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1、(10)申请公布号 CN 103146607 A (43)申请公布日 2013.06.12 CN 103146607 A *CN103146607A* (21)申请号 201310068240.0 (22)申请日 2013.03.05 CGMCC No.1809 2006.09.11 C12N 1/20(2006.01) C12N 1/04(2006.01) A23K 1/16(2006.01) A23K 1/18(2006.01) C12R 1/245(2006.01) (71)申请人 北京农学院 地址 102206 北京市昌平区回龙观镇北农路 7 号 (72)发明人 刘慧 谢远红 张红星 。
2、周妍 熊利霞 高秀芝 (54) 发明名称 一种产胆盐水解酶干酪乳杆菌 KL1 活菌制剂 的制备方法 (57) 摘要 本发明涉及一种产胆盐水解酶干酪乳杆菌 KL1 活菌制剂的制备方法， 适用于家禽畜牧业中 饲用功能性活菌制剂等微生态制剂的生产。本发 明利用筛选自藏灵菇中的产胆盐水解酶的干酪乳 杆菌 KL1 菌株， 经过活化、 扩大培养、 高密度发酵、 离心浓缩、 加入冻干保护剂、 预冻和冷冻干燥等工 序制备活菌制剂。本发明利用全自动发酵罐优化 发酵条件， 并利用马铃薯粉浆作为冻干保护基质， 确定冻干保护剂较优组合配方， 使 KL1 菌株的活 菌数量可达 1010CFU/g 以上， 存活率达到 8。
3、5以 上。本发明制备的活菌制剂价格低廉， 活菌含量 高， 可作为家禽饲料添加剂， 具有鸡生长速度快、 饲料用量省、 少生病等特点。 它不仅有降低鸡蛋胆 固醇的效果， 而且具有调节鸡的肠道菌群平衡作 用， 对鸡白痢有较好预防和治疗作用。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书6页 (10)申请公布号 CN 103146607 A CN 103146607 A *CN103146607A* 1/1 页 2 1. 一种利用菌株 KL1CGMCC No.1809 为干酪乳杆菌 。
4、(Lactobacillus casei) 的产胆盐 水解酶乳酸菌制备活菌制剂的方法， 其特征在于 ： 将干酪乳杆菌 KL1 扩大培养液按 3的 接种量移种至 2L 改良 MRS 发酵培养基中， 利用 5L 全自动发酵罐进行灭菌和高密度发酵， 控制发酵温度 40， 发酵液 pH6.4， 搅拌转速 55r/min， 发酵时间 20h， 得到发酵液 ； 将发酵 液于 4、 5000r/min 离心 15min， 收集得到菌泥 ； 在 600mL 冻干瓶中按离心前发酵液 1/10 体积的量， 加入马铃薯粉浆作为冻干保护基质， 再加入 3.5谷氨酸钠、 2.0脱脂奶粉和 1.5甘油的冻干保护剂与收集的。
5、菌泥， 混合均匀后， 得到浓缩发酵剂 ； 将每个冻干瓶装量 为 100mL 的浓缩发酵剂于 -34预冻 15h 至完全冻结状态， 得到预冻活菌制剂 ； 利用美国产 6L LABCONCO 真空冷冻干燥机将预冻活菌制剂于 -55、 真空度 0.16mBar 的条件下， 冻干 48h 至完全干燥状态， 得到干酪乳杆菌 KL1 冻干活菌制剂。 权 利 要 求 书 CN 103146607 A 2 1/6 页 3 一种产胆盐水解酶干酪乳杆菌 KL1 活菌制剂的制备方法 技术领域 0001 本发明涉及产胆盐水解酶干酪乳杆菌 KL1 活菌制剂的制备方法， 适用于家禽畜牧 业中饲用功能性活菌制剂等微生态制剂。
