肠道病毒71型病毒株、疫苗、动物模型建立方法.pdf

本发明提供一种肠道病毒71型(Enterovirus 71)病毒株、疫苗、动物模型建立方法。本发明病毒株的保藏编号为CGMCC No.5539。本发明所提供的EV71型病毒株具有如下优点：毒力强，可用于EV71疫苗或药物的评价。本发明所提供的用于评价肠道病毒71型疫苗效果的动物模型的建立方法能够提供稳定的动物模型，为肠道病毒71型疫苗研制和抗病毒药物的筛选提供了基础。由本发明的EV71型病毒株制备的疫苗符合《中国药典(三部)2010年版》的有关要求，并且具有有效的免疫活性和攻毒保护能力。该疫苗的制备方法的生产过程易于控制、重复性好、适合规模化生产、质量稳定。

权利要求书一种肠道病毒71型(Enterovirus 71)病毒株，所述病毒株的保藏编号为CGMCC No.5539。
根据权利要求1所述的病毒株，其中所述病毒株的全基因序列为SEQ ID No.：2所示的序列。
根据权利要求1所述的病毒株在制备用于预防和/或治疗手足口病的药物中的用途。
根据权利要求3所述的用途，其中，所述药物为疫苗。
一种用于预防和/或治疗手足口病的疫苗，其中，所述疫苗含有：1)经灭活的权利要求1或2所述的病毒株；以及任选的2)佐剂。
根据权利要求5所述的疫苗，其中，以病毒蛋白含量计，所述病毒株的含量为1～4μg/ml；并且/或者所述佐剂为氢氧化铝，并且所述氢氧化铝的含量为0.5～1.5μg/ml。
一种根据权利要求5或6所述的疫苗的制备方法，其包括：将权利要求1或2所述的病毒株进行培养，并进行灭活、纯化，从而制备得到所述的疫苗。
一种制备抗体或杂交瘤细胞或抗血清的方法，其中，以根据权利要求1或2所述的病毒株或权利要求5或6所述的疫苗为免疫原进行制备。
根据权利要求8的制备方法得到的制备抗体或杂交瘤细胞或抗血清。
根据权利要求1或2所述的病毒株在建立用于评价肠道病毒71型疫苗效果的动物模型中的用途。
根据权利要求10所述的用途，所述病毒株用作攻击毒株。
一种用于评价肠道病毒71型疫苗效果的动物模型的建立方法，其包括：
1)将权利要求1所述的病毒株进行培养，得到病毒培养液；以及
2)将步骤1)所得的病毒培养液施予动物，从而制备得到所述的动物模型；
其中，所述的动物为小鼠。
根据权利要求12所述的制备方法，其中，所述的小鼠为1‑14日龄的乳鼠。
根据权利要求13所述的制备方法，其中，所述的乳鼠是通过如下方法获得的：将每只成年雌鼠与1只成年雄鼠交配，对所述雌鼠在所述交配前采用待评价的肠道病毒71型疫苗进行初次免疫、在所述交配后2‑3周采用该肠道病毒71型疫苗进行加强免疫，并在所述雌鼠怀孕后将其与所述雄鼠分窝，将所述雌鼠产下的乳鼠培养1‑14天。

说明书肠道病毒71型病毒株、疫苗、动物模型建立方法
技术领域
本发明属于疫苗生产领域，具体而言，涉及一种肠道病毒71型病毒株及其用途、由该肠道病毒71型病毒株制备的疫苗和制备方法、和用于评价肠道病毒71型疫苗效果的动物模型的建立方法。
背景技术
手足口病(Hand，foot and mouth disease，HFMD)是由肠道病毒感染引起的一种急性传染病，多发生于5岁以下的婴幼儿，以手、足、口腔等部位皮肤粘膜的皮疹、疱疹、溃疡为典型表现，少数患者可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑脊髓膜炎、脑炎等并发症。引发手足口病的肠道病毒有20多种(型)，其中以柯萨奇病毒A16型(CA16)和肠道病毒71型(以下称为EV71)最为常见，其中EV71不仅引起手足口病，而且可引起严重中枢神经系统并发症，如脑膜炎、脑炎、急性迟缓性瘫痪等。研究发现，感染重症病例中，EV71感染占90％以上。
我国于1981年上海首次报道手足口病，此后，北京、河北、天津、福建、吉林、山东、湖北、青海和广东等十几个省份均有本病报道。1983年天津发生Cox A16引起的手足口病爆发，1986年再次爆发。中国大陆首次发现EV71型感染是在1987年冬季湖北省的一次手足口病流行期间。2010年，全国共报告手足口病病例1593437例，死亡839余人。
目前尚无针对预防该病的特异性疫苗、药物等。其中，在预防该病的特异性疫苗的研制过程中，肠道病毒71型病毒疫苗属于预防人类传染病的新型疫苗，我国台湾地区以及新加坡等国家曾先后开始进行相关疫苗的研究，包括灭活疫苗、重组疫苗、多肽疫苗和减毒活疫苗等，但均停留在临床前研究阶段。目前，EV71疫苗的研究在世界范围内仍未取得突破，但血清流行病学调查资料显示，人群感染后产生的EV71中和抗体可有效预防EV71病毒的再次感染，为EV71疫苗的研发奠定了一定的免疫学基础。由于不同基因型毒株间、相同基因型不同基因亚型毒株间、甚至相同基因亚型不同毒株间抗原性和免疫原性可能存在差异，从而导致不同毒株的交叉保护水平可能存在差异，对疫苗株的选择提出了严峻的挑战；虽然EV71感染已流行多年，但近年来EV71感染多次爆发、并且导致较多的重症甚至死亡病例，其致病机制仍不清楚；这些均使EV71疫苗的研制存在一定的困难。
此外，国内外肠道病毒71型疫苗的研发还受困于稳定的动物模型，因此建立成熟稳定的动物模型显得尤为重要。
发明内容
为解决上述现有技术中存在的问题，本发明提供了一种肠道病毒71型病毒株及其用途。
具体而言，本发明提供：
