用于同时检测沙门菌枸橼菌变形菌和爱德华菌的多重PCR引物及其设计方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103146827 A (43)申请公布日 2013.06.12 CN 103146827 A *CN103146827A* (21)申请号 201310072599.5 (22)申请日 2013.03.06 C12Q 1/68(2006.01) C12Q 1/10(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (71)申请人 厦门市农产品质量安全检验测试中 心 地址 361012 福建省厦门市思明区湖滨中路 532 号 申请人 厦门出入境检验检疫局检验检疫技 术中心 (72)发明人 陈琼 孔繁德 徐淑菲 赵冉 周昱 杨涛 陈永锋 连玉华 (74)专利代理。

2、机构 厦门南强之路专利事务所 35200 代理人 马应森 (54) 发明名称 用于同时检测沙门菌枸橼菌变形菌和爱德华 菌的多重 PCR 引物及其设计方法 (57) 摘要 用于同时检测沙门菌枸橼菌变形菌和爱德华 菌的多重 PCR 引物及其设计方法， 涉及沙门氏菌 等的检测。沙门氏菌引物对应的 PCR 扩增片段为 526bp， 弗氏枸橼酸杆菌引物对应的 PCR 扩增片段 为161bp， 奇异变形杆菌引物对应的PCR扩增片段 为396bp， 迟缓爱德华菌引物对应的PCR扩增片段 为 330bp。1 设计多重 PCR 引物组合 ； 2 对引物组 合中的引物进行筛选， 保留不能合成引物二聚体 的引物 ；。

3、 3 判断所保留引物的竞争优劣状态， 将步 骤 2 保留不能合成引物二聚体的引物的 GC% 和碱 基数进行比较， 选取 GC 含量高的判断为竞争状态 优势引物， 转步骤 5 ； 否则转步骤 4 ； 4 再次筛选竞 争状态劣的引物 ； 5 对竞争状态优引物扩增。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 7 页 序列表 2 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书7页 序列表2页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103146827 A CN 103146827 A *CN103146827A* 1/2 页 2 1. 用于同。

4、时检测沙门氏菌、 弗氏枸橼酸杆菌、 奇异变形杆菌和迟缓爱德华菌的多重 PCR 引物， 其特征在于为 ： S.spp.F1 ： 5 -GCCGGTAAACTACACGATGA-3 ； S.spp.R1 ： 5 -GAGTTACTGAACCAACAGCT-3 ； C.freu.F1 ： 5 -AACATAGCGATGGACAACTGA-3 ； C.freu.R1 ： 5 -TTAGCAAAAATTTAAGCCGGT-3 ； P.mira.F1 ： 5 -TTTATCAATAGCCTCAAACCCT-3 ； P.mira.R1 ： 5 -TGCGTCACCCTCTAACTCATCC-3 ； E.ta。

5、rda.F1 ： 5 -CTGGGCAAGTATCCGACCTC-3 ； E.tarda.R1 ： 5 -GGTAACCGTATCGGCGTAAG-3 ； 其中， Sspp. 为沙门氏菌的英文缩写， Cfreu. 为弗氏枸橼酸杆菌的英文缩写 ,P mira. 为奇异变形杆菌的英文缩写， Etarda. 为迟缓爱德华菌的英文缩写 ； S.spp.F1 和 S.spp.R1 为根据沙门氏菌 FimA 基因设计的上游引物 F1 和下游引物 R1 ； C.freu.F1 和 C.freu.R1 为根据弗氏枸橼酸杆菌 Idh 基因设计的上游引物 F1 和下游引物 R1;P.mira.F1 和 P.mir。

6、a.R1 为根据奇异变形杆菌 IdsC 基因设计的上游引物 F1 和下游引 物 R1 ； E.tarda.F1 和 E.tarda.R1 为根据迟缓爱德华菌 FimA 基因设计的上游引物 F1 和下 游引物 R1 ； 所述沙门氏菌引物对应的PCR扩增片段大小为526bp， 弗氏枸橼酸杆菌引物对应的PCR 扩增片段大小为 161bp， 奇异变形杆菌引物对应的 PCR 扩增片段大小为 396bp， 迟缓爱德华 菌引物对应的 PCR 扩增片段大小为 330bp。 2. 如权利要求 1 所述用于同时检测沙门氏菌、 弗氏枸橼酸杆菌、 奇异变形杆菌和迟缓 爱德华菌的多重 PCR 引物的设计方法， 其特征在。

