芫花总黄酮苷元有效部位的制备及其在抗免疫性炎症药物中的应用.pdf

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摘要
申请专利号:

CN201110315273.1

申请日:

2011.10.18

公开号:

CN102349959A

公开日:

2012.02.15

当前法律状态:

授权

有效性:

有权

法律详情:

授权|||实质审查的生效IPC(主分类):A61K 36/83申请日:20111018|||公开

IPC分类号:

A61K36/83; C12P17/06; A61P29/00; A61K125/00(2006.01)N; A61K133/00(2006.01)N; A61K135/00(2006.01)N

主分类号:

A61K36/83

申请人:

中国药科大学

发明人:

张春凤; 何欣; 何建廷

地址:

210009 江苏省南京市童家巷24号

优先权:

专利代理机构:

代理人:

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内容摘要

本发明涉及芫花总黄酮苷元有效部位的制备方法,其主要由芫花素、羟基芫花素、芹菜素、木犀草素和其他苷元组成,可单独或与药学上可接受载体混合,用于制备治疗免疫性炎症药物,尤其适于制备治疗类风湿关节炎的药物。

权利要求书

1: 一种抗免疫性炎症的芫花总黄酮苷元有效部位, 其特征是芫花总黄酮苷元有效部位 主要由芫花素、 羟基芫花素、 木犀草素、 芹菜素及其他苷元组成, 按重量百分比计, 含有总黄 酮苷元 50-99%。
2: 如权利要求 1 所述的芫花总黄酮苷元有效部位, 其特征在于其来源于含芫花素、 羟 基芫花素的药材, 优选瑞香科植物芫花、 芫花根、 芫花条、 了哥王。
3: 权利要求 1 所述的芫花总黄酮苷元有效部位的制备方法, 其特征是包括以下步骤 : 方法 1 : 芫花、 芫花根、 芫花条或了哥王采用酶解或酸水解或自酶解后, 再以水溶性溶剂提取, 回收溶剂, 得芫花总黄酮苷元提取物, 所述的水溶性提取物选自水、 乙醇的一种溶剂或两种 溶剂组成的混合溶剂 ; 将芫花总黄酮苷元提取物上样于层析柱, 再分别以水、 20-80%的乙醇洗脱, 收集乙醇 洗脱液, 回收溶剂后得芫花总黄酮苷元, 其中所述的层析柱为大孔树脂或聚酰胺柱 ; 或将芫 花总黄酮苷元提取物采用合适极性的溶剂提取, 回收溶剂获得芫花总黄酮苷元部位 ; 方法 2 : 芫花、 芫花根、 芫花条或了哥王以水溶性溶剂提取, 回收溶剂, 得芫花总黄酮提取物, 所 述的水溶性提取物选自水、 乙醇的一种溶剂或两种溶剂组成的混合溶剂 ; 将芫花总黄酮提取物采用酶解或酸水解后, 干燥, 得黄酮苷元提取物, 上样于层析柱, 再分别以水、 20-80%的乙醇洗脱, 收集乙醇洗脱液, 回收溶剂后得芫花总黄酮苷元, 其中所 述的层析柱为大孔树脂或聚酰胺柱 ; 或将芫花总黄酮苷元提取物采用合适极性的溶剂提 取, 获得芫花总黄酮苷元有效部位 ; 方法 3 : 芫花、 芫花根、 芫花条或了哥王以水溶性溶剂提取, 回收溶剂, 得芫花总黄酮提取物, 上 样于层析柱, 再分别以水、 20-80%的乙醇洗脱, 收集乙醇洗脱液, 回收溶剂后得芫花总黄酮 苷元, 其中所述的层析柱为大孔树脂或聚酰胺柱 ; 或将芫花总黄酮苷元提取物采用合适极 性的溶剂提取, 获得芫花总黄酮苷元有效部位。
4: 如权利要求 3 中所述的芫花总黄酮苷元有效部位的制备方法, 其特征是所述的自酶 解为 : 将芫花、 芫花根、 芫花条或了哥王药材加入 0.01-30 倍量的水, 在 20-50℃的条件下, PH 为 3-8, 酶解 1-72h, 利用其自身酶使其中的苷水解为苷元。
5: 如权利要求 3 中所述的芫花总黄酮苷元有效部位的制备方法, 其特征是所述的酶解 采用的酶为纤维素酶、 蜗牛酶、 混合酶、 β-D- 葡萄糖苷酶或 α-D- 葡萄糖苷酶, 酶解温度为 20-60℃, 酶解 Ph 值 3-8, 酶用量 0.01-20mg/g, 酶解时间为 0.1-72h。
6: 如权利要求 3 中所述的方法, 其中经酶解或酸水解后得到的芫花总黄酮苷元提取物 或直接从药材提得芫花总黄酮后需进一步精制, 便能得到纯度更高的芫花总黄酮苷元有效 部位, 所述的精制方法为上样于层析柱纯化, 或者将芫花总黄酮苷元提取物以合适极性的 溶剂进行提取, 回收溶剂, 浓缩干燥后即得到芫花总黄酮苷元有效部位, 所述合适极性的溶 剂选自 70-100 ∶ 30-0 乙醇∶水、 丙酮∶水或甲醇∶水。
7: 权利要求 1 所述的芫花总黄酮苷元有效部位在制备抗免疫性炎症药物中的应用。
8: 如权利要求 7 所述的应用, 其特征在于所述的抗免疫性炎症为类风湿关节炎、 哮喘 2 或鼻炎。
9: 一种药用组合物, 其特征在于含有权利要求 1 所述芫花总黄酮苷元有效部位, 以及 含有药学上可接受的载体。
10: 如权利要求 1 和 9 所述在抗免疫性炎症药物中的应用, 其特征在于所述的有效部位 或药用组合物可制备成口服制剂、 注射剂、 吸入制剂或外用制剂。

