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1、(10)申请公布号 CN 103156873 A (43)申请公布日 2013.06.19 CN 103156873 A *CN103156873A* (21)申请号 201310113327.5 (22)申请日 2013.04.02 A61K 31/704(2006.01) A61P 1/16(2006.01) C07H 15/244(2006.01) C07H 1/08(2006.01) (71)申请人 上海和黄药业有限公司 地址 200331 上海市普陀区真南路 2098 号 (72)发明人 丁丽丽 刘轩 杨莉 王峥涛 詹常森 沈丹萍 王玲 张正光 (74)专利代理机构 上海光华专利事务。
2、所 31219 代理人 许亦琳 余明伟 (54) 发明名称 大黄素 -8-O-D- 葡萄糖苷在制备保肝利 胆药物中的新用途 (57) 摘要 本发明涉及中药研究领域， 具体涉及大黄 素 -8-O-D- 葡萄糖苷在制备保肝利胆药物中 的新用途。本发明还制备了一种保肝利胆药物制 剂， 其有效成分为大黄素 -8-O-D- 葡萄糖苷。 本发明通过 ANIT 诱发的大鼠肝内胆汁淤积模型， 研究并证实了大黄素 -8-O-D- 葡萄糖苷针对 肝内胆汁淤积疾病， 能显著降低血清转氨酶水平， 促进胆汁排泄， 增加胆汁流量， 具有保肝利胆的功 效， 将其应用于保肝利胆药物的研发将能创造良 好的经济效益和广泛的社会效。
3、益。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 9 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书9页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103156873 A CN 103156873 A *CN103156873A* 1/1 页 2 1. 大黄素 -8-O-D- 葡萄糖苷在制备保肝利胆药物中的应用。 2. 如权利要求 1 所述的应用， 其特征在于， 所述应用为大黄素 -8-O-D- 葡萄糖苷作 为主要有效成分在制备保肝利胆药物中的应用。 3. 如权利要求 1 或 2 任一权利要求所述的应用， 其特征在于， 所述应用为大黄 素。
4、 -8-O-D- 葡萄糖苷作为单一有效成分在制备保肝利胆药物中的应用。 4.如权利要求1所述的应用， 其特征在于， 所述保肝利胆药物为胆汁淤积预防和/或治 疗药物。 5.如权利要求4所述的应用， 其特征在于， 所述保肝利胆药物为肝内胆汁淤积预防和/ 或治疗药物。 6. 一种保肝利胆药物制剂， 其有效成分为大黄素 -8-O-D- 葡萄糖苷。 7. 如权利要求 6 所述的保肝利胆药物制剂， 其特征在于， 所述保肝利胆药物制剂中， 还 含有药学上可接受的载体。 8. 如权利要求 6 所述的保肝利胆药物制剂， 其特征在于， 所述保肝利胆药物为口服制 剂。 9. 如权利要求 8 所述的保肝利胆药物制剂，。
5、 其特征在于， 所述保肝利胆药物制剂形式 选自片剂、 颗粒剂、 丸剂或胶囊剂。 10. 一种从胆宁片中提取大黄素 -8-O-D- 葡萄糖苷的方法， 其具体步骤如下 ： 1） 取胆宁片粉末， 采用乙醇水溶液提取 1 3 次， 浓缩得到胆宁片浸膏 ； 2） 将胆宁片浸膏用热水溶解、 过滤， 将滤液上样到填充有 D101 型大孔树脂的柱子， 上 样后分别用蒸馏水、 20% 的乙醇、 50% 的乙醇、 70% 的乙醇及 95% 的乙醇洗脱 ； 3） 收集 50% 的乙醇洗脱物， 并将该洗脱物反复经凝胶柱分离， 即可得到纯化的大黄 素 -8-O-D- 葡萄糖苷。 权 利 要 求 书 CN 1031568。
