醇。该方法的纤 维素在较低底物浓度下 （10-15%） 进行较高得率 的水解， 水解后糖液和水解渣分离， 清液浓缩进行 高糖 （160-250g/L） 发酵， 酶解渣直接固体变温发 酵， 既避免了低底物浓度酶解、 发酵分开进行工艺 中酶解渣洗涤耗用大量水和能耗高的问题 ； 又避 免了高底物浓度酶解、 水解物直接发酵工艺中酶 水解得率低、 能耗高、 不能实现高糖发酵。
3、和酵母回 收循环利用的问题 ； 同时酶解渣的固体变温发酵 也具有同步糖化发酵的作用， 具有很好的实用性。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 7 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书7页 附图3页 (10)申请公布号 CN 103146764 A CN 103146764 A *CN103146764A* 1/1 页 2 1. 一种变温发酵制取乙醇的方法， 包括纤维原料预处理、 酶水解、 水解物固液分离、 清 液浓缩发酵和酶解渣发酵步骤 ； 其特征在于 ： 在所述的酶解渣发酵步骤中， 酶解渣不经过 洗涤分离糖， 直。
4、接用酿酒酵母固体变温发酵成乙醇。 2. 根据权利要求 1 所述的变温发酵制取乙醇的方法， 其特征在于 ： 所述的固体变温发 酵为 ： 用酿酒酵母于 28-30条件下厌氧发酵 18-36h， 再变温至 32-38下继续厌氧发酵 36-48h。 3. 根据权利要求 1 或 2 所述的变温发酵制取乙醇的方法， 其特征在于 ： 在所述的固体 变温发酵中， 酿酒酵母的用量为 41052106 个 /g 酶解残渣。 4. 根据权利要求 1 所述的变温发酵制取乙醇的方法， 其特征在于 ： 所述的植物纤维原 料预处理指以提高纤维质原料中纤维素对纤维素酶的可及度所采用的物理、 化学、 生物或 以上几种方法联合应。
5、用的方法。 5. 根据权利要求 1 所述的变温发酵制取乙醇的方法， 其特征在于 ： 在所述的酶水解中， 所用的酶为纤维素酶， 是以木霉、 曲霉或细菌产生的能降解纤维素成葡萄糖的纤维素酶的 一种或多种酶的复合物。 6.根据权利要求1、 2、 3、 4或5所述的变温发酵制取乙醇的方法， 其特征在于， 具体步骤 如下 ： （1） 先粉碎、 酸处理、 蒸汽爆破处理纤维原料， 再水洗、 挤干， 得酶解底物 ； （2） 混合酶解底物和纤维素酶底物浓度 10-15%， 控制 pH4.0-6.0， 45-55条件下酶解 反应 48-72h ； 其中， 反应体系中每克纤维素的纤维素酶用量为 10-25FPIU/。
6、g ； （3） 酶水解反应结束后将水解物离心固液分离， 得清液和酶解渣 ； （4） 清液经减压蒸发浓缩至糖液中葡萄糖浓度为 160-250g/L， 在浓缩糖液中添加营养 盐后， 用酿酒酵母于 28-35条件下厌氧发酵 24-48h ； （5） 在酶解渣中添加营养盐， 用酿酒酵母于 28-30条件下厌氧发酵 18-36h， 再变温至 32-38下继续厌氧发酵 36-48h。 权 利 要 求 书 CN 103146764 A 2 1/7 页 3 一种变温发酵制取乙醇的方法 技术领域 0001 本发明属于利用植物纤维原料制备生物乙醇技术领域， 具体涉及一种变温发酵制 取乙醇的方法。 背景技术 000。