(1)一种肠道病毒71型(Enterovirus 71)病毒株，所述病毒株的保藏编号为CGMCC No.5539。
(2)根据(1)所述的病毒株，其中所述病毒株的全基因序列为SEQ ID No.：2所示的序列。
(3)根据(1)所述的病毒株在制备用于预防和/或治疗手足口病的药物中的用途。
(4)根据(3)所述的用途，其中，所述药物为疫苗。
(5)一种用于预防和/或治疗手足口病的疫苗，其中，所述疫苗含有：1)经灭活的(1)或(2)所述的病毒株；以及任选的2)佐剂。
(6)根据(5)所述的疫苗，其中，以病毒蛋白含量计，所述病毒株的含量为1～4μg/ml；并且/或者所述佐剂为氢氧化铝，并且所述氢氧化铝的含量为0.5～1.5μg/ml。
(7)一种根据(5)或(6)所述的疫苗的制备方法，其包括：
将(1)或(2)所述的病毒株进行培养，并进行灭活、纯化，从而制备得到所述的疫苗。
(8)一种制备抗体或杂交瘤细胞或抗血清的方法，其中，以根据(1)或(2)所述的病毒株或(5)或(6)所述的疫苗为免疫原进行制备。
(9)根据(8)的制备方法得到的制备抗体或杂交瘤细胞或抗血清。
(10)根据(1)或(2)所述的病毒株在建立用于评价肠道病毒71型疫苗效果的动物模型中的用途。
(11)根据(10)所述的用途，所述病毒株用作攻击毒株。
(12)一种用于评价肠道病毒71型疫苗效果的动物模型的建立方法，其包括：
1)将(1)所述的病毒株进行培养，得到病毒培养液；以及
2)将步骤1)所得的病毒培养液施予动物，从而制备得到所述的动物模型；
其中，所述的动物为小鼠。
(13)根据(12)所述的制备方法，其中，所述的小鼠为1‑14日龄的乳鼠。
(14)根据(13)所述的制备方法，其中，所述的乳鼠是通过如下方法获得的：将每只成年雌鼠与1只成年雄鼠交配，对所述雌鼠在所述交配前采用待评价的肠道病毒71型疫苗进行初次免疫、在所述交配后2‑3周采用该肠道病毒71型疫苗进行加强免疫，并在所述雌鼠怀孕后将其与所述雄鼠分窝，将所述雌鼠产下的乳鼠培养1‑14天。
本发明与现有技术相比具有以下优点和积极效果：
1.本发明提供了两种新的肠道病毒71型病毒株(EV71病毒株1和2)，以及使用该病毒株所生产的用于预防手足口病的疫苗1和2(分别为EV71病毒株1和2所制备)，所生产的疫苗1和2均符合《中国药典(三部)2010年版》的有关要求，并且具有有效的免疫活性和攻毒保护能力。本发明所述的病毒株(EV71病毒株1和2)细胞适应性好、产量高、交叉免疫原性好；采用本发明所述的方法制备的EV71疫苗1或EV71疫苗2免疫动物后，能刺激机体产生高效价的特异性血清中和抗体，动物免疫后，采用致病性较强的毒株进行病毒攻击，动物各项指标正常，且不出现临床症状，表明该疫苗具有较好的保护作用。
2.本发明所提供的所述疫苗1或2的制备方法，具有以下优点：生产过程易于控制、重复性好、适合规模化生产、质量稳定。
3.本发明所提供的EV71病毒株2还可用作攻毒用病毒株，其具有如下优点：毒力强，能使乳鼠出现明显的麻痹、瘫痪甚至死亡等典型的EV71感染症状，可用于EV71疫苗或药物的评价。
4.本发明还提供了用于评价肠道病毒71型疫苗效果的动物模型的建立方法，该方法能够提供稳定的动物模型，为肠道病毒71型疫苗研制和抗病毒药物的筛选提供了基础。
保藏信息：
关于保藏编号为CGMCC No.5540的肠道病毒71型病毒株：该病毒的分类命名为人肠道病毒71型(Human Enterovirus 71)，拉丁文学名为Enterovirus 71，是于2011年12月5日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)进行的保藏，保藏编号为CGMCC No.5540。
关于保藏编号为CGMCC No.5539的肠道病毒71型病毒株：该病毒的分类命名为人肠道病毒71型(Human Enterovirus 71)，拉丁文学名为Enterovirus 71，是于2011年12月5日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)进行的保藏，保藏编号为CGMCC No.5539。
附图说明
图1为本发明EV71病毒株1在Vero细胞上连续传代滴定结果图；
图2为由本发明一个实施方案建立的乳鼠模型经本发明疫苗1免疫后的乳鼠腹腔攻毒生存率曲线图(A)、乳鼠脑腔攻毒生存率曲线图(B)；
图3为采用本发明EV71病毒株2颅内攻击后乳鼠生存率曲线图；
图4为采用本发明EV71病毒株2腹腔攻击后乳鼠生存率曲线图；
图5为采用本发明EV71病毒株2攻击后乳鼠发病表现图，其中A图为正常对照组正常乳鼠，B图为病毒组后肢麻痹、瘫痪乳鼠；
图6为由本发明另一个实施方案建立的乳鼠模型经本发明疫苗1免疫后的乳鼠腹腔攻毒生存率曲线图(A)、颅内攻毒生存率曲线图(B)；
图7为经本发明疫苗1免疫后中和抗体水平图；
图8为本发明疫苗1接种组与未接种疫苗对照组组织中EV71RNA水平比较图，其中横坐标中C1～C10代表未接种疫苗组中的10个个体，即10只未接种疫苗的乳鼠；P1～P10代表疫苗接种组中的10个个体，即10只接种疫苗的乳鼠；