6、的生产。 背景技术 0002 本发明涉及的干酪乳杆菌 (Lactobacillus casei)KL1 是从开菲尔粒中分离纯化 出来的一种具有降低胆固醇作用的乳酸菌。 0003 “藏灵菇” (Tibetan Kefir， TK) 又称开菲尔粒， 19 世纪被人类发现。开菲尔粒起 源于俄罗斯北高加索地区， 当地牧民将牛乳或山羊乳注入羊皮口袋经自然发酵生产酸乳 酒， 其残留物再补加牛乳或山羊乳继续发酵， 经长期发酵后在皮口袋中形成不规则颗粒状 物体， 即为开菲尔粒。 此后人们便直接将开菲尔粒添加到牛乳中， 使之发酵成具有爽快酸味 和起泡性的保健饮料， 即为开菲尔。开菲尔具有多种保健功效。开菲尔中的。
7、活菌对志贺氏 菌、 沙门氏菌等病原菌的生长有强烈抑制作用 ； 其中的酵母菌对结核杆菌、 大肠杆菌有较强 抗菌活性。故开菲尔对肠道疾病、 肺结核有很好疗效。此外， 开菲尔中的乳酸菌产生的代谢 产物， 如胞外多糖、 胆盐水解酶等能有效预防肿瘤和高血脂症的发生。 0004 在藏灵菇的黏多糖基质中微生物菌相主要以乳酸菌、 酵母菌及少量醋酸菌为基础 的小生态系。本发明所用干酪乳杆菌 KL1 是从藏灵菇中分离纯化出来的一种益生乳酸菌， 可在生长代谢过程中产生大量高活力的胆盐水解酶， 经过体外牛津杯试验和动物实验证明 有降低机体血清总胆固醇含量的功效。其降低胆固醇机理是缘于干酪乳杆菌 KL1 代谢产生 的胆。
8、盐水解酶 (Bile Salt Hydrolase， BSH)。BSH 是肠道中的双歧杆菌属、 乳杆菌属、 乳球 菌属中的多种乳酸细菌在生长过程中产生的代谢产物。大量实验证明， 胆盐水解酶能在肝 肠循环中将结合胆盐分解， 产生氨基酸与溶解度较低的游离胆盐。后者能与胆固醇结合形 成沉淀复合物而排出体外， 从而降低血清总胆固醇的含量。 0005 早在 1963 年人们就证实摄取含有某种乳杆菌或双歧杆菌发酵的酸奶具有降低血 清胆固醇含量的功效。迄今为止， 国内外学者对乳酸菌降胆固醇作用机理的研究尚存在不 同观点， 主要集中于以下三点 ： (1) 乳酸菌菌体细胞直接吸收同化胆固醇 ； (2) 乳酸菌的。
9、胆 盐水解酶活性使结合态胆盐降解为游离态胆盐， 后者溶解度下降与胆固醇发生共同沉淀作 用 ； (3) 其他理论， 如吸收同化与共沉淀联合作用。 0006 目前， 国内申请各种活菌制剂制备方法的专利较多， 如江苏省微生物研究所有限 责任公司唐宝英和朱晓慧申请的 “酪酸菌活菌制剂及其制备方法” (CN101032527) 是由酪酸 菌制备的人兽两用活菌制剂 ； 上海信谊药业有限公司陈彬华和姚义强申请的 “双歧三联活 菌制剂及制备方法” (CN98110623.4) 是由两歧双歧杆菌、 嗜酸乳酸杆菌和粪链球菌冷冻干 燥活菌粉作为活性成份与保护剂组成的 ； 上海环伟生物科技有限公司张琴和陈建吕申请的 。
10、“一种复合微生物活菌制剂及其制备方法和应用” (ZL200810034746) 是利用片球菌、 酵母菌 和芽孢杆菌分别液体扩大培养， 然后按所需比例混合， 经固态发酵、 干燥、 粉碎制得的一种 复合微生物活菌制剂。但关于利用分离筛选自藏灵菇中的产胆盐水解酶的干酪乳杆菌 KL1 说 明 书 CN 103146607 A 3 2/6 页 4 制备活菌制剂， 利用自动发酵罐高密度发酵， 以及利用马铃薯粉浆保存生物制剂中活菌的 方法尚未见国内外相关文献报道和专利报道。 发明内容 0007 本发明的目的在于提供一种利用产胆盐水解酶的干酪乳杆菌 KL1 菌种制备活菌 制剂的方法。 0008 本发明是通过以。
11、下技术方案实现的 ： 0009 所述方法中， 干酪乳杆菌 (Lactobacillus casei)KL1 分离筛选自吉林、 呼和浩特 市普通家庭的藏灵菇(又称开菲尔粒)， 并已于2006年9月11日保藏于中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心， 其保藏号为 ： CGMCC No.1809( 菌株 KL1)。在含有碳酸钙和 纳他霉素的MRS选择性培养基上， 干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)KL1菌株的菌落大小 2 3mm， 表面粗糙如雪花状， 边缘不规则， 无光泽， 扁平， 灰白色， 半透明， 菌落有较高黏性 ； 个体形态呈杆状， 长短不等， 短链状排列， 有时菌体呈。