说明书


芫花总黄酮苷元有效部位的制备及其在抗免疫性炎症药物 中的应用

    技术领域 :
     本发明涉及芫花总黄酮苷元有效部位的制备, 及该总黄酮苷元有效部位及其药物 组合物在抗免疫性炎症药物中的应用。 背景技术 :
     类风湿关节炎是一种病因尚未明了的慢性异质性疾病, 属自身免疫性疾病。目 前, 对于类风湿关节炎的治疗主要采用非甾体类抗炎药 (NSAIDs)、 改善病情的抗风湿药 (DMARDs)、 糖皮质激素药和植物药。非甾体类药 (NSAIDs) 虽常作为治疗类风湿关节炎的一 线药物, 但均具有明显的不良反应, 其缓解症状是由于具有抗炎作用, 因此, 不能防止组织 损伤、 关节破坏和畸形。改善病情的抗风湿药 (DMARDs) 尽管能改善症状, 需要长期使用且 毒副作用大。对于常规治疗无效时, 可以采用糖皮质激素与一、 二线药物合用, 但长期大量 使用糖皮质激素会产生毒副作用。 植物药临床主要应用雷公藤多苷片、 白芍总苷片、 青藤碱 等制剂, 但各自均有一定的缺陷和局限性。 中药具有多成分、 多靶点、 多环节, 且毒副作用小 等优势, 因此, 从中药中开发有效成分明确、 质量可控、 安全高效的抗类风湿关节炎的新一 代有效部位药物是非常必要的。
     芫花为瑞香科 (Thymelaeaceae) 植物芫花 (Daphne genkwa sied.etZucc) 的干燥 花蕾。具有泻水逐饮, 行气通脉, 解毒消肿的功效, 临床主要用于水肿胀满, 胸腹积水, 痰饮 积聚, 气逆喘咳, 二便不利 ; 外治疥癣秃疮, 冻疮。主要分布于长江流域以南各省区及山东、 河南、 陕西等地。
     芫花条与绿豆为民间治疗风湿病的验方, 已作为一种中成药在临床上应用, 但单 味芫花及其中化学成分用于治疗类风湿关节炎并未见相关文献报道。
     目 前 国 内 对 芫 花 中 化 学 成 分 的 研 究 较 多, 文 献 报 道 其 中 含 有 4’ , 7- 二 甲 氧 基 -5- 羟 基 黄 酮 (4’ , 7-dimethoxy-5-hydroxyflovone)、 芫 花 素 (genkwanin)、 木犀草素 (luteolin)、 芹 菜 素 (apigenin)、 羟 基 芫 花 素 (3’ -hydroxy-genkwanin) 等 黄 酮 苷 元 成 分, 除此之外, 芫花中含量比较高的黄酮苷包括羟基芫花素 -3′ -O-β-D- 葡萄糖苷、 芫花 素 -5-O-β-D- 葡萄糖苷和木犀草素 -7- 甲氧基 -3′ -O-β-D- 葡萄糖苷等, 但这些苷的溶 解性与苷元有较大的区别, 很难采用溶剂将苷与苷元同时提取出来, 因此有必要采用水解 法将苷转化为苷元, 增加苷元的提取量, 然后进一步提取纯化获得芫花总黄酮苷元有效部 位。目前这方面的研究较少, 董倩等 ( 芫花及其炮制品的质量评价, 辽宁中医药大学 ( 硕士 论文 ). 董倩, 2010.3) 尽管采用公知技术对芫花总黄酮苷元的酸水解工艺进行了研究, 但 其仅仅以芫花素、 芹菜素、 木犀草素为考察对象, 对酸水解条件进行了考察, 并无进一步提 取、 纯化研究。
     本发明采用酶解法、 酸水解法、 自酶解法使芫花总黄酮苷尽可能的转化为芫花总 黄酮苷元, 并进一步提取纯化获得芫花总黄酮苷元有效部位, 其主要成分为芫花素、 羟基芫 花素、 木犀草素、 芹菜素和其他苷元。 迄今为止, 尚未发现本发明涉及的采用酶解法、 自酶解法水解芫花总黄酮苷的文献报道, 未发现本发明涉及的芫花总黄酮苷元的提取纯化获得芫 花总黄酮苷元有效部位的文献报道, 也未发现本发明所涉及的芫花总黄酮苷元有效部位及 其药物组合物在抗免疫性炎症 ( 如类风湿关节炎 ) 药物中的应用, 也未见采用酸水解水解 芫花总黄酮苷后再进一步纯化得到本发明涉及的芫花总黄酮苷元有效部位的文献报道, 因 此, 本发明具有创造性。 发明内容 :
     本发明解决的技术问题是采用水解法获得芫花总黄酮苷元, 并进一步提取纯化获 得芫花总黄酮苷元有效部位, 以及研究该有效部位在抗免疫性炎症药物的应用, 尤其在治 疗类风湿关节炎方面的用途。
     本发明解决的技术问题还包括芫花总黄酮苷元可供工业化生产的制备方法, 以及 芫花总黄酮有效部位的组成, 鉴于该有效部位的主要化学成分清楚明确, 这将有利于工业 化生产中的质量控制, 从而保证疗效和制剂质量的稳定性。
     为解决上述问题, 提供如下技术方案 :
     一种抗免疫性炎症的芫花总黄酮苷元有效部位, 芫花总黄酮苷元有效部位主要由 芫花素、 羟基芫花素、 木犀草素、 芹菜素及其他苷元组成, 按重量百分比计, 含有总黄酮苷元 50-99%。
     所述的芫花总黄酮苷元有效部位, 来源于含芫花素、 羟基芫花素的药材, 优选瑞香 科植物芫花、 芫花根、 芫花条、 了哥王。
     所述的芫花总黄酮苷元有效部位的制备方法, 包括以下步骤 :
     方法 1 :
     芫花、 芫花根、 芫花条或了哥王采用酶解或酸水解或自酶解后, 再以水溶性溶剂提 取, 回收溶剂, 得芫花总黄酮苷元提取物, 所述的水溶性提取物选自水、 乙醇的一种溶剂或 两种溶剂组成的混合溶剂 ;
     将芫花总黄酮苷元提取物上样于层析柱, 再分别以水、 20-80%的乙醇洗脱, 收集 乙醇洗脱液, 回收溶剂后得芫花总黄酮苷元, 其中所述的层析柱为大孔树脂或聚酰胺柱 ; 或 将芫花总黄酮苷元提取物采用合适极性的溶剂提取, 回收溶剂获得芫花总黄酮苷元部位 ;
     方法 2 :
     芫花、 芫花根、 芫花条或了哥王以水溶性溶剂提取, 回收溶剂, 得芫花总黄酮提取 物, 所述的水溶性提取物选自水、 乙醇的一种溶剂或两种溶剂组成的混合溶剂 ;
     将芫花总黄酮提取物采用酶解或酸水解后, 干燥, 得黄酮苷元提取物, 上样于层析 柱, 再分别以水、 20-80%的乙醇洗脱, 收集乙醇洗脱液, 回收溶剂后得芫花总黄酮苷元, 其 中所述的层析柱为大孔树脂或聚酰胺柱 ; 或将芫花总黄酮苷元提取物采用合适极性的溶剂 提取, 获得芫花总黄酮苷元有效部位 ;
     方法 3 :
     芫花、 芫花根、 芫花条或了哥王以水溶性溶剂提取, 回收溶剂, 得芫花总黄酮提取 物, 上样于层析柱, 再分别以水、 20-80%的乙醇洗脱, 收集乙醇洗脱液, 回收溶剂后得芫花 总黄酮苷元, 其中所述的层析柱为大孔树脂或聚酰胺柱 ; 或将芫花总黄酮苷元提取物采用 合适极性的溶剂提取, 获得芫花总黄酮苷元有效部位。所述的自酶解优选 :
     将芫花、 芫花根、 芫花条或了哥王药材加入 0.01-30 倍量的水, 在 20-60℃的条件 下, PH 为 3-9, 酶解 1-72h, 利用其自身酶使其中的苷水解为苷元。
     所述的酶解优选 :
     纤维素酶、 蜗牛酶、 混合酶、 β-D- 葡萄糖苷酶或 α-D- 葡萄糖苷酶, 酶解温度 20-50℃, 酶解 Ph 值 3-9, 酶用量 0.1-20mg, 酶解时间为 0.1-72h。
     所述的方法, 其中经酶解后得到的芫花总黄酮苷元提取物需进一步精制, 便能得 到纯度更高的芫花总黄酮苷元有效部位, 所述的精制方法为上样于层析柱纯化, 或者将芫 花总黄酮苷元提取物以合适极性的溶剂进行提取, 回收溶剂, 浓缩干燥后即得到芫花总黄 酮苷元有效部位, 所述合适极性的溶剂选自 70-100 ∶ 30-0 乙醇∶水、 丙酮∶水或甲醇∶ 水。
     所述的芫花总黄酮苷元有效部位在制备抗免疫性炎症药物中的应用。