图9为由本发明一个实施方案建立的乳鼠模型经本发明疫苗2免疫后的乳鼠腹腔攻毒生存率曲线图(A)、颅内攻毒生存率曲线图(B)。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述并参照附图对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
在本文中，所述的“攻毒用毒株”是指能引起动物发病的攻击毒株。在本发明中EV71病毒株2既可用作攻毒株，也可经灭活后用于制备疫苗。
本发明人筛选出了可用于预防手足口病的肠道病毒71型病毒株1和2，并在此基础上，开发了用于预防手足口病的疫苗。经实验证明，本发明疫苗1和2具有有效的免疫活性和攻毒保护能力。本发明人通过选育与纯化肠道病毒71型疫苗株1和2，建立并检定毒种三级种子批库。并用(例如)生物反应器(发酵罐)、细胞工厂或WAVE生物反应器培养Vero细胞或人二倍体细胞，在细胞长成致密单层或细胞在微载体上生长至合适密度时，接种病毒，36±1℃培养4‑7天后收获病毒悬液，经过浓缩、纯化灭活等步骤后，制备出疫苗原液。可经过换算稀释加入诸如Al(OH)3之类的佐剂吸附配制成含佐剂半成品，也可不加入佐剂配制成不含佐剂半成品。分装0.5ml/支即可为肠道病毒71型灭活疫苗1和2。
具体而言，本发明的又一方面提供一种肠道病毒71型病毒株(EV71病毒株1)。该病毒的分类命名为人肠道病毒71型(Human Enterovirus 71)，拉丁文学名为Enterovirus 71，是于2011年12月5日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)进行的保藏，保藏编号为CGMCC No.5540。所述病毒株的全基因序列(cDNA序列)可如SEQ ID No.：1所示。
本发明还提供一种肠道病毒71型病毒株(EV71病毒株2)。该病毒的分类命名为人肠道病毒71型(Human Enterovirus 71)，拉丁文学名为Enterovirus 71，是于2011年12月5日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)进行的保藏，保藏编号为CGMCC No.5539。所述病毒株的全基因序列(cDNA序列)可如SEQ ID No.：2所示。
EV71病毒株1和2均可用于制备预防和/或治疗手足口病的药物。优选地，所述药物为疫苗。
本发明的另一个方面提供一种用于预防和/或治疗手足口病的疫苗，其含有经灭活的EV71病毒株1(对应本发明疫苗1)或含有经灭活的EV71病毒株2(对应本发明疫苗2)。本发明疫苗1或2可含有佐剂，也可以不含有佐剂。
本领域技术人员可以根据需要确定EV71病毒株1或EV71病毒株2在本发明的疫苗1或2中的含量。优选地，以蛋白含量计，EV71病毒株1或EV71病毒株2的含量为1～4μg/ml。蛋白含量可采用(例如)BCA方法(可参见以下文献中公开的方法：李海玲，彭书明，李凛，张雪梅，4种常用蛋白浓度测定方法的比较.中国生化药物杂志2008，29(4)：277‑282.)进行检测。
优选地，本发明的疫苗中含有佐剂。佐剂可以为本领域公知的常用的佐剂，例如：氢氧化铝佐剂、CpG佐剂等。本领域技术人员可以根据需要确定佐剂在本发明的疫苗中的含量。优选地，佐剂为氢氧化铝。并且优选地，所述氢氧化铝的含量为0.5～1.5μg/ml。
优选地，每剂疫苗为0.1～2ml；更优选地，每剂疫苗为0.5ml。
本发明的另一个方面提供疫苗的制备方法，其包括：将EV71病毒株1或EV71病毒株2进行培养，并进行灭活、纯化，从而制备得到所述的疫苗。优选地，所述纯化在所述灭活之前进行并且/或者在所述灭活之后进行。
优选地，本发明的制备方法包括：
1)提供Vero细胞或人二倍体细胞；
2)在步骤1)得到的Vero细胞或人二倍体细胞中，对EV71病毒株1或EV71病毒株2进行培养，从而得到病毒悬液；
3)将步骤2)得到的病毒悬液进行纯化并灭活，从而得到疫苗原液；以及
4)将步骤3)得到的疫苗原液进行稀释，从而得到所述的疫苗。
在本文中，Vero细胞是指非洲绿猴肾传代细胞，可得自ATCC公司；人二倍体细胞来源于正常人胎儿组织，可得自ATCC公司。在进行病毒接种前，可将Vero细胞或人二倍体细胞在细胞工厂或生物反应器中进行培养。可在细胞长成合适密度的致密单层或细胞在微载体上生长至合适密度时，接种病毒。其中，所述微载体是细胞培养中所使用的一类无毒性、非刚性、密度均一、通常是透明的小颗粒，能使依赖贴壁的细胞在悬浮培养时贴附在颗粒表面单层生长，从而增加细胞贴附生长的面积，有利于细胞的大规模培养和收集。
在本文中，细胞工厂是指一种细胞培养的耗材，它和细胞培养皿、瓶类似，均用于细胞培养，只是细胞工厂用于较大规模的细胞培养，可得自(例如)NUNC公司；生物反应器是指动物细胞体外培养时，为细胞提供的一个适宜的生长环境的容器，使之快速增殖并达到较高密度，常用于大规模、高密度细胞培养，其可得自(例如)SARTORIS公司。
优选地，在步骤2)中，所述的培养在生物反应器(发酵罐或WAVE生物反应器)或细胞工厂中进行。优选地，所述的培养在生物反应器中进行，培养条件为温度36±1℃、pH值7.0±0.5、溶解氧浓度20～80％、转速20～80rpm。培养可进行4‑7天。
在步骤3)中，可以先进行纯化、再进行灭活，也可以先进行灭活、再进行纯化。
