不对称水解酶及其基因.pdf

本发明涉及，例如，α-取代的β-氨基酸酯衍生物不对称水解酶，所述酶包括以下(a)或(b)的酶：(a)包含SEQ ID NO：1的至少第1位至第362位的氨基酸序列的酶，其中SEQ ID NO：1的第277位的酪氨酸被丙氨酸、色氨酸、异亮氨酸或组氨酸取代，并且所述酶具有水解底物的能力；或者(b)包含SEQ ID NO：1的至少第1位至第362位的氨基酸序列的酶，其中SEQ ID NO：1的第277位的酪氨酸被不同于酪氨酸的氨基酸取代，并且所述酶具有水解底物的能力。

权利要求书以下(a)或(b)的酶：
(a)包含SEQ ID NO：1的至少第1位至第362位的氨基酸序列的酶，其中SEQ ID NO：1的第277位的酪氨酸被丙氨酸、色氨酸、异亮氨酸或组氨酸取代，并且所述酶具有水解底物的能力；或者
(b)包含SEQ ID NO：1的至少第1位至第362位的氨基酸序列的酶，其中SEQ ID NO：1的第277位的酪氨酸被不同于酪氨酸的氨基酸取代，并且所述酶具有水解底物的能力。
一种多核苷酸，所述多核苷酸包含编码根据权利要求1所述的酶的氨基酸序列的核苷酸序列。
一种载体，所述载体包含根据权利要求2所述的多核苷酸。
一种转化体，在所述转化体中已经引入了根据权利要求2所述的多核苷酸。
一种转化体，所述转化体包含根据权利要求3所述的载体。
一种生产酶的方法，所述方法包括培养根据权利要求4或5所述的转化体。
一种修饰包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的酶的方法，所述方法包括将SEQ ID NO：1的氨基酸序列中的第277位的酪氨酸用丙氨酸、色氨酸、异亮氨酸或组氨酸取代的步骤。
一种修饰包含编码SEQ ID NO：1的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸的方法，所述方法包括将编码SEQ ID NO：1的氨基酸序列的核苷酸序列中第829至831位的编码酪氨酸的密码子用编码丙氨酸、色氨酸、异亮氨酸或组氨酸的密码子取代的步骤。

说明书不对称水解酶及其基因
本申请要求于2011年12月19日提交的日本专利申请号2011‑277193的优先权和利益，所述日本专利申请号2011‑277193的全部内容通过引用结合于此。
技术领域
本发明涉及适用于α‑取代的β‑氨基酸酯衍生物的不对称水解的酶，编码所述酶的多核苷酸等。
背景技术
旋光α‑取代的β‑氨基酸衍生物作为用于制备药物本体(bulk)化合物、农业化学品或生物活性物质的原料和中间体是有用的。例如，专利文献1公开了被用作用于制备抗菌剂的物质的旋光α‑取代的β‑氨基酸衍生物。此外，非专利文献1和2公开了被用作用于制备细胞毒性酯肽念珠草环肽(cryptophycin)的中间体的旋光α‑取代的β‑氨基酸衍生物。
水解酶具有水解底物的能力，并且近年来，已被用于制备例如用作药物或农业化学品的活性成分的化合物或其中间体的有机合成反应。尤其，水解酶已被用于制备旋光化合物或其中间体的有机合成反应。例如，具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列并且具有水解底物的能力的酶已知作为水解酶(参见例如，专利文献2)。
理想的是，这样的用于制备旋光化合物或其中间体等的可用于工业的水解酶，具有以下性质：产生具有高光学纯度的水解反应产物的能力；高度识别底物的绝对构型的能力；对各种反应条件如温度，pH，溶剂或压力的高度稳定性；等等。尤其，如果反应产物具有高光学纯度(即水解酶的光学选择性高)，则在酶反应后不需要纯化步骤以致于旋光化合物可以以有利的产率被合成。
引用列表
专利文献
专利文献1：WO 02/102790
专利文献2：日本专利号3875283
非专利文献
非专利文献1：J.Am.Chem.Soc.1995，117，2479
非专利文献2：J.Chem.Soc.，Perkin Trans.1，2000，1461
发明内容
为了减少反应步骤并提高生产率，强烈需要开发具有高光学选择性的水解酶。
本发明提供，例如，具有优异光学选择性的水解酶以及编码所述酶的多核苷酸。
在示例性实施方案中，本发明提供以下1)‑8)：
1)以下(a)或(b)的酶(下文中，有时被称为本发明的酶)：
(a)包含SEQ ID NO：1的至少第1位至第362位的氨基酸序列的酶，其中SEQ ID NO：1的第277位的酪氨酸被丙氨酸、色氨酸、异亮氨酸或组氨酸取代，
并且所述酶具有水解底物的能力；或者
(b)包含SEQ ID NO：1的至少第1位至第362位的氨基酸序列的酶，其中SEQ ID NO：1的第277位的酪氨酸被不同于酪氨酸的氨基酸取代，
并且所述酶具有水解底物的能力；
2)包含编码根据1)的酶的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸(下文中，有时被称为本发明的多核苷酸)；
3)包含根据2)的多核苷酸的载体(下文中，有时被称为本发明的载体)；
4)引入有根据2)的多核苷酸的转化体(下文中，有时被称为本发明的转化体)；
5)包含根据3)的载体的转化体；
6)一种生产酶的方法，所述方法包括培养根据4)或5)的转化体；
7)一种修饰包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的酶的方法，所述方法包括以下步骤：将SEQ ID NO：1的氨基酸序列中的第277位的酪氨酸用丙氨酸、色氨酸、异亮氨酸或组氨酸取代(下文中，有时被称为本发明的酶修饰方法)；以及
8)一种修饰包含编码SEQ ID NO：1的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸的方法，所述方法包括以下步骤：将编码SEQ ID NO：1的氨基酸序列的核苷酸序列中第829至831位的编码酪氨酸的密码子用编码丙氨酸、色氨酸、异亮氨酸或组氨酸的密码子取代(下文中，有时被称为本发明的多核苷酸修饰方法)。
