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1、(10)申请公布号 CN 103146751 A (43)申请公布日 2013.06.12 CN 103146751 A *CN103146751A* (21)申请号 201310042470.X (22)申请日 2013.02.04 CGMCC No ： 6652 2012.10.11 C12N 15/86(2006.01) C12N 15/66(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (71)申请人 扬州大学 地址 225009 江苏省扬州市大学南路 88 号 (72)发明人 刘秀梵 丁平云 陈雨昕 刘晓文 胡顺林 王晓泉 (74)专利代理机构 南京知识律师事务所 3220。
2、7 代理人 卢亚丽 (54) 发明名称 新城疫病毒株 rLX/H9HA 及其构建方法和应 用 (57) 摘要 本 发 明 表 达 H9 亚 型 禽 流 感 病 毒 （AvianInfluenzaVirus） 血凝素蛋白的重组新城 疫 病 毒 (NewcastleDiseaseVirus)rLX/H9HA， 保 藏号为 CGMCCNo ： 6652。本发明是利用已建立的 NDV 弱毒 LX 株的反向遗传操作平台， 将 H9N2 亚型 AIV流行株 A/Chicken/Jiangsu/WJ57/2012的HA 基因插入 LX 株基因组全长转录载体 pLX 中， 得到 含有H9N2亚型AIVHA基因。
3、的重组新城疫病毒基因 组全长 cDNA 克隆 pLX-H9HA。经转染获得的重组 病毒 rLX/H9HA 在鸡胚上具有较高的繁殖滴度， 连 续传多代仍能稳定表达 HA 蛋白， 适合于疫苗的大 规模生产， 可用于制造疫苗。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 8 页 序列表 3 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书8页 序列表3页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103146751 A CN 103146751 A *CN103146751A* 1/1 页 2 1.一株新城疫病毒(Newca。
4、stle Disease Virus) rLX/H9HA， 保藏号为CGMCC No ： 6652。 2. 权利要求 1 所述新城疫病毒 rLX/H9HA 的构建方法， 其特征在于 ： 以 NDV 弱毒 LX 株 的基因组全长转录载体 pLX 为骨架， 将 H9 亚型 AIV 流行株 A/Chicken/Jiangsu/WJ57/2012 的 HA 基因插入转录载体 pLX 的 P、 M 基因之间， 经反向遗传技术获得重组病毒 rLX/H9HA。 3. 权利要求 1 所述新城疫病毒 rLX/H9HA 用于表达 H9 亚型禽流感病毒血凝素蛋白的 应用。 权 利 要 求 书 CN 10314675。
5、1 A 2 1/8 页 3 新城疫病毒株 rLX/H9HA 及其构建方法和应用 技术领域 0001 本发明涉及应用反向遗传技术， 拯救一株以新城疫病毒为载体表达 H9 亚型禽流 感病毒血凝素蛋白的重组疫苗株 rLX/H9HA， 用于研制疫苗。 背景技术 0002 反向遗传操作技术 (Reverse genetics manipulation technique) 是指将 RNA 病毒基因组 RNA 逆转录成 cDNA， 在体外通过采用基因突变、 基因插入、 基因敲除、 基因置 换等方法人为构建新的具有感染性的病毒， 以研究病毒的基因组结构及功能和病毒宿主 之间的相互作用等 Conzelmann。
6、 KK.Reverse genetics of mononegavirales.Curr Top Microbiol Immunol.2004.283:1-41.， 也叫全长感染性 cDNA 克隆技术， 又常被称为 “病毒 拯救” 。解决了 RNA 病毒基因组难以操作这一难题， 同时为新型疫苗的研发提供了新的思 路 Nakaya T,et al.,Recombinant Newcastle disease virus as a vaccine vector. Journal of Virology,2001.75(23):p.11868-73.。 0003 新城疫病毒 (Newcastle d。