纯化方式可为本领域常用的方法，如超滤浓缩及层析，层析可包括：凝胶过滤层析(例如采用Sepharose 4FF、Sepharose 6FF、或Sephacryl S400介质的层析)和/或离子交换层析(如阴离子交换层析(如采用DEAE‑Sepharose FF介质的层析))。
灭活方式可为本领域常用的方法，如采用甲醛作为灭活剂，按1∶1500‑1∶4000比例于34‑38℃灭活2‑7天。也可用β‑丙内酯灭活，按1∶2000‑1∶4000比例于2‑8℃灭活2‑3天，然后37℃水解2‑4小时。
优选地，在步骤4)中，用氢氧化铝溶液对步骤3)得到的疫苗原液进行稀释，使得在所得疫苗中，以病毒蛋白含量计，所述病毒株的含量为1～4μg/ml，并且所述氢氧化铝的含量为0.5～1.5μg/ml。
本发明的另一个方面提供以EV71病毒株1、2或本发明的疫苗1或2为免疫原制备的抗体(例如，多克隆抗体或单克隆抗体或其功能性片段)或杂交瘤细胞或抗血清。可以根据本领域常用的方法，来制备抗体或杂交瘤细胞或抗血清。例如，家兔背部多点皮下注射法制备抗血清及细胞融合法制备杂交瘤细胞，辛酸沉淀法及亲和层析法纯化多克隆或单克隆抗体。
可以采用本领域已知的用于评价肠道病毒71型疫苗效果的动物模型建立方法(例如中国专利申请公开No.CN 101982181A或CN101978970A中所披露的方法)来建立动物模型，并评价本发明的疫苗1或2的效果。本发明的疫苗1或2的效果还可以采用由本发明所述的方法建立的动物模型来进行评价。
本发明人提供了一种用于评价肠道病毒71型疫苗效果的稳定的动物模型建立方法，为肠道病毒71型疫苗研制和抗病毒药物的筛选提供了基础。为此，本发明提供了EV71病毒株2作为攻毒用毒株，所述攻毒用毒株具有如下特点：毒力强，能使乳鼠出现明显的麻痹、瘫痪甚至死亡等典型的EV71感染症状，可用于EV71疫苗或药物的评价。
EV71病毒株2可用于建立用于评价肠道病毒71型疫苗效果的动物模型。其中，EV71病毒株2可用作攻击毒株。
本发明的又一方面提供一种用于评价肠道病毒71型疫苗效果的动物模型的建立方法，其包括：
1)将EV71病毒株2进行培养，得到病毒培养液；以及
2)将步骤1)所得的病毒培养液施予动物(例如注射到动物体内)，从而制备得到所述的动物模型。
优选地，所述病毒培养液的中病毒含量为104～107CCID50/ml。
所述的动物可以采用本领域常用的动物，例如：小鼠、大鼠、豚鼠、兔子。优选地所述的动物为小鼠。更优选地，所述的小鼠为1‑14日龄的乳鼠。更优选地，所述的小鼠的品系为ICR、BALB/c、NIH或昆明品系。
优选地，在步骤2)中，所述注射为颅内注射。优选地，所述病毒培养液的注射量为每只小鼠1000‑10000CCID50。
优选地，在步骤2)中，所述注射为腹腔注射。优选地，所述病毒培养液的注射量为每只小鼠1000‑10000CCID50。
所述的乳鼠可采用本领域常用的方法获得。优选地，所述的乳鼠是通过如下方法获得的：将每只成年雌鼠与1只成年雄鼠交配，对所述雌鼠在所述交配前采用本发明所述的疫苗1或2进行初次免疫(0.5～4μg/ml，优选2μg/ml)、在所述交配后2‑3周采用该疫苗进行加强免疫(0.5～4μg/ml，优选2μg/ml)，并在所述雌鼠怀孕后将其与所述雄鼠分窝，将所述雌鼠产下的乳鼠培养1‑14天，优选培养1‑7天。
本发明的动物模型可以用于评价本领域已知的肠道病毒71型疫苗(例如中国专利申请公开No.CN101575593A或CN101897963A中所披露的疫苗)的效果，也可以用于评价本发明的疫苗的效果。
以下通过实施例的方式进一步解释或说明本发明内容，但这些实施例不应被理解为对本发明保护范围的限制。
以下实施例中的DMEN培养基可购自GIBCO公司；Vero细胞或人二倍体细胞可购自ATCC公司；牛血清可购自GIBCO公司；抗EV71免疫血清可购自ATCC公司；199细胞生长液可购自SIGMA公司；胰酶可购自GIBCO公司；细胞工厂可购自NUNC公司；超滤膜可购自MILLIPORE公司；Sepharose 4FF、DEAE‑Sepharose FF介质可购自GE公司；β‑丙内酯可购自SIGMA公司；RD细胞可购自ATCC公司；ICR、BALB/c、NIH、昆明小鼠可购自北京维通利华试验动物科技有限公司。
实施例1：EV71病毒株1的分离与鉴定方法
(1)EV71病毒株1的分离方法
候选毒株要具有完整的记录、历史、来源。测定候选毒株的生物学特性，候选病毒株制备的灭活疫苗应当具备病毒产量高、诱导免疫保护的能力强、交叉保护谱广、生物学特性稳定，并依据流行病学和分子流行病学选择的，在当前和今后具有广泛流行潜力的病毒株。候选病毒免疫动物，分离血清，测定血清中和抗体效价，筛选保护谱广，诱导免疫保护能力强的病毒作为灭活疫苗病毒株。
收集手足口病患者(来自安徽阜阳一名4岁手足口病患儿黄××)咽拭子标本，在4℃条件下，2000～4000rpm离心30min，取上清用0.2μm滤器过滤除菌，将过滤后的上清接种Vero细胞或人二倍体细胞。接种标本前，倒掉生长液，每瓶细胞接种0.2～1ml的标本悬液，培养温度为36±1℃；吸附1～2小时后，换上含2％牛血清的DMEN培养基继续培养。使用倒置显微镜逐日观察细胞病变，若7天无细胞病变效应(CPE)的出现，盲传1代继续观察7天，直到75％～90％的细胞发生变化，然后储藏在‑20℃以备二次传代。第二代培养见可疑细胞病变时继续传代，待细胞病变稳定出现后‑70℃冻存，阴性则废弃。从而得到EV71病毒株1，送中国微生物菌毒种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏号为：CGMCC No.5540。