6、73 A 2 1/9 页 3 大黄素 -8-O-D- 葡萄糖苷在制备保肝利胆药物中的新 用途 技术领域 0001 本发明涉及中药研究领域， 具体涉及大黄素 -8-O-D- 葡萄糖苷在制备保肝利 胆药物中的新用途。 背景技术 0002 肝内胆汁淤积 （intrahepatic cholestasis） 由于各种原因使肝细胞排泌胆汁障 碍， 以致肝内胆汁淤滞和血中胆汁成分增多， 而无胆道阻塞者， 称为肝内胆汁淤积。可见于 原发性胆汁性肝硬变、 病毒性肝炎、 某些药物的损害 （如酒精、 氯丙嗪、 睾丸酮、 妊酮等） 及个 别孕妇。其病变特点 ： 光镜下， 可见有肝细胞肿胀， 内有胆色素沉积 ； 严重。
7、的， 有少数肝细胞 变性坏死， 毛细胆管内胆汁浓缩和有胆栓形成。电镜下， 毛细胆管扩张， 微绒毛减少， 变平、 甚至消失， 滑面内质网呈不规则之增生， 线粒体的嵴卷曲， 毛细胆管周围溶酶体增多等。 0003 肝内胆汁淤积的发病机制， 目前还不完全清楚， 可能与下列因素有关 ： 0004 1） 自身免疫机制 ： 原发性胆汁性肝硬化被认为与自身免疫有密切关系， 早期见小 胆管周围有淋巴细胞浸润和小胆管上皮细胞增生和坏死 ； 以后发展成小胆管周围纤维组织 增生和小叶间胆管萎缩， 数目减少。病人血中抗线粒体抗体、 抗小胆管抗体检出率高， 免疫 球蛋白浓度高。 0005 2） 滑面内质网功能障碍 ： 胆。
8、固醇先在肝细胞滑面内质网中羟化， 再在线粒体中 进行侧链氧化， 生成游离型初级胆汁酸 （primary bile acibs） ， 其中主要是三羟基的胆酸 （cholic acid） 和二羟基的鹅脱氧胆酸 （lithochocholic acid） 很少。游离型胆汁酸再 与牛磺酸或甘氨酸结合， 形成结合型初级胆汁酸 （如牛磺胆酸或甘氨胆酸、 牛磺鹅脱氧胆酸 或甘氨鹅脱氧胆） ， 与胆红素、 胆固醇形成亲水性强的乳粒， 分泌入毛细胆管， 经胆管排入肠 道。胆汁酸盐在肠内受细菌作用， 水解脱羟， 成为次级胆汁酸 （secondary bile acids） ， 例 如牛磺胆酸变为脱氧胆酸 （deo。
9、xycholicacid） ， 甘氨鹅脱氧胆酸变为石胆酸， 然后被重吸收 入肝， 再经过羟化生成胆酸和鹅脱氧胆酸。 0006 肝细胞主动分泌胆汁酸盐， 使毛细胆管内渗透压升高， 使水和电解质进入毛细胆 管， 因此胆汁酸盐是决定毛细胆管胆汁流量的重要因素， 这部分胆汁称为 “胆盐依赖性胆 流”（bile saltdependent bile flow， BSDF） 。 滑面内质网质损， 羟化胆固醇功能降低， 此时 胆固醇直接经侧链氧化而生成大量的石胆酸 ； 从肠道重吸收入肝的石胆酸也增多， 而在肝 内又不能再羟化， 因而在细胞内石胆酸过多。 胆汁酸为两亲性化合物， 一端为极性基团 （-0H 等）。