7、2 乙醇， 俗称酒精， 是一种重要的化学品。 乙醇广泛应用于化工、 能源、 饮料、 食品、 轻 工、 农业等领域。 乙醇的生产方法主要包括化学合成法和微生物发酵法， 其中以微生物发酵 法为主。 微生物发酵法制取乙醇的原料主要包括三类 ： 淀粉质原料、 糖质原料和植物纤维原 料。 目前， 大规模商业化生产乙醇主要以淀粉质、 糖质为原料， 其工艺已经较为成熟， 而以植 物纤维原料制取乙醇的技术尚处于研究阶段。 0003 随着人类工业文明进步的加快和社会经济的发展， 人类社会对以石油为代表的化 石资源的过度开采和使用使人类社会不可避免地面临资源危机、 能源危机和环境污染等问 题， 其中近年来能源短缺。
8、问题尤为突出。人类社会急需寻找清洁、 可再生的替代能源， 其中 来源于生物质材料 （包括淀粉质、 糖质和植物纤维原料） 的生物乙醇是良好的汽油替代品。 尽管以淀粉质、 糖质等粮食为原料生产乙醇的技术体系已经较为成熟， 但从全球范围看， 人 类社会粮食生产形势依然严峻， 粮食基乙醇的生产不能满足迅猛发展的汽车工业对乙醇的 大量需求。而地球上有丰富的植物纤维资源， 以可再生的植物纤维资源生产乙醇作为汽车 燃料， 不仅可以达到节粮代粮的目的， 而且可以实现资源的永续利用， 符合循环经济的要 求。 0004 植物纤维原料生物法制取乙醇的关键技术主要包括原料预处理、 纤维素酶制备、 纤维素水解、 糖液发。
9、酵 4 个关键技术， 其中纤维素水解、 发酵工艺是影响乙醇生产成本的关 键因素之一。 从降低乙醇生产成本的角度出发， 植物纤维原料制取乙醇对水解、 发酵工艺的 要求除了有较高的纤维素水解得率和较高的乙醇发酵糖利用率和乙醇得率外， 还要求在生 产过程中吨乙醇消耗的水、 能耗尽可能低。 0005 目前研究较多的纤维素水解、 发酵技术主要包括以下三种 ： 1、 低底物浓度纤维素水解、 清液乙醇发酵。 该法是国内外目前研究较多的方法之一。 具 体过程为 ： 预处理的植物纤维原料在较低的底物浓度下水解， 一般在底物浓度 10-15% （固液 比 1:10-1:6.67） 之间， 水解结束后固液分离， 并。
10、用一定量的水将固液分离后固体酶解渣中 的糖分洗出， 与前面糖液合并后直接发酵或浓缩到一定糖浓度后发酵成乙醇。该法的理由 是 ： 纤维素酶是一种属于反馈抑制的水解酶类， 在纤维素水解过程中纤维素酶活性受到纤 维素水解产物葡萄糖的反馈抑制， 因此， 高底物浓度导致的水解糖液中高糖浓度对纤维素 酶的活性产生较高的抑制作用， 降低了纤维素酶水解得率。所以在较低底物浓度下水解有 利于提高水解得率。但该法存在以下缺点 ：（1） 水解结束固液分离后仍有一部分糖分存留 于酶解渣中， 需耗用大量水来洗涤， 同时洗涤后糖液与前面固液分离得到的糖液合并后糖 液浓度降低， 如果不浓缩直接清液发酵得到的发酵醪液中乙醇浓。
11、度较低， 从而使后续的乙 醇蒸馏消耗大量的蒸汽 ； 如果合并后糖液浓缩后发酵， 因为洗涤额外增加的水分的浓缩又 说 明 书 CN 103146764 A 3 2/7 页 4 消耗大量的蒸汽。 （2） 纤维素酶水解结束后采用固液分离、 洗涤的工艺不可能将酶水解渣中 糖分完全洗出， 导致一部分的糖分的损失。 0006 2、 高底物浓度纤维素水解、 带渣乙醇发酵。该法是国内外目前研究较多的方法之 一。具体过程为 ： 预处理的植物纤维原料在较高的底物浓度下水解， 一般在 20-30%（固液 比 1:5-1:3.33） 之间， 水解结束后水解物不固液分离直接用于发酵。该法的理由是 ： 鉴于 低底物浓度纤。