根据本发明，可以提供具有优异光学选择性等的水解酶，所述水解酶可用于制备旋光化合物或所述旋光化合物的中间体、如旋光α‑取代的β‑氨基酸衍生物的有机合成反应，所述旋光化合物可用作药物或农业化学品中的活性成分。
具体实施方式
下文中，更具体地说明本发明。
当在本文中使用时，本发明的酶可以被描述为SEQ ID NO：1的氨基酸序列中的位置号与表示氨基酸的字母表的一个字母的组合。例如，″277I″表示这样的酶，所述酶包含相当于SEQ ID NO：1的氨基酸序列的氨基酸序列，不同之处在于它具有氨基酸突变，其中SEQ ID NO：1的第277位的酪氨酸被异亮氨酸取代。
关于本发明的酶，″水解底物的能力″(下文中，有时被称为水解酶活性)可以例如通过以下方法确定：在水的存在下将所述酶与其底物如α‑取代的β‑氨基酸酯衍生物(具体地，例如，2‑正丁基‑3‑[(N‑苄氧基‑N‑甲酰基)氨基]丙酸乙酯)混合，随后将该混合物在25℃孵育，并且然后通过高效液相色谱定量α‑取代的β‑氨基酸衍生物(具体地，例如，2‑正丁基‑3‑[(N‑苄氧基‑N‑甲酰基)氨基]丙酸)在获得的反应溶液中的光学纯度和化学纯度。
本发明的酶是通过以下(a)或(b)表征的酶：
(a)包含SEQ ID NO：1的至少第1位至第362位的氨基酸序列的酶，其中SEQ ID NO：1的第277位的酪氨酸被丙氨酸、色氨酸、异亮氨酸或组氨酸取代，
并且所述酶具有水解底物的能力；或者
(b)包含SEQ ID NO：1的至少第1位至第362位的氨基酸序列的酶，其中SEQ ID NO：1的第277位的酪氨酸被不同于酪氨酸的氨基酸取代，并且所述酶具有水解底物的能力。
具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的酶(下文中被称为野生型水解酶)是本领域中已知的来源于色杆菌(Chromobacterium)SC‑YM‑1菌株(FERMBP‑6703)的水解酶。当在重组大肠杆菌(E.coli)中生产该野生型水解酶时，除了全长水解酶以外，还产生缺少全长水解酶的八个C端氨基酸的截短的水解酶。该截短的水解酶具有水解活性，并且其C端氨基酸是Glu，对应于SEQ ID NO：1的氨基酸序列中的第362位的Glu。因此，本发明的酶可以具有对应于SEQ ID NO：1的氨基酸序列的至少第1位至第362位的氨基酸序列。
上述″不同于酪氨酸的氨基酸″是指构成蛋白质的20种氨基酸中除酪氨酸之外的任何氨基酸，包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸或色氨酸。优选地，上述″不同于酪氨酸的氨基酸″是指丙氨酸、色氨酸、异亮氨酸或组氨酸。
本发明的酶的具体实例包括以下酶：
基本上由SEQ ID NO：1的第1位至第362位的氨基酸序列组成的酶，其中SEQ ID NO：1的第277位的酪氨酸被丙氨酸取代，并且所述酶具有水解底物的能力；
包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的酶，其中SEQ ID NO：1的第277位的酪氨酸被丙氨酸取代，并且所述酶具有水解底物的能力；
基本上由SEQ ID NO：1的第1位至第362位的氨基酸序列组成的酶，其中SEQ ID NO：1的第277位的酪氨酸被色氨酸取代，并且所述酶具有水解底物的能力；
包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的酶，其中SEQ ID NO：1的第277位的酪氨酸被色氨酸取代，并且所述酶具有水解底物的能力；
基本上由SEQ ID NO：1的第1位至第362位的氨基酸序列组成的酶，其中SEQ ID NO：1的第277位的酪氨酸被异亮氨酸取代，并且所述酶具有水解底物的能力；
包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的酶，其中SEQ ID NO：1的第277位的酪氨酸被异亮氨酸取代，并且所述酶具有水解底物的能力；
基本上由SEQ ID NO：1的第1位至第362位的氨基酸序列组成的酶，其中SEQ ID NO：1的第277位的酪氨酸被组氨酸取代，并且所述酶具有水解底物的能力；以及
包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的酶，其中SEQ ID NO：1的第277位的酪氨酸被组氨酸取代，并且所述酶具有水解底物的能力。
为获得包含编码本发明的酶的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸，例如，可以使用以下方法。
首先，获得包含编码野生型水解酶的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸(下文中，有时被称为野生型多核苷酸)。编码SEQ ID NO：1的氨基酸序列的核苷酸序列的实例包括SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11的核苷酸序列。
野生型多核苷酸可以根据常规遗传工程技术获自色杆菌SC‑YM‑1菌株(根据布达佩斯条约，在1999年4月15日保藏于国际专利生物保藏中心(International Patent Organism Depositary)(IPOD)，国家技术和评估研究所(National Institute of Technology and Evaluation)(NITE)，Tsukuba Central6，1‑1‑1，Higashi，Tsukuba，Ibaraki 305‑8566，日本，保藏编号为FERMBP‑6703)，所述遗传工程技术描述于，例如，J.Sambrook，E.F.Fritsch，T.Maniatis；Molecular Cloning(第二版)，Cold Spring Harbor Laboratory，1989中。具体地，根据常规方法从色杆菌SC‑YM‑1菌株抽提基因组DNA。例如，通过常规方法如超声波均化作用将细菌细胞破碎，之后是蛋白酶处理等并且随后抽提基因组DNA。将获得的基因组DNA用适当的限制酶切割，并使用连接酶将其插入到例如噬菌体载体λgt11或质粒载体pUC19中，从而由此制备基因组DNA文库。可以通过筛选方法从获得的基因组DNA文库获得野生型多核苷酸，所述筛选方法例如使用针对野生型水解酶的抗体的免疫学方法，使用对应于野生型水解酶的部分氨基酸序列的合成的DNA探针的杂交方法，或测定野生型水解酶活性的方法。备选地，野生型多核苷酸也可以通过以下方法来制备：使用合适的引物进行PCR，由此扩增包含编码SEQ ID NO：1的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸。