7、isease virus,NDV) 是单股、 不分节段的负链 RNA 病 毒， 属于副粘病毒科成员。按照标准的致病性指标可以将病毒分为速发型 ( 强毒 )、 中发型 ( 中等毒力 ) 和缓发型 ( 弱毒 )。基因组长度大约 15kb， 其结构为 3 -leader-NP-P-M-F-H N-L-trailer-5 ， 依次编码 6 种结构蛋白 ： 核衣壳蛋白 （Nucleocapsidprotein,NP） 、 磷蛋白 （Phosphoprotein,P） 、 基质蛋白 （Matrix protein,M） 、 融合蛋白 （Fusion protein,F） 、 血凝 素 - 神经 0004 。
8、氨酸酶蛋白 （Heamagglutinin-Neuraminidase protein， HN） 和大分子蛋白 （Large protein,L） 。 0005 禽流感病毒(Avian Influenza Virus， AIV)是禽流感(Avian influenza,A I)的 病原体， 分类上属于正黏病毒科 (Orthomyxovoridae)， A 型流感病毒属。病毒基因组由 8 个 单股负链的 RNA 片段组成， 各自编码功能性蛋白， 分别为 PB1、 PB2、 PA、 HA、 NP、 NA、 M 和 NS 基因。一般呈球形， 直径 80nm120nm， 有囊膜， 囊膜表面主要有 2 。
9、种糖蛋白纤突， 即血凝素 (Hemagglutinin,HA) 和神经氨酸酶 (Neuraminidase,NA)， 迄今已发现 16 种 HA 亚型和 9 种 NA亚型。 禽流感病毒对宿主的致病性是由多个基因决定的， 其中HA基因及其编码的蛋白尤 为重要， 在病毒吸附及穿膜过程中起着关键作用， 是重要的表面抗原， 它刺激机体产生中和 抗体， 可中和病毒的感染。 0006 H9N2 亚型禽流感病毒是危害当前养禽业的重要病原之一， 广泛存在于家禽中， 虽 然表现为低致病性， 但具有一些独有的发病特点， 主要表现为高感染率、 高发病率、 低死亡 率， 多引起雏鸡和育成鸡的隐性感染和产蛋鸡的产蛋下降。
10、且产蛋率难以恢复， 对养禽业造 成了严重的危害， 并具有重要的公共卫生意义。 0007 疫苗接种是防制新城疫和禽流感这两种疾病的主要有效手段。同灭活苗相比， 活 载体疫苗具有用量少、 成本低、 省时省力、 免疫保护时间长等优点， 可达到一针防多病的目 的。载体病毒最重要的一个特点是能被用来迅速研制出针对新发高致病性传染病的基因 说 明 书 CN 103146751 A 3 2/8 页 4 工程疫苗。NDV 除具备这一特点外， 还具有遗传稳定性好、 不存在与细胞基因组整合的可 能、 高繁殖性能、 免疫刺激性强等诸多优点， 可作为疫苗载体 Bukreyev A,Skiadopoulos M H,M。
11、urphy B R,et al.Nonsegmented negative-strand viruses as vaccine vectorsJ. Journal of Virology,2006,80(21):10293-10306.。在 NDV 基因组内插入禽流感病毒 HA 基因后的重组病毒， 可在动物体内复制并稳定持续地表达 HA 蛋白， 用此重组病毒作为 疫苗 , 可以诱导机体产生针对 AI 和 ND 的双重免疫保护力 Veits J,Wiesner D,Fuchs W,et al.Newcastle disease virus expressing H5 hemagglutinin 。
12、gene protects chickens against Newcastle disease and avian influenzaJ.Proc Natl Acad Sci USA,2006,103(21):8197-8202.Schroer D,Veits J,Grund C,et al.Vaccination with Newcastle disease virus vectored vaccine protects chickens against highly pathogenic H7 avian influenza virusJ.Avian Dis,2009,53(2):190。