12、维素水解尽管纤维素水解得率高， 但固液分离、 渣中糖分洗涤后的糖液浓度 变稀， 直接发酵导致所需发酵罐体积增加， 浓缩后发酵浓缩则所需能耗大的问题， 采取高底 物浓度批式酶水解可获得较高浓度的糖液 ； 同时酶水解结束后水解物直接发酵避免了酶 水解渣中糖分洗涤和洗涤导致糖分损失的问题 ； 另外， 酶水解后水解物直接发酵， 在酶解 过程中没有失活的部分纤维素酶在发酵时仍然可以降解纤维素成葡萄糖， 但由于发酵温度 （28-35） 与酶水解温度 （45-50） 不统一， 此时的酶水解效率低。但该法存在以下缺点 ： （1） 由于高底物浓度水解， 高底物浓度水解过程中生成的高浓度水解产物葡萄糖严重抑制 了。
13、纤维素酶的活性， 降低了纤维素酶水解的得率。 （2） 尽管是高底物浓度酶解， 但研究表明， 纤维素水解过程中底物浓度仍然存在一定限制， 一般不能超过 30%， 底物浓度超过 30% 不仅 纤维素水解得率大幅度下降， 而且更重要的是工业过程植物纤维原料预处理后较难实现固 形物浓度在 30% 以上的物料。而就是在底物浓度 30% 的物料水解， 一般水解糖液中葡萄糖 浓度在 70-120g/L 之间， 由于水解物中含大量固体残渣， 很难进行水解物的带渣浓缩， 从而 无法实现高糖浓度 （160-250g/L） 下的乙醇发酵， 而对于乙醇生产而言， 对发酵醪液中乙醇 浓度的要求是越高越好。含葡萄糖浓度 。
14、70-120g/L 的糖液发酵， 乙醇理论得率 （1g 葡萄糖 经酿酒酵母发酵乙醇理论得率为 0.51g） 为 35.7-61.2g/L， 而含葡萄糖浓度 160-250g/L 的 糖液发酵， 乙醇理论得率可达 81.6-127.5g/L， 含高浓度乙醇的发酵醪液可以大幅度降低后 续乙醇蒸馏所耗能量 （蒸汽） 。因此， 本法虽然采用高底物浓度水解获得较高浓度的糖液， 但 水解物中葡萄糖浓度仍然受到限制， 发酵后醪液中乙醇浓度仍然较低， 不利于后续的乙醇 蒸馏。 （3） 工业生产上传统的清液发酵过程无需搅拌， 而高底物浓度纤维素经过酶水解后直 接发酵， 需要在搅拌条件下进行， 耗能高。 （4） 。
15、清液发酵可实现酵母的循环利用， 而带渣发酵 由于酵母和酶水解渣不能有效分离而不能循环利用。 0007 3、 纤维素同步糖化发酵。具体过程为 ： 纤维素的酶水解和乙醇发酵在同一反应器 中进行。该法的理由是 ： 鉴于纤维素的酶水解产物葡萄糖对纤维素酶能产生抑制作用， 采 用纤维素的酶水解和乙醇发酵在同一反应器中进行， 目的是纤维素经纤维素酶水解的产物 葡萄糖及时被酵母发酵成乙醇， 从而解除酶水解产物对纤维素酶的抑制作用。但该法存在 的缺点是 ： 纤维素的酶水解和酵母乙醇发酵的温度不一致。纤维素的酶水解一般要求在 45-50， 而酵母乙醇发酵则要求温度在 28-35， 酶反应和乙醇发酵最适温度的差异。
16、严重 影响了纤维素的酶水解过程和乙醇发酵过程， 从而限制了该法在工业上的应用。 0008 综上所述， 从生产成本角度出发， 目前研究的主要几种植物纤维原料纤维素酶水 解、 发酵工艺均存在着一些问题， 有待于进一步优化。 发明内容 0009 发明目的 ： 针对现有技术中存在的不足， 本发明的目的是提供一种高效、 低成本的 变温发酵制取乙醇的方法， 以使其满足使用要求。 说 明 书 CN 103146764 A 4 3/7 页 5 0010 技术方案 ： 为了实现上述发明目的， 本发明采用的技术方案如下 ： 一种变温发酵制取乙醇的方法， 包括纤维原料预处理、 酶水解、 水解物固液分离、 清液 浓缩。