10、 ， 另一端为非极性基团 （CH 等） ， 胆酸和鹅脱氧胆酸含羟基较多， 极性较高， 与胆红素和胆 固醇形成的乳粒亲水性强， 较易通过毛细胆管微绒毛分泌入毛细胆管， 而石胆酸的羟基少， 极性低， 与胆红素和胆固醇形成的乳粒亲水性差， 在毛细胆管微绒毛内发生淤积， 渗透活性 降低， 从而使胆盐依赖性胆流减少， 引起肝内胆汁淤积。 0007 3） 毛细胆管内胆流受到抑制 ： 胆盐分泌可以带动水分流入毛细血管， 这是推动毛 细胆管内胆管内胆汁流动的一个因素。但是， 在毛细胆管内胆汁流动率中还有 40 70 说 明 书 CN 103156873 A 3 2/9 页 4 是由另外的因素推动的， 叫做 “。
11、不依赖于胆盐的胆流 （bile salt independent bile flow， BSIF） 。 BSIF在毛细胆管的胆汁流中似有更重要作用。 实验证明， 氨丙嗪、 雌激素、 特别是炔 雌醇可抑制 BSIF。凡能抑制细胞质膜 Na+-K+-ATP 酶的物质 （如毒毛旋花苷） ， 可抑制 BSIF。 氯丙嗪和炔雌醇 （避孕药） 在人可引起肝内胆汁淤积， 可能是通过抑制Na+-K+-ATP酶而起作 用的。 0008 胆汁酸的生成和肝肠循环正常石胆酸生成很少， 结合石胆酸约占结合型胆汁酸总 量的 1 2， 滑面内质网功能障碍时， 石胆酸生成增多。 0009 4） 微丝的功能降低 ： 毛细胆管微。
12、绒毛中有丰富的微丝， 其中含有肌动蛋白样的收 缩蛋白。 微丝在胆汁分泌中的重要性可用下述实验说明 ； 用细胞松弛素 （选择性地降低微丝 的功能） 灌流大鼠肝脏 1 小时， 胆汁流量减少 50， 灌流 2 小时， 胆流完全停止， 微丝的作用 大概是通过它的收缩、 松弛， 使微绒毛变形， 毛细胆管扩张或缩小， 从而推动胆汁流动。 0010 各种原因引起的肝内胆汁淤积， 几乎无例外地都有毛细胆管微绒毛的形态变化， 如肿胀、 变形、 数目减少等。 0011 由于肝细胞胆汁分泌障碍， 发生肝内胆汁淤积， 胆汁则从肝细胞弥散入血， 造成肝 内胆汁淤积性黄疸， 血液中胆汁酸盐增多。其胆色素代谢变化 ： 血清。
13、结合胆红素明显增多， 胆红素定性试验直接阳性反应 ； 粪和尿内尿 （粪） 胆素元减少 ； 尿内胆红素阳性。除胆红素 代谢变化外， 绝大多数病人血清硷性磷酸酶显著升高， 还有其它肝功能损害的变化。 0012 胆宁片是上海和黄药业有限公司按照原三类新药要求开发研制的中药， 是国家实 行新药审批办法后上海地区第一个国家级中药新药 （原三类新药） ， 由于疗效明确， 无毒副 作用， 服用方便而深受广大患者欢迎。 0013 胆宁片由大黄、 虎杖、 青皮、 白茅根、 陈皮、 郁金、 山楂等 7 味药材组成， 为新的中药 复方。具有疏肝利胆、 清热通下的功效， 临床用于肝郁气滞、 湿热未清所致的右上腹隐隐作。
14、 痛， 食入作胀， 胃纳不香、 嗳气、 便秘 ； 慢性胆囊炎等上述症候者的治疗。 0014 研究发现胆宁片对 ANIT（- 萘异硫氰酸酯， -naphthyl isothiocy） 所致的胆 汁淤积具有很好的保护作用， 但是胆宁片药味较多， 药效成分复杂， 胆宁片具体的药效物质 基础尚未有报道。 发明内容 0015 本发明的目的在于克服现有技术的局限， 对大黄素 -8-O-D- 葡萄糖苷 (Emodin-8-O-D-glucopyranoside) 针对肝内胆汁淤积的保护作用效果进行研究， 确切 了大黄素 -8-O-D- 葡萄糖苷对肝内胆汁淤积的保护作用。 0016 本发明首先公开了大黄素 -。