13、-197.。 0008 2004 年刘晓文等从 LBM 的健康鸭群中分离到具有高滴度生长特性的 NDV 毒株 LX （遗传进化上属于ClassII基因I型） ， 并成功构建其全长克隆pLX王晓泉,刘晓文,等.新 城疫病毒弱毒骨架表达强毒 F 基因的重组病毒生物学特性研究 J. 中国动物传染病学 报 .2010,18(6):22-26.。2012 年， 古小兵等于常州武进分离到一株具有代表性的 H9N2 亚 型 AIV 流行毒株 A/Chicken/Jiangsu/WJ57/2012， 其 HA 效价为 11log2， EID50为 9.17， 热稳 定， 具有很好的抗原性。因此， 本发明以 p。
14、LX 为骨架， 构建可表达 H9 亚型禽流感病毒血凝素 蛋白的重组疫苗株， 用于应对当前 H9 亚型禽流感和新城疫的流行。 发明内容 0009 本发明的第一个目的在于提供一种以新城疫病毒为载体表达 H9 亚型禽流感病毒 血凝素蛋白的重组疫苗株， 用于制造疫苗。 0010 本发明新城疫病毒 (Newcastle Disease Virus)rLX/H9HA， 保藏号为 CGMCC No ： 6652。 0011 本发明新城疫病毒 rLX/H9HA 用于表达 H9 亚型禽流感病毒血凝素蛋白的应用。 0012 本发明利用已建立的鸭源新城疫病毒 LX 株的反向遗传操作平台， 将 H9N2 亚型 AIV。
15、WJ57株的HA基因ORF插入NDV全长转录载体pLX， 构建出重组质粒pLX-H9HA， 该重组质 粒与三个辅助质粒共转染 BSR-T7/5 细胞后， 获得了具有较高繁殖性能的表达 H9 亚型禽流 感病毒 HA 蛋白的重组疫苗株 rLX/H9HA， 适合疫苗的大规模生产。 0013 本发明的第二个目的在于提供一种表达 H9 亚型禽流感病毒血凝素蛋白的重组新 城疫疫苗株 rLX/H9HA 的构建方法， 是以 NDV 弱毒 LX 株的基因组全长转录载体 pLX 为骨架， 将 H9 亚型 AIV 流行株 A/Chicken/Jiangsu/WJ57/2012 的 HA 基因的开放阅读框插入转录载 。
16、体 pLX 的 P、 M 基因之间， 经反向遗传技术获得重组病毒 rLX/H9HA。具体包括以下步骤 ： 0014 1. 全长克隆 pLX-H9HA 的构建 0015 1） H9N2 亚型禽流感病毒 WJ57 株 HA 基因的分段克隆 0016 构建阳性质粒 pmWJ1 和 pmWJ2 ： 以 WJ57 株病毒的 cDNA 为模板， 设计两对引物分两 段扩增 HA 基因 ORF， 即 WJ1 ： 11067nt、 WJ2 ： 10681683nt， 分别克隆获得阳性质粒 pmWJ1 和 pmWJ2。 0017 2） pmWJ1 与 NDVLX 株 P 基因融合克隆的构建 说 明 书 CN 10。
17、3146751 A 4 3/8 页 5 0018 以LX株基因组cDNA为模板扩增其2350-3141nt， 以pmWJ1为模板扩增HA基因ORF 的 11067nt， 通过 Overlap PCR 将二者融合在一起并克隆得到质粒 pPWJ1。 0019 3） pmWJ2 与 NDVLX 株 M 基因融合克隆的构建 0020 分别以阳性质粒 pmWJ2 和 LX 株基因组 cDNA 为模板 PCR 扩增 H9HA 基因 ORF 的 10681683nt 和 LX 株基因组 31423635nt， Overlap PCR 将二者融合在一起， 克隆得到阳性 质粒 pWJ2M。 0021 4） 全长。
18、克隆 pLX-H9HA 的获得 0022 质粒 pPWJ1 与 pWJ2M 同时用 Aar 和 Spe 进行双酶切， 回收目的片段并连接， 构 建质粒 pPWJM ； 用 Sac 和 Avr 对质粒 pPWJM 进行双酶切后替换 pLX 的对应序列， 构建出 重组 NDV 基因组全长克隆 pLX-H9HA， 具体的构建模式见图 1。 0023 2. 重组病毒 rLX/H9HA 株的拯救 0024 将质粒 pLX-H9HA 与 pCI-NP、 pCI-P 和 pCI-L 三个真核表达质粒共转染 BSR-T7/5 细胞， 一段时间后接种 911 日龄 SPF 鸡胚， 收获得到重组病毒 rLX/H9。