     所述的抗免疫性炎症优选类风湿关节炎、 哮喘或鼻炎。
     一种药用组合物, 含有所述芫花总黄酮苷元有效部位, 以及含有药学上可接受的 载体。 所述的有效部位或药用组合物可制备成口服制剂、 注射剂、 吸入制剂或外用制剂。
     本发明经进一步研究发现该有效部位主要含芫花素、 羟基芫花素、 木犀草素、 芹菜 素及其他苷元, 采用该部位 50mg/kg 口服给药, 明显抑制大鼠佐剂关节炎大鼠的原发和继 发性足跖肿胀, 80mg/kg 角叉菜胶所致小鼠足跖肿胀及醋酸所致小鼠扭提反应, 说明该有效 部位抑制急慢性炎症和疼痛。因此, 可用该有效部位制备治疗类风湿关节炎及其他炎症相 关疾病的药物。
     本发明的芫花总黄酮苷元用于临床时, 建议剂量范围为 50mg/ 次, 也可以根据剂 型的不同和疾病的严重程度, 使用剂量超出该范围。
     本发明所涉及的芫花总黄酮苷的酶解、 自酶解, 芫花总黄酮苷元的提取纯化及芫 花总黄酮苷元有效部位在抗免疫性炎症药物中的应用均为首次发明, 该方法涉及的芫花总 黄酮苷元有效部位的酶解、 自酶解可以使芫花中的黄酮苷转化为黄酮苷元, 可提高芫花中 总黄酮苷元的提取率, 从而可降低药材的用量, 节省药材, 降低成本, 尤其自酶解转化苷元 的方法, 不需要另外添加酶, 利用芫花自身的酶使其中相应的苷发生水解, 因此该方法更简 便, 快捷, 成本更低 ; 本发明采用无毒、 安全的溶剂、 材料提取纯化该有效部位, 更适合于工 业化生产。
     本发明以帕夫林 ( 白芍总苷胶囊, 批号 110405, 宁波立华制药有限公司 ) 和雷公藤 多苷片 ( 批号 091202, 上海复旦复华药业有限公司 ) 为阳性对照药, 采用大鼠佐剂关节炎模 型、 角叉菜胶致小鼠足跖肿胀模型、 醋酸致小鼠扭体反应模型研究发现, 芫花总黄酮苷元有 效部位明显抑制佐剂大鼠关节炎的原发肿胀和继发肿胀, 减轻大鼠足跖的继发性病变, 明 显抑制角叉菜胶所致小鼠足跖肿胀, 明显抑制醋酸致小鼠的扭体反应, 且药效均优于帕夫 林和雷公藤多苷片, 同时佐剂大鼠关节炎大鼠踝关节滑膜病理切片表明 80mg/kg 的芫花总 黄酮苷元有明显的修复关节的作用。
     下面通过实施例对本发明进一步描述, 但本发明并不限于实施例所述的范围。
     具体实施方式 :
     实施例 1. 芫花总黄酮苷元的制备
     取干燥芫花 2kg 粉碎, 加入含有 16g 纤维素酶的 PH 为 4.5 的缓冲液 20L 于 45℃ 放置 2h 后, 弃去缓冲液, 以 90%乙醇 20L 回流提取 2 次, 提取时间为 2h。合并提取液, 减压 浓缩得浸膏, 干燥。将干浸膏以溶剂溶解, 溶解液与 50g 聚酰胺 (200-300 目 ) 粉末拌匀, 干 法上样, 进行聚酰胺柱层析, 先后以水、 15%、 30%、 50%的乙醇洗脱, 合并 30-50%乙醇洗脱 液, 减压回收, 得干浸膏, 经高效液相色谱法测定其中总黄酮苷元含量为 87.72%, 其中芫花 素、 羟基芫花素、 芹菜素、 木犀草素的含量分别为 : 30.05%、 30.45%、 19.47%、 7.75%。
     实施例 2. 芫花总黄酮苷元的制备
     取干燥芫花 1kg 粉碎, 加入含有 10g 蜗牛酶的 PH 为 5 的缓冲液 10L 于 45℃放置 2h 后, 弃去缓冲液, 以 90%乙醇 10L 回流提取 2 次, 提取时间为每次 2h, 合并提取液, 减压 浓缩得浸膏, 干燥。将干浸膏以溶剂溶解, 溶解液与 20g 聚酰胺 (200-300 目 ) 粉末拌匀, 干 法上样, 进行聚酰胺柱层析, 先后以水、 15%、 30%、 50%的乙醇洗脱, 合并 30-50%乙醇洗脱 液, 减压回收, 得干浸膏, 经高效液相色谱法测定其中总黄酮苷元含量为 76.60%, 其中芫花 素、 羟基芫花素、 芹菜素、 木犀草素的含量分别为 : 27.81%、 27.89%、 16.51%、 4.39%。 实施例 3. 芫花总黄酮苷元的制备
     取干燥芫花 1kg 粉碎, 加入 6%盐酸 5L, 于沸水浴中水解 3 小时后, 弃去酸溶液, 以 90%乙醇 10L 回流提取 2 次, 提取时间为每次 2h, 合并提取液, 减压浓缩得浸膏, 干燥。 将干 浸膏以溶剂溶解, 溶解液与 20g 聚酰胺 (200-300 目 ) 粉末拌匀, 干法上样, 进行聚酰胺柱层 析, 先后以水、 15%、 30%、 50%的乙醇洗脱, 合并 30-50%乙醇洗脱液, 减压回收, 得干浸膏, 经高效液相色谱法测定其中总黄酮苷元含量为 65.60%, 其中芫花素、 羟基芫花素、 芹菜素、 木犀草素的含量分别为 : 23.83%、 23.67%、 13.52%、 4.48%。
     实施例 4. 芫花总黄酮苷元的制备
     取干燥芫花 1kg 粉碎, 加入 Ph 为 6.4 的柠檬酸 - 柠檬酸钠缓冲液 13L, 于 45℃下 放置 28h, , 以 80%乙醇 20L 回流提取 2 次, 提取时间为每次 2h, 合并提取液, 减压浓缩得浸 膏, 干燥。将干浸膏以溶剂溶解, 溶解液与 20g 聚酰胺 (200-300 目 ) 粉末拌匀, 干法上样, 进行聚酰胺柱层析, 先后以水、 15%、 30%、 50%的乙醇洗脱, 合并 30-50%乙醇洗脱液, 减压 回收, 得干浸膏, 经高效液相色谱法测定其中总黄酮苷元含量为 78.92%, 其中芫花素、 羟基 芫花素、 芹菜素、 木犀草素的含量分别为 : 29.28%、 29.17%、 16.82%、 3.65%。
     实施例 5. 芫花总黄酮苷元的制备
     取干燥芫花 1kg 粉碎, 加入 Ph 为 6.4 的柠檬酸 - 柠檬酸钠缓冲液 13L, 于 45℃下 放置 28h, , 以 80%乙醇 20L 回流提取 2 次, 提取时间为每次 2h, 合并提取液, 减压浓缩得浸 膏, 干燥。将干浸膏以溶剂溶解, 溶解液与 20g 大孔树脂 (200-300 目 ) 粉末拌匀, 干法上 样, 先后以水、 15%、 30%、 50%、 60%的乙醇洗脱, 合并 30-60%乙醇洗脱液, 减压回收, 得干 浸膏, 经高效液相色谱法测定其中总黄酮苷元含量为 61.77%, 其中芫花素、 羟基芫花素、 芹 菜素、 木犀草素的含量分别为 : 22.87%、 22.79%、 13.72%、 2.39%。
     实施例 6. 芫花总黄酮苷元的制备
     取干燥芫花 1kg 粉碎, 加入 Ph 为 6.4 的柠檬酸 - 柠檬酸钠缓冲液 13L, 于 45℃下 放置 28h, , 以 80%乙醇 20L 回流提取 2 次, 提取时间为每次 2h, 合并提取液, 减压浓缩得浸
     膏, 干燥。将干浸膏粉加加入 500ml 丙酮∶水 (8 ∶ 2) 提取 3 次, 减压回收溶剂, 得干浸膏, 经高效液相色谱法测定其中总黄酮苷元含量为 51.07%, 其中芫花素、 羟基芫花素、 芹菜素、 木犀草素的含量分别为 : 19.35%、 19.16%、 9.22%、 4.34%。
     实施例 7. 芫花总黄酮苷元的制备