可以通过如下所示的位点定向诱变来突变获得的野生型多核苷酸，由此制备本发明的多核苷酸。位点定向诱变方法是这样的方法，其中使用整合有原始的多核苷酸(即野生型多核苷酸)的质粒的单链DNA作为模板以及包含要被突变的核苷酸序列的合成的寡核苷酸作为引物来合成变体多核苷酸(即本发明的多核苷酸)。在本发明中，可以制备用于诱变的引物以通过PCR方法进行扩增，以使SEQ ID NO：1的氨基酸序列中第277位的氨基酸可以被不同于酪氨酸的氨基酸取代。优选的是第277位的氨基酸被丙氨酸、色氨酸、异亮氨酸或组氨酸取代的特定突变。
在本文的上下中，″位点定向诱变方法″的实例可以包括Olfert Landt等的方法(Gene 96，125‑128，1990)，Smith等的方法(Genetic Engineering 3，1，Setlow，J.和Hollaender，A，Plenum：New York)，Vlasuk等的方法(Experimental Manipulation of Gene Expression，Inouye，M.：Academic Press，New York)，以及Hos.N.Hunt等的方法(Gene 77，51，1989)，以及使用市售试剂盒如Mutan‑Express Km(由Takara Shuzo Co.，Ltd.生产)，TaKaRa LaPCR体外诱变试剂盒(由Takara Shuzo Co.，Ltd.生产)，和QuikChange II位点定向诱变试剂盒(由Stratagene Corp.生产)。
具体地，为制备编码包含SEQ ID NO：1的至少第1位至第362位的氨基酸序列(其中使用例如Olfert Landt等的方法(Gene 96，125‑128，1990)用不同于酪氨酸的氨基酸取代SEQ ID NO：1的第277位的酪氨酸)的水解酶的多核苷酸，首先根据例如以下文献中所述的方法制备整合了野生型基因的载体(DNA)：J.Sambrook，E.F.Fritsch，T.Maniatis；Molecular Cloning第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，1989。
随后，将所获得的载体(DNA)用作模板从而通过PCR方法扩增DNA片段，所述PCR方法使用，例如，包含编码其中SEQ ID NO：1的第277位的酪氨酸被丙氨酸、色氨酸、异亮氨酸或组氨酸取代的氨基酸序列的核苷酸序列的寡核苷酸(例如，包含SEQ ID NO：2的核苷酸序列的寡核苷酸)作为正义引物和包含与正义引物互补的核苷酸序列的寡核苷酸(例如，包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列的寡核苷酸)作为反义引物。在本文中，PCR反应的条件的实例可以包括以下条件：在95℃孵育1分钟；并且随后是95℃孵育处理50秒、然后55℃1分钟以及68℃5分钟进行12个循环；并且最后在4℃孵育。将DpnI限制酶加入到含扩增的DNA片段的PCR反应溶液中，并且然后在37℃孵育1小时，之后用所得的溶液转化大肠杆菌。可以从所获得的转化体中纯化载体，由此获得所需的本发明的多核苷酸。
也可以基于本发明的多核苷酸的核苷酸序列，根据常规方法如亚磷酸三酯法(Hunkapiller，M.等，Nature，310，105，1984)，通过化学合成包含所需核苷酸序列的核酸来制备本发明的多核苷酸。
为了获得本发明的酶，制备允许本发明的多核苷酸在宿主细胞如微生物中表达的载体，并且将所述载体引入到宿主细胞中以制备转化体。随后，可以根据常规细胞培养方法来培养所制备的转化体。以此方式，可以大量制备并获得本发明的酶。
本发明的载体包含本发明的多核苷酸。
本发明的载体可以通过以下方法构建：根据常规遗传工程技术将本发明的多核苷酸整合到载体中，所述载体可以用于要引入本发明的多核苷酸的宿主细胞中，例如，所述载体包含在宿主细胞中可复制的遗传信息，可以自主增殖，可以从宿主细胞分离和纯化，并且具有可检测的标记物(下文中，有时被称为基本载体)。
在本文中，在将大肠杆菌用作宿主细胞的情况中，″基本载体″的实例包括：载体pUC119(由Takara Shuzo Co.，Ltd.生产)和噬菌粒pBluescript II(由Stratagene Corp.生产)。此外，在将芽殖酵母用作宿主细胞的情况中，″基本载体″的实例可以包括载体pGBT9，pGAD424，和pACT2(由ClontechLaboratories，Inc.生产)。此外，在将哺乳动物细胞用作宿主细胞的情况中，″基本载体″的实例可以包括载体如pRc/RSV和pRc/CMV(由InvitrogenCorp.生产)，包含来源于病毒的自主复制起点的载体如牛乳头瘤病毒(bovine papilloma virus)载体pBPV(由Amersham Pharmacia Biotech Inc.生产)和EB病毒载体pCEP4(由Invitrogen Corp.生产)，以及病毒如牛痘病毒。此外，在将昆虫细胞用作宿主细胞的情况中，″基本载体″的实例可以包括昆虫病毒如杆状病毒。
当使用含自主复制起点的载体(具体地，例如，用于酵母的载体pACT2，牛乳头瘤病毒载体pBPV，或EB病毒载体pCEP4)构建本发明的载体时，在被引入到宿主细胞后，该载体在细胞内保持为附加体。
可以通过以下方法转化宿主细胞：向其中引入允许本发明的多核苷酸在宿主细胞如微生物中表达的载体，由此制备转化体。可以根据常规细胞培养方法培养所制备的转化体，由此大量生产并获得本发明的酶。