17、发酵和酶解渣发酵步骤 ； 在所述的酶解渣发酵步骤中， 酶解渣不经过洗涤分离糖， 直接 用酿酒酵母固体变温发酵成乙醇。 0011 所述的固体变温发酵为 ： 用酿酒酵母于 28-30条件下厌氧发酵 18-36h， 再变温 至 32-38下继续厌氧发酵 36-48h。 0012 在所述的固体变温发酵中， 酿酒酵母的用量为 41052106 个 /g 酶解残渣。 0013 所述的植物纤维原料预处理指以提高纤维质原料中纤维素对纤维素酶的可及度 所采用的物理、 化学、 生物或以上几种方法联合应用的方法。 0014 在所述的酶水解中， 所用的酶为纤维素酶， 是以木霉 （Trichoderma） 、 曲霉 （。
18、Aspergillus） 或细菌产生的能降解纤维素成葡萄糖的纤维素酶的一种或多种酶的复合 物。 0015 上述的变温发酵制取乙醇的方法， 具体步骤如下 ： （1） 先粉碎、 酸处理、 蒸汽爆破处理纤维原料， 再水洗、 挤干， 得酶解底物 ； （2） 混合酶解底物和纤维素酶底物浓度 10-15%， 控制 pH4.0-6.0， 45-55条件下酶解 反应 48-72h ； 其中， 反应体系中每克纤维素的纤维素酶用量为 10-25FPIU/g ； （3） 酶水解反应结束后将水解物离心固液分离， 得清液和酶解渣 ； （4） 清液经减压蒸发浓缩至糖液中葡萄糖浓度为 160-250g/L， 在浓缩糖液中添。
19、加营养 盐后， 用酿酒酵母于 28-35条件下厌氧发酵 24-48h ； （5） 在酶解渣中添加营养盐， 用酿酒酵母于 28-30条件下厌氧发酵 18-36h， 再变温至 32-38下继续厌氧发酵 36-48h。 0016 本发明的方法， 首次提出植物纤维原料在较低底物浓度下进行高效水解， 水解结 束固液分离后清液浓缩到较高糖浓度进行清液发酵， 固液分离后的酶解渣不洗涤直接固体 变温发酵的酶解发酵工艺。该法既避免了低底物浓度酶解、 发酵分开进行工艺中酶解渣洗 涤耗用大量水和能耗高的问题 ； 又避免了高底物浓度酶解、 水解物直接发酵工艺中酶水解 得率低、 能耗高、 不能实现高糖发酵和酵母回收循环。
20、利用的问题 ； 同时酶解渣的固体变温发 酵也具有同步糖化发酵的作用。 0017 有益效果 ： 与现有技术相比， 本发明的变温发酵方法， 纤维素在低底物浓度下 （10-15%） 水解可以获得较高的水解得率， 水解后糖液和水解渣分离可以实现清液浓缩后的 高糖 （160-250g/L） 发酵且工业规模上无需搅拌， 高糖发酵获得的高乙醇浓度的醪液可降低 后续乙醇蒸馏的蒸汽消耗， 固液分离后的水解渣直接固体发酵可以避免从水解渣中洗涤糖 分过程， 降低了水耗和后续糖液浓缩的能耗， 并避免了由洗涤造成的糖分损失。 同时本发明 采用的固体渣变温发酵技术分为两段发酵， 前一段采用 28-30发酵保证酿酒酵母能快。
21、速 将全部葡萄糖转化为乙醇， 后一段采用 32-38发酵促进固体发酵中的同步糖化发酵作用， 进一步提高乙醇产量。 附图说明 0018 图 1 是 15% 底物浓度下预处理玉米秸秆纤维素酶水解历程 ； 图 2 是浓缩水解糖液乙醇发酵历程 ； 说 明 书 CN 103146764 A 5 4/7 页 6 图 3 是 30% 底物浓度酶水解后带渣乙醇发酵历程。 具体实施方式 0019 下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。 0020 以下实施例中所使用的材料、 试剂等， 若无特殊说明， 均可从商业途径获得， 或采 用常规方法制备。 0021 实施例 1 ： 玉米秸秆的预处理 取 玉 米 秸 秆 。