     取干燥芫花 1kg 粉碎, 加入 Ph 为 6.4 的柠檬酸 - 柠檬酸钠缓冲液 13L, 于 45℃下 放置 28h, , 以 80%乙醇 20L 回流提取 2 次, 提取时间为每次 2h, 合并提取液, 减压浓缩得浸 膏, 干燥。将干浸膏粉加入 500ml 丙酮∶水 (7 ∶ 3) 提取 3 次, 减压回收溶剂, 得干浸膏, 经 高效液相色谱法测定其中总黄酮苷元含量为 59.25%, 其中芫花素、 羟基芫花素、 芹菜素、 木 犀草素的含量分别为 : 26.35%、 22.16%、 6.24%、 4.50%。
     实施例 8. 芫花总黄酮苷元的制备
     取干燥芫花 1kg 粉碎, 加入 80%乙醇 20L 回流提取 2 次, 提取时间为每次 2h, 合并 提取液, 减压浓缩得浸膏, 在浸膏粉中加入含 8g 纤维素酶的 PH4.5 的缓冲液 20L 于 45℃放 置 2h 后, 干燥, 得干浸膏, 将干浸膏以溶剂溶解, 溶解液与 20g 聚酰胺 (200-300 目 ) 粉末 拌匀, 干法上样, 进行聚酰胺柱层析, 先后以水、 15%、 30%、 50%的乙醇洗脱, 合并 30-50% 乙醇洗脱液, 减压回收, 得干浸膏, 经高效液相色谱法测定其中总黄酮苷元含量为 70.56%, 其中芫花素、 羟基芫花素、 芹菜素、 木犀草素的含量分别为 : 26.53 %、 28.66 %、 8.94 %、 6.43%。 实施例 9. 芫花总黄酮苷元对大鼠佐剂关节炎的影响
     将热灭活的乳酪分枝杆菌加入高压灭菌的液体石蜡中, 充分研磨均匀, 配制成 浓度为 10mg/ml 的混悬液, 混匀, 作完全弗氏佐剂使用。致炎前, 用 10 %的水合氯醛按 0.3ml/100g 的剂量麻醉大鼠, 用 75%酒精擦拭将进行致炎的各大鼠右后足足趾部位, 避开 大鼠足趾血管部位, 为避免致炎剂溢出, 1ml 注射针头进入大鼠右后足跖皮内 3/4 左右, 进 而注射弗氏完全佐剂 0.1ml 致炎。各组大鼠均于继发性足趾肿胀出现后第 21 天灌胃给予 供试药物, 实验组给予本发明芫花总黄酮苷元 12.5、 25、 50mg/kg, 对照组给药帕夫林 ( 白芍 总苷 )155mg/kg, 连续给药 10 天, 每天一次, 给药至致炎后第 31 天, 测定足跖肿胀的程度。
     由表 1、 表 2 可见, 芫花总黄酮苷元 50mg/kg 口服给药, 连续给药 10 天, 显著抑制佐 剂大鼠关节炎的原发肿胀和继发肿胀, 减轻大鼠足跖的继发性病变, 且明显优于帕夫林组 和雷公藤多苷片组。
     表 1 芫花黄酮苷元部位对佐剂性大鼠继发性足趾肿胀的影响 (x±SD, n = 8)
     * ** *** ** *** 与模型组比较 : P < 0.05, P < 0.01, P < 0.001(*P < 0.05, P < 0.01, P < 0.001vs control group) # ## ### ##
     与中药阳性药帕夫林组比较 : P < 0.05, P < 0.01, P < 0.001(#P < 0.05, P ### < 0.01, P < 0.001vs control group)
     表 2 芫花黄酮苷元部位对佐剂性大鼠原发性足趾肿胀的影响 (x±SD, n = 8)
     * ** *** ** *** 与模型组比较 : P < 0.05, P < 0.01, P < 0.001(*P < 0.05, P < 0.01, P < 0.001vs control group) # ## ### ##
     与中药阳性药帕夫林组比较 : P < 0.05, P < 0.01, P < 0.001(#P < 0.05, P ### < 0.01, P < 0.001vs control group)
     实施例 10. 芫花总黄酮苷元对小鼠角叉菜胶致大鼠足跖肿胀的影响
     取小鼠 60 只, 随机分 6 组, 分别口服给予芫花总黄酮苷元 20.0、 40.0、 80.0mg/kg, 阳性对照组帕夫林 ( 白芍总苷 )225mg/kg, 阳性对照组雷公藤多苷片 11.25mg/kg, 对照组给 药生理盐水, 给药 1h 后, 用 10%水合氯醛, 按 3mL/kg 剂量将小鼠麻醉, 将小鼠右后肢拉直, 局部消毒, 于后足跖腱膜皮下注入 1%角叉菜胶 0.02ml 致炎。分别于注射前和注射后 1、 4h 测定足趾肿胀的厚度, 计算足跖肿胀率。
     由表 3 可知, 芫花总黄酮苷元 80mg/kg( 与大鼠 50mg/kg 相当 ) 明显抑制角叉菜胶 所致小鼠足跖肿胀, 抑制作用优于帕夫林组, 优于雷公藤多苷片。
     表 3. 芫花黄酮苷元部位对佐剂性小鼠角叉菜胶致大鼠足跖肿胀的影响 (x±SD, n = 10)
     * ** *** ** *** 与模型组比较 : P < 0.05, P < 0.01, P < 0.001(*P < 0.05, P < 0.01, P < 0.001vs control group) # ## ### ##
     与中药阳性药帕夫林组比较 : P < 0.05, P < 0.01, P < 0.001(#P < 0.05, P ### < 0.01, P < 0.001vs control group)
     实施例 11. 芫花总黄酮苷元对醋酸致小鼠扭体反应的影响
     取小鼠 60 只, 随机分为 6 组, 分别口服给予本发明的芫花总黄酮苷元 20.0、 40.0、 80.0mg/kg, 阳性对照组帕夫林 ( 白芍总苷 )225mg/kg, 阳性对照组雷公藤多苷片 11.25mg/ kg, 对照组给药生理盐水, 1 小时后, 腹腔注射 1%醋酸生理盐水 0.2mg/ 只, 观察 15 分钟内 的小鼠扭体反应次数。
     由表 4 可见, 芫花总黄酮苷元 80mg/kg( 与大鼠 50mg/kg 相当 ) 明显抑制醋酸所致 小鼠扭体反应, 抑制作用与帕夫林组相当, 优于雷公藤多苷片。
     表 4 芫花黄酮苷元部位对醋酸致小鼠扭体反应的影响 (x±SD, n = 10)
     * ** *** ** *** 与模型组比较 : P < 0.05, P < 0.01, P < 0.001(*P < 0.05, P < 0.01, P < 0.001vs control group) # ## ### ##
     与白芍总苷组比较 : P < 0.05, P < 0.01, P < 0.001(#P < 0.05, P < 0.01, ### P < 0.001vs control group) & && &&& &&
     与雷公藤多苷片组比较 : P < 0.05, P < 0.01, P < 0.001(&P < 0.05, P &&& < 0.01, P < 0.001vs control group)
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1、10申请公布号CN102349959A43申请公布日20120215CN102349959ACN102349959A21申请号201110315273122申请日20111018A61K36/83200601C12P17/06200601A61P29/00200601A61K125/00200601A61K133/00200601A61K135/0020060171申请人中国药科大学地址210009江苏省南京市童家巷24号72发明人张春凤何欣何建廷54发明名称芫花总黄酮苷元有效部位的制备及其在抗免疫性炎症药物中的应用57摘要本发明涉及芫花总黄酮苷元有效部位的制备方法,其主要由芫花素、羟基芫花素。

