具有聚合物骨架的荧光探针 发明领域 本发明涉及通过生物化学过程激活的猝灭的荧光探针。 设计探针使得在未被激活 探针中发生分子内猝灭， 但猝灭剂部分在限定条件下从探针裂解， 这使探针发出荧光。 亦公 开了适于体内成像的包含探针的光学显像剂以及药物组合物和试剂盒以及体内成像方法。
发明背景
US 6,083,485 及相似专利公开用具有 2.0 或更小的辛醇 - 水分配系数的花青染 料的体内近红外 (NIR) 光学成像方法。亦公开所述染料与分子量高达 30kDa 的 “生物学检 测单元” 的缀合物， 所述生物学检测单元与特定细胞群结合， 或与受体选择性结合， 或在组 织或肿瘤中积聚。 US 6083485 的染料亦可与大分子缀合， 所述大分子为例如聚赖氨酸、 葡聚 糖、 聚乙二醇、 甲氧基聚乙二醇、 聚乙烯醇、 葡聚糖、 羧基葡聚糖或级联聚合物样结构 ( 分子 量为 100Da 到超过 100kDa)。未公开特定染料 - 缀合物。
US 6,083,486(General Hospital Corporation) 公开 NIR 荧光探针， 所述探针仅 在体内与靶标组织相互作用 ( 即激活 ) 后才发射大量荧光。探针在分子内猝灭， 包含聚合 物骨架和众多与骨架共价连接的 NIR 荧光染料。荧光染料相对于彼此保持在允许通过能量 转移相互作用从而猝灭彼此的荧光的位置。设计探针使得 ： (i) 通过非生物可降解的连接 (linkage) 来让荧光染料与骨架连接， 但所述骨架含有激活位点 ； 或 (ii) 通过含有激活位 点的连接让荧光染料与骨架连接。US 6,083,486 的 “荧光激活位点” 是探针内的共价键， 其 可由靶标组织中存在的酶裂解， 即遭受特异性酶促裂解。 聚合物骨架优选为多肽， 例如聚赖 氨酸。据信优选选项 (ii)， 以便酶促裂解 ( 激活 ) 使荧光染料分子从被约束在荧光猝灭位 置中释放。因此， 将酶促裂解设计为从探针释放荧光染料， 以便除掉猝灭荧光的布置， 并因 此在体内在酶激活位点选择性地观察到荧光。
WO 2004/028449 公开可用作荧光染料的猝灭剂的非荧光双甘菊环 (bisazulene) 二聚物。亦阐述了包含双甘菊环猝灭剂和与间隔基连接的 NIR 荧光染料的荧光探针， 其 中猝灭剂和荧光染料由靶标特异性激活位点分开。然后在靶标组织中在激活位点的代 谢和键裂解导致荧光染料 - 猝灭剂相互作用的瓦解， 结果荧光由被释放的荧光染料产生 (WO2004/028449 的图 3)。
WO 2007/109364 公开猝灭的荧光染料缀合物和其在检测和治疗特征为有害细胞 增殖的病症 ( 包括癌症 ) 中的使用方法。荧光染料缀合物包含树枝状大分子和至少两种荧 光染料， 每一种经由蛋白酶裂解位点与树枝状大分子在猝灭位置共价连接。优选至少一种 荧光染料为光敏剂。树枝状大分子有助于为缀合的荧光染料提供必须的几何结构， 以确保 未修饰的缀合物猝灭。 关于 US 6,083,486， 可代谢的基团可在骨架内， 或处于使荧光染料与 树枝状大分子骨架缀合的连接中。
US 2007/0036725A1 公开用于标记活性蛋白酶的基于活性的探针， 其具有下式 ：
其中 ：
(a) 肽为单个氨基酸、 二肽、 三肽或四肽， 并还包含封端基团 ；
(b)Qu 为猝灭剂或封端基团， 其中封端基团选自脂族酯、 芳族酯或杂环酯 ；
(c)Flu 为荧光团， 前提条件为可交换荧光团猝灭剂对的位置， 使得猝灭剂在肽上， 而荧光团在 “Q” 处； 和
(d) 任何荧光团和猝灭剂都通过低级烷基、 芳基或芳基 - 低级烷基连接基团来连 接。
WO 2007/008080 阐述双靶向光学成像造影剂， 其包含彼此在一个分子中缀合的 ：
靶标结合配体 (V) ；
酶可裂解基团 (E) ；
荧光团 (D) ； 和
猝灭剂 (Q)。
造影剂优选包含彼此缀合的结构单元 (i)E-Q 和 (ii)V-D。 最优选所述造影剂具有 1 2 3 1 2 3 式 Q-L -E-L -V-L -D， 其中 L 、 L 和 L 独立为接头基团。
US 7,329,505 公开包含肽骨架的短肽序列， 所述肽骨架具有与其缀合的荧光染料 和色氨酸 ( 作为猝灭剂 )。经由外肽酶降解肽骨架来激活探针。该过程释放单独的肽片段， 其中荧光染料和色氨酸被分开， 导致荧光显著增加。据信标记的肽可用于检测外肽酶。
WO 2008/078190 公开可激活的探针， 所述探针包含荧光团 - 聚合物缀合物， 其中 荧光团经由可代谢的接头与聚合物结合， 聚合物进一步包含水溶性基团。因荧光团从聚合 物裂解而在特异性靶标位点产生荧光。据信水溶性基团有助于降低天然聚合物的固有荧 光， 使得在酶促裂解时的荧光变化更显著。
本发明
本发明提供通过生物化学过程激活的猝灭的荧光探针。 设计探针使得在未被激活 探针中发生分子内猝灭， 但猝灭剂部分在限定条件下从探针裂解， 这使探针发出荧光。
现有技术的可激活荧光探针通常由与聚合物 ( 例如聚 -L- 赖氨酸 ) 通过酶 ( 例如 通过组织蛋白酶 B) 可裂解的短序列共价结合的荧光染料组成。当荧光染料以彼此紧密接
近的方式连接到聚合物上时， 其荧光将遭受自动猝灭， 使得聚合物构建体的荧光低 ( 但通 常不是 0)。在通过酶作用释放荧光染料后， 其荧光将大大增强。完整探针的背景荧光是不 利因素。另一缺点是释放的荧光染料易于从激活位点扩散开这一事实。
因此， US 2007/0036725 和 WO 2007/008080 二者都阐述 ：
(1) 使荧光染料从猝灭中释放出 ；
(2) 使活性荧光染料离开去猝灭的点的移动最小化。
在 US 2007/0036725 中， 活性荧光染料与酶的活性位点共价连接 ( 第 0009 段， 第 1 页， 第 1 栏底部 )。在 WO 2007/008080 中， 活性荧光染料与靶标结合配体连接。在本发明 中， 通过保持与高分子量聚合物的连接来阻止活性荧光染料的移动 ( 缓慢扩散 )。相比之下， 本发明提供以以下间隔与聚合物骨架永久连接的荧光染料， 所述间隔使得当仅有荧光 染料与聚合物连接时， 不发生由荧光共振能量转移引起的猝灭。荧光能量转移对荧光染料 之间的距离极为敏感。在猝灭部分与酶接触时， 其将被裂解下来， 并从该位点扩散开， 剩下 缓慢扩散的大的荧光聚合物。这将改进探针的灵敏性和特异性， 使其优于产生可自由扩散 的荧光染料的探针。