22、粉 碎 至 3-5cm， 用 质 量 分 数 为 0.50-1.00% 的 稀 硫 酸 浸 泡 2h， 控 压 1.5-2.2MPa、 停留时间 2-6min 条件下蒸汽爆破预处理， 得稀酸蒸汽爆破物料， 用 1:7.5-15 的水洗涤， 挤干物料， 作为后续酶水解的底物。分析底物的水分、 葡聚糖和木聚糖含量。 0022 结果表明， 玉米秸秆经稀酸蒸汽爆破预处理、 洗涤、 挤干后， 物料中水分含量为 68.44%， 葡聚糖和木聚糖质量分数分别为 52.34% 和 4.49%（干基） 。 0023 实施例 2 ： 底物浓度对玉米秸秆纤维素酶水解的影响 （1）称取稀酸蒸汽爆破洗涤物料 （实施例 1。
23、 制备）绝干重分别为 5.0g、 7.5g、 10.0g、 12.5g、 15.0g 于 5 个 250mL 三角瓶中， 在每个三角瓶中加入 1mol/L 柠檬酸缓冲液 2.5mL、 按 17.5FPIU/g 纤维素的酶加量分别在每个三角瓶中加入相应的纤维素酶， 在每个三角瓶中添 加适量的蒸馏水使酶解体系中水分总体积为 50mL， 用玻棒将反应体系充分混匀后盖上盖 子， 于 150 转 / 分、 50的恒温摇床中酶解 72h。 0024 （2） 水解结束后， 分别将上述水解物用离心机于 4000 转 / 分条件下离心 10min， 取 上清液适当稀释后测定其中的葡萄糖浓度和纤维二糖浓度， 并计。
24、算酶水解得率。底物浓度 对玉米秸秆纤维素酶水解得率的影响作用结果见表 1。 0025 葡萄糖和纤维二糖浓度采用高效液相色谱法 （HPLC） 测定。色谱条件如下 ： 色谱 仪 ： Agillent1100高效液相色谱仪 ； 色谱柱 ： Bio-Rad Aminex HPX-87H ； 流动相 ： 0.005mol/ L 硫酸， 流速 ： 0.6mL/min ； 柱温 ： 55 ； 检测器 ： 示差折光检测器 ； 进样量 ： 10L。外标法测 定。 0026 葡聚糖酶水解得率 （%） = （C10.9+ C20.95） 0.05/（W0.5234） 100% 式中 ： C1 ： 水解液稀释后葡萄糖。
25、浓度， g/L ； C2 ： 水解液稀释后纤维二糖浓度， g/L ； 0.9 ： 葡萄糖与葡聚糖的转换系数 ； 0.95 ： 纤维二糖与葡聚糖的转换系数 ； 0.05 ： 水解糖液体积， L ； 0.5234 ： 原料中葡聚糖含量， % ； W ： 底物绝干重， g。 0027 表 1 底物浓度对玉米秸秆纤维素酶水解得率的影响 底物浓度 （%）1015202530 酶水解得率 （%）81.7 72.8 66.2 62.8 49.3 结果表明， 底物浓度对稀酸蒸汽爆破预处理玉米秸秆的纤维素酶水解影响较大， 在每 克纤维素的酶用量相同的条件下， 当底物浓度 10.0%-15.0% 时可以获得较高的。
26、酶水解得 率。 说 明 书 CN 103146764 A 6 5/7 页 7 0028 实施例 3 ： 15% 底物浓度 （固液比 1:6.67） 下预处理玉米秸秆的纤维素酶水解 ； 1、 取 4640.8mL 蒸馏水于 121灭菌 15min， 冷却后加入已空罐灭菌的 10L 生化反应器 中。 0029 2、 取实施例 1 的玉米秸秆酸性蒸汽爆破洗涤物料 3327g（绝干重 1050g， 水分 2277g， 葡聚糖 549.57g） 在搅拌的情况下加入 10L 生化反应器中， 充分搅拌后用少量固体氢 氧化钠中和至 pH 值为 4.8。 0030 3、 将反应体系升温至 50， 加入纤维素酶 。