12、球形， G+无芽孢杆菌。 0010 所述方法中， 将脱脂乳试管保种的干酪乳杆菌 KL1 菌株以新鲜灭菌脱脂乳于 37 培养 12h， 至脱脂乳凝固， 如此活化 2 3 代后， 冷藏备用。 0011 所述方法中， 在上述试验的基础上， 将活化好的菌液以 2 (V/V， 体积分数 ) 的接 种量移种至改良 MRS 培养基中， 于 37培养 12h， 得到扩大培养液。 0012 所述方法中， 在上述试验结果基础上， 采用三因素三水平正交试验优化发酵条件。 将2L改良MRS培养基加入到5L全自动发酵罐中， 利用发酵罐灭菌系统于115灭菌15min， 利用冷水机将发酵罐中的培养基冷却至发酵温度。将 KL。
13、1 菌株的扩大培养液按 3 (V/V， 体积分数 ) 的接种量移种至发酵罐中， 利用发酵罐自动控温系统维持发酵温度为 40， 发 酵过程中以流加 10 (W/V， 质量体积比浓度 ) 的灭菌 Na2CO3溶液控制发酵液 pH6.4， 搅拌 转速为 55r/min， 发酵 20h， 得到发酵液。 0013 上述方法中， 改良 MRS 培养基成分 ： 葡萄糖 10g、 大豆蛋白胨 10g、 牛肉膏 10g、 酵 母干粉 5g、 柠檬酸二铵 2g、 磷酸氢二钾 2g、 乙酸钠 5g、 七水合硫酸镁 0.58g、 四水合硫酸锰 0.25g、 吐温 -801mL、 蒸馏水 1000mL， 调节 pH 为。
14、 6.4。 0014 上 述 方 法 中， 5L 发 酵 罐 由 上 海 高 机 生 物 工 程 有 限 公 司 生 产， 其 型 号 为 BIOF6005GBN。 0015 所述方法中， 在上述试验结果基础上， 将 2L 发酵液于 4条件下， 5000r/min 离心 15min， 弃上清液， 收集得到菌泥。 0016 所述方法中， 在上述试验结果基础上， 将收集的菌泥平均加入2只盛有100mL马铃 薯粉浆 ( 冻干保护基质 ) 的 600mL 冻干瓶中， 加入 3.5谷氨酸钠、 2.0脱脂奶粉和 1.5 甘油作为冻干保护剂， 混合均匀后， 得到浓缩活菌制剂。 0017 上述方法中， 采用单。
15、因素多水平试验， 确定干酪乳杆菌 KL1 的冻干保护剂较优组 合配方为(W/V， 质量体积比浓度) ： 3.5谷氨酸钠+2.0脱脂奶粉(伊利)+1.5甘油(V/ V， 体积分数 )。 0018 上述方法中， 将新鲜去皮马铃薯以九阳牌食物料理机打浆， 即成为马铃薯粉浆。 0019 所述方法中， 将浓缩活菌制剂于 -34预冻 15h 至完全冻结状态， 得到预冻活菌制 剂。 说 明 书 CN 103146607 A 4 3/6 页 5 0020 所述方法中， 在上述试验结果基础上， 利用 6L LABCONCO 真空冷冻干燥机 ( 美国 ) 将预冻活菌制剂于冻干温度 -55、 真空度 0.16mBa。
16、r 的条件下， 冻干 48h 至完全干燥状态， 得到冻干活菌制剂。 0021 所述方法中， 所得产胆盐水解酶干酪乳杆菌 KL1 活菌制剂的活菌数量可达 1010CFU/g 以上， 菌种存活率可达 85以上。此种活菌制剂由于用马铃薯粉浆作为冻干保 护基质， 使产品价格低廉， 活菌含量高， 可作为家禽饲料添加剂， 具有鸡生长速度快、 饲料用 量省、 少生病等特点。 它不仅有降低鸡蛋胆固醇的效果， 而且具有调节鸡的肠道菌群平衡作 用， 对鸡白痢有较好预防和治疗作用。 0022 上述方法得到的产胆盐水解酶干酪乳杆菌 KL1 活菌制剂及其制备方法属于本发 明保护范围。 具体实施方式 0023 下述实施例。