2、、芹菜素、木犀草素和其他苷元组成,可单独或与药学上可接受载体混合,用于制备治疗免疫性炎症药物,尤其适于制备治疗类风湿关节炎的药物。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书7页CN102349962A1/2页21一种抗免疫性炎症的芫花总黄酮苷元有效部位,其特征是芫花总黄酮苷元有效部位主要由芫花素、羟基芫花素、木犀草素、芹菜素及其他苷元组成,按重量百分比计,含有总黄酮苷元5099。2如权利要求1所述的芫花总黄酮苷元有效部位,其特征在于其来源于含芫花素、羟基芫花素的药材,优选瑞香科植物芫花、芫花根、芫花条、了哥王。3权利要求1所述的芫花总黄酮苷元有效部位的制。

3、备方法,其特征是包括以下步骤方法1芫花、芫花根、芫花条或了哥王采用酶解或酸水解或自酶解后,再以水溶性溶剂提取,回收溶剂,得芫花总黄酮苷元提取物,所述的水溶性提取物选自水、乙醇的一种溶剂或两种溶剂组成的混合溶剂;将芫花总黄酮苷元提取物上样于层析柱,再分别以水、2080的乙醇洗脱,收集乙醇洗脱液,回收溶剂后得芫花总黄酮苷元,其中所述的层析柱为大孔树脂或聚酰胺柱;或将芫花总黄酮苷元提取物采用合适极性的溶剂提取,回收溶剂获得芫花总黄酮苷元部位;方法2芫花、芫花根、芫花条或了哥王以水溶性溶剂提取,回收溶剂,得芫花总黄酮提取物,所述的水溶性提取物选自水、乙醇的一种溶剂或两种溶剂组成的混合溶剂;将芫花总黄酮。

4、提取物采用酶解或酸水解后,干燥,得黄酮苷元提取物,上样于层析柱,再分别以水、2080的乙醇洗脱,收集乙醇洗脱液,回收溶剂后得芫花总黄酮苷元,其中所述的层析柱为大孔树脂或聚酰胺柱;或将芫花总黄酮苷元提取物采用合适极性的溶剂提取,获得芫花总黄酮苷元有效部位;方法3芫花、芫花根、芫花条或了哥王以水溶性溶剂提取,回收溶剂,得芫花总黄酮提取物,上样于层析柱,再分别以水、2080的乙醇洗脱,收集乙醇洗脱液,回收溶剂后得芫花总黄酮苷元,其中所述的层析柱为大孔树脂或聚酰胺柱;或将芫花总黄酮苷元提取物采用合适极性的溶剂提取,获得芫花总黄酮苷元有效部位。4如权利要求3中所述的芫花总黄酮苷元有效部位的制备方法,其特。

5、征是所述的自酶解为将芫花、芫花根、芫花条或了哥王药材加入00130倍量的水,在2050的条件下,PH为38,酶解172H,利用其自身酶使其中的苷水解为苷元。5如权利要求3中所述的芫花总黄酮苷元有效部位的制备方法,其特征是所述的酶解采用的酶为纤维素酶、蜗牛酶、混合酶、D葡萄糖苷酶或D葡萄糖苷酶,酶解温度为2060,酶解PH值38,酶用量00120MG/G,酶解时间为0172H。6如权利要求3中所述的方法,其中经酶解或酸水解后得到的芫花总黄酮苷元提取物或直接从药材提得芫花总黄酮后需进一步精制,便能得到纯度更高的芫花总黄酮苷元有效部位,所述的精制方法为上样于层析柱纯化,或者将芫花总黄酮苷元提取物以合。

6、适极性的溶剂进行提取,回收溶剂,浓缩干燥后即得到芫花总黄酮苷元有效部位,所述合适极性的溶剂选自70100300乙醇水、丙酮水或甲醇水。7权利要求1所述的芫花总黄酮苷元有效部位在制备抗免疫性炎症药物中的应用。8如权利要求7所述的应用,其特征在于所述的抗免疫性炎症为类风湿关节炎、哮喘权利要求书CN102349959ACN102349962A2/2页3或鼻炎。9一种药用组合物,其特征在于含有权利要求1所述芫花总黄酮苷元有效部位,以及含有药学上可接受的载体。10如权利要求1和9所述在抗免疫性炎症药物中的应用,其特征在于所述的有效部位或药用组合物可制备成口服制剂、注射剂、吸入制剂或外用制剂。权利要求书C。