(2)病毒的鉴定方法
形态学观察：在光学显微镜下观察EV71病毒在细胞上的病变，细胞圆缩、分散、胞浆内颗粒增加。EV71病毒超滤浓缩后，经2％磷钨酸溶液负染后，置电镜下可观察到球形病毒颗粒。
鉴别试验：将病毒培养液与等量的抗EV71免疫血清于36±1℃中和1～2小时后，接种于细胞培养板，继续培养7天，观察病变细胞孔数，同时设血清和细胞对照，病毒对照的滴度应不低于500CCID50/ml，实验有效。结果显示病毒对照组孔全部出现细胞病变，血清对照组、细胞对照组细胞均未出现病变；候选毒株均可被抗EV71免疫血清中和，证明它们确为EV71。
分子生物学鉴定：取病毒液0.2‑0.5ml，提取病毒RNA，采用EV71特异性引物进行全基因扩增、序列测定和基因分型，上述步骤可由北京诺赛基因组研究中心进行。结果显示，其基因组全长7406bp，属于C4基因亚型。全基因序列如SEQ ID No.：1所示。
实施例2：EV71病毒株1的纯化和传代稳定性分析
(1)噬斑纯化
将实施例1得到的EV71病毒悬液系列稀释，显微镜下观察细胞长成单层后，弃掉六孔细胞培养板内原有的培养液，加入病毒悬液0.1‑0.5ml/孔，36±1℃吸附1‑2小时，吸附结束后，倒掉板中液体，用无菌PBS洗一次，加覆盖物，置于二氧化碳孵育箱36±1℃培养。接种病毒后3‑7天，镜下观察噬斑形成，挑取噬斑，做进一步噬斑纯化，如此方法再纯化2次。
(2)病毒的传代稳定性分析
以Vero细胞为例，将EV71选用病毒株在Vero细胞上连续传代，病变为75％～90％时收获，采用微量细胞病变法测定滴度，观察其在Vero细胞上连续传代的滴度稳定性。结果显示，该株在Vero细胞上连续十五代以上传代的滴度均维持在7.0Lg CCID50/ml以上，具有很好的传代稳定性。结果图1所示。
实施例3：EV71病毒株1的种子批的建立和检定
按照《中国药典》关于种子库建立方法的要求，疫苗生产用毒种应以病毒种子批系统为基础进行三级管理，即原始种子批、主种子批和工作种子批，种子批细胞均需于‑60℃以下冷冻保存。原始种子批应验明其记录、历史来源和生物特性。主种子批，应进行全面检定，检定内容包括鉴别试验、无菌试验、支原体检查、病毒滴定、病毒外源因子检查、免疫原性检查等项目。工作种子批进行鉴别试验、无菌试验、支原体检查、病毒滴定等项目检定，合格后方可使用。
以Vero细胞为例，简述三级种子批的建立方法(但本发明不限于此)：将来自原始种子批的病毒接种至长成单层的Vero细胞(M.O.I＝0.001～1)，使用倒置显微镜逐日观察细胞病变，直至出现75％～90％的细胞病变时，将培养物置于‑20℃冷冻，室温融化二次后，按照上述方法接种至新的Vero细胞单层细胞，直至出现75％～90％的细胞病变，如此反复进行病毒传代。每一批收获物记为一代。
实施例4：EV71病毒株1的培养和收获
(1)细胞：生产用细胞为Vero细胞或人二倍体细胞。
(2)病毒：制备的EV71工作种子批。
(3)细胞及病毒培养
从液氮罐中取出冻存细胞，移植细胞悬液1ml(浓度：8×106/ml)于199细胞生长液10ml中，置于36±1℃培养，4小时后更换培养液，继续置于36±1℃培养，待生长成致密单层后进行传代。弃去瓶中原有生长液，加入0.25％胰酶20ml消化，待细胞脱壁后，补充199细胞生长液100ml吹打至细胞呈分散悬液状，取细胞悬液20ml接种至转瓶中，进行细胞扩增，同样方法进行胰酶消化后，取细胞悬液200ml接种至生物反应器或细胞工厂中，培养4～7天后，观察细胞生长状态，确定病毒接种时间，按病毒接种量为M.O.I＝0.001～1的比例加入维持液20000ml，混匀，接种至长成单层的细胞中，继续培养观察病变、根据病变程度收获病毒液。反应器细胞培养条件：微载体含量2～15克/升、温度36±1℃、pH值7.0±0.5、溶解氧浓度20～80％、转速20～80rpm；病毒培养条件：温度36±1℃、pH值7.0±0.5、DO浓度20～80％、转速20～80rpm。
(4)病毒收获：待接种病毒后48‑120h、细胞出现明显病变后，收获病毒培养液。
实施例5：EV71病毒株1的浓缩、纯化及灭活
超滤浓缩病毒：将按照上述方法制备获得的病毒收获液，经截留分子量为100‑1000KD的超滤膜进行超滤浓缩，浓缩倍数约为20‑200倍。
病毒的纯化
凝胶过滤层析：将病毒浓缩液加入至用pH6.0‑8.0PBS平衡好的Sepharose 4FF介质进行凝胶过滤层析，收集病毒峰。
离子交换层析：将凝胶过滤层析后收集液加入至用pH6.0‑8.0PBS平衡好的DEAE‑Sepharose FF介质中进行离子交换层析，洗脱液为含0.1M～0.5M NaCl的pH6.0‑8.0PBS，收集病毒峰。
病毒灭活：采用甲醛作为灭活剂，按1∶2000比例于35℃灭活7天。也可用β‑丙内酯灭活，按1∶2000比例于2‑8℃灭活2天，然后37℃水解2小时。去除灭活剂后，即为疫苗原液5～40μg/ml。
实施例6：EV71疫苗1的配制
EV71灭活疫苗半成品与成品(氢氧化铝佐剂吸附)的配制
