一种抗病毒的药物组合物.pdf

本发明涉及一种抗病毒的药物组合物，本发明药物组合物是以芦竹萜、血竭素、木蝴蝶苷B、澳洲茄碱为原料药，配比而成，可按常规制剂工艺制成各种剂型，本发明所提供的药物组合物对制备抗病毒药物具有重要意义。

权利要求书
1.  一种抗病毒的药物组合物，其特征在于制成该药物组合物的原料药的组成和重量份为：
芦竹萜20-40重量份  血竭素5-20重量份  木蝴蝶苷B15-35重量份 澳洲茄碱1-10重量份。

2.  根据权利要求1所述：一种抗病毒的药物组合物，其特征在于制成该药物组合物的原料药的组成和重量份为：
芦竹萜20重量份  血竭素20重量份 木蝴蝶苷B15重量份 澳洲茄碱1重量份。

3.  根据权利要求1所述：一种抗病毒的药物组合物，其特征在于制成该药物组合物的原料药的组成和重量份为：
芦竹萜40重量份  血竭素5重量份 木蝴蝶苷B35重量份 澳洲茄碱10重量份。

4.  根据权利要求1所述：一种抗病毒的药物组合物，其特征在于制成该药物组合物的原料药的组成和重量份为：
芦竹萜35重量份  血竭素15重量份 木蝴蝶苷B20重量份 澳洲茄碱5重量份。

5.  根据权利要求1所述：一种抗病毒的药物组合物，其特征在于制成该药物组合物的原料药的组成和重量份为：
芦竹萜25重量份  血竭素18重量份  木蝴蝶苷B25重量份 澳洲茄碱6重量份。

6.  根据权利要求1所述的一种抗病毒的药物组合物，可以采用制剂学的常规方法制备成片剂、胶囊剂、滴丸。

7.  根据权利要求1所述的一种抗病毒的药物组合物，其特征在于用于抗病毒。

说明书一种抗病毒的药物组合物
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种抗病毒的药物组合物。
背景技术
目前大量使用抗生素引起的细菌耐药性不断上升已成为全世界共同关注的难题之一。尤其是金黄色葡萄球菌的耐药率已达90％以上。单纯疱疹病毒II型主要引起生殖器部位皮肤粘膜感染。病毒经呼吸道、口腔、生殖器粘膜以及破损皮肤进入体，潜居于人体正常粘膜、血液、唾液及感觉神经节细胞内。当机体抵抗力下降时，如发热、胃肠功能紊乱、月经、妊娠、病灶感染和情绪改变时，体内潜伏的HSV-II 被激活而发病。合成药物在单纯疱疹性的治疗中较肯定的抗病毒药物是阿昔洛韦（ACV），但近年来临床不断发现ACV 的耐药株，且耐药性随药物疗程的延长有增长趋势。
因此，开发新的高效低毒的抗菌、抗病毒药物具有广阔的前景，传统中药的多靶点作用机制、低毒副作用、易于代谢、无耐药性等优点使它成为筛选高效低毒的抗菌、抗病毒药物的热点。
芦竹萜（arundoin）：CAS号4555-56-0，分子式C31H52O，分子量440.74。
血竭素（cochinchinenin）：CAS号400603-95-4，分子式C31H30O7，分子量514.57。
木蝴蝶苷B（oroxin B）：CAS号114482-86-9，分子式C27H30O15，分子量594.52。
澳洲茄碱（solasonine）：CAS号19121-58-5，分子式C45H73NO16，分子量884.06。
本发明药物组合物的4种药物结构如下：
           