在 US 2007/0036725 中， 支架 (scaffold) 包含单肽、 二肽、 三肽或四肽 ( 第 0011 段 )。在 WO 2007/008080 中， 可将寡聚物 ( 至多约 10 个单元 ) 用作接头 ( 第 16 页 )。在 这两个现有技术公开内容中， 光学显像剂与聚合物的连接都有不利之处， 因为固定化第一 种显像剂将可能因位阻而阻止随后的反应。未提及数种显像剂与高分子量聚合物的连接。 在本公开内容中， 高分子量支架 ：
(1) 阻止从产生荧光的点离开 ；
(2) 倾向于将显像剂保持在具有高浓度的分裂出猝灭部分的酶的区域。
发明详述
在第一方面， 本发明提供在分子内猝灭的荧光探针， 所述探针包含分子量为 10-100kD 的聚合物骨架和 ： (i) 若干 (z) 种近红外荧光染料， 每一种经由抗酶裂解和生物化学氧化的第一连 接与骨架共价连接 ；
(ii) 若干 (z) 个猝灭剂部分， 每一个经由可通过酶代谢或生物化学氧化裂解的第 二连接与骨架共价连接 ；
其中 z 为数值 1-150 的整数， 其中所述猝灭剂部分与所述荧光染料处于荧光猝灭 能量转移关系。
术语 “探针” 意指可用于体外或体内检测酶活性或生物化学活性组分的化合物。 在 诸如癌症和动脉粥样硬化病等疾病中， 多种酶增量调节。 这些及其它疾病伴随炎性病况， 其 中由激活的免疫细胞演变氧自由基， 例如超氧阴离子。 因此， 可将检测特定酶和氧自由基的 增加量的探针用于检测所述疾病。
术语 “聚合物骨架” 意指荧光染料和猝灭剂所连接的生物相容的聚合物。 聚合物骨 架可为 ： 多肽， 其可包含不同的氨基酸残基或相同的氨基酸 ( 即聚氨基酸 ) ； 蛋白质 ； 多糖 ； 聚酯 ； 聚酰胺基胺 (polyamidoamine) ； 聚丙烯酸 ； 聚醇或壳聚糖。聚合物骨架可包含 D- 或 L- 氨基酸。术语 “生物相容的” 意指生理学上可耐受的， 即可给予哺乳动物体而无毒性或过 分不适。 聚合物骨架的分子量适当地为 10-100kDa(10,000-100,000Da)。 为了延迟扩散， 探 针分子量高， 但未高到阻碍其从循环中转移至组织或肿瘤中。
术语 “荧光染料” 具有其常规含义， 即发荧光的染料。 用于本发明的合适荧光染料， 为具有 600-1000nm 范围内的最大吸光度和 600-1200nm 范围内的发射最大值的荧光染料。
术语 “荧光猝灭剂” 意指这样的部分， 其阻止荧光染料发荧光， 使得连接有猝灭剂 和荧光染料两者的未被激活探针， 具有极微的荧光。 猝灭剂分子为本领域已知 [Johansson， Meth.Mol.Biol.， 335， 17-29(2006) 和 Bullok 等 Biochem.， 46(13)， 4055-4065(2007)]。 Shanker 等 [Meth.Cell Biol.， 84， 第 8 章， 213-242(2008)] 并在 Lakowicz(“Principles of Fluorescence Spectroscopy” 第二版， Kluwer， (1999)， 第 388 页 ] 中阐述了易受荧光 共振能量转移影响的荧光染料对。 Shanker 和 Lakowicz 亦包括用于发现新的荧光染料 / 猝
灭剂对的方法。
术语 “分子内猝灭的” 意指在完整探针分子内， 安排荧光染料和猝灭剂部分使得猝 灭来自荧光染料的任何荧光。
术语 “生物化学氧化” 意指由哺乳动物体的细胞或器官在体内或体外产生的氧化 过程。具有该性质的合适氧化过程包括由细胞外超氧阴离子、 过氧化氢或羟基自由基进行 的氧化， 它们能够裂解二硫键以及呈某些构象的碳碳双键， 例如在多不饱和脂肪酸中存在 的那些。
术语 “抵抗酶促裂解或生物化学氧化的” ， 意指这样的共价键， 其不是哺乳动物体 的酶的底物， 且不被上述生物化学氧化过程裂解。 用于第一连接的合适的这类键的实例为 ： 碳碳键 ； 醚键 ； 硫醚键 ； 磺酰胺键和酰胺键 ( 不包括肽键 )。 显然的是， 第一连接不包括那些 落入第二连接定义范围内的可裂解键 ( 参见以下 )。
术语 “可通过酶代谢或生物化学氧化裂解的” ， 意指第二连接可通过以下裂解 ： (a) 哺乳动物体内或体外的酶 ； 或 (b) 如上所定义的生物化学氧化过程。(a) 的酶促反应可裂 解酶的天然底物或底物类似物。酶可包括 ： 酯酶、 肽链内切酶、 内切蛋白酶、 脱烷基酶、 糖苷 酶、 内切聚糖酶 (endoglycanase)、 肝素酶、 软骨素酶、 透明质酸酶、 RNA 酶、 DNA 酶或磷酸二 酯酶。 术语 “荧光猝灭能量转移关系” ， 意指荧光染料和猝灭剂相对于彼此保持在允许它 们通过能量转移相互作用以允许发生猝灭的位置。
术语 “猝灭剂部分” 意指阻止荧光染料发荧光使得完整的探针具有极微荧光的部 分。因此， 在用激发荧光染料的波长的光辐照时， 猝灭剂吸收被激发的荧光染料的能量， 使 得大体上完整探针具有极微荧光。适用于本发明的猝灭剂包括 ：
(a) 非 荧 光 染 料， 例 如 DABCYL[4-(4 ′ - 二 甲 基 氨 基 苯 偶 氮 ) 苯 甲 酸 ； 其 在 360-560nm 区 内 吸 收 ] 和 其 它 偶 氮 染 料 ； DANSYL、 QSY-7、 黑 洞 猝 灭 剂 (Black Hole Quencher) 等 ；
(b) 具合适的吸收光谱的荧光团 ；
(c) 硝基取代的苯基部分， 包括对硝基苯甲酸、 间硝基苯甲酸、 邻硝基苯甲酸、 3， 5- 二硝基苯甲酸和 2， 4， 6- 三硝基苯磺酸 ；
(d) 甘菊环二聚物。
猝 灭 剂 分 子 为 本 领 域 已 知 [Johansson， Meth.Mol.Biol.， 335， 17-29(2006) ； Marras， 同前， 335， 3-16(2006) 和 Bullok 等 ( 见上 )]。
将本发明探针设计为使得经裂解的探针中 ( 即除掉一个或多个猝灭剂部分后 ) 荧 光染料对不处于自猝灭的关系。要注意的是， 即使荧光染料的某种自猝灭在完整探针中出 现， 那也不是问题， 因为反正对于完整探针期需要极微荧光。在图 1 中图示探针的激活 ：