7、于包括以下步骤 ： 步骤 1， 利用引物设计软件设计同时检测沙门氏菌、 弗氏枸橼酸杆菌、 奇异变形杆菌和 迟缓爱德华菌的多重 PCR 引物组合， 所形成的引物组合所包含的引物碱基数为 20 24 个， 引物组合的熔解温度 Tm 值为 52 62， 引物组合的 GC% 为 40% 60% ； 步骤 2， 对引物组合中的引物进行筛选， 保留不能合成引物二聚体的引物 ； 步骤 3， 判断所保留引物的竞争优劣状态， 将步骤 2 所述保留不能合成引物二聚体的引 物的 GC% 和碱基数进行比较， 选取 GC 含量高的判断为竞争状态优势引物， 进行步骤 5 ； 否则 判断为竞争状态劣势引物， 进行步骤 4 。

8、； 步骤 4， 再次筛选竞争状态劣的引物， 具体步骤为 ： 重复步骤 2， 对所保留的引物按照步 骤 3 进行再次判断 ； 步骤 5， 利用 PCR 方法对竞争状态优引物进行扩增。 3. 如权利要求 2 所述用于同时检测沙门氏菌、 弗氏枸橼酸杆菌、 奇异变形杆菌和迟缓 爱德华菌的多重PCR引物的设计方法， 其特征在于在步骤1中， 所述所用的引物设计软件为 Primer Premier5.0。 4. 如权利要求 2 所述用于同时检测沙门氏菌、 弗氏枸橼酸杆菌、 奇异变形杆菌和迟缓 爱德华菌的多重 PCR 引物的设计方法， 其特征在于在步骤 1 中， 所述多重 PCR 引物组合的熔 解温度 Tm 。

9、值为 60。 5. 如权利要求 2 所述用于同时检测沙门氏菌、 弗氏枸橼酸杆菌、 奇异变形杆菌和迟缓 权 利 要 求 书 CN 103146827 A 2 2/2 页 3 爱德华菌的多重PCR引物的设计方法， 其特征在于在步骤2中， 所述对引物组合中的引物进 行筛选的具体步骤为 ： 对所用的引物进行 PCR 扩增， 筛选扩增效果最好的引物组合。 6. 如权利要求 2 所述用于同时检测沙门氏菌、 弗氏枸橼酸杆菌、 奇异变形杆菌和迟缓 爱德华菌的多重PCR引物的设计方法， 其特征在于在步骤2中， 所述不能形成引物二聚体的 引物的碱基数目为 20 24。 7. 如权利要求 2 所述用于同时检测沙门氏。

10、菌、 弗氏枸橼酸杆菌、 奇异变形杆菌和迟缓 爱德华菌的多重 PCR 引物的设计方法， 其特征在于在步骤 5 中， 所述 PCR 方法的变性温度 94， 退火温度为 60， 延伸温度 72。 权 利 要 求 书 CN 103146827 A 3 1/7 页 4 用于同时检测沙门菌枸橼菌变形菌和爱德华菌的多重 PCR 引物及其设计方法 技术领域 0001 本发明涉及沙门氏菌、 弗氏枸橼酸杆菌、 奇异变形杆菌和迟缓爱德华菌的检测， 尤 其是涉及一种用于同时检测沙门氏菌、 弗氏枸橼酸杆菌、 奇异变形杆菌和迟缓爱德华菌的 多重 PCR 引物及其设计方法。 背景技术 0002 沙门氏菌、 弗氏枸橼酸杆菌、。

11、 奇异变形杆菌、 迟缓爱德华菌均属于肠杆菌科， 可通 过食物、 伤口传播。除了引起食物中毒还能引起人和动物机体的多系统感染。 0003 沙门氏菌为肠杆菌科细菌较早的成员， 具有呼吸和发酵两种代谢类型， 存在于温 血及冷血动物体内、 食物和环境中， 是一种常见的病原菌， 可以引起伤寒、 肠伤寒、 胃肠炎和 败血症等相关疾病。沙门菌的血清型很多， 给鉴定带来很大困难。沙门菌在自然界分布比 较广泛， 在外界环境中能生存较久， 在水和土壤中能生存数周到数月， 在冰库中甚至能存活 半年以上。近年来， 由于抗生素的滥用， 该菌对氯霉素的耐药菌株明显增多， 有的菌株对庆 大霉素、 卡那霉素、 氨苄青霉素等也。

12、耐药， 这使得食品安全中对该菌的检测投入了大量的人 力物力。 0004 弗氏枸橼酸杆菌， 也被称为弗氏柠檬酸杆菌。曾被归于埃希菌属。柠檬酸杆菌属 的细菌， 具有如肠杆菌科的菌体、 表面和鞭毛的相应抗原， 有研究表明， 柠檬酸杆菌中许多 血清型的抗原与沙门菌属和埃希菌属的抗原有关， 这个也给常规鉴定带来了一定困难。弗 氏枸橼酸杆菌在自然界广泛分布， 是人和多种动物包括哺乳类、 鸟类、 爬行类和两栖类的肠 道常在菌， 常见于粪便和被粪便污染的地方， 也常见于土壤、 水体和食物中， 所以该菌也列 在了大肠菌群。作为环境和食品等的粪源污染的卫生细菌学指标。该属的细菌作为人的条 件致病菌， 看在社区或者。