芦竹萜（arundoin）               血竭素（cochinchinenin）
         
木蝴蝶苷B（oroxin B）          澳洲茄碱（solasonine）。
发明内容
本发明的目的是克服背景技术的不足，提供一种抗病毒的药物组合物。
本发明是通过如下技术方案实现的：
本发明的一种抗病毒的药物组合物的原料药的组成和重量份为：
芦竹萜20-40重量份  血竭素5-20重量份  木蝴蝶苷B15-35重量份 澳洲茄碱1-10重量份。
本发明的一种抗病毒的药物组合物可以采用制剂学的常规方法制备成片剂、胶囊剂、滴丸。
本发明的一种抗病毒的药物组合物，其特征在于用于抗病毒。
本发明的药物组合物通过多组分，多环节、多途径地发挥协同作用而表现出抗病毒功效，对HSV-II 侵入细胞的阻断作用和直接杀灭病毒是本发明药物组合物体外抗病毒的主要作用途径。HSV-II 是有包膜的病毒，最外层的包膜由脂质和糖蛋白组成，其中任何一种成分改变，即可使包膜变性，从而灭活病毒。实验结果表明本发明药物组合物对HSV-II 的直接灭活作用较强。HSV-II 侵入细胞的阻断作用研究表明，本发明药物组合物不仅有抗病毒活性，还具有一定程度保护细胞防止病毒侵入的作用。利用HSV-II 脑炎模型研究本发明药物组合物对HSV-II 感染小鼠的保护作用，结果表明本发明药物组合物表现出一定的抗病毒活性。
具体实施方式
下面通过具体实验例和实施例对本发明的一种抗病毒的药物组合物做进一步说明，但不限于本发明。
实施例1：抗病毒的药物组合物
抗病毒的药物组合物的原料药的组成和重量份为：
芦竹萜20重量份  血竭素20重量份 木蝴蝶苷B15重量份 澳洲茄碱1重量份
实施例2：抗病毒的药物组合物
抗病毒的药物组合物的原料药的组成和重量份为：
芦竹萜40重量份  血竭素5重量份 木蝴蝶苷B35重量份 澳洲茄碱10重量份
实施例3：抗病毒的药物组合物
抗病毒的药物组合物的原料药的组成和重量份为：
芦竹萜35重量份  血竭素15重量份 木蝴蝶苷B20重量份 澳洲茄碱5重量份
实施例4：抗病毒的药物组合物
抗病毒的药物组合物的原料药的组成和重量份为：
芦竹萜25重量份  血竭素18重量份  木蝴蝶苷B25重量份 澳洲茄碱6重量份
实施例5：片剂的制备
取实施例1组合物150g，加入淀粉75g，混匀，制粒，干燥，加微晶纤维素20g，硬脂酸镁2.5g，混匀，压制成1000片, 即得本发明组合物片剂。
实施例6：胶囊的制备
取实施例2组合物165g，加入淀粉65g，混匀，制粒，干燥，整粒，加入适量硬脂酸镁，混匀，装胶囊1000粒，即得本发明组合物胶囊。
实施例7：滴丸的制备
称取聚乙二醇 6000  200g水浴(80℃)加热煮熔，加入实施例3组合物50g，充分搅拌均匀，以液体石蜡为冷却剂，置玻璃管（4*80cm）中，冷却温度为10℃，滴口内外径为7.0/2.0(mm/mm)，滴口距液面为2cm，滴速以每分50滴为最佳条件，用棉布吸干滴丸表面的冷凝剂，即得本发明组合物滴丸。
实验例1：药物组合物抗菌作用
 1.菌种和培养基
 实验菌种由山东省疾病控制中心和山东省临床检验中心提供。列表如下：
实验用培养基：细菌MH 培养基，真菌PDA 培养基均购自中国药品生物制品检定所。
2.抑菌效果检测方法：
2.1 抑菌效果用杯碟法测定抑菌圈大小
活化菌液用无菌生理盐水稀释至105～106cfu/ml 备用。加0.2ml菌液至干燥的MH 培养基平板，涂匀。放置5min，使培养基充分吸收菌液。每个平板放置已灭菌的牛津杯6个，放置5min，使牛津杯紧密吸附于培养基表面。牛津杯中加入0.1g/ml水提物100ul。阳性对照用左氧氟沙星和氟康唑。阳性对照细菌用浓度均为40μg/ml 左氧氟沙星，白色念珠菌用浓度均为200μg/ml 氟康唑，均加100ul。阴性对照加无菌水。然后将平板置于37℃恒温培养箱培养24h(白色念珠球菌48h)，出用卡尺量取抑菌圈直径，计算平均值，用抑菌圈直径D 表示抑菌活性。抑菌效果判断标准为：D≤8mm为不敏感，8mm＜D≤13mm为低度敏感，13mm＜D≤19mm为中度敏感，D＞19mm为高度敏感。
2.2 最小抑菌浓度MIC 的测定采用微量稀释板法
试验菌液浓度为106cfu/ml。吸取稀释好的菌液加于96 孔细胞培养板中，每孔100ul，每种药物100ul，依次对比稀释10 孔，最后一孔不加药物( 仅加培养基和细菌) 加入稀释菌液100ul，为细菌生长对照孔。留一列孔不加细菌( 仅加培养基和药物) 作药物对照孔，阳性对照用左氧氟沙星和氟康唑，按说明做倍比稀释。置于振荡器上振荡1min，使孔内溶液充分混匀后，微孔板加盖并放在铺有湿纱布的方形搪瓷盘中，于37℃温箱中孵育24h( 白色念珠球菌48h)，眼观无细菌生长孔所含最低药物浓度即为最小抑菌浓度。
3. 抑菌效果
表1 各药物组合物抑菌圈(mm)