19、HA。 附图说明 0025 图 1 重组质粒 pLX-H9HA 构建模式图。 0026 图 2 重组质粒 pLX-H9HA 的 Hind 酶切鉴定图 ； 0027 M ： 500bp DNA ladder marker ； 1 ： pLX-H9HA。 0028 图 3 重组病毒 rLX/H9HA 的 HA 基因 RT-PCR 产物电泳图 ； 0029 1 ： WJ-S1、 WJ-R2 引物扩增产物 ； M ： 200bp DNA ladder marker。 0030 图 4 重组病毒感染 CHO 细胞外源基因表达的检测 ； 0031 A-C 为 LX 感染组， D-F 为 rLX/H9HA 。
20、感染组。A、 D 组以抗 NDV HN 的单克隆抗体为 一抗， B、 E 组以 H9N2 亚型 AIV 高免血清为一抗， C、 F 组以 SPF 鸡阴性血清为一抗进行间接 免疫荧光检测。 具体实施方式 0032 本发明表达H9亚型禽流感病毒血凝素蛋白的重组新城疫疫苗株rLX/H9HA于2012 年10月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏单位地址 ： 北京 市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号， 中国科学院微生物研究所 ； 其保藏号 CGMCC No ： 6652， 分类 命名为 ： 新城疫病毒 (Newcastle Disease Virus) 其长度为 ： 1689。
21、6bp。 0033 构建步骤一 ： 以新城疫病毒 LX 为载体表达 H9 亚型禽流感病毒血凝素蛋白的全长 表达克隆的构建 0034 生物材料准备 ： 0035 新城疫病毒 LX 株的全长表达克隆 pLX 王晓泉 , 刘晓文 , 等 . 新城疫病 毒弱毒骨架表达强毒 F 基因的重组病毒生物学特性研究 J. 中国动物传染病学 报 .2010,18(6):22-26.， 由扬州大学农业部畜禽传染病重点开放实验室构建、 保存。 0036 H9N2 亚型禽流感病毒 A/Chicken/Jiangsu/WJ57/2012 株 （下称 WJ57 株） 由扬州大 学农业部畜禽传染病学重点开放实验室分离、 保存。
22、。 0037 pGEMT-easy 载 体 ：购 自 Promega 公 司 ； AMV 反 转 录 酶、 High fidelity 说 明 书 CN 103146751 A 5 4/8 页 6 DNApolymerase、 T4 DNA 连接酶、 Agarose Gel DNA ExtractionKit 购自 Roche 公司 ； 转染 试剂SuperFect和质粒抽提试剂盒(QIAprep Spin MiniPrep Kit)为QIAGEN公司产品 ； 其 余常规试剂均为国产分析纯。 0038 1、 H9N2 亚型禽流感病毒 HA 基因的序列分析与基因突变 0039 提 取 H9N2 。
23、亚 型 禽 流 感 病 毒 WJ57 株 的 总 RNA，并 用 12nt 随 机 引 物 （5 -AGCAAAAGCAGG-3 （SEQ ID NO.1） ） 进行 RT-PCR 反应。序列分析发现需要先对其 ORF 的 31 和 1063 位两个 Spe 酶切位点进行沉默突变。设计 2 对引物， 分别用于扩增 HA 基因 ORF 的 11076nt、 10681683nt。 0040 两对突变引物分别是 ： 0041 WJ-S1 ： 5 -TTAGAAAAAATACGGGTAGAAGCCACCATGGAGACAGTATCACTA 0042 ATAACTATACTCTGTAGCAA-3 （S。