将实施例5获得的EV71灭活疫苗原液与氢氧化铝溶液(铝含量为10‑20mg/ml)混合，使氢氧化铝含量为0.5～1.5mg/ml、蛋白含量为1～4μg/ml，即可获得EV71灭活疫苗1半成品。将制成的半成品分装至无菌西林瓶(或预充式注射器)中，即可得到EV71灭活疫苗1成品。
EV71灭活疫苗半成品与成品(无佐剂吸附)的配制
将获得的EV71灭活疫苗原液稀释，稀释液为50mM PBS缓冲液(pH为7.0)，使蛋白含量为1～4μg/ml，即可获得EV71灭活疫苗1半成品。将制成的半成品分装至无菌西林瓶(或预充式注射器)，即可得到EV71灭活疫苗1成品。
实施例7：EV71疫苗1的质量分析
根据《中国药典(三部)2010年版》的有关要求，对EV71灭活疫苗1成品进行测定，结果显示，疫苗的外观为乳白色浑悬液体、疫苗的装量不低于0.5ml/瓶、疫苗的PH值在6.0～8.0、鉴别试验符合规定、氢氧化铝含量≤2mg/ml、无菌检查阴性、细菌内毒素≤10EU/剂、异常毒性试验符合规定、牛血清白蛋白残留量≤50ng/剂、游离甲醛含量≤10μg/剂、Vero细胞DNA残留量＜100pg/剂等，均不低于国家标准，符合有关规定。
实施例8：EV71疫苗1免疫原性分析
测定血清中和抗体效价方法：待测血清在96孔微量滴定板上进行2倍系列稀释，将中和用病毒(实施例4得到的病毒)分别稀释至100CCID50/50μl，滴加至微量滴定板上(血清、细胞对照除外)，50μl/孔。至36℃培养箱，中和2小时。中和结束后，将RD细胞用胰酶消化后制备成细胞悬液，1.5×105/ml，加入96孔板中，100μl/孔，36℃、5％CO2继续培养7天后，观察细胞病变，判定结果，中和结束后进行病毒回滴，设立病毒对照、血清对照和细胞对照。结果判定：当最高稀释度血清的2孔中有1孔出现细胞病变，另一孔不出现细胞病变，该稀释度的倒数计即为该血清标本的中和抗体效价；当高稀释度2孔完全病变，相邻低稀释度2孔完全不病变，则两者平均稀释度的倒数即为该血清标本的中和抗体效价；当两个相邻稀释度血清均出现1孔细胞病变，另1孔不出现细胞病变，则两者平均稀释度的倒数即为该血清标本的EV71中和抗体效价。
小鼠免疫：将EV71灭活疫苗分为不同剂量组：5、2.5、1.25、0.625、0.31、0.15、0.07μg/ml，将实验动物Balb/c小鼠按疫苗接种剂量进行随机分组，每组10只。取EV71灭活疫苗，免疫Balb/c小鼠，腹腔注射，0.5ml/只，免疫2次，间隔2～4周，于加强免疫后3～4周采血，分离血清，按上述方法检测血清中和抗体效价。
结果显示，血清中和抗体水平与疫苗剂量存在明显的量效关系，5、2.5、1.25、0.625、0.31、0.15、0.07μg/ml组，血清中和抗体阳转率除0.07μg/ml组为90％外，其他均达到100％，对照组未产生中和抗体，血清中和抗体阳转率为0％。各组血清中和抗体GMT达1∶(32～1024)，对照组GMT低于1∶8。阳性判定标准：中和效价大于1∶8。
实施例9：EV71疫苗1保护效果的分析
以实施例6得到的含氢氧化铝佐剂的疫苗为例，采用本发明所述的EV71感染小鼠模型对疫苗的保护效果进行分析。将EV71灭活疫苗1分为高、中、低三个剂量组(2、1、0.5μg/ml)。将成年ICR(每只配1只雄鼠，雌鼠怀孕后将雄鼠分窝)8只，于交配前0周初次免疫、交配后2‑3周加强免疫，肌肉注射，0.1‑1.0ml/只。母鼠产下乳鼠后1‑7天，通过脑腔注射10μl由下述实施例10中的方法制备的EV71病毒株2培养液/只或者腹腔注射100μl由下述实施例10中的方法制备的病毒株2培养液/只，逐日观察发病情况，计算生存率。
病毒攻击后第1天、2天和3天疫苗组和佐剂对照组均无异常，病毒攻击后第4～5天对照组乳鼠后肢出现明显的麻痹、瘫痪症状，疫苗组无异常。病毒攻击后第5～6天佐剂对照组乳鼠全部死亡，而疫苗组无任何异常，生存率曲线如图2所示，结果显示，EV71疫苗1具有明显的保护作用，采用高、中、低剂量组的EV71疫苗1免疫后，均可保护小鼠免受EV71感染。疫苗接种组与正常对照组小鼠无明显差别，体重正常、未出现肢体麻痹等行动异常现象，存活率率达100％，而佐剂对照组乳鼠于病毒攻击后4～5天相继发病直至死亡。
实施例10：EV71病毒株2的分离及鉴定
1.EV71病毒株2的分离方法如下：收集手足口病患者(分离自浙江宁波一名3岁重症手足口病患儿龚××)咽拭子标本，在4℃条件下，2000～4000rpm离心30min，取上清用0.2μm滤器过滤除菌，将过滤后的上清接种Vero细胞或人二倍体细胞。接种标本前，倒掉生长液，每瓶细胞(8×106个/瓶)接种0.2～1ml的标本悬液，培养温度为36±1℃；吸附1～2小时后，换上含2％牛血清的DMEM培养基10ml继续培养。使用倒置显微镜逐日观察细胞病变，若7天无细胞病变效应(CPE)的出现，盲传1代继续观察7天，直到75％～90％的细胞发生变化，然后储藏在‑20℃以备二次传代。第二代培养见可疑细胞病变时继续传代，待细胞病变稳定出现后‑70℃冻存，阴性则废弃。从而得到EV71病毒株2，送至中国微生物菌毒种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏号为：CGMCC No.5539。
2.EV71病毒株2的培养方法如下：