允许本发明的多核苷酸在宿主细胞如微生物中表达的载体可以通过以下方法制备：将在宿主细胞如微生物中可操作的(operable)启动子可操作地连接到本发明的多核苷酸的上游，并将此整合到上述基本载体中。
在本文中，短语″可操作地连接或可操作连接的″是指连接启动子和本发明的多核苷酸以使本发明的多核苷酸在引入有本发明的多核苷酸的宿主细胞如微生物中在启动子的控制下表达。
在宿主细胞中可操作的启动子的实例可以包括在转移有本发明的多核苷酸的宿主细胞中显示启动子活性的DNA。在宿主细胞是大肠杆菌的情况中，在宿主细胞中可操作的启动子的实例可以包括大肠杆菌乳糖操纵子启动子(lacP)，色氨酸操纵子启动子(trpP)，精氨酸操纵子启动子(argP)，半乳糖操纵子启动子(galP)，tac启动子，T7启动子，T3启动子，和λ噬菌体启动子(λ‑pL和λ‑pR)。此外，在宿主细胞是动物细胞或裂殖酵母的情况中，在宿主细胞中可操作的启动子的实例可以包括劳斯肉瘤(Rous sarcoma)病毒(RSV)启动子，巨细胞病毒(CMV)启动子，猿病毒(SV40)早期或晚期启动子，和鼠乳瘤病毒(mouse mammary tumor virus，MMTV)启动子。此外，在宿主细胞是芽殖酵母的情况中，在宿主细胞中可操作的启动子的实例可以包括ADH1启动子(ADH1启动子可以通过常规遗传工程方法从例如携带有ADH1启动子和ADH1终止子的酵母表达载体pAAH5[可从Washington Research Foundation获得；Ammerer等，Method in Enzymology，101部分(p.192‑201)]制备)。
在使用本来就携带有在宿主细胞中可操作的启动子的基本载体的情况中，本发明的多核苷酸可以被插入到该启动子的下游以使该启动子可操作地连接到本发明的多核苷酸。在例如pRc/RSV或pRc/CMV的情况中，将克隆位点设置于在动物细胞中可操作的启动子的下游。通过将本发明的多核苷酸插入到克隆位点获得的载体可以被引入到动物细胞中，由此允许本发明的多核苷酸在动物细胞中表达。因为这些载体原本就携带有SV40自主复制起点(ori)，所以当所述载体被引入到转化有ori缺失型SV40基因组的培养的细胞(例如，COS细胞)中时，该载体的拷贝数在细胞内大量增加，并且因此，已经整合到该载体中的本发明的多核苷酸可以大量表达。此外，用于酵母的载体pACT2具有ADH1启动子，并且本发明的多核苷酸可以被插入到该载体或其衍生物中的ADH1启动子的下游，由此构建允许本发明的多核苷酸在芽殖酵母(例如，CG1945(由Clontech Laboratories，Inc.生产))中大量表达的载体。将本发明的多核苷酸连接到核糖体结合位点可以获得更高的表达。虽然关于核糖体结合位点已知Guarente.L等的报道(Cell 20，p.543(1980))以及Taniguchi等的报道(Genetics of IndustrialMicroorganisms(工业微生物的遗传学)，p.202(1982)，Kodansha Ltd.)，但是可以根据需要设计并合成适合于本发明的多核苷酸的表达的核糖体结合位点。
宿主细胞的实例可以包括微生物，例如，真核生物和原核生物。其优选的实例可以包括大肠杆菌。上述载体可以通过常规遗传工程方法被引入到宿主细胞中由此转化该宿主细胞。
适于宿主细胞的常规转染方法可以用于将本发明的载体引入到宿主细胞中的方法。在将大肠杆菌用作宿主细胞的情况中，转染方法的实例可以包括常规方法如氯化钙法以及电穿孔法，所述方法描述于，例如，J.Sambrook，E.F.Frisch，T.Maniatis；Molecular Cloning(分子克隆)第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，1989。此外，在将哺乳动物细胞或昆虫细胞用作宿主细胞的情况中，转染方法的实例可以包括常规基因转移方法如磷酸钙方法、DEAE葡聚糖法、电穿孔法和脂质转染法。此外，在将酵母用作宿主细胞的情况中，转染方法的实例可以包括常规方法如锂方法，所述方法用于，例如，Yeast transformation kit(酵母转化试剂盒)(由ClontechLaboratories，Inc.生产)。在使用病毒作为载体的情况中，可以通过如上所述的常规基因转移方法将病毒的基因组引入到宿主细胞中。此外，也可以通过用病毒颗粒感染宿主细胞而将病毒的基因组引入到宿主细胞中，所述病毒颗粒含有插入了本发明的多核苷酸的病毒的基因组。
对于本发明的转化体的选择，例如，可以将其中标记基因与本发明的载体一起被引入的宿主细胞通过适合于标记基因的性质的方法培养。在标记基因是例如赋予针对选择试剂的药物抗性的基因的情况中，引入有本发明的载体的宿主细胞可以使用补充有该选择试剂的培养基培养，所述选择试剂显示对宿主细胞的致死活性。赋予药物抗性的基因和选择试剂的组合的实例可以包括赋予新霉素抗性的基因和新霉素的组合，赋予潮霉素抗性的基因和潮霉素的组合，以及赋予杀稻瘟菌素S(Blasticidin S)抗性的基因和杀稻瘟菌素S的组合。在标记基因是互补宿主细胞的营养缺陷型的基因的情况中，引入有本发明的载体的宿主细胞可以使用不含对应于该营养缺陷型的营养物的基本培养基进行培养。此外，在引入允许本发明的多核苷酸在宿主细胞中表达的本发明的载体的情况中，可以使用基于本发明的酶的酶活性的检测方法。
为了获得其中本发明的多核苷酸位于宿主细胞的染色体中的本发明的转化体，例如，本发明的载体和具有标记基因的载体首先通过用限制酶等消化来线性化，并且然后通过上述方法将这些引入到宿主细胞中。随后，通常将细胞培养数周。然后，可以通过基于所引入的标记基因的表达水平的选择来获得目标转化体。备选地，例如，首先通过上述方法将本发明的载体引入到宿主细胞中，所述载体具有作为标记基因的如上所述的赋予对选择试剂的抗性的基因。随后，将细胞在补充有选择试剂的培养基中传代培养数周或更长。然后，已经以集落形式存活的抗选择试剂的克隆也可以被培养以用于纯化，由此选择并获得其中本发明的多核苷酸被引入到宿主细胞的染色体中的本发明的转化体。为确认引入的本发明的多核苷酸被成功地整合在宿主细胞的染色体中，根据常规遗传工程方法制备细胞的基因组DNA，并且可以使用以下方法，如PCR或DNA杂交(Southernhybridization)，利用包含引入的本发明的多核苷酸的部分核苷酸序列的DNA作为引物或探针，从制备的基因组DNA检测本发明的多核苷酸的存在。因为转化体可以冷冻保存并且如有必要的话可以在复苏后使用，可以节约每个实验的转化体制备的时间和精力，并且可以使用其性质或操作条件已被提前确认的转化体来进行测试。