7、N102349959ACN102349962A1/7页4芫花总黄酮苷元有效部位的制备及其在抗免疫性炎症药物中的应用技术领域0001本发明涉及芫花总黄酮苷元有效部位的制备,及该总黄酮苷元有效部位及其药物组合物在抗免疫性炎症药物中的应用。背景技术0002类风湿关节炎是一种病因尚未明了的慢性异质性疾病,属自身免疫性疾病。目前,对于类风湿关节炎的治疗主要采用非甾体类抗炎药NSAIDS、改善病情的抗风湿药DMARDS、糖皮质激素药和植物药。非甾体类药NSAIDS虽常作为治疗类风湿关节炎的一线药物,但均具有明显的不良反应,其缓解症状是由于具有抗炎作用,因此,不能防止组织损伤、关节破坏和畸形。改善病情的抗风。

8、湿药DMARDS尽管能改善症状,需要长期使用且毒副作用大。对于常规治疗无效时,可以采用糖皮质激素与一、二线药物合用,但长期大量使用糖皮质激素会产生毒副作用。植物药临床主要应用雷公藤多苷片、白芍总苷片、青藤碱等制剂,但各自均有一定的缺陷和局限性。中药具有多成分、多靶点、多环节,且毒副作用小等优势,因此,从中药中开发有效成分明确、质量可控、安全高效的抗类风湿关节炎的新一代有效部位药物是非常必要的。0003芫花为瑞香科THYMELAEACEAE植物芫花DAPHNEGENKWASIEDETZUCC的干燥花蕾。具有泻水逐饮,行气通脉,解毒消肿的功效,临床主要用于水肿胀满,胸腹积水,痰饮积聚,气逆喘咳,二。

9、便不利;外治疥癣秃疮,冻疮。主要分布于长江流域以南各省区及山东、河南、陕西等地。0004芫花条与绿豆为民间治疗风湿病的验方,已作为一种中成药在临床上应用,但单味芫花及其中化学成分用于治疗类风湿关节炎并未见相关文献报道。0005目前国内对芫花中化学成分的研究较多,文献报道其中含有4,7二甲氧基5羟基黄酮4,7DIMETHOXY5HYDROXYFLOVONE、芫花素GENKWANIN、木犀草素LUTEOLIN、芹菜素APIGENIN、羟基芫花素3HYDROXYGENKWANIN等黄酮苷元成分,除此之外,芫花中含量比较高的黄酮苷包括羟基芫花素3OD葡萄糖苷、芫花素5OD葡萄糖苷和木犀草素7甲氧基3O。

10、D葡萄糖苷等,但这些苷的溶解性与苷元有较大的区别,很难采用溶剂将苷与苷元同时提取出来,因此有必要采用水解法将苷转化为苷元,增加苷元的提取量,然后进一步提取纯化获得芫花总黄酮苷元有效部位。目前这方面的研究较少,董倩等芫花及其炮制品的质量评价,辽宁中医药大学硕士论文董倩,20103尽管采用公知技术对芫花总黄酮苷元的酸水解工艺进行了研究,但其仅仅以芫花素、芹菜素、木犀草素为考察对象,对酸水解条件进行了考察,并无进一步提取、纯化研究。0006本发明采用酶解法、酸水解法、自酶解法使芫花总黄酮苷尽可能的转化为芫花总黄酮苷元,并进一步提取纯化获得芫花总黄酮苷元有效部位,其主要成分为芫花素、羟基芫花素、木犀草。

11、素、芹菜素和其他苷元。迄今为止,尚未发现本发明涉及的采用酶解法、自酶解说明书CN102349959ACN102349962A2/7页5法水解芫花总黄酮苷的文献报道,未发现本发明涉及的芫花总黄酮苷元的提取纯化获得芫花总黄酮苷元有效部位的文献报道,也未发现本发明所涉及的芫花总黄酮苷元有效部位及其药物组合物在抗免疫性炎症如类风湿关节炎药物中的应用,也未见采用酸水解水解芫花总黄酮苷后再进一步纯化得到本发明涉及的芫花总黄酮苷元有效部位的文献报道,因此,本发明具有创造性。发明内容0007本发明解决的技术问题是采用水解法获得芫花总黄酮苷元,并进一步提取纯化获得芫花总黄酮苷元有效部位,以及研究该有效部位在抗免。

12、疫性炎症药物的应用,尤其在治疗类风湿关节炎方面的用途。0008本发明解决的技术问题还包括芫花总黄酮苷元可供工业化生产的制备方法,以及芫花总黄酮有效部位的组成,鉴于该有效部位的主要化学成分清楚明确,这将有利于工业化生产中的质量控制,从而保证疗效和制剂质量的稳定性。0009为解决上述问题,提供如下技术方案0010一种抗免疫性炎症的芫花总黄酮苷元有效部位,芫花总黄酮苷元有效部位主要由芫花素、羟基芫花素、木犀草素、芹菜素及其他苷元组成,按重量百分比计,含有总黄酮苷元5099。0011所述的芫花总黄酮苷元有效部位,来源于含芫花素、羟基芫花素的药材,优选瑞香科植物芫花、芫花根、芫花条、了哥王。0012所述。

13、的芫花总黄酮苷元有效部位的制备方法,包括以下步骤0013方法10014芫花、芫花根、芫花条或了哥王采用酶解或酸水解或自酶解后,再以水溶性溶剂提取,回收溶剂,得芫花总黄酮苷元提取物,所述的水溶性提取物选自水、乙醇的一种溶剂或两种溶剂组成的混合溶剂;0015将芫花总黄酮苷元提取物上样于层析柱,再分别以水、2080的乙醇洗脱,收集乙醇洗脱液,回收溶剂后得芫花总黄酮苷元,其中所述的层析柱为大孔树脂或聚酰胺柱;或将芫花总黄酮苷元提取物采用合适极性的溶剂提取,回收溶剂获得芫花总黄酮苷元部位;0016方法20017芫花、芫花根、芫花条或了哥王以水溶性溶剂提取,回收溶剂,得芫花总黄酮提取物,所述的水溶性提取物。

14、选自水、乙醇的一种溶剂或两种溶剂组成的混合溶剂;0018将芫花总黄酮提取物采用酶解或酸水解后,干燥,得黄酮苷元提取物,上样于层析柱,再分别以水、2080的乙醇洗脱,收集乙醇洗脱液,回收溶剂后得芫花总黄酮苷元,其中所述的层析柱为大孔树脂或聚酰胺柱;或将芫花总黄酮苷元提取物采用合适极性的溶剂提取,获得芫花总黄酮苷元有效部位;0019方法30020芫花、芫花根、芫花条或了哥王以水溶性溶剂提取,回收溶剂,得芫花总黄酮提取物,上样于层析柱,再分别以水、2080的乙醇洗脱,收集乙醇洗脱液,回收溶剂后得芫花总黄酮苷元,其中所述的层析柱为大孔树脂或聚酰胺柱;或将芫花总黄酮苷元提取物采用合适极性的溶剂提取,获得。