13、医院内发生感染， 大多数感染部位是尿路和呼吸道， 还可引起败血 症、 脑膜炎、 骨髓炎、 中耳炎及心内膜炎， 在一定的数量下， 还能引起食物中毒。对动物的致 病性有明确记述的主要是鱼类， 最近也有甲壳类和爬行类感染的报道， 死亡率较高， 对水产 养殖影响不小， 当前分子生物学鉴定还局限于对该菌的 16SrRNA 基因序列测定与系统发育 学分析， 时间周期太长， 无法应用于日常监测和检测。 0005 奇异变形杆菌亦被称作奇异杆菌， 是变形杆菌属中较早的成员， 对人类可引起原 发性或继发性感染， 也可以导致人类食物中毒， 对动物也有致病作用。 该属的细菌广泛存在 于自然界中， 尤其以奇异变形杆菌更。

14、为常见， 它是一种已被确定的病原菌， 或是单独或是与 其他病原菌混合感染引起人的不同类型感染症， 也是人尿路感染的一种主要病原， 有的菌 株还引起食物中毒， 在呼吸道、 消化道以及烧伤创面感染中的检出率也不断增加， 是一种常 见的医院感染菌。 最重要的是， 奇异变形杆菌能产生耐热肠毒素， 引起相应的胃肠炎性食物 中毒。 0006 迟缓爱德华菌在试爱德华均属细菌中最早的成员， 该菌能在特定条件下引起人的 多种类型感染， 也是鱼类常见的病原细菌， 广泛存在于自然界中， 此菌多从腹泻病人的粪便 说 明 书 CN 103146827 A 4 2/7 页 5 中分离到， 而在健康人群的粪便中是极少分离到。

15、的。 迟缓爱德华菌还能引起人的脑膜炎、 腹 膜炎、 菌血症、 败血症、 皮肤软组织感染， 发生肠道感染的临床表现类似沙门氏菌， 虽然该菌 被认定为人、 鱼共染病原菌， 但是主要发生在鱼类， 甲壳类也是常见宿主， 对养殖产业造成 巨大影响。 0007 目前， 国内对沙门菌的检测已经有了相应的国家标准， 分为以下几个过程 :(1) 前 增菌 ； (2) 选择性增菌 ； (3) 选择性培养 ； (4) 生化鉴定 ； (5) 血清学实验。但国标方法步骤 繁琐， 费时费力， 重复性不好， 且弗氏枸橼酸杆菌、 奇异变形杆菌和迟缓爱德华菌的检测还 没有建立相应的标准。因此， 建立简便、 快速、 准确、 可靠。

16、、 的检测方法同时适用于这四种的 检测， 弥补目前检测方法的不足尤为重要。 0008 多重 PCR 技术的应用， 可大大减少检测成本， 可大大减少工作量， 适应于口岸快速 检测的需要， 是一种准确、 可靠、 科学的分子生物学方法。 有鉴于此， 尽快开发一种用于同时 检测沙门氏菌、 弗氏枸橼酸杆菌、 奇异变形杆菌和迟缓爱德华菌的多重 PCR 势在必行。 0009 聚合酶链式反应 （Polymerase Chain Reaction, 简称 PCR） 是一种体外快速扩增 DNA 的方法， 用于放大特定的 DNA 片段， 数小时内可使目的基因片段扩增到数百万个拷贝的 分子生物学技术。一个反应常有 2。

17、5 35 个循环， 一个循环包含 3 个步骤， 首先使模板 DNA 双链在 94 95变性为单链， 然后在较低温度下， 使引物与模板结合， 接着在引物的引导 及 Taq 酶的作用下， 于 72合成模板 DNA 互补链。可看作生物体外的特殊 DNA 复制。一般 PCR仅应用一对引物， 通过PCR扩增产生一个核酸片段。 多重PCR， 又称多重引物PCR或复合 PCR， 它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物， 同时扩增出多个核酸片段的PCR反应， 其反应原理， 反应试剂盒操作过程与一般 PCR 相同。多重 PCR 是在普通 PCR 的基础上加以 改造， 于一个PCR反应体系中加多对特异性引物，。