 注：a、实施例2药物组合物、实施例1药物组合物、实施例3药物组合物、实施例4药物组合物加入量为1mg/杯，b、阳性对照细菌用浓度均为40μg/ml 左氧氟沙星，白色念珠菌用浓度均为200μg/ml 氟康唑，均加100ul。5％DMSO 为阴性对照。
表2 ：不同药物组合物最小抑菌浓度(MIC)( 单位mg/ml)

注：阳性对照细菌用左氧氟沙星，白色念珠菌用氟康唑，均加100ul。5％ DMSO 为阴性对照。
 结果表明：本发明药物组合物具有广谱抗菌和杀菌作用。对革兰氏阳性菌：金黄色葡萄球菌、耐药性表皮葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、枯草杆菌；革兰氏阴性细菌：大肠杆菌、粪肠球菌；深部感染真菌白色念珠菌都有杀灭和抑制生长的作用，具有重要的实践意义和应用价值，可在制备有抑菌和/ 或杀菌作用的食品、保健品、化妆品和药品中应用。
实验例2 ：药物组合物抗病毒作用
1、实验材料
    病毒：HSV-II 型(3 代)20110913，兰州生物制品研究所疫苗研究室提供(herpessimplex virus，HSV-II)
细胞：非洲绿猴肾细胞(Vero 细胞) 兰州生物制品研究所提供。培养用DMEM 培养基+7％牛血清。
动物：清洁级昆明小鼠，雌雄各半，体重18-22g，购于兰州生物制品研究所动物房。
药物及试剂：噻唑蓝(MTT，Fluka Biochemika 公司)，二甲基亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO，Sigma 公司生产)，DMEM(GIBCO 公司)，标准新生牛血清( 中美合资兰州民海生物工程有限公司)，注射用阿昔洛韦(ACV，9-(2- 羟乙氧甲基-) 鸟嘌呤，武汉普生制药有限公司，生产批号110811 国药准字H42020129)。实施例2药物组合物、实施例1药物组合物、实施例3药物组合物、实施例4药物组合物，均为实施例1方法制备得到，批号分别为：20110208、20110209、20110210、20110211。
2、实验方法
2.1 体外实验
2.1.1 药物细胞毒性测定(MTT 法)
将细胞悬液以8×105/ml 密度接种于96 孔细胞培养板中，每孔200μl，37℃，5％CO2，100％相对湿度培养24h。实施例2药物组合物、实施例1药物组合物、实施例3药物组合物、实施例4药物组合物均倍比稀释至以下6 个浓度：16，8，4，2，1，0.5mg/ml，加入细胞悬液孔中，每一药物浓度重复4 孔，另设正常细胞对照。相同条件下继续培养33h，观察细胞病变(CPE) 情况，并以MTT 法检测细胞存活率。
2.1.2 病毒毒力测定( 蚀斑法)
将细胞悬液以8×105/ml 密度接种于24 孔细胞培养板中，每孔1mL，37℃，5％ CO2，100％相对湿度培养24h。病毒稀释至以下6 个浓度：10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8，加入细胞悬液孔中，每一药物浓度重复4 孔，另设正常细胞对照，甲基纤维素覆盖物覆盖，相同条件下继续培养72h，结晶紫染色，计数。
感染性病毒量(PFU/ml) ＝ ( 每孔内斑数/ 每孔接种病毒量ml)× 病毒稀释倍数。
2.1.3 药物对HSV-II 侵入细胞的阻断作用( 蚀斑法)
将供试品液与HSV-II 等体积混合，以此病毒药物混合液感染Vero 细胞。37℃，5％CO2 吸附90min，洗涤，加细胞维持液置37℃，5％CO2 培养。每日观察CPE，72h 后以蚀斑法检测病毒抑制率。采用治疗指数(TI) 作为评价指标来衡量药物对病毒的抑制效力。治疗指数(TI) ＝半数毒性浓度(TC50)/ 半数抑制浓(IC50)。每一药物浓度重复4 孔，同时设置正常细胞对照、药物对照及病毒对照。
