具有聚合物骨架的荧光探针.pdf

1、10申请公布号CN102325551A43申请公布日20120118CN102325551ACN102325551A21申请号200980157309922申请日200912220823315720081222GBA61K49/00200601C12Q1/3420060171申请人通用电气医疗集团股份有限公司地址挪威奥斯陆72发明人H托勒斯豪格74专利代理机构中国专利代理香港有限公司72001代理人孔青林森54发明名称具有聚合物骨架的荧光探针57摘要本发明涉及通过生物化学过程激活的猝灭的荧光探针。将所述探针设计为使得在未被激活探针中发生分子内猝灭，但猝灭剂部分在限定条件下从所述探针裂解，这使探

2、针发出荧光。本发明亦公开适于体内成像的包含所述探针的光学显像剂以及药物组合物和试剂盒以及体内成像方法。30优先权数据85PCT申请进入国家阶段日2011081886PCT申请的申请数据PCT/EP2009/0677342009122287PCT申请的公布数据WO2010/072752EN2010070151INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书18页CN102325564A1/2页21一种分子内猝灭的荧光探针，所述荧光探针包含分子量为10100KDA的聚合物骨架和I若干Z种近红外荧光染料，每一种经由抗酶裂解和生物化学氧化的第一连接与所述骨架共价连接；II

3、若干Z个猝灭剂部分，每一个经由可通过酶代谢或生物化学氧化裂解的第二连接与所述骨架共价连接；其中Z为数值1150的整数，其中所述猝灭剂部分与所述荧光染料处于荧光猝灭能量转移关系。2权利要求1的探针，其中所述第二连接可通过酶代谢裂解。3权利要求2的探针，其中所述酶为水解酶。4权利要求13中任一项的探针，其中所述聚合物骨架抵抗酶裂解。5权利要求14中任一项的探针，其中所述聚合物骨架包括多肽。6权利要求15中任一项的探针，其中所述聚合物骨架包括共聚物。7权利要求6的探针，其中所述共聚物包括赖氨酸谷氨酸共聚物。8权利要求17中任一项的探针，其中所述猝灭剂部分选自I非荧光染料；II硝基取代的苯基部分；II

4、I甘菊环二聚物。9权利要求18中任一项的探针，其中所述猝灭剂部分为非荧光的。10权利要求19中任一项的光学显像剂，其中所述猝灭剂为生物相容的。11权利要求110中任一项的探针，其中所述第一连接包含磺酰胺键或酰胺键。12权利要求111中任一项的探针，其中所述荧光染料为在6001000NM范围内具有最大吸光度的荧光染料。13权利要求112中任一项的探针，所述探针还包含生物学靶向分子。14一种适于体内成像的光学显像剂，所述光学显像剂包含权利要求113中任一项的探针。15权利要求14的光学显像剂，其中所述探针提供为呈适于哺乳动物给予形式的药物组合物，所述药物组合物包含所述探针连同生物相容的载体。16权

5、利要求15的光学显像剂组合物，所述组合物具有适于单个患者的剂量，并提供在合适的注射器或容器中。17一种用于制备权利要求15或权利要求16的光学显像剂组合物的试剂盒，所述试剂盒包括呈无菌固态形式的权利要求113中任一项的探针，使得当用生物相容载体的无菌供应品重构时，发生溶解获得所期需的组合物。18权利要求17的试剂盒，其中所述无菌固态形式为冻干固体。19一种体内光学成像的方法，所述方法包括I将权利要求1416中任一项的光学显像剂给予活动物或人受试者；II留出时间用于A探针在所述受试者内的目的靶标组织中聚积，和B在所述靶标组织中的酶通过在一个或多个如权利要求1中所定义的第二连接处的酶促裂解来激活探

6、针，以获得激活的探针；III用具有所述激活探针的荧光染料可吸收的波长的近红外激发光照射所述靶标组权利要求书CN102325551ACN102325564A2/2页3织；IV用荧光检测仪检测来自所述激活的探针的荧光，所述荧光通过步骤III中的荧光染料的激发而产生；V任选过滤由所述荧光检测仪检测的光，以分出荧光组分；和VI根据步骤IV或V检测的荧光，形成所述靶标组织的光学图像。20权利要求19的方法，其中步骤III的激发光在性质上为连续波CW。21一种体内光学成像的方法，所述方法包括I将权利要求1416中任一项的光学显像剂给予活动物或人受试者；II留出时间用于A探针在所述受试者内的目的靶标组织中聚