15、8-O-D- 葡萄糖苷在制备保肝利胆药物中的应用。 0017 较优的， 所述保肝利胆药物为胆汁淤积预防和 / 或治疗药物。 0018 更优的， 所述保肝利胆药物为肝内胆汁淤积预防和 / 或治疗药物。 0019 优选的， 所述应用为大黄素 -8-O-D- 葡萄糖苷作为主要有效成分在制备保肝 利胆药物中的应用。 0020 更优的， 所述应用为大黄素 -8-O-D- 葡萄糖苷作为单一有效成分在制备保肝 利胆药物中的应用。 0021 本发明通过研究发现， 针对 ANIT（- 萘异硫氰酸酯， -naphthyl isothiocy） 说 明 书 CN 103156873 A 4 3/9 页 5 所致肝内。
16、胆汁淤积大鼠， 施用大黄素 -8-O-D- 葡萄糖苷的实验组与未施用任何药物的 空白对照组相比， 大鼠血清中谷丙转氨酶 （ALT） 、 谷草转氨酶 （AST） 和碱性磷酸酶 （ALP） 的 活力减低， 总胆红素 （TBIL）和直接胆红素 （DBIL）的含量下降， 胆汁流量增加， 可见大黄 素 -8-O-D- 葡萄糖苷具有利胆、 保肝降酶的功效， 可用于保肝利胆药物的研发。 0022 本 发 明 第 二 方 面 公 开 了 一 种 保 肝 利 胆 药 物 制 剂， 其 有 效 成 分 为 大 黄 素 -8-O-D- 葡萄糖苷。 0023 本发明的保肝利胆药物制剂中， 仅含有大黄素 -8-O-D-。
17、 葡萄糖苷这一单一有 效成分。 0024 较优的， 所述保肝利胆药物为胆汁淤积预防和 / 或治疗药物 ； 更优的， 所述保肝利 胆药物为肝内胆汁淤积预防和 / 或治疗药物。 0025 本发明的保肝利胆药物制剂中， 含有治疗有效量的大黄素 -8-O-D- 葡萄糖苷。 0026 较优的， 所述保肝利胆药物制剂中， 还含有药学上可接受的载体。 0027 较优的， 大黄素-8-O-D-葡萄糖苷在所述药物制剂中的质量百分比为550%。 0028 更优的， 大黄素 -8-O-D- 葡萄糖苷在所述药物制剂中的质量百分比为 20 50%。 0029 所述药学上可接受的载体为各种药学上常用的辅料和 / 或赋形剂。
18、， 包括 ( 但不限 于 ) 糖类 （如乳糖、 葡萄糖和蔗糖） ， 淀粉 （如玉米淀粉和土豆淀粉） ， 纤维素及其衍生物 （如羧 甲基纤维素钠、 乙基纤维素和甲基纤维素） ， 黄蓍胶粉末， 麦芽， 明胶， 滑石， 固体润滑剂 （如 硬脂酸和硬脂酸镁） ， 硫酸钙， 植物油， 如花生油、 棉籽油、 芝麻油、 橄榄油、 玉米油和可可油， 多元醇 （如丙二醇、 甘油、 山梨糖醇、 甘露糖醇和聚乙二醇） ， 海藻酸， 乳化剂 （如 Tween） ， 润湿 剂 （如月桂基硫酸钠） ， 着色剂， 调味剂， 压片剂、 稳定剂， 抗氧化剂， 防腐剂， 无热原水， 等渗 盐溶液和磷酸盐缓冲液等 ； 该载体可根据。
19、需要提高配方的稳定性、 活性及生物有效性等， 或 在口服的情况下产生可接受的口感或气味。 0030 本发明的药物制剂可以按照药剂学上的通用方法制成任何常规的形式， 包括口服 制剂和注射制剂。 所述口服制剂优选的是片剂、 颗粒剂、 丸剂、 粉剂、 糖浆剂、 汤剂和胶囊剂 ； 更优选为片剂、 颗粒剂、 丸剂和胶囊剂。 0031 本发明药物制剂中所使用的大黄素 -8-O-D- 葡萄糖苷即可以采用现有技术 从中药材虎杖、 大黄以及何首乌中提取， 也可以直接从市面上进行购买， 或者从含有大黄 素 -8-O-D- 葡萄糖苷的药物 （例如胆宁片） 中进行提取。 0032 从胆宁片中提取大黄素 -8-O-D-。