图1： 探针的激活
其中 ： B 为聚合物骨架 ； L1 为第一连接 ； L2 为第二连接 ； Lc 为裂解的第二连接的残基 ； Q 为猝灭剂部分 ； Qc 为裂解的猝灭剂部分， 包括裂解的第二连接的任何残基 ； Fq 为与 Q 处于猝灭关系的荧光染料 ； Fm 为处于可发荧光的环境中的荧光染料。每一探针的荧光染料和猝灭剂部分对的数目合适地介于 1-150 之间。优选探针具 有至少 2 或 3 对所述对。对于上限 (150)， 探针将具有大约 100kDa 的分子量。
第一方面的探针优选用于适于体内成像的光学显像剂， 如在第二方面 ( 见下面 ) 所述。然而， 探针亦可有体外应用 ( 例如定量测定生物学样品中的裂解酶的测定或所述酶 在组织样品中的可视化 )。
本发明探针可任选还包含生物学靶向部分。生物学靶向部分可与骨架、 图 1 的 L1 或荧光染料连接。术语 “生物学靶向部分” (BTM)， 意指体内给予后被选择性吸收或定位在 哺乳动物体的特定部位的化合物。所述部位可例如涉及特定疾病状态， 其指示器官或代谢 过程如何起作用。生物学靶向部分优选包含 ： 3-100 聚体的肽、 肽类似物、 拟肽或肽模拟物， 其可为线性肽或环状肽或其组合 ； 或酶底物、 酶拮抗剂或酶抑制剂 ； 合成的结合受体的化 合物 ； 寡核苷酸或寡 -DNA 或寡 -RNA 片段。
术语 “肽” 意指包含由肽键连接的如下定义的两个或更多个氨基酸的化合物， 所 述肽键即让一个氨基酸的胺官能团与另一氨基酸的羧基以及与各个氨基酸的 C-2( 或 “α 碳” ) 连接的羧基连接的酰胺键。术语 “肽模拟物” 或 “模拟物” ， 是指模仿肽或蛋白质的生 物学活性但在化学特性上不再是肽的生物学活性化合物， 也就是说， 它们不再含有任何肽 键 ( 即氨基酸之间的酰胺键 )。 本文术语肽模拟物以更广泛的含义使用， 包括在性质上不再 是完整肽的分子， 例如假肽、 半肽和拟肽。术语 “肽类似物” 是指如下所述包含一个或多个 氨基酸类似物的肽。亦参见 “Synthesis of Peptides and Peptidomimetics” ， M.Goodman 等， Houben-Weyl E22c， Thieme。
术语 “氨基酸” 意指 L- 或 D- 氨基酸、 氨基酸类似物 ( 例如萘基丙氨酸 ) 或氨基酸 模拟物， 其可为天然存在的或纯合成来源的， 并可为光学纯的， 即单对映异构体， 并因此为 手性的， 或为对映异构体的混合物。本文采用氨基酸的常规 3- 字母或单字母缩写。优选本 发明氨基酸为光学纯的。术语 “氨基酸模拟物” 意指天然存在的氨基酸的合成类似物， 其为 电子等排物， 即已被设计为模仿天然化合物的空间和电子结构。所述电子等排物为本领域 技术人员所熟知， 包括但不限于酯肽、 逆 - 反肽 (retro-inverso peptide)、 硫代酰胺、 环链烷或 1， 5- 二取代四唑 [ 参见 M.Goodman， Biopolymers， 24， 137， (1985)]。
合适的酶底物、 拮抗剂或抑制剂包括葡萄糖和葡萄糖类似物， 例如氟脱氧葡萄糖 ； 脂肪酸或弹性蛋白酶、 血管紧张素 II 或金属蛋白酶抑制剂。优选非肽血管紧张素 II 拮抗 剂为依那普利。氯沙坦为血管紧张素 II 受体的非肽拮抗剂。合适的合成的受体结合化合 物包括雌二醇、 雌激素、 黄体酮、 孕酮和其它类固醇激素 ； 多巴胺 D-1 或 D-2 受体的配体或多 巴胺转运蛋白例如托烷 ； 和血清素受体的配体。
优选特征
聚合物骨架的分子量优选为 9-50kDa， 更优选为 10-40kDa， 最优选为 11-35kDa。 本 发明探针优选具有约 30-50kDa 的分子量， 这有利于减慢经由肾脏的排除。探针优选适于体 内应用。
本发明探针优选亲水， 以便提高在水中的溶解度及减少聚集。探针亦应该优选具 有净负电荷， 以便减少与细胞表面 ( 其总是带负电荷 ) 的非特异性连接， 并促进体内肾脏清 除。
猝灭剂部分优选为与荧光染料不同的化学物质。猝灭剂部分最优选为非荧光的， 即当用适于激发荧光染料的波长的光辐照时不发出荧光， 当用荧光染料发射的光辐照时其 也不发出荧光。那样的话， 一旦猝灭剂从探针裂解， 其也不提供任何竞争荧光——任何荧 光全部由激活的探针产生。对于体内应用， 猝灭剂合适地为生物相容的 ( 如上所定义 )， 因 此释放的猝灭剂对哺乳动物体无毒性。因此， 用于体内应用的优选猝灭剂部分既是非荧光 的又是生物相容的。优选的非荧光猝灭剂包括由 Weissleder 等 [Ang.Chem.Int.Ed.Eng.， 41， 3659-3662(2002) 和 WO 04/028449] 所教导的甘菊环二聚物。远红外猝灭剂 QSY 21 由 Bullok 等 [Biochem.， 46(13)， 4055-4065(2007)] 教导。 因为发射近红外范围的光的荧光染 料尤其适于体内应用， 因此优选在该范围吸收的猝灭剂。猝灭剂应该通过肾快速排除。排 除可能伴随缀合反应， 例如肝脏中的葡糖苷酸化。
优选选择这样的探针， 其使得可通过一种或多种酶的作用来裂解第二连接。优选 所述酶为水解酶， 更优选肽酶或蛋白酶。最优选用于本发明的裂解酶包括 ： 组织蛋白酶 B、 D、 K、 L和S； 基质金属蛋白酶 ； 尿激酶型纤溶酶原激活剂 ； 激肽释放酶 ； hepsin ； 弗林蛋白 酶； 蛋白裂解酶 (matriptase) ； 前胶原转化酶 ； 骨形态生成蛋白 -1 ； 和 tolloid 样蛋白酶 1 和 2。这些酶中的很多参与肿瘤侵袭。特异性酶底物连接示于表 1 和 2 中 ：
表1：
其中 ： Nva ＝ L- 正缬氨酸 ； AHX ＝氨基己酸 ； Dpa ＝ N-3-(2， 4- 二硝基苯基 )-L-2， 3- 二氨基丙酰基猝灭剂部分 ； pNA ＝对硝基苯胺和 AMC ＝氨基甲基香豆素
蛋白酶敏感序列示于表 2 中 ：
表2# ＝裂解点 ； X ＝任何氨基酸 ； POH ＝羟脯氨酸 ； Dnp ＝二硝基苯基