含本发明的多核苷酸或本发明的载体的转化体(即，本发明的转化体)的培养可以通过常规细胞培养方法进行。
在本发明的转化体是微生物的情况中，例如，转化体可以使用适当地含有碳源、氮源、有机或无机盐等的用于常规微生物的常规培养的各种培养基培养。
碳源的实例包括：糖类如葡萄糖、糊精和蔗糖；糖醇如甘油；有机酸如富马酸、柠檬酸和丙酮酸；以及动物油、植物油和糖蜜。被添加到培养基中的碳源的量通常为培养液的大约0.1至30％(w/v)。
氮源的实例包括：天然有机氮源如肉膏、蛋白胨、酵母抽提物、麦芽提取物、大豆粉、玉米浆、棉籽粉、干酵母和酪蛋白氨基酸；氨基酸；无机酸的钠盐如硝酸钠；无机酸的铵盐如氯化铵、硫酸铵和磷酸铵；有机酸的铵盐如富马酸铵和柠檬酸铵；和尿素。在这些中，有机酸的铵盐、天然有机氮源、氨基酸等在很多情况中也可以用作碳源。被添加到培养基中的氮源的量通常为培养液的大约0.1至30％(w/v)。
有机盐或无机盐的实例可以包括钾、钠、镁、铁、锰、钴、锌、铜等的氯化物、硫酸盐、乙酸盐、碳酸盐和磷酸盐。具体地，其实例包括氯化钠、氯化钾、硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸锰、氯化钴、硫酸锌、硫酸铜、乙酸钠、碳酸钙、磷酸二氢钾和磷酸氢二钾。被添加到培养基中的有机盐和/或无机盐的量通常为培养液的大约0.0001至5％(w/v)。
此外，在其中引入有基因的转化体的情况中，例如，可以将少量的异丙基硫代‑β‑D‑半乳糖苷(IPTG)作为诱导剂加入到培养基中以用于诱导本发明的酶的产生，所述基因是通过将异乳糖可诱导型启动子如tac启动子、trc启动子和lac启动子可操作地连接到本发明的多核苷酸而制备的。
本发明的转化体的培养可以根据通常用于培养宿主细胞如微生物的方法来进行。所述方法的实例包括液体培养和固体培养，如试管振荡培养、往复式(reciprocal)振荡培养、发酵罐培养和槽培养(tank culture)。
培养温度可以在可使转化体存活的范围内适当变化，并且通常是约15℃至约40℃。培养基的pH优选为约6至约8。培养时间取决于培养条件而不同并且通常优选为约1天至约5天。
在常规蛋白质纯化中使用的方法可以应用于从本发明的转化体的培养物纯化本发明的酶的方法。例如，可以使用如下显示的方法。
首先，通过离心等从转化体的培养物收集细胞，并且然后将这些细胞通过例如以下方法均化：物理均质法如超声波处理、Dyno‑mill处理或弗氏压碎(French press)处理，或化学均质法，其使用表面活性剂，或裂解酶如溶菌酶。可以通过离心、通过薄膜过滤器过滤等将杂质从所获得的匀浆溶液中除去，由此制备不含细胞的提取物溶液，然后可以适当地使用诸如以下的分离和纯化方法将该提取物溶液分级：阳离子交换色谱，阴离子交换色谱，疏水色谱，凝胶过滤色谱，或金属螯合色谱，由此纯化本发明的酶。
用于色谱的载体的实例包括不可溶的聚合物载体如纤维素、糊精或琼脂糖，其中引入有羧甲基(CM)，二乙氨基乙基(DEAE)，苯基，或丁基。可以使用市售的装填有载体(carrier‑packed)的柱。市售的装填有载体的柱的实例包括Q‑Sepharose FF和苯基‑Sepharose HP(商品名；都由GEHealthcare Japan生产)，以及TSK‑gel G3000SW(商品名；由Tosoh Corp.生产)。
为选择包含本发明的酶的级分，例如，可以基于根据本发明的水解酶活性的出现或不出现或其出现的程度进行所述选择。可以通过以下方法进行该选择：测定不对称水解底物α‑取代的β‑氨基酸酯衍生物(具体地，例如，2‑正丁基‑3‑[(N‑苄氧基‑N‑甲酰基)氨基]丙酸乙酯)从而优先产生相应的羧酸的能力。
用本发明的酶或本发明的转化体或其加工产物处理α‑取代的β‑氨基酸酯衍生物从而优先产生相应的旋光羧酸。
与α‑取代的β‑氨基酸酯衍生物的α位的碳原子结合的取代基(下文中，简称为α‑取代基)是具有1至20个碳原子的烃基。所述烃基可以是以下任一：脂族烃基、脂环族烃基和芳族烃基以及它们的组合。对于作为α‑取代基的烃基，其碳原子数目优选为1至7，更优选为3至6。脂族烃基典型地是烷基。其实例包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、辛基、癸基、十二烷基、十四烷基、十六烷基、十八烷基和二十烷基(icosyl group)，所述基团可以是直链的或支链的。脂环族烃基的实例包括环丁基、环戊基、环己基、环辛基、环癸基、降莰烷基(norbornyl)和金刚烷基。芳族烃基典型地是芳基。芳基的实例包括苯基、萘基、蒽基和联苯基。作为α‑取代基的这些烃基也可以被取代。取代基的实例包括烷基、烷氧基、芳基、芳氧基、芳烷氧基、卤素原子、硝基和氰基。
α‑取代的β‑氨基酸酯衍生物中的α‑取代基可以是，如上所述，脂族烃基和脂环族烃基的组合，脂族烃基和芳族烃基的组合，或者脂环族烃基和芳族烃基的组合。脂族烃基和脂环族烃基的组合的实例典型地包括环烷基和烷二基(alkanediyl)的组合。具体地，其实例包括环戊基甲基、环戊基乙基、环戊基丙基、环戊基丁基、环己基甲基、环己基乙基、环己基丙基、环己基丁基、环辛基甲基、环辛基乙基、环辛基丙基和环辛基丁基。脂族烃基和芳族烃基的组合典型地是芳烷基，并且其实例包括苄基和萘基甲基。脂环族烃基和芳族烃基的组合是苯基环戊基、苯基环己基、萘基环戊基、萘基环己基等。同样，一个α‑取代基或两个彼此不同的α‑取代基可以结合到α‑位的碳原子。优选地，一个α‑取代基结合到α‑位的碳原子。