从液氮罐中取出冻存细胞，移植细胞悬液1ml(浓度：8×106个/ml)于10ml 199细胞生长液中，置于36±1℃的温度下培养，4小时后更换培养液，继续置于36±1℃的温度下培养，待生长成致密单层后进行传代。弃去瓶中原有199细胞生长液，加入10m10.25％胰酶消化，待细胞脱壁后，补充6ml 199细胞生长液，吹打至细胞呈分散悬液状，取1ml细胞悬液接种至方瓶中，进行细胞扩增，培养4～7天后，观察细胞生长状态，确定病毒接种时间，按病毒接种量为M.O.I＝0.001～1的比例加入10ml含2％牛血清的DMEM培养基，混匀，接种至长成单层的细胞中，继续培养观察病变，待接种病毒后48‑120小时，细胞出现明显病变后，收获病毒培养液。
3.EV71病毒株2的鉴定方法如下：
(1)形态学观察：在光学显微镜下观察EV71病毒株2在细胞上的病变，细胞圆缩、分散、胞浆内颗粒增加。超滤浓缩后，经2％磷钨酸溶液负染后，置电镜下可观察到球形病毒颗粒。
(2)免疫学试验鉴定：将EV71病毒株2的病毒培养液与等量的抗EV71免疫血清于36±1℃中和1～2小时后，接种于细胞培养板，继续培养7天，观察病变细胞孔数，同时设血清和细胞对照，病毒对照的滴度应不低于500CCID50/ml。结果显示病毒对照组孔全部出现细胞病变，血清对照组、细胞对照组细胞均未出现病变；候选毒株均可被抗EV71免疫血清中和，证明它们确为EV71病毒株2。
(3)分子生物学鉴定：取病毒液0.2‑0.5ml，提取病毒RNA，采用EV71特异性引物进行全基因扩增、序列测定和基因分型，以上步骤可由北京诺赛基因组研究中心进行。结果显示，其基因组全长7404bp，属于C4基因亚型。全基因序列如SEQ ID No.：2所示。
实施例11：由EV71病毒株2制备EV71疫苗2
EV71病毒株2可作为动物模型的攻毒株使用，同样地也可用于制备EV71灭活疫苗。
制备方法与EV71病毒株1类似，具体步骤可参见实施例2‑6，唯一不同的是，将各步骤中所用的EV71病毒株1替换为EV71病毒株2。例如，以Vero细胞制备EV71灭活疫苗2为例，建立并检定毒种三级种子批库，并用生物反应器或细胞工厂培养Vero细胞，在细胞长成致密单层或细胞在微载体上生长至合适密度时，接种病毒，36±1℃培养4‑7天后收获病毒悬液，经过浓缩、纯化灭活等步骤后，制备出疫苗原液。可经过换算稀释加入诸如Al(OH)3之类的佐剂吸附配制成含佐剂半成品，也可不加入佐剂配制成不含佐剂半成品。分装0.5ml/支即可为肠道病毒71型疫苗2。
实施例12：EV71疫苗2的质量分析
根据《中国药典(三部)2010年版》的有关要求，对EV71灭活疫苗1成品进行测定，结果显示，疫苗的外观为乳白色浑悬液体、疫苗的装量不低于0.5ml/瓶、疫苗的PH值在6.0～8.0、鉴别试验符合规定、氢氧化铝含量≤2mg/ml、无菌检查阴性、细菌内毒素≤10EU/剂、异常毒性试验符合规定、牛血清白蛋白残留量≤50ng/剂、游离甲醛含量≤10μg/剂、Vero细胞DNA残留量＜100pg/剂等，均不低于国家标准，符合有关规定。
实施例13：EV71疫苗2免疫原性分析
测定血清中和抗体效价方法：待测血清在96孔微量滴定板上进行2倍系列稀释，将中和用病毒(实施例11得到的病毒)分别稀释至100CCID50/50μl，滴加至微量滴定板上(血清、细胞对照除外)，50μl/孔。至36℃培养箱，中和2小时。中和结束后，将RD细胞用胰酶消化后制备成细胞悬液，1.5×105/ml，加入96孔板中，100μl/孔，36℃、5％CO2继续培养7天后，观察细胞病变，判定结果，中和结束后进行病毒回滴，设立病毒对照、血清对照和细胞对照。结果判定：当最高稀释度血清的2孔中有1孔出现细胞病变，另一孔不出现细胞病变，该稀释度的倒数计即为该血清标本的中和抗体效价；当高稀释度2孔完全病变，相邻低稀释度2孔完全不病变，则两者平均稀释度的倒数即为该血清标本的中和抗体效价；当两个相邻稀释度血清均出现1孔细胞病变，另1孔不出现细胞病变，则两者平均稀释度的倒数即为该血清标本的EV71中和抗体效价。
小鼠免疫：将EV71疫苗分为不同剂量组：5、2.5、1.25、0.625、0.31、0.15、0.07μg/ml，将实验动物Balb/c小鼠按疫苗接种剂量进行随机分组，每组10只。取EV71灭活疫苗，免疫Balb/c小鼠，腹腔注射，0.5ml/只，免疫2次，间隔2～4周，于加强免疫后3～4周采血，分离血清，按上述方法检测血清中和抗体效价。
结果显示，血清中和抗体水平与疫苗剂量存在明显的量效关系，5、2.5、1.25、0.625、0.31、0.15、0.07μg/ml组，血清中和抗体阳转率除0.07μg/ml组为85％外，其他均达到100％，对照组未产生中和抗体，血清中和抗体阳转率为0％。各组血清中和抗体GMT达1∶(24～1024)，对照组GMT低于1∶8。阳性判定标准：中和效价大于1∶8。
实施例14：EV71疫苗2保护效果的分析
以实施例11得到的含氢氧化铝佐剂的疫苗为例，采用本发明所述的EV71感染小鼠模型对疫苗的保护效果进行分析。将EV71疫苗2分为高、中、低三个剂量组(2、1、0.5μg/ml)。将成年ICR(每只配1只雄鼠，雌鼠怀孕后将雄鼠分窝)8只，于交配前0周初次免疫、交配后2‑3周加强免疫，肌肉注射，0.1‑1.0ml/只。母鼠产下乳鼠后1‑7天，通过脑腔注射10μl由实施例10中的方法制备的EV71病毒株2培养液/只或者腹腔注射100μl由实施例10中的方法制备的病毒株2培养液/只，逐日观察发病情况，计算生存率。