Coombs 等， Substrate specificity of prostate-specific antigen(PSA)( 前列 腺特异性抗原 (PSA) 的底物特异性 ).Chemistry&Biology 5， 第9期： 475-488(1998)。
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可用于本情境中的其它肽酶和蛋白酶包括 ： 纤溶酶、 尿激酶纤溶酶原激活剂、 prostatin、 睾蛋白 (testisin)、 TSP50、 GPI-SP1-3、 TESP 1-2、 DISP、 类胰蛋白酶 γ1、 蛋白 裂解酶 -1、 2 和 3、 hepsin、 TMPRSS 2、 3 和 4、 脊骨蛋白 (spinesin)、 HAT、 MSPL、 激肽释放 酶 -14、 多聚丝氨酸酶 (polyserase)-1、 弗林蛋白酶、 PACE4、 PC1、 PC5、 PC7、 激肽释放酶 -5、 胱天蛋白酶 9、 组织蛋白酶 H、 K 和 L 以及 DESC-1。
优选探针骨架抵抗酶裂解， 即其在体内稳定。这可例如通过使用非天然氨基酸 ( 例如 2， 3- 二氨基丙酸或 2， 4- 二氨基丁酸 ) 的聚合物来实现。或者， 肽的一端或两端 ( 优 IG 选两端 ) 具有与其缀合的代谢抑制基团 (M )。术语 “代谢抑制基团” (MIG) 意指抑制或阻抑 酶活性尤其是肽酶例如羧肽酶活性的生物相容性基团， 否则所述酶可从肽的氨基末端或羧 基末端裂解氨基酸。 所述基团对于体内应用尤其重要， 并为本领域技术人员所知， 对于肽胺 末端， 所述基团合适地选自 ：
N- 酰化的基团 -NH(C ＝ O)RG， 其中酰基 -(C ＝ O)RG 具有选自 C1-6 烷基、 C3-10 芳基 G 的R， 或包含聚乙二醇 (PEG) 结构单元。合适的 PEG 基团如下所述。优选所述 PEG 基团为 式 Bio1 或 Bio2( 见下面 ) 的生物改性剂。优选所述氨基末端 MIG 基团为乙酰基、 苄氧基羰 基或三氟乙酰基， 最优选乙酰基。
用于肽羧基末端的合适代谢抑制基团包括 ： 甲酰胺、 叔丁酯、 苄酯、 环己酯、 氨基醇 IG 或聚乙二醇 (PEG) 结构单元。用于 BTM 肽羧基末端氨基酸残基的合适的 M 基团， 为其中氨 IG IG 基酸残基的末端胺被 C1-4 烷基 ( 优选甲基 )N- 烷基化的 M 基团。优选所述 M 基团为甲酰 胺或 PEG， 最优选所述基团为甲酰胺。
优选 PEG 基团包含由下式 Bio1 或 Bio2 的单分散性 PEG 样结构寡聚化获得的单 元：
式 Bio1 的 17- 氨基 -5- 氧代 -6- 氮杂 -3， 9， 12， 15- 四氧杂十七烷酸 其中 p 为 1-10 的整数。或者， 可使用基于式 Bio2 的丙酸衍生物的 PEG 样结构 ：其中 p 如式 Bio1 所定义， q 为 3-15 的整数。
在式 Bio2 中， p 优选为 1 或 2， q 优选为 5-12。
探针骨架对裂解的这类抗性具有优势， 即一旦被激活， 含相对高分子量荧光染料 的部分不易扩散开， 而含相对低分子量猝灭剂的片段更迅速地扩散开。 因此， 探针将倾向于 保持与目的靶标接近， 因此获得靶标选择性成像。骨架优选包含多肽和 / 或共聚物。共聚 物具有以下优势 ： 可选择共聚物的两个组分以具有不同的官能团， 这使得在第一和第二连 接之间有化学区别。优选的这类共聚物包括赖氨酸 - 谷氨酸共聚物。那样的话， 可让荧光 团与赖氨酸残基连接 ( 例如经由磺酰胺或甲酰胺键 )， 而可裂解的短序列与猝灭部分的谷 氨酸残基末端连接。可通过包括 “间隔基” ( 例如另外的氨基酸或乙二醇寡聚物 ) 以增加酶 促作用后荧光团之间的距离， 来改善性能 ：
[Lys(L1-Fq)-Glu(L2-Q)-Ala-Ala]n → [Lys(L1-Fm)-Glu(Lc)-Ala-Ala]n+Qc
其中 ：
Fq 如对图 1 所定义， 并经由 L1 在赖氨酸的 6- 位连接 ；
L1、 L2、 Lc、 Fm、 Q 和 Qc 如对图 1 所定义 ；
n 为数值 2-150 的整数。
在右侧的裂解产物中， 荧光染料 (Fm) 由三个氨基酸分开， 因此对自猝灭具有最小 易感性。共振能量转移的效能以距离的 6 次幂方式降低 [Shanker 等， Meth.Cell Biol.， 84， 第 8 章， 213-242(2008)]。
可任选如下进一步改进探针 ： 通过选择取代基， 以使底物聚合物带负电荷 ( 并易 溶解 )， 而裂解的产物探针带正电荷， 从而赋予裂解的探针粘附到细胞表面的倾向。这可通 过选择被大量磺化或羧化的可释放的猝灭剂来实现。
优选的荧光染料具有大量的离域电子系统， 例如 ： 花青染料、 部花青染料、 吲哚菁、 酞菁、 萘酞菁、 三苯次甲基 (triphenylmethines)、 卟啉、 吡喃 染料、 方酸 染料、 克酮酸 染料、 薁 (pyrilium) 染料、 噻喃 嗪 染料、(azulenium) 染料、 靛苯胺类、 苯并吩苯并噻吩并噻嗪染料、 蒽醌类、 萘醌类、 阴丹士林、 邻苯二甲酰吖啶酮类、 三苯酚合苯醌、偶氮染料、 分子内和分子间电荷转移染料和染料络合物、 环庚三烯酮、 四嗪类、 双 ( 二硫醇 烯 (dithiolene)) 络合物、 双 ( 苯 - 二硫醇盐 ) 络合物、 靛苯胺染料、 双 (S， O- 二硫醇烯 ) 络合物。荧光蛋白例如绿色荧光蛋白 (GFP) 和具有不同的吸收 / 发射特性的 GFP 修饰物亦 有用。 某些稀土金属 ( 例如铕、 钐、 铽或镝 ) 络合物用于某些情境中， 作为荧光纳米晶体 ( 量 子点 )。