27、82.20g（按 17.5FPIU/g 葡聚糖的酶加 量） ， 整个酶解体系为 7000mL， 于 48-50条件下水解 72h。水解过程中前 12h 每隔 6h 取样 一次、 12h 后每隔 12h 取样， 样品于 4000 转 / 分条件下离心 10min 后取上清液用 HPLC 测定 水解液中葡萄糖和纤维二糖浓度。并计算酶水解得率。水解历程如图 1。 0031 4、 水解 72h， 将水解物于 4000 转 / 分条件下离心 10min（离心管事先灭菌） ， 上清 液用于后续水解糖液的浓缩发酵， 离心固体渣用于后续酶解渣的固体变温发酵。 0032 结果表明， 稀酸蒸汽爆破预处理的玉米秸秆。
28、在底物浓度 15%、 酶用量 17.5FPIU/g 纤维素、 pH4.8 条件下经纤维素酶水解 72h， 水解糖液中葡萄糖浓度为 60.68g/L， 纤维二糖 浓度为 0.90g/L， 纤维素水解得率为 70.65%。 0033 实施例 4 ： 水解糖液的浓缩、 浓缩糖液的发酵 1、 取实施例 3 的蒸汽爆破预处理玉米秸秆经纤维素酶水解、 水解物的离心上清液 3000mL， 在旋转蒸发器上于 70、 160mbar 下真空浓缩至 1000mL（浓缩 3 倍） ， 用 HPLC 分析 浓缩糖液中的葡萄糖浓度为 170.69g/L。 0034 2、 取上述浓缩糖液1000mL于2L发酵罐中， 加入。
29、0.24g尿素、 0.08g硫酸镁、 0.08g 氯化锌、 0.20g 氯化钙， 4.0g 活性酿酒酵母干粉， 于 100 转 / 分、 30发酵 48h， 每隔 8h 取样 于 4000 转 / 分条件下离心 10min， 取上清液适当稀释后用 HPLC 测定葡萄糖和乙醇浓度， 并 计算糖利用率和乙醇得率。浓缩水解糖液发酵结果如图 2。 0035 葡萄糖和乙醇浓度采用高效液相色谱法 （HPLC） 测定。色谱条件如下 ： 色谱仪 ： Agillent1100高效液相色谱仪 ； 色谱柱 ： Bio-Rad Aminex HPX-87H ； 流动相 ： 0.005mol/L硫 酸， 流速 ： 0.。
30、6mL/min ； 柱温 ： 55 ； 检测器 ： 示差折光检测器 ； 进样量 ： 10L。外标法测定。 0036 葡萄糖利用率计算如下 ： 葡萄糖利用率 （%） = （170.69 C3） /170.69 100 ； 式中 ： C3： 发酵液稀释后葡萄糖浓度， g/L ； 170.69 ： 初始葡萄糖浓度， g/L。 0037 乙醇得率计算如下 ： 乙醇得率 （%） = C4/（170.69- C3） 0.51 100 式中 ： C3： 发酵液稀释后葡萄糖浓度， g/L ； C4： 发酵液稀释后乙醇浓度， g/L ； 170.69 ： 初始葡萄糖浓度， g/L ； 0.51 ： 葡萄糖和乙醇。
31、的理论糖醇转化率。 0038 结果表明， 葡萄糖浓度为170.69g/L的浓缩水解糖液经酿酒酵母48h发酵， 发酵醪 说 明 书 CN 103146764 A 7 6/7 页 8 液中葡萄糖浓度为 1.81g/L、 乙醇浓度为 80.67g/L， 糖利用率和乙醇得率分别为 98.94% 和 93.66%。 0039 实施例 5 ： 酶解渣的固体变温发酵 1、 取实施例 3 蒸汽爆破预处理玉米秸秆经纤维素酶水解、 水解物离心得到的沉淀酶解 渣 2g， 测定水分含量为 71.85%。 0040 2、 取实施例 3 得到的酶解渣 5g 于烧杯中， 加入 70mL 蒸馏水， 用玻璃棒充分搅拌后 于 4。