18、 针对多个DNA模板或同一模板的不同区域 扩增多个目的片段的 PCR 技术。多重 PCR 在一次反应中就能同时扩增一个基因的多个靶序 列。多重 PCR 最先是在 1988 年就被 Chamberlain（Chamberlain JS.Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA amplificationJ. Nucleic Acids Research， 1988， 16 ： 11141-11156） 所提出， 在这短短 22 个年头之内， 它已 经在DNA检测的多个领域得到成功的应。

19、用。 具体包括检测基因突变、 缺失等多态， 定量PCR， 反转录 PCR。Henegariu 在 1997 年设计出了多重 PCR 步步优化协议， 指导怎样多重 PCR 的 反应体系。但是多重 PCR 最大的问题还是存在于引物的设计上。和一般 PCR 相比较， 多重 PCR在同一PCR反应管内同时扩增出多个病原的基因片段， 一次完成多个模板的扩增。 多重 PCR 的系统性主要体现在它能够根据需求一次性扩增出所有的相关基因， 将大大节省时间， 节省试剂， 节约经费开支， 为临床提供更多更准确的诊断信息。 0010 多重 PCR 检测技术在一次反应中就能同时扩增一个模板的不同区域扩增多个目 的片段。

20、的 PCR 技术。以其快速、 高效， 特异性好、 灵敏度高的特点， 在食品病原微生物、 非致 病微生物及环境微生物检测中具有重要作用 ； 但多重 PCR 在提高食品微生物检测灵敏度、 去除食品抑制因子的干扰， 提高卫生标准及加强技术人员水平上仍有许多问题需要解决。 多重 PCR 改进技术简化了食品微生物检测过程、 缩短检测时间、 降低检测成本同时提高了 食品微生物检测的灵敏度 ； 但是多重 PCR 的改进技术也存在一定问题。未来的研究主要集 中在改进样品前处理技术、 去除食品抑制因子干扰， 其次是多重 PCR 与其它技术的整合应 用， 如多重 PCR 与变性梯度凝胶电泳、 基因芯片、 荧光探针。

21、定量技术、 免疫磁珠吸附等技术 说 明 书 CN 103146827 A 5 3/7 页 6 结合应用， 进一步提高食品微生物检测的灵敏度、 可重复性， 实现大批量食品检测、 复杂样 品基质中的多种微生物的有效检测、 食品微生物检测的标准化， 必将在未来食品微生物检 测中有非常好的应用前景。 0011 PCR 是一种模拟体内 DNA 复制过程的技术， 由于具有快速、 特异和敏感等特点， 近 年来在猪病诊断上得到广泛应用。多重 PCR 是一种特殊 PCR 形式， 比单一 PCR 反应更快捷、 更节约， 其最突出的特点， 即一次 PCR 反应， 可同时检测、 鉴别出多种病原体， 在临床混合感 染的。

22、鉴别诊断上具有其独特优势和很高的使用价值。 0012 多重 PCR 技术的应用， 可大大减少检测成本， 可大大减少工作量， 适应于口岸快速 检测的需要， 是一种准确、 可靠、 科学的分子生物学方法。 有鉴于此， 尽快开发一种用于同时 检测沙门氏菌、 弗氏枸橼酸杆菌、 奇异变形杆菌和迟缓爱德华菌的多重 PCR 势在必行。这对 于加强进出口水产品中弧菌的快速检验检疫、 水产养殖病害的调查和防治、 无公害水产品 检测和生产以及水产品卫生质量监督检验等方面都具有十分重要的意义。 发明内容 0013 本发明的目的是为了解决快速检测进出口水生动物及其产品中的沙门氏菌、 弗氏 枸橼酸杆菌、 奇异变形杆菌和迟。

23、缓爱德华菌， 提供一种用于同时检测沙门氏菌、 弗氏枸橼酸 杆菌、 奇异变形杆菌和迟缓爱德华菌的多重 PCR 引物及其设计方法， 所述用于同时检测沙 门氏菌、 弗氏枸橼酸杆菌、 奇异变形杆菌和迟缓爱德华菌的多重 PCR 引物在同时检测沙门 氏菌、 弗氏枸橼酸杆菌、 奇异变形杆菌和迟缓爱德华菌的应用中具有简单、 灵敏、 快速、 特异 的优点。 0014 所述用于同时检测沙门氏菌、 弗氏枸橼酸杆菌、 奇异变形杆菌和迟缓爱德华菌的 多重 PCR 引物为 ： 0015 S.spp.F1 ： 5 -GCCGGTAAACTACACGATGA-3 ； 0016 S.spp.R1 ： 5 -GAGTTACTGA。