病毒攻击后第1天、2天和3天疫苗组和佐剂对照组均无异常，病毒攻击后第4～5天对照组乳鼠后肢出现明显的麻痹、瘫痪症状，疫苗组无异常。病毒攻击后第5～6天佐剂对照组乳鼠全部死亡，而疫苗组无任何异常，生存率曲线如图9所示，结果显示，EV71疫苗2具有明显的保护作用，采用高、中、低剂量组的EV71疫苗2免疫后，均可保护小鼠免受EV71感染。疫苗接种组与正常对照组小鼠无明显差别，体重正常、未出现肢体麻痹等行动异常现象，存活率率达100％，而佐剂对照组乳鼠于病毒攻击后3～4天相继发病直至死亡。
实施例15：颅内注射EV71感染动物模型的建立方法
包括以下步骤：取1‑14日龄ICR乳鼠，颅内注射攻毒用毒株的病毒培养液(具体制备方法可参见实施例10，下同)，浓度为105CCID50/ml，10‑30μl/只，即获得EV71感染动物模型。
具体操作步骤如下：
(1)动物分组
取1‑14日龄乳鼠两组(每组10只)，分别设为病毒组和正常对照组，病毒组颅内注射攻毒用毒株培养液，正常对照组注射DMEM培养液。
(2)颅内注射
用无菌注射器吸取攻毒用毒株病毒培养液，颅内注射乳鼠，10‑30μl/只，正常对照组注射病毒培养液，10‑30μl/只，逐日观察乳鼠发病情况。
(3)乳鼠发病情况观察
颅内注射后第1天、2天和3天病毒组和正常对照组均无异常，病毒攻击后第4～5天病毒组乳鼠后肢出现明显的麻痹、瘫痪症状，正常对照组无异常。病毒攻击后第5～6天病毒组乳鼠全部死亡，而正常对照组无异常，生存率曲线如图3所示，证明动物模型建立成功。
实施例16：腹腔注射EV71感染动物模型的建立方法
包括以下步骤：取1‑14日龄ICR乳鼠，腹腔注射攻毒用毒株的病毒培养液(具体制备方法可参见实施例10，下同)，浓度为105CCID50/ml，100μl/只，即获得肠道病毒71型病毒的腹腔感染动物模型。
具体操作如下：
(1)动物分组
取1‑14日龄乳鼠两组(每组10只)，分别设为病毒组和正常对照组，病毒组颅内注射攻毒用毒株病毒培养液，正常对照组注射DMEM培养液。
(2)腹腔注射
用无菌注射器吸取攻毒用毒株病毒培养液，腹腔注射病毒组乳鼠，100μl/只；正常对照组注射DMEM培养液，100μl/只。逐日观察乳鼠发病情况。
(3)乳鼠发病情况观察
腹腔注射后第1天、2天和3天病毒组和正常对照组均无异常，病毒攻击后第4～5天病毒组乳鼠后肢出现明显的麻痹、瘫痪症状，正常对照组无异常。病毒攻击后第5～6天实验组乳鼠全部死亡，而正常对照组无异常，如图5所示。生存率曲线如图4所示，证明动物模型建立成功。
实施例17：EV71感染动物模型的应用
(1)肠道病毒71型灭活疫苗的制备
使用的是实施例6制备的EV71灭活疫苗(氢氧化铝佐剂吸附)成品。
(2)EV71感染动物模型在EV71灭活疫苗保护效果评价中的应用
1)疫苗准备
将制备成的EV71灭活疫苗，稀释为高、中、低三个剂量(2、1、0.5μg/ml)，对照为氢氧化铝佐剂，浓度为1mg/ml。
2)动物免疫和攻毒
将成年ICR雌鼠(每只配1只雄鼠，雌鼠怀孕后将雄鼠分窝)，于交配前(0周)用本发明所制备的EV71疫苗进行初次免疫、交配后2‑3周加强免疫，肌肉注射，0.1‑1.0ml/只。母鼠产下乳鼠后1‑7天，通过颅内注射10μl病毒液/只或者腹腔注射100μl病毒液/只，逐日观察发病情况，计算生存率。
3)攻毒后的观察
病毒攻击后第1天、2天和3天疫苗组和佐剂对照组均无异常，病毒攻击后第4～5天对照组乳鼠后肢出现明显的麻痹、瘫痪症状，疫苗组无异常。病毒攻击后第5～6天佐剂对照组乳鼠全部死亡，而疫苗组无任何异常，生存率曲线如图6所示，结果显示，EV71灭活疫苗具有明显的保护作用，采用高、中、低剂量组的EV71灭活疫苗免疫后，均可保护小鼠免受EV71感染。疫苗接种组与正常对照组小鼠无明显差别，体重正常、未出现肢体麻痹等行动异常现象，存活率率达100％，而佐剂对照组乳鼠于病毒攻击后4～5天相继发病直至死亡。
4)测定中和抗体效价
分别采集对照组、疫苗接种组母鼠、1日龄乳鼠、14日龄乳鼠血清进行中和抗体检测(检测方法可参见以下文献：毛群颖，何鹏，于祥，李楠，郝春生等.人肠道病毒71型中和抗体检测方法的实验室评价.中国生物制品学杂志.2010，23(8)：885‑888)。结果如图7所示，EV71灭活疫苗免疫后，母鼠、1日龄、14日龄乳鼠血清中和抗体明显高于对照组。
5)各组织器官病毒载量检测
采用荧光定量PCR方法(检测方法可参见以下文献：朵建英，王卫，丛喆，刘强，魏强等.SYBR Green I实时荧光定量RT‑PCR测定肠道病毒71型(EV71)RNA拷贝数方法的建立.中国比较医学杂志.2010，20(7)：27‑31.)，检测疫苗接种组和氢氧化铝佐剂对照组小鼠各器官(脑、心、肝、脾、肺、肾、肌肉、脊髓、肠)中的EV71 RNA的相对含量。结果发现，疫苗接种组乳鼠组织器官中病毒载量明显低于对照组。以脾为例，如图8所示。对照组乳鼠上述各脏器中EV71RNA含量明显高于氢氧化铝佐剂对照组，这表明EV71疫苗接种后，可明显降低各器官组织中的EV71病毒载量，从而达到保护乳鼠免受EV71感染的作用。