20、 葡萄糖苷的方法如下 ： 0033 1） 取胆宁片粉末， 采用乙醇水溶液提取 1 3 次， 浓缩得到胆宁片浸膏 ； 0034 2） 将胆宁片浸膏用热水溶解、 过滤， 将滤液上样到填充有 D101 型大孔树脂的柱 子， 上样后分别用蒸馏水 (15L)， 20% 的乙醇 (20L)， 50% 的乙醇 (20L)， 70%(20L) 的乙醇及 95% 的乙醇 (20L) 洗脱 ； 0035 3） 收集 50% 的乙醇洗脱物， 并将该洗脱物反复经凝胶柱分离， 即可得到纯化的大 黄素 -8-O-D- 葡萄糖苷。 0036 较优的， 步骤 1） 所述乙醇水溶液浓度为 80 95%。 0037 更优的， 步。
21、骤 1） 所述乙醇水溶液浓度为 95%。为节省成本， 步骤 1） 可采用 95% 的 工业酒精进行提取。本发明中乙醇的浓度均为体积百分比。 说 明 书 CN 103156873 A 5 4/9 页 6 0038 较优的， 步骤 3） 对洗脱物进行分离的重复次数不少于两次。 0039 本发明的有益效果为 ： 本发明通过 ANIT 诱发的大鼠肝内胆汁淤积模型， 研究并证 实了大黄素 -8-O-D- 葡萄糖苷作用于肝内胆汁淤积， 能促进胆汁排泄， 增加胆汁流量， 具有保肝降酶的功效， 将其应用于保肝利胆药物的研发将能创造良好的经济效益和广泛的 社会效益。 附图说明 0040 图 1 ： 从胆宁片中提。
22、取大黄素 -8-O-D- 葡萄糖苷的分离流程图 0041 图 2 ： 大黄素 -8-O-D- 葡萄吡喃糖苷的结构式 0042 图 3 ： 各组大鼠肝脏病理切片图 具体实施方式 0043 下面结合具体实施例进一步阐述本发明， 应理解， 以下实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的保护范围。 0044 实施例 1 0045 本实施例的目的在于提供一种从胆宁片中提取大黄素 -8-O-D- 葡萄糖苷的方 法。 0046 1. 实验材料和方法 0047 1.1 实验材料、 仪器与试剂 0048 胆宁片粉末 （批次 ： 20100315 上海和黄药业有限公司） 0049 DK-S24 型电热恒温水浴锅。
23、 （上海精宏实验设备有限公司） 0050 DHG-9070A 型电热恒温鼓风干燥箱 （上海精宏实验设备有限公司） 0051 KW-250DB 型数控超声波清洗器 （昆山市超声仪器有限公司） 0052 SENCO R205 旋转蒸发器 ( 上海申生科技有限公司 ) 0053 SENCO W201 恒温水浴锅 ( 上海申生科技有限公司 ). 0054 试剂均为国产分析纯。 0055 1.2 胆宁片浸膏的提取 0056 胆宁片粉末 800g， 95% 的工业酒精 4L 提取三次浓缩得到浸膏 384.6g。 0057 1.3 大黄素 8-O-D- 葡萄糖苷分离 0058 D101 型大孔树脂 3kg 。
24、经 1% 的盐酸 4L 浸泡 2h， 蒸馏水洗至中性后， 1% 的氢氧化钠 溶液4L浸泡2h， 蒸馏水洗至中性后， 用95%的工业乙醇冲洗至无味， 再用蒸馏水将工业乙醇 全部更换之。 0059 浸膏用热水溶解， 过滤后将滤液上样后分别用蒸馏水 (15L)， 20% 的乙醇 (20L)， 50% 的乙醇 (20L)， 70%(20L) 的乙醇及 95% 的乙醇 (20L) 洗脱。 0060 50%的乙醇洗脱物经反复上凝胶柱得到大黄素-8-O-D-葡萄糖苷8.037g， 提取 分离流程图如图 1 所示。 0061 2. 分离结果 0062 2.1 化合物结构鉴定 0063 2.1.1 大黄素 -8。