17、对本发明作进一步说明而不限制本发明的保护范围。 0024 下述实施例中的实验方法， 如无特别说明， 均为常规方法。 0025 下述实施例中的百分含量， 如无特别说明， 均为体积分数。 0026 实施例 1、 产胆盐水解酶干酪乳杆菌 KL1 活菌制剂的制备方法 0027 1、 菌种的活化和扩大培养 0028 将脱脂乳试管保种的干酪乳杆菌 KL1 菌株以新鲜灭菌脱脂乳于 37培养 12h， 至 脱脂乳凝固， 如此活化23代， 冷藏备用 ； 将活化好的菌液以2的接种量移种至改良MRS 培养基中， 于 37培养 12h， 得到扩大培养液。 0029 2、 发酵培养基的确定 0030 分别制备 3 种发。
18、酵培养基 ： 灭菌的牛奶培养基、 改良 MRS 培养基、 牛奶 +10胡萝 卜培养基。将活化好的菌种按 2的接种量分别移种至上述培养基中， 于 37发酵 12h 后， 采用MRS培养基以倾注平板培养法检测发酵液中的活菌数量， 每个稀释度设3次重复， 结果 见表 1。 0031 表 1 不同发酵培养基对干酪乳杆菌 KL1 活菌数量的影响 0032 0033 由表 1 可知， 以改良 MRS 培养基发酵时， 活菌数量较高， 达 2.95108CFU/mL， 采用 牛奶 +10胡萝卜培养基的活菌数量次之， 为 1.10108CFU/mL， 而采用牛奶培养基的活菌 数量最低， 故确定发酵培养基为改良 。
19、MRS 培养基。 0034 3、 正交试验优化干酪乳杆菌 KL1 发酵条件 0035 (1) 正交试验 0036 根据单因素多水平试验结果， 选择发酵温度、 发酵时间、 发酵接种量为影响因素， 设计三因素三水平 (L9(33) 正交试验。在 5L 自动发酵罐中， 以 2L 改良 MRS 为发酵培养 基， 在分批发酵过程中以流加 10 (W/V， 质量体积比浓度 ) 的灭菌 Na2CO3溶液控制发酵液 说 明 书 CN 103146607 A 5 4/6 页 6 pH6.4， 采用 MRS 培养基以倾注平板培养法检测发酵液中的活菌数量， 每个稀释度设 3 次重 复， 结果见表 2。 0037 表。
20、 2 干酪乳杆菌 KL1 发酵条件优化正交试验结果 0038 0039 由表2极差分析可知， 对发酵液的活菌数影响因素的顺序为 ： BAC， 即发酵时 间影响最大， 发酵温度次之， 发酵接种量影响最小 ； 由直观分析得出分批发酵条件的最优组 合为 A3B3C1， 即优化发酵条件为 ： 发酵温度为 40， 发酵时间为 20h， 接种量为 3。 0040 (2) 验证试验 0041 根据正交试验优化结果进行验证试验。在 5L 自动发酵罐中以 2L 改良 MRS 为发酵 培养基， 分批发酵过程中以流加10的灭菌Na2CO3溶液控制发酵液pH6.4， 以不控制发酵液 pH(自然)作为对照组。 采用MR。
21、S培养基以倾注平板培养法检测发酵液中的活菌数量， 每个 稀释度设 3 次重复， 结果见表 3。 0042 表 3 正交试验的验证试验结果 0043 0044 由表 3 可知， 在优化条件下进行发酵， 发酵液活菌数达 8.2109CFU/mL， 为优化前 (3.2108CFU/mL) 活菌数的 25.63 倍。 0045 4、 高密度发酵 0046 将 2L 改良 MRS 培养基加入 5L 自动发酵罐中， 利用发酵罐灭菌系统于 115灭菌 15min， 利用冷水机将发酵罐中的培养基冷却至发酵温度。将 KL1 菌株的扩大培养液按 3 的接种量移种至发酵罐中， 利用发酵罐控温系统维持发酵温度为 40。