24、ACCAACAGCT-3 ； 0017 C.freu.F1 ： 5 -AACATAGCGATGGACAACTGA-3 ； 0018 C.freu.R1 ： 5 -TTAGCAAAAATTTAAGCCGGT-3 ； 0019 P.mira.F1 ： 5 -TTTATCAATAGCCTCAAACCCT-3 ； 0020 P.mira.R1 ： 5 -TGCGTCACCCTCTAACTCATCC-3 ； 0021 E.tarda.F1 ： 5 -CTGGGCAAGTATCCGACCTC-3 ； 0022 E.tarda.R1 ： 5 -GGTAACCGTATCGGCGTAAG-3 。 0023 其中。

25、， Sspp. 为沙门氏菌的英文缩写， Cfreu. 为弗氏枸橼酸杆菌的英文缩写 ,P mira. 为奇异变形杆菌的英文缩写， Etarda. 为迟缓爱德华菌的英文缩写 ； 0024 S.spp.F1 和 S.spp.R1 为根据沙门氏菌 FimA 基因设计的上游引物 F1 和下游引物 R1 ； C.freu.F1 和 C.freu.R1 为根据弗氏枸橼酸杆菌 Idh 基因设计的上游引物 F1 和下游引 物 R1;P.mira.F1 和 P.mira.R1 为根据奇异变形杆菌 IdsC 基因设计的上游引物 F1 和下游 引物 R1 ； E.tarda.F1 和 E.tarda.R1 为根据迟缓。

26、爱德华菌 FimA 基因设计的上游引物 F1 和 下游引物 R1 ； 0025 所述沙门氏菌引物对应的 PCR 扩增片段大小为 526bp， 弗氏枸橼酸杆菌引物对应 的 PCR 扩增片段大小为 161bp， 奇异变形杆菌引物对应的 PCR 扩增片段大小为 396bp， 迟缓 说 明 书 CN 103146827 A 6 4/7 页 7 爱德华菌引物对应的 PCR 扩增片段大小为 330bp。 0026 所述用于同时检测沙门氏菌、 弗氏枸橼酸杆菌、 奇异变形杆菌和迟缓爱德华菌的 多重 PCR 引物的设计方法， 包括以下步骤 ： 0027 步骤 1， 利用引物设计软件设计同时检测沙门氏菌、 弗氏枸。

27、橼酸杆菌、 奇异变形杆 菌和迟缓爱德华菌的多重PCR引物组合， 所形成的引物组合所包含的引物碱基数为2024 个， 引物组合的熔解温度 Tm 值为 52 62， 引物组合的 GC% 为 40% 60% ； 0028 步骤 2， 对引物组合中的引物进行筛选， 保留不能合成引物二聚体的引物 ； 0029 步骤 3， 判断所保留引物的竞争优劣状态， 将步骤 2 所述保留不能合成引物二聚体 的引物的 GC% 和碱基数进行比较， 选取 GC 含量高的判断为竞争状态优势引物， 进行步骤 5 ； 否则判断为竞争状态劣势引物， 进行步骤 4 ； 0030 步骤 4， 再次筛选竞争状态劣的引物， 具体步骤为 ：。

28、 重复步骤 2， 对所保留的引物按 照步骤 3 进行再次判断 ； 0031 步骤 5， 利用 PCR 方法对竞争状态优引物进行扩增。 0032 在步骤 1 中， 所述所用的引物设计软件为 Primer Premier5.0， 所述多重 PCR 引物 组合的熔解温度 Tm 值为 60。 0033 在步骤 2 中， 所述对引物组合中的引物进行筛选的具体步骤可为 ： 对所用的引物 进行 PCR 扩增， 筛选扩增效果最好的引物组合 ； 所述不能形成引物二聚体的引物的碱基数 目为 20 24。 0034 在步骤 5 中， 所述 PCR 方法的变性温度可 94， 退火温度可为 60， 延伸温度可 72。 。

29、0035 本发明的有益效果如下 ： 0036 采用本发明建立的多重 PCR 技术同时检测沙门氏菌、 弗氏枸橼酸杆菌、 奇异变形 杆菌和迟缓爱德华菌的方法， 具有操作简便、 快速， 特异性强， 灵敏度高等优点 , 只需一个 PCR 反应就可同时检测出沙门氏菌、 弗氏枸橼酸杆菌、 奇异变形杆菌和迟缓爱德华菌， 通过 应用该方法对肉类、 蛋类、 禽类、 海产品、 乳制品等 50 份样品的检测， 同时与常规方法检测 进行比较。 多重PCR方法检测出1份沙门氏菌阳性， 与常规细菌分离鉴定结果完全吻合。 本 发明可大大加快沙门氏菌、 弗氏枸橼酸杆菌、 奇异变形杆菌和迟缓爱德华菌的检测。 0037 采用本发。