24、EQ ID NO.2） 0043 WJ-R1 ： 5 -TATTCACCTGCATCGACAGCCCTGACCAACCTCCCTCTAT-3 （SEQ ID NO.3） 0044 WJ-S2 ： 5 -TATTCACCTGCATCGTGTTGCTGGTTGGTATGGATT-3 （SEQ ID NO.4） 0045 WJ-R2 ： 5 -GTTTGCAGATTATATACAAATGTTGCATCT-3 （SEQ ID NO.5） 0046 突变碱基以斜体标注。以上引物由上海生物工程有限公司合成。 0047 PCR 反应 ： 以反转录的 cDNA 为模板配制如下 PCR 反应体系 ： 0048 。
25、0049 0050 PCR 反应循环参数 ： 94预变性 3min， 94 35s， 55 1min， +0.5 /cycle， 72延 伸， 延伸时间为 1min/kb， 20 个循环后 72延伸 10min， 4保存。 0051 用引物 WJ-S1 和 WJ-R1 扩增 HA 基因 ORF 的 11076nt 区域， PCR 产物经回收纯化 后分别与pGEMT-easy载体相连， 转化至大肠杆菌DH5感受态细胞， 提取质粒， 阳性质粒命 名为 pmWJ1 ； 用引物 WJ-S2 和 WJ-R2 扩增其 10681683nt 区域， PCR 产物经回收纯化后分别 与 pGEMT-easy 载。
26、体相连， 转化至大肠杆菌 DH5 感受态细胞， 提取质粒， 阳性质粒命名为 pmWJ2。 0052 2、 融合克隆 pPWJ1 的构建 0053 以 pLX 为模板扩增 LX 株基因组部分 P 基因 2350-3141nt， 以 pmWJ1 为模板扩增 HA 基因 ORF 的 11067nt。PCR 产物分别命名为 P 和 WJ1。 0054 用于扩增的两对引物分别是 ： 0055 PS ： 5AAAGCCGCGGAAACAGCC3（SEQ ID NO.6） 0056 PR ： 5GGTGGCTTCTACCCGTATTTTTTCTA AGAGGAGCTTGGTGCAGATACCGTG3（SEQ。
27、 ID NO7） 说 明 书 CN 103146751 A 6 5/8 页 7 0057 WJ-S1 ： 5 -TTAGAAAAAATACGGGTAGAAATGGAGACAGTATCACTAATAACTATACT CTGTAGCAA-3 （SEQ ID NO.2） 0058 WJ-R1 ： 5 -TATTATCGACAGCCTGACCAACCTCCCTCTAT-3 （SEQ ID NO.3） 0059 突变碱基以斜体标注， 酶切位点以波浪线标注， ACgggTAgAA 为 NDV 转录起始信号 序列， TTAgAAAAAA 为 NDV 转录终止信号序列， Kozak 序列由双下划线标注， 重叠。
28、部分以下划 线标注。以上引物由上海生物工程有限公司合成。 0060 PCR 反应 ： 以 pLX 或 pmWJ1 为模板配制如下 PCR 反应体系 ： 0061 0062 0063 PCR 反应循环参数 ： 94预变性 3min， 94 30s， 58 1min， 72延伸， 延伸时间为 1min/kb， 20 循环后 72延伸 10min， 4保存。 0064 用引物 PS 和 WJ-R1 将上述两个扩增产物通过 Overlap PCR 融合在一起， Overlap PCR 反应体系及条件 ： 0065 0066 Overlap PCR反应循环参数 ： 94预变性3min ； 9430s， 。
29、58退火1min， +0.5/ cycle， 72延伸 2min， 18 个循环之后再 94 40s， 64退火 1min， 72延伸 2min， 7 个循环 后 72延伸 10min， 4保存。 0067 Overlap PCR产物经回收纯化后克隆入pGEMT-easy载体。 提取的质粒送南京金斯 瑞生物科技有限公司进行测序验证， 阳性质粒命名为 pPWJ1。 0068 3. 融合克隆 pWJ2M 的构建 0069 分别以阳性质粒 pmWJ2 和 pLX 为模板 PCR 扩增 H9HA 基因 ORF 的 10681683nt 和 说 明 书 CN 103146751 A 7 6/8 页 8 。