25、-O-D- 葡萄吡喃糖苷 ： 说 明 书 CN 103156873 A 6 5/9 页 7 0064 桔红色针晶 (MeOH),ESI-MS m/z(%):431M-H-； 1H NMR 及13C-NMR 数据见下表 1， 与文献值相比较 梁永锋 , 陈东 ,2008， 确定该化合物为大黄素 -8-O-D- 葡萄吡喃糖 苷， 结构式见图 2。 0065 表 1 大黄素 -8-O-D- 葡萄吡喃糖苷 1H NMR、13C-NMR 归属 0066 0067 0068 实施例 2 0069 目的在于观察不同剂量的大黄素-8-O-D-葡萄糖苷对ANIT所致胆汁淤积大鼠 血清 ALT、 AST、 ALP。
26、、 T-Bil 和 D-Bil 水平、 胆汁流量变化的以及肝脏病理切片变化的影响。 0070 1. 实验材料和方法 0071 1.1 实验动物 0072 Wistar 大鼠 (25020)g， 清洁级， 雄性 40 只。购自上海必凯实验动物有限责任公 司， 动物合格证号 ： SCXK( 沪 )2008-0016。大鼠饲养温度 （221） ， 相对湿度 （6510） ， 照明时间每天 12h。 0073 1.2 试剂 0074 ALT 试剂盒， AST 试剂盒， T-Bil 试剂盒， D-Bil 试剂盒 （世诺临床诊断制品有限公 司， 日本） ； ALP 试剂盒 （上海荣盛） ； - 萘异硫氰酸。
27、盐 (ANIT;Sigma,N5242) ； 其他试剂均为 国产分析纯。 0075 大黄素 -8-O-D- 葡萄糖苷 （南京泽朗医药公司） 。 说 明 书 CN 103156873 A 7 6/9 页 8 0076 1.3 主要仪器 0077 酶标仪 （Power Wave XS ； Bio-Tek Instruments,USA） ； 0078 Eppendorf5415R 低温高速离心机 （Eppendorf,Germany） ； 0079 日立 HITACHI7080 全自动生化分析仪 （日立， Japan） ； 0080 SANYO 制冰机 （SANYO Electric Co.,Lt。
28、d.,Japan） ； 0081 Millipore 纯水仪 （Millipore,Bedford,MA,USA） 。 0082 1.4 实验处理方法 0083 Wistar 大鼠 40 只， 随机分为以下五组 ： 正常对照组、 阳性对照 UDCA 组 （剂量 为 60mgkg-1） 、 模 型 组、 大 黄 素 -8-O-D- 葡 萄 糖 苷 20mgkg-1剂 量 组， 以 及 大 黄 素 -8-O-D- 葡萄糖苷 40m gkg-1剂量组 ； 每组 8 只。 0084 所有药物组 （UDCA60mg kg-1剂量组、 大黄素 -8-O-D- 葡萄糖苷 20mg kg-1剂量 组， 及大黄。
29、素-8-O-D-葡萄糖苷40m g kg-1剂量组） 均用0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na) 溶解至所需浓度。并且大鼠每日同一时间按 10ml kg-1剂量灌胃给药， 每天给药 1 次， 连续 7d。正常组和模型组灌胃给予相同体积的 0.5% 羧甲基纤维素钠溶液。 0085 第 7 次给药 12h 后， 除正常对照组之外， 其余各组动物均按 60mg kg-1剂量灌胃给 予 ANIT 大豆油溶液 (5mlkg-1) 进行造模， 造模 12h， 36h 后给药组继续给药两次。实验结 束前， 动物禁食不禁水 12h。 、 0086 所有动物在给予 ANIT 后 48h( 即末次给药 12h 后。