可使用的生色团的具体实例包括 ： 荧光素、 磺酰罗丹明 101(Texas Red)、 罗丹明 B、 罗丹明 6G、 罗丹明 19、 吲哚菁绿、 Cy2、 Cy3B、 Cy3.5、 Cy5、 Cy5.5、 Cy7、 Cy7.5、 Marina 蓝、 太平洋蓝 (Pacific Blue)、 俄勒冈绿 (Oregon green)488、 俄勒冈绿 514、 四甲基罗丹明和 AlexaFluor 350、 Alexa Fluor 430、 Alexa Fluor 532、 Alexa Fluor 546、 AlexaFluor 555、 Alexa Fluor 568、 Alexa Fluor 594、 Alexa Fluor 633、 AlexaFluor 647、 Alexa Fluor 660、 Alexa Fluor 680、 Alexa Fluor 700 和 AlexaFluor 750。尤其优选花青染料。Licha 等综述了用于体内光学成像的染料和染料缀合物 [Topics Curr.Chem.， 222， 1-29(2002) ； Adv.Drug Deliv.Rev.， 57， 1087-1108(2005)]。
作为荧光团的优选花青染料具有下式 II ：其中 ：
每一个 X′独立选自 ： -C(CH3)2、 -S-、 -O- 或 -C[(CH2)aCH3][(CH2)bM]-， 其中 a 为数 1 值 0-5 的整数， b 为数值 1-5 的整数， M 为基团 G 或选自 SO3M 或 H ；
每一个 Y′独立代表 1-4 个选自以下的基团 ：
H、 -CH2NH2、 -SO3M1、 -CH2COOM1、 -NCS 和 F， 其中将 Y′基团置于芳环的任意位置 ； 1 1
Q′独立选自 ： H、 SO3M 、 NH2、 COOM 、 铵、 酯基、 苄基和基团 G ； 1 c c
M 为H或B， 其中 B 为生物相容的阳离子 ；
l 为 1-3 的整数 ；
m 为 1-5 的整数 ；
其中 X′、 Y′和 Q′中的至少一个包含基团 G ；
G 为适于连接骨架的活性基团或官能团。
术语 “生物相容的阳离子” (Bc)， 意指带正电荷的反荷离子， 其与电离的带负电荷 的基团形成盐， 其中所述带正电荷的反荷离子亦无毒性， 因此适于给予哺乳动物体， 尤其是 人体。合适的生物相容的阳离子实例包括 ： 碱金属钠或钾 ； 碱土金属钙和镁 ； 和铵离子。优 选生物相容的阳离子为钠和钾， 最优选钠。
当连接生物学靶向分子 (BTM) 时， BTM 可为人工合成或天然来源的， 但优选人工合 成的。 术语 “人工合成的” 具有其常规含义， 即与从天然来源例如从哺乳动物体分离的相反， 为人造的。所述化合物具有可完全控制其制备及杂质分布的优点。因此， 天然来源的单克 隆抗体及其片段在本文所用术语 “人工合成的” 的范围之外。当 BTM 为肽时， 优选的这类肽 包括 ：
- 促生长素抑制素、 奥曲肽 (octreotide) 及类似物 ；
- 与 ST 受体结合的肽， 其中 ST 是指由大肠杆菌及其它微生物产生的热稳定毒素 ；
- 层粘连蛋白片段， 例如 YIGSR、 PDSGR、 IKVAV、 LRE 和 KCQAGTFALRGDPQG ；
- 靶向白细胞聚集位点的 N- 甲酰基肽 ；
- 血小板因子 4(PF4) 及其片段 ；
- 含有 RGD(Arg-Gly-Asp) 的肽， 其可例如靶向血管发生 [R.Pasqualini 等 .， Nat. Biotechnol.1997 年 6 月 ； 15(6) ： 542-6] ； [E.Ruoslahti， Kidney Int.1997 年 5 月 ； 51(5) ： 1413-7] ；
-α2- 抗纤溶酶、 纤连蛋白或 β 酪蛋白、 血纤蛋白原或血小板反应蛋白的肽片段。 可在以下参考文献中发现 α2- 抗纤溶酶、 纤连蛋白、 β 酪蛋白、 血纤蛋白原及血小板反应蛋 白的氨基酸序列 ： α2- 抗纤溶酶前体 [M.Tone 等 .， J.Biochem， 102， 1033， (1987)] ； β- 酪 蛋白 [L.Hansson 等， Gene， 139， 193， (1994)] ； 纤连蛋白 [A.Gutman 等， FEBS Lett.， 207， 145， (1996)] ； 血小板反应蛋白 -1 前体 [V.Dixit 等， Proc.Natl.Acad.Sci.， USA， 83， 5449， (1986)] ； R.F.Doolittle， Ann.Rev.Biochem.， 53， 195， (1984) ；
- 作为血管紧张素的底物或抑制剂的肽， 例如 ：
血管紧张素 II ： Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe(E.C.Jorgensen 等， J.MeD. Chem.， 1979， Vol 22， 9， 1038-1044) ； [Sar， Ile] 血管紧张素 II ： Sar-Arg-Val-Tyr-Ile-His -Pro-Ile(R.K.Turker 等 .， Science， 1972， 177， 1203) ；
- 血管紧张素 I ：Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu ；
- 内皮缩血管肽， 例如内皮缩血管肽 -1 ：
Cys-Ser-Cys-Ser-Ser-Leu-Met-Asp-Lys-Glu-Cys-Val-Tyr-Phe-Cys-His-Leu-A sp-Ile-Ile-Trp ；
- 铃蟾肽 ：
Xaa-Gln-Arg-Leu-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2 ；
- 胃泌素 ： 焦谷氨酰基
-Gly-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Tyr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2 ；
- 促性腺激素释放激素 ： 焦谷氨酰基
-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2。
BTM 作为探针的部分的使用具有进一步提高探针特异性的优点。
当 BTM 为肽时， 所述肽的一端或两端 ( 优选两端 ) 具有与其缀合的如上所述的代 IG 谢抑制基团 (M )。