30、LX 株基因组 31423635nt， PCR 产物分别命名为 WJ2 和 M。 0070 用于扩增的引物序列如下 ： 0071 WJ-S2 ： 5 -TATTATCGTCGTTGCTGGTTGGTATGGATT-3 0072 WJ-R2 ： 5 -GTTTGCAGATTATATACAAATGTTGCATCT-3 0073 MS ： 5-ATTTGTATATAATCTGCAAACCCAAGGTCCAAC-3（SEQ ID NO.8） 0074 MR ： 5-TTACCACCATAGTGAGGCAGG-3（SEQ ID NO.9） 0075 酶切位点以斜体标注， 重叠部分以下划线标注。以上引物由。
31、上海生物工程有限公 司合成。 0076 PCR 反应 ： 以 pmWJ2 或 pLX 为模板配制如下 PCR 反应体系 ： 0077 0078 0079 PCR 反应循环参数 ： 94预变性 4min， 94 40s， 59退火 1min， 72延伸 1min， 15 个循环之后再 94 40s， 63退火 1min， 72延伸 1min， 10 循环后 72延伸 10min， 4保 存。 0080 用引物 WJ-S2 和 MR 将以上两个扩增片段通过 Overlap PCR 相连， Overlap PCR 反 应体系及条件 ： 0081 0082 Overlap PCR 反应循环参数 ： 9。
32、4预变性 3min， 94 30s， 58退火 1min， +0.5 / cycle， 72延伸 2min， 18 循环之后再 94 40s， 60退火 1min， 72延伸 2min， 6 循环后 72延伸 10min， 4保存。 0083 Overlap PCR产物经回收纯化后克隆入pGEMT-easy载体。 提取的质粒送南京金斯 瑞生物科技有限公司进行测序验证， 阳性质粒命名为 pWJ2M。 说 明 书 CN 103146751 A 8 7/8 页 9 0084 4、 全长克隆 pLX-H9HA 的获得 0085 质粒 pPWJ1 与 pWJ2M 同时用 Aar 和 Spe 进行双酶切，。
33、 回收目的片段并连接， 构 建质粒 pPWJM ； 用 Sac 和 Avr 分别对质粒 pPWJM 与 pLX 进行双酶切， 回收目的片段后连 接， 构建质粒 pLX-H9HA， 并用 Hind 进行酶切鉴定， 阳性克隆保存于 -70（见图 2） 。 0086 以上各工具酶购自 Thermo Fisher Scientific。 0087 步骤二 ： 重组病毒 rLX/H9HA 株的拯救 0088 生物材料准备 ： 0089 可稳定表达T7RNA聚合酶的BSR-T7/5细胞 ： 由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 步志高研究员惠赠。 0090 真核表达质粒 pCI-NP、 pCI-P、 pCI-。
34、L 胡顺林 , 张艳梅 , 孙庆等 . 鹅源新城疫病毒 拯救体系的建立 J. 微生物学通报 .2007,34(3):426-429. ： 由扬州大学农业部畜禽传染 病学重点开放实验室构建、 保存。 0091 SPF 种蛋购自北京梅里亚公司， 在扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室 孵化。 0092 1、 重组病毒的拯救 0093 转 染 时 所 用 质 粒 (pLX-H9HA、 pCI-NP、 pCI-P 和 pCI-L) 均 采 用 QIAprep SpinMiniPrepKit 抽提。将 pCI-NP、 pCI-P 和 pCI-L3 个辅助质粒与重组 NDV 基因组全长 cDNA 克隆。
35、 pLX-H9HA 共转染 BSR-T7/5 细胞， 18-24h 后加入终浓度为 10%SPF 胚尿囊液， 60h 后将转染样品反复冻融 3 次后， 收获并接种 911 日龄 SPF 鸡胚， 收集鸡胚尿囊液， 按 OIE 标 准测定血凝效价， 即获得表达 H9 亚型禽流感病毒血凝素蛋白的重组病毒 rLX/H9HA。 0094 在鸡胚上传代三次后， 所测 HA 效价为 9log2， 与母本毒株 LX 相比下降了 1 个滴度。 0095 2、 RT-PCR 验证获救病毒 rLX/H9HA 0096 将 红 细 胞 凝 集 试 验 (hemagglutination,HA) 和 红 细 胞 凝 集。