以上根据其具体实例描述了α‑取代的β‑氨基酸酯衍生物中的α‑取代基。其中，α‑取代基优选是脂族烃基，更优选是甲基、乙基、正丙基、正丁基或正戊基，尤其优选是正丁基或正戊基。用于生产生物活性物质如在以上非专利文献1和2中描述的α‑取代的β‑氨基酸衍生物的中间体物质可以容易地从其α‑取代基是甲基或正丙基的α‑取代的β‑氨基酸酯衍生物获得。同样，作为药物或农业化学品中的活性成分的旋光化合物，或其中间体，如在以上专利文献1中所述的α‑取代的β‑氨基酸衍生物，可以容易地从其α‑取代基是正丁基或正戊基的α‑取代的β‑氨基酸酯衍生物获得。
α‑取代的β‑氨基酸酯衍生物的β‑位的氨基可以具有取代基。氨基中的取代基的实例包括常规氨基保护基。氨基保护基也可以根据例如以下文献进行适当地选择：Greene等，Protective Groups in Organic Synthesis(有机合成中的保护基)，第3版，1999，John Wiley & Sons，Inc。
氨基中的取代基或氨基保护基是指，例如，可以具有取代基的具有1至10个碳原子的烷基，可以具有取代基的具有2至10个碳原子的烯基，可以具有取代基的具有7至20个碳原子的芳烷基，可以具有取代基的具有1至10个碳原子的酰基，可以具有取代基的具有2至15个碳原子的烷氧羰基，可以具有取代基的具有2至15个碳原子的烯氧羰基，可以具有取代基的具有8至20个碳原子的芳烷氧羰基，可以具有取代基的具有6至20个碳原子的亚苄基，可以具有取代基的具有1至10个碳原子的磺酰基，羧基(‑COOH)，甲酰胺基(‑CONH2)，羟基(‑OH)，可以具有取代基的具有1至10个碳原子的烷氧基，可以具有取代基的具有2至10个碳原子的烯氧基，可以具有取代基的具有7至20个碳原子的芳烷氧基，可以具有取代基的具有6至20个碳原子的芳氧基，可以具有取代基的具有2至15个碳原子的酰氧基，可以具有取代基的具有2至15个碳原子的烷氧羰氧基，可以具有取代基的具有2至15个碳原子的烯氧羰氧基，可以具有取代基的具有8至20个碳原子的芳烷氧羰氧基，或者可以具有取代基的具有4至10个碳原子的环状乙烯氧基(ethenyloxy)。
烷基的实例包括甲基、乙基、丙基和丁基，它们可以是直链的、支链的或环状的。
烯基的实例包括乙烯基和烯丙基，它们可以是直链的、支链的或环状的。
芳烷基的实例包括苄基、4‑甲氧基苄基、二苯甲基和三苯甲基。
酰基的实例包括甲酰基、乙酰基、氯乙酰基、丙酰基、丁酰基、新戊酰基、苯甲酰基和邻苯二甲酰基，它们可以是直链的、支链的或环状的。
烷氧羰基的实例包括甲氧基羰基、乙氧基羰基、2，2，2‑三氯乙氧基羰基、丙氧基羰基和丁氧基羰基，它们可以是直链的、支链的或环状的。
烯氧羰基的实例包括乙烯氧基羰基和烯丙氧基羰基，它们可以是直链的、支链的或环状的。
芳烷氧羰基的实例包括9‑芴基甲氧基羰基、苄氧基羰基、4‑甲氧基苄氧基羰基和4‑硝基苄氧基羰基。
亚苄基的实例包括亚苄基、4‑甲氧基亚苄基和二苯基亚甲基。
磺酰基的实例包括苯磺酰基、4‑甲苯磺酰基、2‑硝基苯磺酰基和4‑硝基苯磺酰基。
烷氧基的实例包括甲氧基、乙氧基、丙氧基和丁氧基，它们可以是直链的、支链的或环状的。
烯氧基的实例包括乙烯氧基和烯丙氧基，它们可以是直链的、支链的或环状的。
芳烷氧基的实例包括苄氧基和4‑甲氧基苄氧基。
芳氧基的实例包括苯氧基和萘氧基。
酰氧基的实例包括乙酰基氧基、氯乙酰基氧基、丙酰基氧基、丁酰基氧基、新戊酰基氧基和苯甲酰基氧基，它们可以是直链的、支链的或环状的。
烷氧羰氧基的实例包括甲氧基羰基氧基、乙氧基羰基氧基、2，2，2‑三氯乙氧基羰基氧基、丙氧基羰基氧基和丁氧基羰基氧基，它们可以是直链的、支链的或环状的。
烯氧羰氧基的实例包括乙烯氧基羰基氧基和烯丙氧基羰基氧基，它们可以是直链的、支链的或环状的。
芳烷氧羰氧基的实例包括9‑芴基甲氧基羰基氧基、苄氧基羰基氧基、4‑甲氧基苄氧基羰基氧基和4‑硝基苄氧基羰基氧基。
环状乙烯氧基的实例包括四氢‑2H‑吡喃‑2‑基氧基、四氢呋喃‑2‑基氧基和1，4‑二烷‑2‑基氧基。
此外，烷基，烯基，芳烷基，酰基，烷氧羰基，烯氧羰基，芳烷氧羰基，亚苄基，磺酰基，烷氧羰基，甲酰胺基，烷氧基，烯氧基，芳烷氧基，芳氧基，酰氧基，烷氧羰氧基，烯氧羰氧基，芳烷氧羰氧基，和环状乙烯氧基可以进一步具有取代基。所述取代基与被例举为作为α‑取代基的烃基取代基的那些是相同的。
氨基保护基可以被0、1或2个取代基取代。在2个取代基的情况中，这些取代基可以是彼此相同的或不同。
以上，根据其具体实例描述了β‑位的氨基中的取代基。其中，β‑位的氨基中的取代基优选为氢原子，具有1至10个碳原子的酰基，或者具有7至20个碳原子的芳烷氧基，更优选为甲酰基或苄氧基，尤其优选为甲酰基和苄氧基的组合。
结合到β‑位的碳原子的不同于氨基的取代基不受具体限制，并且优选为氢原子。
α‑取代的β‑氨基酸酯衍生物中具有酯键的基团是可以具有取代基的具有2至10个碳原子的烷氧羰基。所述烷氧羰基可以是直链的或支链的。此外，烷氧羰基的具体实例与被描述为是作为β‑位的氨基中的取代基或保护基的烷氧羰基的那些相同，其中碳原子数目为2至10。对于烷氧羰基，其碳原子的数目更优选为2至4。甲氧基羰基或乙氧基羰基是尤其优选的。烷氧羰基中的任选取代基与作为α‑取代基中的任选取代基被例举的那些相同。
在本文中，优选的α‑取代的β‑氨基酸酯衍生物的实例具体地包括2‑正丁基‑3‑[(N‑苄氧基)氨基]丙酸甲酯，2‑正丁基‑3‑[(N‑苄氧基)氨基]丙酸乙酯，2‑正戊基‑3‑[(N‑苄氧基)氨基]丙酸甲酯，2‑正戊基‑3‑[(N‑苄氧基)氨基]丙酸乙酯，2‑正丁基‑3‑[(N‑苄氧基‑N‑甲酰基)氨基]丙酸甲酯，2‑正丁基‑3‑[(N‑苄氧基‑N‑甲酰基)氨基]丙酸乙酯，2‑正戊基‑3‑[(N‑苄氧基‑N‑甲酰基)氨基]丙酸甲酯，和2‑正戊基‑3‑[(N‑苄氧基‑N‑甲酰基)氨基]丙酸乙酯。其中，2‑正丁基‑3‑[(N‑苄氧基‑N‑甲酰基)氨基]丙酸甲酯或2‑正丁基‑3‑[(N‑苄氧基‑N‑甲酰基)氨基]丙酸乙酯是尤其优选的。