15、芫花总黄酮苷元有效部位。说明书CN102349959ACN102349962A3/7页60021所述的自酶解优选0022将芫花、芫花根、芫花条或了哥王药材加入00130倍量的水,在2060的条件下,PH为39,酶解172H,利用其自身酶使其中的苷水解为苷元。0023所述的酶解优选0024纤维素酶、蜗牛酶、混合酶、D葡萄糖苷酶或D葡萄糖苷酶,酶解温度2050,酶解PH值39,酶用量0120MG,酶解时间为0172H。0025所述的方法,其中经酶解后得到的芫花总黄酮苷元提取物需进一步精制,便能得到纯度更高的芫花总黄酮苷元有效部位,所述的精制方法为上样于层析柱纯化,或者将芫花总黄酮苷元提取物以合适极。

16、性的溶剂进行提取,回收溶剂,浓缩干燥后即得到芫花总黄酮苷元有效部位,所述合适极性的溶剂选自70100300乙醇水、丙酮水或甲醇水。0026所述的芫花总黄酮苷元有效部位在制备抗免疫性炎症药物中的应用。0027所述的抗免疫性炎症优选类风湿关节炎、哮喘或鼻炎。0028一种药用组合物,含有所述芫花总黄酮苷元有效部位,以及含有药学上可接受的载体。0029所述的有效部位或药用组合物可制备成口服制剂、注射剂、吸入制剂或外用制剂。0030本发明经进一步研究发现该有效部位主要含芫花素、羟基芫花素、木犀草素、芹菜素及其他苷元,采用该部位50MG/KG口服给药,明显抑制大鼠佐剂关节炎大鼠的原发和继发性足跖肿胀,80。

17、MG/KG角叉菜胶所致小鼠足跖肿胀及醋酸所致小鼠扭提反应,说明该有效部位抑制急慢性炎症和疼痛。因此,可用该有效部位制备治疗类风湿关节炎及其他炎症相关疾病的药物。0031本发明的芫花总黄酮苷元用于临床时,建议剂量范围为50MG/次,也可以根据剂型的不同和疾病的严重程度,使用剂量超出该范围。0032本发明所涉及的芫花总黄酮苷的酶解、自酶解,芫花总黄酮苷元的提取纯化及芫花总黄酮苷元有效部位在抗免疫性炎症药物中的应用均为首次发明,该方法涉及的芫花总黄酮苷元有效部位的酶解、自酶解可以使芫花中的黄酮苷转化为黄酮苷元,可提高芫花中总黄酮苷元的提取率,从而可降低药材的用量,节省药材,降低成本,尤其自酶解转化苷。

18、元的方法,不需要另外添加酶,利用芫花自身的酶使其中相应的苷发生水解,因此该方法更简便,快捷,成本更低;本发明采用无毒、安全的溶剂、材料提取纯化该有效部位,更适合于工业化生产。0033本发明以帕夫林白芍总苷胶囊,批号110405,宁波立华制药有限公司和雷公藤多苷片批号091202,上海复旦复华药业有限公司为阳性对照药,采用大鼠佐剂关节炎模型、角叉菜胶致小鼠足跖肿胀模型、醋酸致小鼠扭体反应模型研究发现,芫花总黄酮苷元有效部位明显抑制佐剂大鼠关节炎的原发肿胀和继发肿胀,减轻大鼠足跖的继发性病变,明显抑制角叉菜胶所致小鼠足跖肿胀,明显抑制醋酸致小鼠的扭体反应,且药效均优于帕夫林和雷公藤多苷片,同时佐剂。

19、大鼠关节炎大鼠踝关节滑膜病理切片表明80MG/KG的芫花总黄酮苷元有明显的修复关节的作用。0034下面通过实施例对本发明进一步描述,但本发明并不限于实施例所述的范围。说明书CN102349959ACN102349962A4/7页7具体实施方式0035实施例1芫花总黄酮苷元的制备0036取干燥芫花2KG粉碎,加入含有16G纤维素酶的PH为45的缓冲液20L于45放置2H后,弃去缓冲液,以90乙醇20L回流提取2次,提取时间为2H。合并提取液,减压浓缩得浸膏,干燥。将干浸膏以溶剂溶解,溶解液与50G聚酰胺200300目粉末拌匀,干法上样,进行聚酰胺柱层析,先后以水、15、30、50的乙醇洗脱,合并。

20、3050乙醇洗脱液,减压回收,得干浸膏,经高效液相色谱法测定其中总黄酮苷元含量为8772,其中芫花素、羟基芫花素、芹菜素、木犀草素的含量分别为3005、3045、1947、775。0037实施例2芫花总黄酮苷元的制备0038取干燥芫花1KG粉碎,加入含有10G蜗牛酶的PH为5的缓冲液10L于45放置2H后,弃去缓冲液,以90乙醇10L回流提取2次,提取时间为每次2H,合并提取液,减压浓缩得浸膏,干燥。将干浸膏以溶剂溶解,溶解液与20G聚酰胺200300目粉末拌匀,干法上样,进行聚酰胺柱层析,先后以水、15、30、50的乙醇洗脱,合并3050乙醇洗脱液,减压回收,得干浸膏,经高效液相色谱法测定其。

21、中总黄酮苷元含量为7660,其中芫花素、羟基芫花素、芹菜素、木犀草素的含量分别为2781、2789、1651、439。0039实施例3芫花总黄酮苷元的制备0040取干燥芫花1KG粉碎,加入6盐酸5L,于沸水浴中水解3小时后,弃去酸溶液,以90乙醇10L回流提取2次,提取时间为每次2H,合并提取液,减压浓缩得浸膏,干燥。将干浸膏以溶剂溶解,溶解液与20G聚酰胺200300目粉末拌匀,干法上样,进行聚酰胺柱层析,先后以水、15、30、50的乙醇洗脱,合并3050乙醇洗脱液,减压回收,得干浸膏,经高效液相色谱法测定其中总黄酮苷元含量为6560,其中芫花素、羟基芫花素、芹菜素、木犀草素的含量分别为23。

22、83、2367、1352、448。0041实施例4芫花总黄酮苷元的制备0042取干燥芫花1KG粉碎,加入PH为64的柠檬酸柠檬酸钠缓冲液13L,于45下放置28H,以80乙醇20L回流提取2次,提取时间为每次2H,合并提取液,减压浓缩得浸膏,干燥。将干浸膏以溶剂溶解,溶解液与20G聚酰胺200300目粉末拌匀,干法上样,进行聚酰胺柱层析,先后以水、15、30、50的乙醇洗脱,合并3050乙醇洗脱液,减压回收,得干浸膏,经高效液相色谱法测定其中总黄酮苷元含量为7892,其中芫花素、羟基芫花素、芹菜素、木犀草素的含量分别为2928、2917、1682、365。0043实施例5芫花总黄酮苷元的制备0。