30、明多重 PCR 技术同时检测沙门氏菌、 弗氏枸橼酸杆菌、 奇异变形杆菌和 迟缓爱德华菌的方法， 具有简单、 灵敏、 快速、 特异等优点， 在食品卫生安全、 公共卫生安全 及口岸卫生检疫中都有重要意义。可应用于日常食品中四种细菌的快速检测， 同时应用于 口岸部门进出口食品中四种细菌的快速验放以及突发食物中毒事件的应急反应。 目前未见 国内外利用该技术检测食品中沙门氏菌、 弗氏枸橼酸杆菌、 奇异变形杆菌和迟缓爱德华菌 的报道。该技术可用于食品中这 4 种细菌的污染情况调查， 可有效预防和控制相关食源性 疾病的发生， 有助于建设食品安全检测与食品安全监管， 打造食品 “放心工程” ， 有利于快速 查。

31、找食品安全中毒事件的原因， 符合科技发展规划倡导的食品质量与安全控制精神， 让人 们吃上健康食物， 建设和谐社会。 附图说明 0038 图 1 为多重 PCR 反应退火温度优化。在图 1 中， M， DL1500 ； 1， 58 ； 2， 59 ； 3， 说 明 书 CN 103146827 A 7 5/7 页 8 60 ； 4， 61 ； 5， 62 ； 6， 63 ； 7， 64 ； 8， 65。 0039 图 2 为多重 PCR 引物体积优化。在图 2 中， M， DL1500 ； 1， 0.8L ； 2， 1.0L ； 3， 1.2L ； 4， 1.4L ； 5， 1.6L ； 6， 。

32、1.8L ； 7， 2.0L ； 8， 2.2L。 0040 图 3 为多重 PCR 反应镁离子优化。在图 3 中， M， DL1500 ； 1， 1.25L ； 2， 1.5L ； 3， 1.75L ； 4， 2.0L ； 5， 2.5L。 0041 图 4 为多重 PCR 体系 dNTP 优化。在图 4 中， M， DL1500 ； 1， 1.0L ； 2， 1.5L ； 3， 2.0L ； 4， 2.5L ； 5， 3.0L ； 6， 3.5L。 0042 图 5 为多重 PCR 体系灵敏度试验。在图 5 中， M， DL1500 ； 1: 阴性对照 ； 2 6: 模 板核酸 101 1。

33、06倍稀释。 0043 图 6 为多重 PCR 引物特异性试验。在图 6 中， M， DL1500 ； 1， 沙门氏菌 ； 2， 弗氏枸橼 酸杆菌 ； 3， 奇异变形杆菌 ； 4， 迟缓爱德华菌 ； 5， 绿脓杆菌 ； 6: 大肠杆菌 ； 7， 溶藻弧菌 ； 8， 副 溶血弧菌 ； 9， 阴沟肠杆菌。 具体实施方式 0044 下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细描述， 但附图和具体实施例 不应理解为是对本发明进行的限定。 0045 所述用于同时检测沙门氏菌、 弗氏枸橼酸杆菌、 奇异变形杆菌和迟缓爱德华菌的 多重 PCR 引物的设计方法， 包括以下步骤 ： 0046 a） 利用 Pri。

34、mer Premier5.0 引物设计软件设计同时扩增沙门氏菌、 弗氏枸橼酸杆 菌、 奇异变形杆菌和迟缓爱德华菌的多重引物组合 ； 0047 b） 筛选多重引物组合中 PCR 检测沙门氏菌的引物 ； 0048 c） 筛选多重引物组合中 PCR 检测弗氏枸橼酸杆菌的引物 ； 0049 d） 筛选多重引物组合中 PCR 检测奇异变形杆菌的引物 ； 0050 e） 筛选多重引物组合中 PCR 检测迟缓爱德华菌的引物 0051 f） 筛选多重 PCR 技术同时检测沙门氏菌、 弗氏枸橼酸杆菌、 奇异变形杆菌和迟缓 爱德华菌的引物组合。 0052 在步骤 a）中， 所涉及的引物为参照 GenBank 上发。

35、表 （S.spp.FimA 为 GenBank M18283， C.freu.Idh为GenBank DQ991236.1， P.mira.IdsC为GenBank EU635876， E.tarda. FimA为GenBank AF491964） 的沙门氏菌、 弗氏枸橼酸杆菌、 奇异变形杆菌和迟缓爱德华菌的 基因序列， 应用 Primer Premier5.0 设计的同时检测沙门氏菌、 弗氏枸橼酸杆菌、 奇异变形 杆菌和迟缓爱德华菌的特异性引物组合。 0053 在步骤 b） 、 c） 、 d） 和 e) 中， 经过筛选， 得出沙门氏菌引物对应的 PCR 扩增片段大小 为 526bp， 弗氏枸。