α‑取代的β‑氨基酸酯衍生物的旋光异构体混合物可以通过本领域中已知的制备方法获得。该制备方法描述于，例如，ARKICOV 2010(iX)，p.196至205中。
旋光α‑取代的β‑氨基酸酯衍生物可以是外消旋物，或者可以是其中旋光异构体以任意比率混合的混合物。该外消旋物或混合物可以是新鲜制备的或者可以在溶解后使用。
通过用本发明的酶、本发明的转化体或它的加工产物处理α‑取代的β‑氨基酸酯衍生物获得的旋光α‑取代的β‑氨基酸衍生物的实例具体地包括(R)‑2‑正丁基‑3‑[(N‑苄氧基)氨基]丙酸，(R)‑2‑正戊基‑3‑[(N‑苄氧基)氨基]丙酸，(R)‑2‑正丁基‑3‑[(N‑苄氧基‑N‑甲酰基)氨基]丙酸，和(R)‑2‑正戊基‑3‑[(N‑苄氧基‑N‑甲酰基)氨基]丙酸，以及其中上述的(R)被(S)取代的化合物。
当用本发明的转化体或其加工产物处理α‑取代的β‑氨基酸酯衍生物以生产相应的旋光羧酸时，所述反应通常在水的存在下进行。用于该反应中的水可以是缓冲的水溶液。在缓冲的水溶液中使用的缓冲液的实例可以包括：碱金属的磷酸盐，如磷酸钠和磷酸钾；碱金属的乙酸盐，如乙酸钠水溶液和乙酸钾；及其混合物。
在反应中，可以允许有机溶剂与水共存。可以允许共存的有机溶剂的实例可以包括：醚如叔丁基甲基醚，二异丙基醚，和四氢呋喃；酯如甲酸乙酯，乙酸乙酯，乙酸丙酯，乙酸丁酯，丙酸乙酯，和丙酸丁酯；烃如甲苯，己烷，环己烷，庚烷，和异辛烷；醇如甲醇，乙醇，2‑丙醇，丁醇，和叔丁醇；有机硫化合物如二甲亚砜；酮如丙酮；腈如乙腈；和它们的混合物。
例如通过以下方式进行反应：通过搅拌、振荡等，将水和α‑取代的β‑氨基酸酯衍生物与本发明的酶或生产本发明的酶的转化体或其加工产物混合，如有必要，在进一步含有有机溶剂等的状态下进行。
反应期间的pH可以适当地选择并且通常为pH3至10。此外，反应温度可以适当地选择，并且考虑到原料和产物的稳定性以及反应速率，通常为0至60℃。
可以例如通过液相色谱等监视α‑取代的β‑氨基酸衍生物在反应溶液中的量来确定反应的终点。可以适当地选择反应时间，并且通常为0.5小时至10天。
反应完成后的反应溶液包含不对称水解反应产物α‑取代的β‑氨基酸衍生物和剩余的α‑取代的β‑氨基酸酯衍生物。为了分离它们，例如，采用这样的方法，所述方法涉及进行水/疏水有机溶剂萃取操作从而将剩余的α‑取代的β‑氨基酸酯衍生物和α‑取代的β‑氨基酸衍生物分别分配到有机层(疏水有机溶剂层)和水层中，并在有机层和水层之间进行分离。
为了从酶、缓冲液或其他水溶性组分分离作为目的化合物的旋光α‑取代的β‑氨基酸衍生物，可以使用疏水有机溶剂将旋光α‑取代的β‑氨基酸衍生物萃取到有机层中，然后将该有机层与水层分离。
疏水有机溶剂的实例包括：醚如叔丁基甲基醚和异丙醚；烃如甲苯，己烷，环己烷，庚烷，辛烷和异辛烷；卤代烃如二氯甲烷，二氯乙烷，氯仿，氯苯，和邻二氯苯；以及酯如乙酸乙酯，乙酸甲酯，和乙酸丁酯。在反应期间使用这些疏水有机溶剂的情况中，反应完成后的反应溶液可以直接进行分离操作，前提是它可以分离成有机层和水层。备选地，在反应期间不使用疏水有机溶剂或者由于所用的疏水有机溶剂或水的量少反应溶液不容易分离成有机层和水层或者由于所用的水的量少而不能容易地分离的情况中，可以适当添加疏水有机溶剂或水等，之后进行分离。所用疏水有机溶剂的量不受具体限制，并且相对于1重量份的α‑取代的β‑氨基酸酯衍生物的旋光异构体，通常为约0.1至200重量份，优选为约0.2至100重量份。
目的化合物萃取期间的pH通常为约2至10，优选为约4至8。
可以适当地使用酸和碱将溶液调至所述pH。在从水层萃取目的化合物不充分的情况中，可以将相同的萃取和分离操作重复若干次。此外，在从有机层去除水溶性组分不充分的情况中，可以将相同的萃取和分离操作重复若干次，如上所述。
因此通过萃取与不对称水解产物羧酸分离的剩余的酯可以通过蒸馏出油层中的有机溶剂而分离。所获得的旋光α‑取代的β‑氨基酸酯衍生物可以进行外消旋化处理，并且由此作为α‑取代的β‑氨基酸酯衍生物的旋光异构体混合物再循环。
因此通过蒸馏出油层中的有机溶剂分离的剩余的酯可以通过柱色谱等进一步纯化。
在萃取后，作为不对称水解产物的旋光α‑取代的β‑氨基酸衍生物被包含在分离的水层中，并且例如，通过蒸馏出水或在中和处理后使用有机溶剂对其进行萃取，可以容易地将其从水层中提取出。分离的α‑取代的β‑氨基酸衍生物可以通过蒸馏出油层中的有机溶剂来分离。
因此获得的旋光α‑取代的β‑氨基酸衍生物可以通过纯化操作如柱色谱、再结晶或再沉淀进一步纯化。在纯化操作如再结晶或再沉淀中，可以使用合适的碱将旋光α‑取代的β‑氨基酸衍生物进一步转变为盐，并且然后通过再结晶或再沉淀来纯化该盐。纯化的盐可以通过适当的方法转变回旋光α‑取代的β‑氨基酸衍生物。
本发明的酶或生产所述酶的转化体或所述转化体的加工产物可以以多种形式用于上述方法。
具体形式的实例可以包括本发明的转化体的培养物，该转化体的加工产物，不含细胞的抽提物溶液，半纯化的蛋白质，纯化的蛋白质，和它们被固定化的形式。在本文中，转化体的处理产物的实例可以包括冻干的转化体，有机溶剂处理的转化体，干燥的转化体，经碾磨的转化体，转化体自溶物，经超声波处理的转化体，转化体抽提物，和碱处理的转化体。用于获得被固定化的形式的方法的实例可以包括载体结合法(该方法涉及将本发明的酶等吸附到无机载体(硅胶、陶瓷等)、纤维素、离子交换树脂等上)和包埋法(该方法涉及使本发明的酶等被截留在聚合物的网状结构中，所述聚合物如聚丙烯酰胺、含硫的多糖凝胶(例如，角叉藻聚糖)、藻酸凝胶或琼脂凝胶)。
考虑到使用本发明的转化体的工业生产，使用其中转化体是死亡的加工产物的方法比使用未处理的转化体的方法更优选，原因在于其较少受生产设备的限制。用于此目的的微生物灭活处理方法的实例可以包括物理灭菌法(加热、干燥、冷冻、光束、超声波、过滤和通电(electrification))，和利用化学品(碱、酸、卤素、氧化剂、硫、硼、砷、金属、醇、酚、胺、硫化物、醚、醛、酮、氰和抗生素)的灭菌法。通常优选的是从这些灭菌方法中选择这样的处理方法，其较少通过残余、污染等影响反应系统，同时尽可能地避免本发明的酶的还原酶活性的失活。