32、000 转 / 分条件下离心 10min， 取上清液用 HPLC 测定其中葡萄糖浓度， 并换算成每克渣 所含的葡萄糖量。结果表明， 每克渣所含葡萄糖的量为 43.6mg。 0041 3、 分别取实施例 3 得到的酶解渣 75g 于 4 个 250mL 事先灭菌的圆底烧瓶中， 加入 1mL 营养盐 （尿素 12g/L、 硫酸镁 4g/L、 氯化锌 4g/L、 氯化钙 10g/L） ， 加入适量活性酿酒酵母 悬浮液， 使酵母含量为 2.0106个 /g 酶解渣。将烧瓶浸于 30水浴锅中， 于搅拌转速 80 转 / 分的条件下发酵 32h， 当体系中的游离葡萄糖被耗尽后， 再将温度分别升至 32、 。
33、34、 36、 38继续发酵至 72h。 0042 4、 发酵72h后， 分别将发酵曲取出置于1000mL烧杯中， 在每个发酵曲中加入450mL 蒸馏水， 用玻璃棒充分搅拌后于4000转/分条件下离心10min， 取上清液测定乙醇浓度和葡 萄糖浓度， 并计算糖利用率和乙醇得率。酵母浓度对酶解渣固体发酵的影响作用表 2。 0043 表 2 酵母浓度对酶解渣固体发酵的影响 发酵温度 （）32343638 初始葡萄糖 （g）3.273.273.273.27 发酵曲残糖 （g）0.030.030.020.19 发酵曲乙醇 （g）1.891.881.901.84 糖醇转化率0.578 0.575 0.5。
34、81 0.563 备注 ： 糖醇转化率以初始葡萄糖 3.27g 为计算基准。 0044 结果表明， 酶解渣经酿酒酵母固体发酵可将其中的葡萄糖转化为乙醇， 当变温发 酵温度为36时， 75g酶解渣固体发酵72h， 发酵曲中葡萄糖量为0.02g， 乙醇量为1.90g， 糖 醇转化率为 0.581。糖醇转化率高于理论转化率 0.51， 是由于在固体发酵过程中， 酶解渣中 残余的纤维素酶在固体发酵过程中部分水解酶解渣中残留的纤维素成葡萄糖并被发酵成 乙醇， 即起到同步糖化发酵 （SSF） 的作用。 0045 比较例 1 ： 稀酸蒸汽爆破预处理玉米秸秆低底物浓度酶解、 洗涤 1、 取实施例 1 的玉米秸。
35、秆蒸汽爆破洗涤物料 95.06g （绝干重 30g， 水分 65.06g， 纤维素 15.70g） 于 500mL 圆底烧瓶中， 加入 1mol/L 柠檬酸缓冲液 10mL， 加入纤维素酶 2.35g（按 17.5FPIU/g 纤维素的酶加量） ， 加入适量蒸馏水使得酶解体系为 200mL， 底物浓度为 15% （w/ v） 。将烧瓶浸于 50水浴锅中， 于 50、 搅拌转速 80 转 / 分的条件下酶解 72h。 0046 2、 上述酶解结束后， 将水解物于 4000 转 / 分条件下离心 10min， 得上清液 157mL （记上清液 1） ； 在离心沉淀 （酶解渣） 中加入 150mL 。
36、蒸馏水并充分搅拌后， 于 4000 转 / 分条 件下离心 10min， 得上清液 107mL（记上清液 2） ； 在第二次离心沉淀中加入 150mL 蒸馏水并 充分搅拌后， 于 4000 转 / 分条件下离心 10min， 得上清液 104mL（记上清液 3） 。用 HPLC 分 别测定上清液 1、 上清液 2 和上清液 3 中葡萄糖浓度， 并计算洗涤过程葡萄糖回收率。合并 上清液， 用 HPLC 测定合并上清液中葡萄糖浓度。实验结果如表 3。 0047 表 3 洗涤过程对酶水解物中葡萄糖回收率的影响 说 明 书 CN 103146764 A 8 7/7 页 9 酶水解物上清液 1 上清液 。