36、橼酸杆菌引物对应的 PCR 扩增片段大小为 161bp， 奇异变形杆菌引物对应 的 PCR 扩增片段大小为 396bp， 迟缓爱德华菌引物对应的 PCR 扩增片段大小为 330bp ； 具体 引物序列如下 ： 0054 S.spp.F1 ： 5 -GCCGGTAAACTACACGATGA-3 ； 0055 S.spp.R1 ： 5 -GAGTTACTGAACCAACAGCT-3 ； 0056 C.freu.F1 ： 5 -AACATAGCGATGGACAACTGA-3 ； 0057 C.freu.R1 ： 5 -TTAGCAAAAATTTAAGCCGGT-3 ； 说 明 书 CN 103146。

37、827 A 8 6/7 页 9 0058 P.mira.F1 ： 5 -TTTATCAATAGCCTCAAACCCT-3 ； 0059 P.mira.R1 ： 5 -TGCGTCACCCTCTAACTCATCC-3 ； 0060 E.tarda.F1 ： 5 -CTGGGCAAGTATCCGACCTC-3 ； 0061 E.tarda.R1 ： 5 -GGTAACCGTATCGGCGTAAG-3 。 0062 在步骤 f） 中， 多重 PCR 技术同时检测沙门氏菌、 弗氏枸橼酸杆菌、 奇异变形杆菌和 迟缓爱德华菌方法最佳反应条件的测定， 分别利用 4 对引物进行 4 种细菌多重 PCR 方法最。

38、 佳退火温度、 引物浓度、 dNTP 浓度、 Mg2+浓度、 模板浓度等的测定， 然后根据实验结果进行多 重 PCR 方法最佳循环次数的测定 ； 多重 PCR 技术同时检测沙门氏菌、 弗氏枸橼酸杆菌、 奇异 变形杆菌和迟缓爱德华菌方法的反应体系为12.5L， 具体如下 ： 10PCR Buffer1.25L， 25mmol/L MgCl22L， 10mmol/L dNTP2.5L， 20mol/L的四种细菌的上下游引物混合物添 加量依次为沙门氏菌 0.72L， 弗氏枸橼酸杆菌 0.21L， 奇异变形杆菌 0.21L， 迟缓爱德 华菌 0.54L， 5u/L Taq 酶 0.075L， ddH2。

39、O0.995L， 4 种细菌的 DNA 模板各 1L。扩增 条件为 94 4min ； 94 35s， 60 40s， 72 40s35 循环 ； 72 7min。 0063 1、 摸索细菌模板提取方法 0064 参照 精编分子生物学实验指南 采用传统方法 （酚 - 氯仿提取法） 、 直接菌体加入 法、 反复冻融法、 热裂解法和试剂盒提取法 5 种方法分别对细菌 DNA 进行提取， 并将提取的 DNA模板进行PCR扩增， 对结果进行对照， 选出最佳提取方法。 其中试剂盒提取法、 热裂解法 和传统提取法提取效果相同， 并且在这 5 种提取方法中， 这 3 种提取方法效果较好。但是传 统方法操作较。

40、为烦琐， 热裂解法提取的 DNA 纯度太低， 因此最终选择试剂盒提取法为最佳 提取方法。 0065 2、 多重 PCR 一步法技术同时检测沙门氏菌、 弗氏枸橼酸杆菌、 奇异变形杆菌和迟 缓爱德华菌方法的建立 0066 将沙门氏菌、 弗氏枸橼酸杆菌、 奇异变形杆菌和迟缓爱德华菌菌株分别接种到营 养肉汤培养基中， 过夜培养后， 按商业化试剂盒提取法制备菌体 DNA 模板溶液， 进行 PCR 扩增。反应体系为 12.5L， 具体如下 ： 10PCR Buffer1.25L， 25mmol/L MgCl22L， 10mmol/LdNTP2.5L， 20mol/L 的四种细菌的上下游引物混合物添加量依次。

41、为沙门氏菌 0.72L， 弗氏枸橼酸杆菌 0.21L， 奇异变形杆菌 0.21L， 迟缓爱德华菌 0.54L， 5u/L Taq 酶 0.075L， ddH2O0.995L， 4 种细菌的 DNA 模板各 1L。扩增条件为 94 4min ； 94 35s， 60 40s， 72 40s35 循环 ； 72 7min。取 PCR 扩增产物 5L 进行琼脂糖 （3%） 电 泳检测扩增结果。 0067 3、 多重 PCR 一步法最佳反应条件的摸索 0068 分别利用 4 对引物进行 4 种细菌多重 PCR 方法最佳退火温度、 引物浓度、 dNTP 浓 度、 Mg2+ 浓度的测定， 然后根据实验结果。