30、 )， 经乙醚麻醉后眼眶静脉丛取 血， 供测定血清生化指标。后经乌拉坦 (1gkg-1) 麻醉进行胆汁排泄实验， 测定 2h 胆汁流 量。取左叶肝脏置 10甲醛溶液中固定备用。 0087 1.5 血清生化指标测定 0088 大鼠乙醚麻醉后眼眶静脉丛取血， 血液室温静置 3h， 3500rmin-1， 离心 15min， 取 上层血清， 全自动生化分析仪测定血清丙氨酸氨基转移酶 (ALT)、 天门冬氨酸氨基转移酶 (AST)、 血清总胆红素 (TBil) 和直接胆红素 (DBil) 含量。按试剂盒所述方法测定并计算血 清碱性磷酸酶 （ALP） 活力。 0089 1.6 胆汁排泄实验 0090 大。
31、鼠腹腔注射乌拉坦 (1gkg-1) 麻醉， 胆总管插管， 用预先称重的离心管， 冰块上 收集胆汁， 收集时间为 ： 0 30min， 30 60min， 60 90min， 90 120min。 0091 1.7 肝组织病理观察 0092 切取相同部位 （肝大叶） 的部分肝组织进行病理学检查， 用10%中性福尔马林固定， 固定后进行组织修切， 石蜡包埋， 切成 4 5m 薄片， 二甲苯脱蜡， 梯度乙醇脱水， 苏木素、 伊红 （HE） 染色， 乙醇脱水， 二甲苯透明， 树脂封固， 在 BX 光学显微下观察。 0093 1.8 统计分析 0094 实验数据计量资料以均数标准差表示， 两均数的比较用。
32、SPSS16.0统 计软件中 one-way ANOVA 分析， P0.05 表示差异有统计学意义。 0095 2. 实验结果 0096 2.1 大黄素 -8-O-D- 葡萄糖苷对 ANIT 所致胆汁淤积大鼠血清学生化指标的影 响 0097 肝细胞受损后， 会释放 ALT 和 AST 入血， 所以血清 ALT 和 AST 是反映肝细胞损伤 说 明 书 CN 103156873 A 8 7/9 页 9 与否的指标。如表 2 所示， ANIT 所致胆汁淤积大鼠血清中 ALT 和 AST 水平与正常对照组 相比显著增高 （P0.01） ， 表明 ANIT 在 60mgkg-1处理 48 小时后诱导了。
33、大鼠肝毒性。大黄 素 -8-O-D- 葡萄糖苷 40mg kg-1剂量和 UDCA60mg kg-1连续给药 9d 对 ANIT 所致胆汁淤 积大鼠血清中 ALT 和 AST 水平有显著降低作用 （P0.01,P0.05） ， 而大黄素 -8-O-D- 葡 萄糖苷 20mgkg-1剂量未显示出明显的作用。以上结果表明大黄素 -8-O-D- 葡萄糖 苷 40mgkg-1对 ANIT 所致胆汁淤积大鼠的肝损伤具有保护作用， 并且其作用效果优于 UDCA60mgkg-1的保肝作用。 0098 血清ALP、 T-Bil和D-Bil水平是胆汁淤积的评价指标， 当胆汁淤积型疾病发生时， 血清 ALP、 T。
34、-Bil 和 D-Bil 水平显著上升。如表 3 所示， 模型组中， ANIT 所致胆汁淤积大鼠血 清中ALP、 T-Bil和D-Bil水平与正常对照组相比显著增高 （P0.01） 。 大黄素-8-O-D-葡 萄糖苷 40mgkg-1剂量连续给药 9d 对 ANIT 所致胆汁淤积大鼠血清中 ALP、 T-Bil 和 D-Bil 水平有显著降低作用 （P0.05 ； P0.01） ， 而 20mgkg-1剂量和 UDCA60mgkg-1剂量均未显 示出明显的作用。以上结果表明， 大黄素 -8-O-D- 葡萄糖苷 40mgkg-1剂量对 ANIT 所 致大鼠胆汁淤积具有改善作用。 0099 表 2。