22、， 发酵过程中以流加 说 明 书 CN 103146607 A 6 5/6 页 7 10的灭菌 Na2CO3溶液控制发酵液的 pH 为 6.4， 搅拌转速为 55r/min， 发酵 20h， 得到活菌 数在 109CFU/mL 以上的发酵液。 0047 5、 离心浓缩与加入保护剂 0048 将新鲜去皮马铃薯以九阳牌食物料理机打浆， 成为马铃薯粉浆 ； 按上述离心前发 酵液1/10体积的量， 取马铃薯粉浆作为冻干保护基质， 分装于600mL的冻干瓶中， 每个冻干 瓶装量为 100mL ； 取 1L 发酵液于 4、 5000r/min 离心 15min， 弃上清液， 收集菌泥， 分别加 入至冻干保。
23、护基质中 ； 按表 4 配方加入冻干保护剂， 混合均匀后， 得到浓缩活菌制剂。采用 MRS 培养基以倾注平板培养法检测冻干前的制剂活菌数量， 每个稀释度设 3 次重复， 结果见 表 4， 以确定冻干保护剂较优组合配方。 0049 表 4 不同组合的冻干保护剂对干酪乳杆菌 KL1 存活率的影响 0050 0051 由表 4 可见， 选取冻干保护剂组合为 3.5谷氨酸钠 +2.0脱脂奶粉 +1.5甘油 时， 干酪乳杆菌KL1存活率最高， 为85.43； 以3.5谷氨酸钠+2.0脱脂奶粉为冻干保护 剂时， 菌种存活率次之， 为 78.08 ； 以 3.5谷氨酸钠为冻干保护剂时， 菌种存活率最小为 4。
24、5.62。故确定干酪乳杆菌 KL1 的冻干保护剂较优组合配方为 (W/V， 质量体积比浓度 ) ： 3.5谷氨酸钠 +2.0脱脂奶粉 +1.5甘油 (V/V)。其活菌数量可达 1010CFU/g 以上， 菌种 存活率可达 85以上。 0052 6、 预冻和冻干 0053 将浓缩活菌制剂于 -34预冻 15h 至完全冻结状态， 得到预冻活菌制剂。利用 6L LABCONCO 真空冷冻干燥机 ( 美国 ) 将预冻活菌制剂于 -55、 真空度 0.16mBar 的条件下， 冻干 48h 至完全干燥状态， 得到冻干活菌制剂。采用 MRS 培养基以倾注平板培养法检测冻 干后的制剂活菌数量， 计算菌种存活。
25、率， 每个稀释度设 3 次重复， 结果见表 4。 0054 综上所述， 将干酪乳杆菌 KL1 以灭菌脱脂乳于 37培养 12h， 至脱脂乳凝固， 如此 活化23代 ； 将活化好的菌液以2的接种量移种至改良MRS培养基中， 于37培养12h， 得到扩大培养液 ； 将上述扩大培养液按 3的接种量移种至 2L 改良 MRS 发酵培养基中， 利 用5L自动发酵罐进行灭菌和高密度发酵， 控制发酵温度40， 发酵液pH6.4， 搅拌转速55r/ min， 发酵时间 20h， 得到发酵液 ； 将发酵液于 4、 5000r/min 离心 15min， 收集得到菌泥 ； 在 600mL 冻干瓶中按离心前发酵液 。
26、1/10 体积的量 (200mL)， 加入马铃薯粉浆作为冻干保护基 质， 再加入 3.5谷氨酸钠、 2.0脱脂奶粉和 1.5甘油的冻干保护剂与收集的菌泥， 混合 均匀后， 得到浓缩发酵剂 ； 将每个冻干瓶装量为 100mL 的浓缩发酵剂于 -34预冻 15h 至完 说 明 书 CN 103146607 A 7 6/6 页 8 全冻结状态， 得到预冻活菌制剂 ； 利用6L LABCONCO真空冷冻干燥机(美国)将预冻活菌制 剂于 -55、 真空度 0.16mBar 的条件下， 冻干 48h 至完全干燥状态， 得到冻干活菌制剂。 0055 所得产胆盐水解酶干酪乳杆菌KL1活菌制剂的活菌数量可达1010CFU/g以上， 菌种 存活率可达 85以上。该活菌制剂价格低廉， 活菌数量高， 可作为家禽饲料添加剂， 具有鸡 生长速度快、 饲料用量省、 少生病等特点。它不仅有降低鸡蛋胆固醇的效果， 而且具有调节 鸡的肠道菌群平衡作用， 对鸡白痢有较好预防和治疗作用。 0056 本专利所属项目 1 ： 北京市自然科学基金 “藏灵菇益生菌产生物活性物质及生理 功能的研究” 0057 项目编号 ： 5062006 0058 项目起止时间 ： 2006.01-2008.12 0059 项目负责人 ： 刘慧 说 明 书 CN 103146607 A 8 。