2.1.4 药物对HSV-II 的直接灭活作用( 蚀斑法)
将供试品液与HSV-II 等体积混合，37℃作用90min 后，以此病毒药物混合液感染Vero 细胞。37℃，5％ CO2 吸附90min，洗涤，同上法培养与检查。
2.1.5 药物对病毒颗粒增殖的抑制作用( 蚀斑法)
将病毒感染细胞，吸附90min 后洗涤，加入不同浓度的供试品液，同上法培养与检查。病毒抑制率(％)＝(病毒对照组平均出斑数-给药试验组平均出斑数)/病毒对照组平均出斑数
2.2 体内实验
2.2.1 药物对小鼠的急性毒性测定
清洁级昆明种小鼠随机分组，每组6只，雌雄各半。根据体外实验结果，选择抑制HSV-II 生物合成活性较好的药物组合物，以400，500，625，800，1000，1250mg/kg 剂量灌胃给药，另设阴性对照组，给予等体积的生理盐水。正常进食进水，连续观察10d，记录小鼠死亡情况并计算LD50。
2.2.2 病毒脑腔模型毒力测定
清洁级昆明种小鼠随机分组每组10只，雌雄各半。感染部位常规消毒后，经右脑室注射病毒，病毒稀释至以下6个浓度：10-1，10-2，10-3，10-4，10-6，10-7，感染剂量为每只0.05mL。正常进食进水，连续观察10d，记录小鼠死亡情况并用Reed-Muench 法计算LD50。
2.2.3 药物对脑腔感染HSV-II 小鼠的保护作用
清洁级昆明种小鼠随机分组每组10 只，雌雄各半。感染部位常规消毒后，经右脑室注射病毒，病毒感染后24h，给药治疗。按药物LD50的1/2～1/4作为药物体内实验的高实验剂量，LD50的1/12～1/16作为低实验剂量，每药物设高低2个剂量组。不用药物的对照组( 病毒对照组、正常对照组)，连续灌胃给药5d，观察动物发病和死亡情况，连续30d。
3、实验结果
3.1 体外实验
3.1.1. 药物细胞毒性测定
表3 不同药物组合物对Vero 细胞的毒性( 单位：mg/ml)
  实施例2药物组合物 实施例3药物组合物 实施例4药物组合物 实施例1药物组合物 TC50 3.82 3.78 4.11 3.76
供试品液对Vero 细胞的毒性作用表现为细胞增殖缓慢、颗粒较多、折光性差、形态改变、部分细胞破碎脱落。由于细胞代谢活性降低或死亡，MTT 法检测到的活细胞数减少。
3.1.2 病毒毒力测定( 蚀斑法)
Vero 细胞对HSV-II 较敏感，HSV-II 感染所致的Vero 细胞细胞病变效应CPE 特征为圆缩肿胀、相互融合形成葡萄串状或星状，甚至部分细胞脱落，形成病灶。蚀斑计数得HSV-II 型(3 代)20110913 感染性病毒量(PFU/ml) 为107.57PFU/ml，该HSV-II 病毒采用10-5时每孔出斑数约为40 个，容易计数，故采用10-5 作为后续实验的病毒稀释度。
3.1.3对HSV-II 侵入细胞的阻断作用
表4 不同药物组合物对HSV-II 侵入Vero 细胞的阻断作用

3.1.4对HSV-II 的直接杀伤作用
表5 不同药物组合物对HSV-II 的直接灭活作用

3.1.5对HSV-II 病毒颗粒增殖的抑制作用( 蚀斑法)
表6. 不同药物组合物对HSV-II 病毒颗粒增殖的抑制作用

本发明的药物组合物通过多组分，多环节、多途径地发挥协同作用而表现出抗病毒功效，对HSV-II 侵入细胞的阻断作用和直接杀灭病毒是本发明药物组合物体外抗病毒的主要作用途径。HSV-II 是有包膜的病毒，最外层的包膜由脂质和糖蛋白组成，其中任何一种成分改变，即可使包膜变性，从而灭活病毒。实验结果表明本发明药物组合物对HSV-II 的直接灭活作用较强。HSV-II 侵入细胞的阻断作用研究表明，本发明药物组合物不仅有抗病毒活性，还具有一定程度保护细胞防止病毒侵入的作用。利用HSV-II 脑炎模型研究本发明药物组合物对HSV-II 感染小鼠的保护作用，结果表明本发明药物组合物表现出一定的抗病毒活性。