37、2 上清液 3 体积 （ml）200125145145 葡萄糖浓度 （g/L）61.2861.2820.056.40 葡萄糖 （g）12.267.662.910.93 葡萄糖回收率 （%） 62.5086.2293.80 结果表明， 稀酸蒸汽爆破预处理玉米秸秆在底物浓度 15%（固液比 1:6.67） 条件下酶解 72h， 水解糖液中葡萄糖浓度为 61.28g/L， 水解结束后离心固液分离糖液后， 用相当于原底 物固液比 1:10 的水分二次洗涤， 葡萄糖回收率为 93.80%， 合并三次固液分离的糖液， 糖液 中葡萄糖浓度为30.33g/L。 因此， 采用低底物浓度纤维素酶水解、 酶解渣洗涤。
38、后糖液发酵工 艺， 尽管可得到较高的纤维素水解得率， 但洗涤工艺一方面使糖液浓度稀释近一半， 不仅增 加了水耗， 而且后续糖液的浓缩又增加了能耗， 另一方面， 采用本工艺仅能回收 93% 左右的 葡萄糖。 0048 比较例 2 ： 稀酸蒸汽爆破预处理玉米秸秆高底物浓度 （30%， 固液比 1:3.33） 酶解、 带渣发酵 1、 取实施例 1 的玉米秸秆稀酸蒸汽爆破洗涤物料 190.11g （绝干重 60g， 水分 130.11g， 纤维素 31.40g） 于 500ml 圆底烧瓶中， 加入适量蒸馏水和纤维素酶 4.70g（按 17.5FPIU/g 纤维素的酶加量） ， 用氢氧化钠调节 pH4.。
39、8-5.0， 酶解体系为 200ml， 将烧瓶浸于 50水浴锅 中， 于搅拌转速 150 转 / 分的条件下酶解 72h。酶解结束后取水解产物 0.5ml 于 4000 转 / 分条件下离心 10min， 上清液稀释后测定其中的葡萄糖和纤维二糖浓度， 并计算水解得率。 0049 2、 将上述酶水解体系冷却到 30， 加入 0.048g 尿素、 0.016g 硫酸镁、 0.016g 氯 化锌、 0.04g 氯化钙， 加入适量活性酿酒酵母液 （酵母浓度 1.0107/g 酶解渣） ， 将烧瓶浸于 30水浴锅中， 于 30、 搅拌转速 80 转 / 分的条件下发酵 48h。发酵过程中每隔 12h 取。
40、样 1ml， 于4000转/分条件下离心10min， 上清液稀释后测定其中的乙醇和葡萄糖浓度， 并计算 糖醇转化率 （糖醇转化率以发酵初始葡萄糖浓度为基准） 。实验结果如图 3。 0050 结果表明 ： 稀酸蒸汽爆破预处理玉米秸秆在底物浓度 30%、 纤维素酶用量 17.5FPIU/g 纤维素、 pH 值 4.8、 50水解 72h， 水解液中葡萄糖浓度为 85.34g/L， 纤维二糖 浓度为 0.62g/L， 纤维素水解得率为 49.29%。该水解产物不固液分离直接用酿酒酵母发酵， 发酵 48h， 发酵醪液中葡萄糖浓度为 0.93g/L， 乙醇浓度为 41.87g/L， 糖醇转化率为 0.491。 说 明 书 CN 103146764 A 9 1/3 页 10 图 1 说 明 书 附 图 CN 103146764 A 10 2/3 页 11 图 2 说 明 书 附 图 CN 103146764 A 11 3/3 页 12 图 3 说 明 书 附 图 CN 103146764 A 12 。