35、. 大黄素 -8-O-D- 葡萄糖苷对 ANIT 所致胆汁淤积大鼠血清生化指标 ALT 和 AST 的影响 （n=8） 0100 0101 与正常对照组比较， *P0.01 ； 与模型组比较， #P0.05,#P0.01 0102 表 3 大黄素 -8-O-D- 葡萄糖苷对 ANIT 所致胆汁淤积大鼠血清生化指标 ALP、 T-Bil 和 D-Bil 的影响 （n=8） 说 明 书 CN 103156873 A 9 8/9 页 10 0103 0104 与正常对照组比较， *P0.01 ； 与模型组比较， #P0.05,#P0.01 0105 2.2 大黄素 -8-O-D- 葡萄糖苷对 ANI。
36、T 所致胆汁淤积大鼠胆汁流量的影响 0106 胆汁流量是评价胆汁淤积型疾病的又一个重要指标。如表 4 所示， ANIT60mg kg-1 处理 48 小时后大鼠胆汁流量与正常对照组相比显著降低 （P0.05） 。大黄素 -8-O-D- 葡 萄糖苷 40mgkg-1剂量给药显著增加了 ANIT 所抑制的大鼠胆汁流量 （P0.05） ， UDCA 组亦 增加 ANIT 胆汁淤积大鼠胆汁流量， 但是大黄素 -8-O-D- 葡萄糖苷作用明显优于 UDCA。 大黄素 -8-O-D- 葡萄糖苷 20mg kg-1剂量给药组对 ANIT 所抑制的大鼠胆汁流量无显著 改善作用。 0107 表 4 大黄素 -8。
37、-O-D- 葡萄糖苷对 ANIT 所致胆汁淤积大鼠胆汁流量的影响 0108 0109 与正常对照组比较， *P0.01 ； 与模型组比较， #P0.05,#P0.01 0110 2.3 大黄素 -8-O-D- 葡萄糖苷对 ANIT 所致胆汁淤积大鼠肝脏病理切片的影响 0111 如图 3 所示， 光镜下观察可见， 正常对照组肝组织中肝细胞大小、 形状均无异常， 肝小叶完整， 肝细胞排列整齐， 未见肝实质细胞病变， 中央静脉和汇管区结构正常 ( 图 3A) ； 模型组肝小叶轮廓不清， 汇管区有大量炎性细胞浸润。肝细胞肿大， 胞质疏松， 有的呈气球 样变及嗜酸样变。毛细胆管结构破坏或丢失。可见明显点。
38、状或灶性坏死 ( 图 3B)。经大黄 素 -8-O-D- 葡萄糖苷 40mgkg-1剂量给药后与模型组相比汇管区炎性细胞浸润减轻。 肝细胞坏死减少 , 肝细胞肿大， 胞质疏松， 呈气球样变及嗜酸样变的情况明显改善。清晰可 见结构正常的毛细胆管 ( 图 3C)。UDCA 组与模型组相比汇管区炎性细胞浸润减轻， 肝细胞 说 明 书 CN 103156873 A 10 9/9 页 11 坏死减少。但仍可见结构破坏的毛细胆管， 呈气球样变及嗜酸样变的肝细胞 ( 图 3D)。大黄 素 -8-O-D- 葡萄糖苷 20mgkg-1剂量组， 汇管区大量炎性细胞浸润， 肝细胞肿大， 坏死， 呈气球样变及嗜酸样变。毛细胆管结构破坏或丢失。( 图 3E)。 说 明 书 CN 103156873 A 11 1/2 页 12 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103156873 A 12 2/2 页 13 图 3 说 明 书 附 图 CN 103156873 A 13 。