本发明的酶修饰方法是用于修饰包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的酶的方法，所述方法包括将SEQ ID NO：1的氨基酸序列中的第277位的酪氨酸用丙氨酸、色氨酸、异亮氨酸或组氨酸取代的步骤。
包括在本发明的酶修饰方法中的步骤可以根据类似于以上描述(例如，关于本发明的酶和本发明的多核苷酸的制备的描述)以及下述实施例(例如，本发明的多核苷酸的制备：位点定向诱变)中的那些的方法进行。
本发明的多核苷酸修饰方法是用于修饰包含编码SEQ ID NO：1的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸的方法，所述方法包括将编码SEQ IDNO：1的氨基酸序列的核苷酸序列中第829至831位的编码酪氨酸的密码子用编码丙氨酸、色氨酸、异亮氨酸或组氨酸的密码子取代的步骤。
包括在本发明的多核苷酸修饰方法中的步骤可以根据类似于以上描述(例如，关于本发明的酶和本发明的多核苷酸的制备的描述)以及下述实施例(例如，本发明的多核苷酸的制备：位点定向诱变)中的那些的方法进行。
实施例
下文中，将根据实施例更具体地描述本发明。然而，本发明不限于这些实施例。
对于用于基因克隆和质粒构建的方法，″Molecular Cloning：ALaboratory Manual(分子克隆：实验室手册)第二版″(1989)，Cold SpringHarbor Laboratory Press，ISBN 0‑87969‑309‑6，″Current Protocols inMolecular Biology(当前分子生物学方法)″(1987)，John Wiley & Sons，Inc.ISBN O‑471‑50338‑X等中描述的方法可以用作参考。下文中，将详细描述诸如克隆的步骤。
实施例1(本发明的多核苷酸的制备：位点定向诱变)
(1‑1)位点定向诱变操作
合成如在SEQ ID NO：2至9中所示的合成的寡核苷酸，其用作用于诱变的引物，使得第277位的酪氨酸可以被丙氨酸、色氨酸、异亮氨酸或组氨酸取代。引入诱变后的氨基酸以及关于诱变用引物的相应的SEQ IDNO和核苷酸序列显示在表1中。
[表1]

将描述于日本专利号3875283中的表达质粒：pCC101用作模板，从而根据以下所示的反应溶液组成和反应条件，使用由SEQ ID NO：2显示的寡核苷酸和由SEQ ID NO：3显示的寡核苷酸作为引物，并且使用由Stratagene Corp生产的QuickChange II位点定向诱变试剂盒进行PCR。所获得的PCR反应溶液被称为PCR反应溶液(A)。
[反应溶液组成]

[PCR反应条件]
将包含具有如上所述的反应溶液组成的反应溶液的容器放置在PERKIN ELMER‑GeneAmp PCR System 2400中，并在95℃进行1分钟孵育；进行由12个循环组成的孵育，每个循环包括95℃50秒，随后55℃1分钟以及68℃5分钟；并且在4℃孵育。
将1μl的DpnI限制酶(包括在试剂盒中)添加至所获得的PCR反应溶液(A)中，并且然后在37℃孵育1小时。将所获得的孵育溶液用于转化大肠杆菌JM109。以如上所述相同的方式，使用SEQ ID NO：4和5的寡核苷酸、SEQ ID NO：6和7的寡核苷酸或者SEQ ID NO：8和9的寡核苷酸(而不是使用SEQ ID NO：2和3的寡核苷酸)进行PCR。以如上所述相同的方式，将1μl的DpnI限制酶添加至所获得的PCR反应溶液中，之后在37℃孵育1小时，并且用所获得的溶液转化大肠杆菌JM109。
(1‑2)变体的测序
从在(1‑1)中获得的每种转化体中抽提载体，并且然后通过双脱氧法对突变位点进行测序以确认核苷酸序列如设计的那样被突变。以此方式，获得含本发明的表达质粒中每一种(本发明的载体：277A、277W、277I和277H)的转化体(即，本发明的转化体)。
实施例2通过转化体微生物生产本发明的酶
将通过实施例1获得的各自转化了用于表达本发明的酶的质粒的四种重组大肠杆菌分别接种到LB培养基(1％胰蛋白胨，0.5％酵母抽提物和0.5％NaCl)中，并且然后在37℃培养。在对数生长期将IPTG(异丙基‑β‑D‑硫代吡喃半乳糖苷)以1mM的终浓度添加到其中，从而诱导水解酶(本发明的酶)的表达。在完成培养后，通过离心(8000g，10min.，4℃)收集细菌细胞并且使用玻璃珠对其进行均化。然后，对每种匀浆溶液的部分离心上清进行SDS‑PAGE。结果，在所有这四种样品中，在约40000的分子量位置观察到作为主要条带的水解酶，并且本发明的酶在所有大肠杆菌样品中高表达。
实施例3至6
制备旋光2‑正丁基‑3‑[(N‑苄氧基‑N‑甲酰基)氨基]丙酸
将表2中所示量的包含通过实施例2获得的四种本发明的酶中的每一种的酶溶液分别称重到容器中，并向其中加入5mL的0.1M磷酸钾缓冲液(pH 7.0)和40.0mg的2‑正丁基‑3‑[(N‑苄氧基‑N‑甲酰基)氨基]丙酸乙酯的旋光异构体混合物(外消旋物)。将这些溶液各自在25℃搅拌48小时，并且然后向其中加入1mL的3.4％磷酸水溶液和10mL的叔丁基甲基醚并混合。静置混合物，并且然后通过高效液相色谱[柱：CHIRALPAK AD‑H，4.6mmφ×25cm，5μm(由Daicel Corp.生产)]分析叔丁基甲基醚层它的光学纯度，并且通过高效液相色谱[柱：Cadenza CD‑18，4.6mmφ×15cm，3μm(由Imtakt Corp.生产)]分析它的化学纯度，从而确定所获得的旋光2‑正丁基‑3‑[(N‑苄氧基‑N‑甲酰基)氨基]丙酸的转化率和对映体过量百分比(enantiomeric excess)。结果显示在表2中。
[表2]

转化率(％)＝产物的量/(底物的量+产物的量)×100
对映体过量百分比(％ee)＝(A‑B)/(A+B)×100(A和B代表相应的对映体的量，其中A＞B)。
[工业适用性]
本发明可以提供，例如，具有优异光学选择性的水解酶，所述水解酶用于制备例如可用作药物或农业化学品中的活性成分的化合物或其中间体(尤其，旋光化合物或其中间体)的有机合成反应。