可通过如下文中所述的固相肽合成法来合成无市售的本发明肽： P.Lloyd-Williams， F.Albericio 和 E.Girald ； Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins， CRC Press， 1997。 本发明探针可如下制备 ： 市购聚 -L- 赖氨酸、 葡聚糖、 淀粉酶 ( 聚 -D- 葡萄糖 )、 壳 聚糖、 RNA、 DNA、 聚乳酸、 聚 ( 乳酸 / 乙醇 )、 硫酸肝素和硫酸软骨素。为了让氨基可用于反 应并增加活性基团的数量， 可让壳聚糖、 硫酸肝素和硫酸软骨素去乙酰化或脱硫酸盐 ； 所述 方法在本领域众所周知。需要合成含侧链氨基的氨基酸聚合物。合适的方法概述如下 ： 将 封端基团引入侧链氨基， 在稍微酸性 pH 的水溶液中用水溶性碳二亚胺让被取代的氨基酸 聚合。除掉封端基团， 并在大小排阻柱上除掉副产物， 同时缩小了产物分子量范围。
为了促进与骨架的缀合， 荧光染料和 / 或猝灭剂部分各自适当地连接活性官能团 a a (Q )。将 Q 基团设计为使其与骨架的互补官能团反应， 从而形成共价键。骨架的互补官能 团可为骨架的内在部分， 或可通过用本领域已知的双官能团衍生来引入。表 3 显示活性基 团及其互补对应物的实例 ：
表3： 活性取代基和与其反应的互补基团
活性基团 (Qa) 活化酯 酸酐、 酸性卤化物 异硫氰酸酯 乙烯砜 二氯三嗪 卤代乙酰胺、 马来酰亚胺 互补基团 伯氨基、 仲氨基 伯氨基、 仲氨基、 羟基 氨基 氨基 氨基 硫醇、 咪唑、 羟基、 胺、 硫代磷酸酯 15102325551 A CN 102325564 碳二亚胺 肼、 酰肼 亚磷酰胺
说明羧酸书13/18 页羰基， 包括醛和酮 羟基术语 “活化酯” 或 “活性酯” 意指羧酸的酯衍生物， 将其设计为具有更好的离去基 团， 并因此使得其更易于与亲核试剂例如胺反应。合适的活性酯实例为 ： N- 羟基琥珀酰亚 胺 (NHS)、 五氟苯酚、 五氟苯硫酚、 对硝基苯酚和羟基苯并三唑。优选活性酯为 N- 羟基琥珀 酰亚胺或五氟苯酚酯。
存在于骨架中的官能团的实例包括 ： 羟基、 氨基、 巯基、 羰基 ( 包括醛和酮 ) 和硫 代磷酸酯。 合适的 Qa 基团可选自 ： 羧基 ； 活化酯 ； 异硫氰酸酯 ； 马来酰亚胺 ； 卤代乙酰胺 ； 酰 a 肼； 乙烯砜、 二氯三嗪和亚磷酰胺。 优选 Q 为 ： 羧酸的活化酯、 异硫氰酸酯、 马来酰亚胺或卤 代乙酰胺。
当互补基团为胺或羟基时， Qa 优选为活化酯， 且优选所述酯如上所述。 当互补基团 为硫醇时， Qa 优选为马来酰亚胺或碘乙酰胺基团。 用于荧光染料和光学染料与生物学分子缀合的通用方法由 Licha 等 [Topics Curr.Chem.， 222， 1-29(2002) ； Adv.Dr ug Deliv.Rev.， 57， 1087-1108(2005)] 所 述。 用 于本发明的肽、 蛋白质和寡核苷酸底物可在末端位置被标记， 或备选地在一个或多个内部 位置被标记。关于用荧光染料标记试剂来进行蛋白质标记的综述和实例， 参见以下文献 ： “Non-Radioactive Labelling， a Practical Introduction( 非放射性标记实用介绍 )” ， Garman， A.J.Academic Press， 1997 ； “Bioconjugation-Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences( 生物缀合 - 用于生物医学科学的蛋白质偶联技术 )” ， Aslam， M. 和 Dent， A.， Macmillan Reference Ltd， (1998)。方案可以用来在合成的肽中获 得位点特异性标记， 例如参见 Hermanson， G.T.， “Bioconjugate Techniques( 生物缀合技 术 )” ， Academic Press(1996)。
在缀合反应中， 骨架、 荧光染料或猝灭剂可任选具有任何另外的官能团， 所述官能 团可潜在地与合适的保护基进行保护性反应， 以使化学反应选择性地仅在所期需位点发 生。术语 “保护基” 意指抑制或阻抑不良化学反应的基团， 但将其设计为具有足够的活性， 以使其可在不改变分子其余部分的足够温和的条件下自所述官能团裂解。 去保护后获得所 期需的产物。 胺保护基为本领域技术人员所熟知， 适当地选自 ： Boc( 其中 Boc 为叔丁氧基羰 基 )、 Fmoc( 其中 Fmoc 为芴基甲氧基羰基 )、 三氟乙酰基、 烯丙氧基羰基、 Dde[ 即 1-(4， 4- 二 甲基 -2， 6- 二氧代亚环己基 ) 乙基 ] 或 Npys( 即 3- 硝基 -2- 吡啶亚磺酰基 )。合适的巯 基保护基为 Trt( 三苯甲基 )、 Acm( 乙酰氨基甲基 )、 t-Bu( 叔丁基 )、 叔丁基硫基、 甲氧基苄 基、 甲基苄基或 Npys(3- 硝基 -2- 吡啶亚磺酰基 )。其它保护基的使用阐述于 “Protective Groups in Organic Synthesis( 有机合成中的保护基 )” ， Theodora W.Greene 和 Peter G.M.Wuts， (John Wiley&Sons， 1991) 中。优选胺保护基为 Boc 和 Fmoc， 最优选 Boc。优选 胺保护基为 Trt 和 Acm。
让光学报告染料与氨基酸及肽缀合的方法由以下文献阐述 ： Licha( 见上 ) 以及 Flanagan 等 [Bioconj.Chem.， 8， 751-756(1997)] ； Lin 等， [ 如 上， 13， 605-610(2002)] 和
Zaheer[Mol.Imaging， 1(4)， 354-364(2002)]。
在第二方面， 本发明提供适于体内成像的光学显像剂， 其包含第一方面的探针。
术语 “显像剂” 意指适于在整个 ( 即完整 ) 哺乳动物体体内的目的区域光学成像的 化合物。优选哺乳动物为人受试者。成像可为侵入式 ( 例如外科手术或内窥镜检测 ) 或非 侵入式。成像可任选用于促进活检 ( 例如经由内窥镜仪器中的活检通道 ) 或肿瘤切除 ( 例 如在外科手术程序中经由肿瘤边缘确定 )。