36、 抑 制 (hemagglutination inhibition,HI) 检测均为阳性的尿囊液在 SPF 鸡胚上传 3 代后， 收集 尿囊液抽提病毒的总 RNA， 用 6nt 随机引物反转录成 cDNA 后用于 RT-PCR 反应。 0097 用引物WJ-S1和WJ-R2扩增H9的HA基因， 长度约为1700bp， 回收目的片段进行测 序鉴定， 扩增片段的测序结果显示毒株 WJ57 的 HA 基因成功插入 （见图 3） 。 0098 用于扩增重组病毒 rLX/H9HA 中 HA 基因的引物序列为 ： 0099 WJ-S1 ： 0100 5 -TTAGAAAAAATACGGGTAGAAGCCA。
37、CCATGGAGACAGTATCACTAATAACTATACTGCTGGTAGCA A-3 0101 WJ-R2 ： 5 -GTTTGCAGATTATATACAAATGTTGCATCT-3 0102 步骤三 ： 重组病毒的生物学特性鉴定 0103 生物材料准备 ： 0104 SPF 种蛋购自北京梅里亚公司， 在扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室 孵化。 0105 抗 NDV HN 蛋白特异性单克隆抗体 6B1 胡顺林 . 基因型新城疫病毒单克隆抗体 的研制、 鉴定与初步应用D.扬州 ： 扬州大学.2004.、 H9N2亚型AIV高免血清由扬州大学 农业部畜禽传染病学重点开放实验室制备、 。
38、保存。 说 明 书 CN 103146751 A 9 8/8 页 10 0106 FITC 标记的羊抗鼠 IgG、 FITC 标记的兔抗鸡 IgG( 以下合称 FITC 标记的 IgG) ： 购 自 Sigma 公司。 0107 1、 MDT 与 ICPI 的测定 0108 鸡胚平均致死时间 (mean death time,MDT) 测定 ： 用灭菌生理盐水分别连续 10 倍 （10-3、 10-410-7） 递增稀释重组病毒 rLX/H9HA， 每个稀释度接种 5 只 9 11 日龄 SPF 鸡胚， 37孵育 5d， 按 OIE 标准方法计算病毒的 MDT。结果 ： 病毒 5 个稀释度的接。
39、种鸡胚在 120h 内没有发生死亡， 说明该毒株的 MDT 值大于 120h。 0109 雏鸡脑内接种致病指数(intracerebral pathogenicity index,ICPI)测定 ： 重组 病毒的尿囊液以灭菌生理盐水 10 倍稀释后经脑内接种 10 只 1 日龄的 SPF 鸡， 按 OIE 标准 方法计算病毒的 ICPI。尿囊液经脑内接种 1 日龄 SPF 鸡后， ICPI 的测定值仅为 0.15， 表明 获救病毒的毒力完全符合弱毒株的标准。 0110 2、 细胞感染试验 0111 将重组病毒rLX/H9HA和母本病毒LX分别作10-3稀释后接种鸡胚成纤维细胞， 48h 后， 。
40、分别以抗 NDVHN 蛋白特异性单克隆抗体 6B1、 H9N2 亚型 AIV 高免血清为一抗， FITC 标记 的 IgG 为二抗， 进行 IFA 试验。重组病毒感染细胞孔内均能观察到特异性荧光信号 ； 母本病 毒感染细胞孔用抗 NDVHN 蛋白特异性单克隆抗体为一抗作用能检测到荧光， 其他则不能检 测到荧光。重组病毒和母本病毒感染细胞以 SPF 阴性血清为一抗的 IFA 结果为阴性 （见图 4） 。 0112 3、 重组病毒的免疫原性试验 0113 重组病毒rLX/H9HA以106EID50滴鼻点眼免疫3周龄SPF鸡， 免疫后3周用WJ57株 配制四单位抗原检测抗体水平， 平均 HI 滴度可以达到 6log2以上。 说 明 书 CN 103146751 A 10 1/3 页 11 0001 0002 序 列 表 CN 103146751 A 11 2/3 页 12 0003 序 列 表 CN 103146751 A 12 3/3 页 13 序 列 表 CN 103146751 A 13 1/2 页 14 图 1 说 明 书 附 图 CN 103146751 A 14 2/2 页 15 图 2 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103146751 A 15 。