23、044取干燥芫花1KG粉碎,加入PH为64的柠檬酸柠檬酸钠缓冲液13L,于45下放置28H,以80乙醇20L回流提取2次,提取时间为每次2H,合并提取液,减压浓缩得浸膏,干燥。将干浸膏以溶剂溶解,溶解液与20G大孔树脂200300目粉末拌匀,干法上样,先后以水、15、30、50、60的乙醇洗脱,合并3060乙醇洗脱液,减压回收,得干浸膏,经高效液相色谱法测定其中总黄酮苷元含量为6177,其中芫花素、羟基芫花素、芹菜素、木犀草素的含量分别为2287、2279、1372、239。0045实施例6芫花总黄酮苷元的制备0046取干燥芫花1KG粉碎,加入PH为64的柠檬酸柠檬酸钠缓冲液13L,于45下放。

24、置28H,以80乙醇20L回流提取2次,提取时间为每次2H,合并提取液,减压浓缩得浸说明书CN102349959ACN102349962A5/7页8膏,干燥。将干浸膏粉加加入500ML丙酮水82提取3次,减压回收溶剂,得干浸膏,经高效液相色谱法测定其中总黄酮苷元含量为5107,其中芫花素、羟基芫花素、芹菜素、木犀草素的含量分别为1935、1916、922、434。0047实施例7芫花总黄酮苷元的制备0048取干燥芫花1KG粉碎,加入PH为64的柠檬酸柠檬酸钠缓冲液13L,于45下放置28H,以80乙醇20L回流提取2次,提取时间为每次2H,合并提取液,减压浓缩得浸膏,干燥。将干浸膏粉加入500。

25、ML丙酮水73提取3次,减压回收溶剂,得干浸膏,经高效液相色谱法测定其中总黄酮苷元含量为5925,其中芫花素、羟基芫花素、芹菜素、木犀草素的含量分别为2635、2216、624、450。0049实施例8芫花总黄酮苷元的制备0050取干燥芫花1KG粉碎,加入80乙醇20L回流提取2次,提取时间为每次2H,合并提取液,减压浓缩得浸膏,在浸膏粉中加入含8G纤维素酶的PH45的缓冲液20L于45放置2H后,干燥,得干浸膏,将干浸膏以溶剂溶解,溶解液与20G聚酰胺200300目粉末拌匀,干法上样,进行聚酰胺柱层析,先后以水、15、30、50的乙醇洗脱,合并3050乙醇洗脱液,减压回收,得干浸膏,经高效液。

26、相色谱法测定其中总黄酮苷元含量为7056,其中芫花素、羟基芫花素、芹菜素、木犀草素的含量分别为2653、2866、894、643。0051实施例9芫花总黄酮苷元对大鼠佐剂关节炎的影响0052将热灭活的乳酪分枝杆菌加入高压灭菌的液体石蜡中,充分研磨均匀,配制成浓度为10MG/ML的混悬液,混匀,作完全弗氏佐剂使用。致炎前,用10的水合氯醛按03ML/100G的剂量麻醉大鼠,用75酒精擦拭将进行致炎的各大鼠右后足足趾部位,避开大鼠足趾血管部位,为避免致炎剂溢出,1ML注射针头进入大鼠右后足跖皮内3/4左右,进而注射弗氏完全佐剂01ML致炎。各组大鼠均于继发性足趾肿胀出现后第21天灌胃给予供试药物,。

27、实验组给予本发明芫花总黄酮苷元125、25、50MG/KG,对照组给药帕夫林白芍总苷155MG/KG,连续给药10天,每天一次,给药至致炎后第31天,测定足跖肿胀的程度。0053由表1、表2可见,芫花总黄酮苷元50MG/KG口服给药,连续给药10天,显著抑制佐剂大鼠关节炎的原发肿胀和继发肿胀,减轻大鼠足跖的继发性病变,且明显优于帕夫林组和雷公藤多苷片组。0054表1芫花黄酮苷元部位对佐剂性大鼠继发性足趾肿胀的影响XSD,N80055说明书CN102349959ACN102349962A6/7页90056与模型组比较P005,P001,P0001P005,P001,P0001VSCONTROLG。

28、ROUP0057与中药阳性药帕夫林组比较P005,P001,P0001P005,P001,P0001VSCONTROLGROUP0058表2芫花黄酮苷元部位对佐剂性大鼠原发性足趾肿胀的影响XSD,N800590060与模型组比较P005,P001,P0001P005,P001,P0001VSCONTROLGROUP0061与中药阳性药帕夫林组比较P005,P001,P0001P005,P001,P0001VSCONTROLGROUP0062实施例10芫花总黄酮苷元对小鼠角叉菜胶致大鼠足跖肿胀的影响0063取小鼠60只,随机分6组,分别口服给予芫花总黄酮苷元200、400、800MG/KG,阳性。

29、对照组帕夫林白芍总苷225MG/KG,阳性对照组雷公藤多苷片1125MG/KG,对照组给药生理盐水,给药1H后,用10水合氯醛,按3ML/KG剂量将小鼠麻醉,将小鼠右后肢拉直,局部消毒,于后足跖腱膜皮下注入1角叉菜胶002ML致炎。分别于注射前和注射后1、4H测定足趾肿胀的厚度,计算足跖肿胀率。0064由表3可知,芫花总黄酮苷元80MG/KG与大鼠50MG/KG相当明显抑制角叉菜胶所致小鼠足跖肿胀,抑制作用优于帕夫林组,优于雷公藤多苷片。0065表3芫花黄酮苷元部位对佐剂性小鼠角叉菜胶致大鼠足跖肿胀的影响XSD,N100066说明书CN102349959ACN102349962A7/7页100。

30、067与模型组比较P005,P001,P0001P005,P001,P0001VSCONTROLGROUP0068与中药阳性药帕夫林组比较P005,P001,P0001P005,P001,P0001VSCONTROLGROUP0069实施例11芫花总黄酮苷元对醋酸致小鼠扭体反应的影响0070取小鼠60只,随机分为6组,分别口服给予本发明的芫花总黄酮苷元200、400、800MG/KG,阳性对照组帕夫林白芍总苷225MG/KG,阳性对照组雷公藤多苷片1125MG/KG,对照组给药生理盐水,1小时后,腹腔注射1醋酸生理盐水02MG/只,观察15分钟内的小鼠扭体反应次数。0071由表4可见,芫花总黄酮苷元80MG/KG与大鼠50MG/KG相当明显抑制醋酸所致小鼠扭体反应,抑制作用与帕夫林组相当,优于雷公藤多苷片。0072表4芫花黄酮苷元部位对醋酸致小鼠扭体反应的影响XSD,N1000730074与模型组比较P005,P001,P0001P005,P001,P0001VSCONTROLGROUP0075与白芍总苷组比较P005,P001,P0001P005,P001,P0001VSCONTROLGROUP0076与雷公藤多苷片组比较P005,P001,P0001P005,P001,P0001VSCONTROLGROUP说明书CN102349959A。

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