优选将显像剂提供为呈适于给予哺乳动物的形式的药物组合物， 其包含显像剂连 同生物相容的载体。 “生物相容的载体” 为流体， 尤其是液体， 其中可悬浮或溶解显像剂， 以 使该组合物为生理上可耐受， 即可被给予哺乳动物体而无毒性或过度不适。生物相容的载 体合适地为可注射载体液体， 例如无菌无热原的注射用水 ； 水溶液， 例如盐水 ( 可让其有利 地平衡以便用于注射的最终产物等渗 ) ； 一种或多种以下物质的水溶液 ： 调节张力的物质 ( 例如具生物相容的反荷离子的等离子体阳离子的盐 )、 糖 ( 例如葡萄糖或蔗糖 )、 糖醇 ( 例 如山梨醇或甘露醇 )、 二醇 ( 例如丙三醇 ) 或其它非离子多元醇物质 ( 例如聚乙二醇、 丙二 醇等 )。优选生物相容的载体为无热原注射用水或等渗盐水。
显像剂和生物相容的载体各自提供在合适的小瓶或容器中， 所述小瓶或容器包括 密封容器， 其允许保持无菌完整性和 / 或放射性安全性， 任选外加惰性顶部空间气体 ( 例如 氮气或氩气 )， 同时允许通过注射器或插管加入及抽出溶液。优选的所述容器为隔膜密封 的小瓶， 其中用顶封物 (overseal)( 通常为铝制 ) 压紧气密塞。塞适于用皮下注射针一次 或多次穿刺 ( 例如在隔膜密封的塞上压紧 )， 同时保持无菌完整性。所述容器具有另外的 以下优点 ： 塞可在需要时承受真空 ( 例如以改变顶部空间气体或给溶液脱气 )， 承受压力变 化， 例如降低压力而不允许外部大气气体例如氧气或水蒸汽进入。
优选多剂量容器包含单个散装小瓶 ( 例如 10-30cm3 体积 )， 其含有多次患者剂量， 由此在制剂的有效期期间于不同时间间隔将单次患者剂量抽到临床级注射器中， 以适合临 床情况。设计预填充的注射器以含有单次人剂量或 “单位剂量” ， 并因此优选为一次性的或 适于临床使用的其它注射器。本发明药物组合物优选具有适于单个患者的剂量， 并提供在 如上所述的合适的注射器或容器中。
药物组合物可任选含有另外的赋形剂， 例如抗微生物防腐剂、 pH 调节剂、 填充剂、 稳定剂或渗透压调节剂。 术语 “抗微生物防腐剂” ， 意指抑制潜在有害的微生物例如细菌、 酵 母或霉菌生长的物质。抗微生物防腐剂亦可表现出某些杀菌特性， 这视使用剂量而定。本 发明一种或多种抗微生物防腐剂的主要作用是抑制任何这类微生物在药物组合物中生长。 然而， 亦可任选将抗微生物防腐剂用于抑制试剂盒的一种或多种组分中可能有害的微生物 的生长， 所述组分用于在给予前制备所述组合物。 合适的一种或多种抗微生物防腐剂包括 ： 对羟基苯甲酸酯类， 即对羟基苯甲酸甲酯、 对羟基苯甲酸乙酯、 对羟基苯甲酸丙酯或对羟基 苯甲酸丁酯或其混合物 ； 苄基醇 ； 苯酚 ； 甲酚 ； 溴化十六烷基三甲铵和硫柳汞。优选的一种 或多种抗微生物防腐剂为对羟基苯甲酸酯类。
术语 “pH 调节剂” ， 意指可用于确保组合物 pH 在对人或哺乳动物给予可接受的限 制 ( 大约 pH 4.0-10.5) 内的化合物或化合物的混合物。合适的所述 pH 调节剂包括 ： 药学 上可接受的缓冲剂， 例如曲辛、 磷酸盐或 TRIS[ 即三 ( 羟基甲基 ) 氨基甲烷 ] ； 和药学上可 接受的碱， 例如碳酸钠、 碳酸氢钠或其混合物。当组合物以试剂盒形式采用时， pH 调节剂可任选提供在单独的小瓶或容器中， 以使试剂盒用户可作为多步骤程序的部分来调节 pH。
术语 “填充剂” 意指药学上可接受的膨胀剂， 其可有助于在生产及冷冻干燥期间 的材料处理。合适的填充剂包括 ： 无机盐， 例如氯化钠 ； 和水溶性糖或糖醇， 例如蔗糖、 麦芽 糖、 甘露醇或海藻糖。
可在无菌制备 ( 即洁净室 ) 条件下制备第二方面的药物组合物， 以获得所期需的 无菌无热原的产物。优选关键组分、 尤其是相关试剂和与显像剂接触的设备部分 ( 例如小 瓶 ) 无菌。可通过本领域已知方法给组分及试剂除菌， 所述方法包括 ： 无菌过滤、 用例如 γ- 辐照、 高压灭菌器、 干热或化学处理 ( 例如用环氧乙烷 ) 终端除菌。优选事先给某些组 分除菌， 以使需要进行最少量的操作。然而， 作为预防措施， 优选包括至少无菌过滤步骤作 为制备药物组合物的最终步骤。
优选从试剂盒制备第二方面的药物组合物， 试剂盒如以下第三方面所述。
在第三方面， 本发明提供用于制备如第二方面所述的显像剂药物组合物的试剂 盒。该试剂盒包括第一方面的无菌固态形式的显像剂， 以便用生物相容载体的无菌供应品 重构后， 发生溶解以获得所期需的药物组合物。
在所述情况下， 可将显像剂外加如上所述的其它任选赋形剂提供为合适的小瓶或 容器中的冻干粉末。然后将该物质设计为用所期需的生物相容载体重构， 以获得呈无菌无 热原形式的药物组合物， 其已准备好用于哺乳动物给予。
优选无菌固态形式的显像剂为冻干固体。 无菌固态形式优选提供在药物级的容器 中， 其如对药物组合物 ( 见上 ) 所述。当将试剂盒冻干时， 制剂可任选包含冷冻保护剂， 其 选自糖， 优选甘露醇、 麦芽糖或曲辛。
在第四方面， 本发明提供体内光学成像的方法， 所述方法包括 ：
(i) 将第二方面的光学显像剂给予活动物或人受试者 ；
(ii) 留出时间用于 (a) 探针在所述受试者内的目的靶标组织中聚积， 和 (b) 在 所述靶标组织中的酶通过在一个或多个第二连接处的酶促裂解激活探针， 以获得激活的探 针；
(iii) 用具有所述激活探针的荧光染料可吸收的波长的近红外激发光照射靶标组 织；
(iv) 用荧光检测仪检测来自激活的探针的荧光， 所述荧光通过步骤 (iii) 中荧光 染料的激发而产生 ；
(v) 任选过滤由荧光检测仪检测的光， 以分出荧光组分 ； 和
(vi) 根据步骤 (iv) 或 (v) 检测的荧光， 形成靶标组织的光学图像。