42、进行多重 PCR 方法最佳循环次数的测定。 0069 结果测得多重 PCR 一步法， 退火温度以 60最佳， 见图 1 ； 0070 引 物 加 入 梯 度 为 0.8L、 1.0L、 1.2L、 1.4L、 1.6L、 1.8L、 2.0L、 2.2L， 最终确定各引物组分浓度如下 ： 沙门氏菌上下游引物添加量为 0.72L ； 弗氏枸橼 酸杆菌上下游引物添加量为 0.21L ； 奇异变形杆菌上下游引物添加量为 0.21L ； 迟缓爱 德华菌上下游引物添加量为 0.54L， 见图 2 ； 0071 多重 PCR 一步法镁离子浓度为在 12.5L 的反应体系中， 设计 25mM Mg2+ 梯度。

43、为 说 明 书 CN 103146827 A 9 7/7 页 10 1.25、 1.5、 1.75、 2.0、 2.25L 通过比较， 最终选择 2.0L 为最佳添加量， 见图 3 ； 0072 2.5mmol/L dNTP的剂量25mM Mg2+梯度为1.0、 1.5、 2.0、 2.5、 3.0、 3.5L， 最终选 择 2.5L 作为最佳添加量， 见图 4。 0073 4、 多重 PCR 一步法灵敏度检测 0074 取 37培养 18h 的沙门氏菌、 弗氏枸橼酸杆菌、 奇异变形杆菌和迟缓爱德华菌菌 液做 10 倍梯度稀释， 稀释至 10-7， 各稀释度菌液平板计数参照国标法 （GB/T4。

44、789.2-2003) 进行细菌计数， 四种目的菌的个数为沙门氏菌 ： 8.9108cfu/ml, 弗氏枸橼酸杆菌 ： 7.2108cfu/ml, 奇异变形杆菌 ： 5.7108cfu/ml, 迟缓爱德华菌 ： 6.4108cfu/ml。选择 提取效果较好的方法提取各个不同稀释度的菌体 DNA 模板， 然后用优化好的 PCR 体系进行 灵敏度的检测。从结果中可知 , 体系的检测灵敏度为 ： 沙门氏菌 89cfu, 弗氏枸橼酸杆菌 7cfu, 奇异变形杆菌 57cfu， 迟缓爱德华菌 6cfu。见图 5。 0075 5、 多重 PCR 一步法特异性测定 0076 分别对沙门氏菌、 弗氏枸橼酸杆菌。

45、、 奇异变形杆菌、 迟缓爱德华菌、 大肠杆菌、 铜绿 假单胞杆菌、 溶藻弧菌、 副溶血弧菌、 阴沟肠杆菌进行 DNA 提取， 利用所选择的最佳条件分 别进行多重 PCR 扩增， 以检测其特异性。结果 9 个菌株中只有沙门氏菌、 弗氏枸橼酸杆菌、 奇异变形杆菌和迟缓爱德华菌能扩增出相应的片段， 分别在 161bp、 330bp、 396bp、 526bp 有 4 条扩增带， 说明本研究建立的方法特异性好。见图 6。 0077 6、 多重 PCR 一步法稳定性测定 0078 按照以上摸索的最优条件将除模板以外的 PCR 反应体系混合后分装， 放 -20中 冻存， 按照最佳反应条件定期取出检测。 检。

46、测期间将预先混合好的PCR混合物放置-20条 件下保存 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12 个月仍能扩增出和现配的 PCR 混合物一样清晰的 条带， 通过一年的检测可以看出该试剂的稳定性较好， 至少能保持一年以上。 0079 7、 多重 PCR 一步法临床检测 0080 肉类、 蛋类、 禽类、 海产品、 乳制品等 50 份样品， 用多重 PCR 技术检测， 同时与常规 方法检测进行比较。 PCR检测出1份样品为沙门氏菌阳性， 与常规细菌分离鉴定结果完全吻 合。 0081 可以理解， 很多细节的变化是可能的， 但这并不因此违背本发明的范围和精神， 任 何所属技术领域的普通技术人员对其所做的适当变化， 皆应视为不脱离本发明专利的范 畴。 说 明 书 CN 103146827 A 10 1/2 页 11 0001 0002 序 列 表 CN 103146827 A 11 2/2 页 12 序 列 表 CN 103146827 A 12 1/2 页 13 图 1 图 2 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103146827 A 13 2/2 页 14 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 103146827 A 14 。