术语 “光学成像” 意指基于与绿色到近红外区 ( 波长 500-1200nm) 的光的相互作 用， 形成用于疾病检测、 分期或诊断、 跟踪疾病进展或用于跟踪疾病治疗的图像的任何方 法。光学成像进一步包括直接显现而不使用任何设备和涉及设备使用的所有方法， 所述 设备为例如各种观测仪器、 导管和光学成像设备， 例如用于层析成像显现的计算机辅助硬 件。模态和测量技术包括但不限于 ： 发光成像 ； 内窥镜检查 ； 荧光内窥镜检查 ； 光学相干层 析术 ； 透射成像 ； 时间分辨透射成像 ； 共焦成像 ； 非线性显微术 ； 光声成像 ； 声 - 光成像 ； 光 谱法 ； 反射光谱法 ； 干涉测量法 ； 相干干涉测量法 ； 扩散光层析术和荧光介导的扩散光层析 术 ( 连续波长、 时域和频域系统 )， 以及光散射、 吸收、 偏振、 发光、 荧光寿命、 量子产率及猝灭的测量。这些技术的进一步细节由以下文献提供 ： (Tuan Vo-Dinh( 编辑 ) ： “Biomedical Photonics Handbook” (2003)， CRC Press LCC ； Mycek&Pogue( 编 辑 ) ： “Handbook of Biomedical Fluorescence” (2003) ， Marcel Dekker ， Inc. ； Splinter&Hopper ： “ An Introduction to Biomedical Optics” (2007)， CRC Press LCC。
用步骤 (iii) 照射光激发的波长视所用的特定荧光染料而变化， 但对于本发明探 针， 其通常介于 500-1200nm 之间， 优选 600-1000nm 的波长。用于产生激发光的仪器可为常 规激发光源， 例如 ： 激光器 ( 例如离子激光器、 染料激光器或半导体激光器 ) ； 卤素光源或氙 气光源。可任选用各种光学过滤器来获得最佳激发波长。优选第四方面步骤 (iii) 的激发 光在性质上为连续波 (CW)。
光学成像的方法优选为荧光内窥镜检查。第四方面的哺乳动物体优选为人体。显 像剂的优选实施方案为如第二方面所述 ( 见上 )。
第四方面的优选光学成像方法为荧光反射成像 (FRI)。 在 FRI 中， 将本发明显像剂 给予待诊断的受试者， 随后用激发光 ( 通常为连续波 (CW) 激发 ) 照射受试者的组织表面。 所述光激发显像剂的荧光染料。用荧光检测仪检测由激发光产生的来自显像剂的荧光。优 选过滤回光以分出荧光组分 ( 单独或部分地 )。由荧光形成图像。通常进行最少处理 ( 没 有计算光学参数例如寿命、 量子产率等的处理器 )， 图像反映荧光强度。将显像剂设计为集 中于疾病区域， 这产生较高的荧光强度。因此， 疾病区域在荧光强度图像中产生正反差。优 选用 CCD 照相机或芯片获得图像， 由此实时成像是可能的。
在第四方面的方法中， 优选事先已给予所述哺乳动物体显像剂或药物组合物。 “事 先给予” 意指在成像前已经进行的涉及临床医师的步骤， 其中将显像剂例如以静脉注射给 予患者。该实施方案包括将第二实施方案的显像剂用于制备诊断剂， 所述诊断剂用于哺乳 动物体疾病状态的体内诊断成像。
在第五方面， 本发明提供体内光学成像的方法， 所述方法包括 ：
(i) 将第二方面的光学显像剂给予活动物或人受试者 ；
(ii) 留出时间用于 (a) 探针在所述受试者内的目的靶标组织中聚积， 和 (b) 所 述靶标组织中的酶通过在一个或多个第二连接处的酶促裂解来激活探针， 以获得激活的探 针；
(iii) 让具有非均一组成的所述受试者的光散射生物组织以预定的随强度变化的 时间暴露于来自光源的激发光， 以激发显像剂， 所述组织多重散射激发光 ；
(iv) 检测因响应所述曝光而从所述组织多重散射的光发射 ；
(v) 通过用处理器建立多个值来定量测定因发射产生的整个组织的荧光特性， 所 述值各自对应于组织内不同位置的荧光特性水平， 该荧光特性水平随组织的非均一组成而 变化 ； 和
(vi) 通过根据步骤 (v) 的值绘制组织的非均一组成图谱， 来产生组织图像。
第五方面的成像方法使用 FDPM( 频域光子迁移 )。这相对于连续波 (CW) 方法， 在 组织内染料的检测深度更深是重要的情况下有优势 [Sevick-Muraca 等， Curr.Opin.Chem. Biol.， 6， 642-650(2002)]。对于所述频域 / 时域成像， 若荧光染料具有可根据待成像的病 灶的组织深度及所采用的仪器类型而调节的荧光特性， 则其有利。
步骤 (v) 的荧光特性优选对应于显像剂吸收， 并进一步优选包括为对应于在给予成像剂之前的组织吸收和散射系数的若干量绘图。步骤 (v) 的荧光特性优选对应于荧光寿 命、 荧光量子效率、 荧光产率及显像剂吸收中的至少一种。 荧光特性优选独立于发射强度并 独立于显像剂浓度。
步骤 (v) 的定量测定优选包括 ： (a) 建立估测值 ； (b) 确定作为估测值函数的计算 发射 ； (c) 将计算发射与所述检测的发射进行比较以确定误差 ； (d) 提供作为误差函数的荧 光特性的修正估测值。 定量测定优选包括根据所述组织的数学关系建模的多重光散射行为 来确定值。 第一选择的方法优选进一步包括通过检测所述荧光特性的变化来监测体内组织 的代谢特性。
第五方面的光学成像优选用于有助于促进哺乳动物体疾病状态管理。 术语 “管理” 意指在以下方面的应用 ： 疾病进展的检测、 分期、 诊断、 监测， 或者治疗监测。疾病状态适宜 地为其中涉及裂解探针的第二连接的酶的状态。成像应用优选包括基于照相机的表面成 像、 内窥镜检查和外科指导。合适的光学成像方法的进一步详细情况由 Sevick-Muraca 等 [Curr.Opin.Chem.Biol.， 6， 642-650(2002)] 综述。
在第六方面， 本发明提供哺乳动物体的疾病进展的检测、 分期、 诊断、 监测或者疾 病状态治疗的监测的方法， 所述方法包括第六方面的体内光学成像方法。
本发明通过以下详述的非限制性实施例来阐明。实施例 1 提供本发明探针的预示 性合成。
实施例 1 ： 组织蛋白酶 B 探针的合成 ( 预示性实施例 )
其中 ：
Q 为猝灭剂部分 ；
Fq 为与 Q 处于猝灭关系的荧光染料 ；
n 为数值在 2-150 范围内的整数。
聚合物骨架为聚乙二醇 (PEG) 基团。与其连接的是经由可被组织蛋白酶 B 选择 性裂解的连接 (Ala-Arg-Arg-Ala) 的猝灭剂部分 (Q)。亦连接到 PEG 骨架上的是荧光染料
(Fq)。
特定化合物如下 ：
猝灭剂 (Q) 为二硝基苯基， 荧光染料为香豆素衍生物。21