7、积，和B所述靶标组织中的酶通过在一个或多个如权利要求1中所定义的第二连接处的酶促裂解来激活探针，以获得激活的探针；III让具有非均一组成的所述受试者的光散射生物组织以预定的随强度变化的时间暴露于来自光源的激发光，以激发所述显像剂，所述组织多重散射所述激发光；IV检测因响应所述曝光而从所述组织多重散射的光发射；V通过用处理器建立多个值来定量测定由发射产生的整个组织的荧光特性，所述值各自对应于所述组织内不同位置的荧光特性水平，所述荧光特性水平随所述组织的非均一组成而变化；和VI通过根据步骤V的值绘制所述组织的非均一组成图谱来产生所述组织的图像。22权利要求1921中任一项的方法，其中将所述体内光学

8、成像用于帮助哺乳动物体的疾病进展的检测、分期、诊断、监测，或疾病状态的治疗的监测。23一种检测、分期、诊断、监测哺乳动物体的疾病进展或者监测哺乳动物体疾病状态的治疗的方法，所述方法包括权利要求1921中任一项的体内光学成像方法。权利要求书CN102325551ACN102325564A1/18页4具有聚合物骨架的荧光探针发明领域0001本发明涉及通过生物化学过程激活的猝灭的荧光探针。设计探针使得在未被激活探针中发生分子内猝灭，但猝灭剂部分在限定条件下从探针裂解，这使探针发出荧光。亦公开了适于体内成像的包含探针的光学显像剂以及药物组合物和试剂盒以及体内成像方法。0002发明背景0003US6,0

9、83,485及相似专利公开用具有20或更小的辛醇水分配系数的花青染料的体内近红外NIR光学成像方法。亦公开所述染料与分子量高达30KDA的“生物学检测单元”的缀合物，所述生物学检测单元与特定细胞群结合，或与受体选择性结合，或在组织或肿瘤中积聚。US6083485的染料亦可与大分子缀合，所述大分子为例如聚赖氨酸、葡聚糖、聚乙二醇、甲氧基聚乙二醇、聚乙烯醇、葡聚糖、羧基葡聚糖或级联聚合物样结构分子量为100DA到超过100KDA。未公开特定染料缀合物。0004US6,083,486GENERALHOSPITALCORPORATION公开NIR荧光探针，所述探针仅在体内与靶标组织相互作用即激活后才发

10、射大量荧光。探针在分子内猝灭，包含聚合物骨架和众多与骨架共价连接的NIR荧光染料。荧光染料相对于彼此保持在允许通过能量转移相互作用从而猝灭彼此的荧光的位置。设计探针使得I通过非生物可降解的连接LINKAGE来让荧光染料与骨架连接，但所述骨架含有激活位点；或II通过含有激活位点的连接让荧光染料与骨架连接。US6,083,486的“荧光激活位点”是探针内的共价键，其可由靶标组织中存在的酶裂解，即遭受特异性酶促裂解。聚合物骨架优选为多肽，例如聚赖氨酸。据信优选选项II，以便酶促裂解激活使荧光染料分子从被约束在荧光猝灭位置中释放。因此，将酶促裂解设计为从探针释放荧光染料，以便除掉猝灭荧光的布置，并因此

11、在体内在酶激活位点选择性地观察到荧光。0005WO2004/028449公开可用作荧光染料的猝灭剂的非荧光双甘菊环BISAZULENE二聚物。亦阐述了包含双甘菊环猝灭剂和与间隔基连接的NIR荧光染料的荧光探针，其中猝灭剂和荧光染料由靶标特异性激活位点分开。然后在靶标组织中在激活位点的代谢和键裂解导致荧光染料猝灭剂相互作用的瓦解，结果荧光由被释放的荧光染料产生WO2004/028449的图3。0006WO2007/109364公开猝灭的荧光染料缀合物和其在检测和治疗特征为有害细胞增殖的病症包括癌症中的使用方法。荧光染料缀合物包含树枝状大分子和至少两种荧光染料，每一种经由蛋白酶裂解位点与树枝状大分

12、子在猝灭位置共价连接。优选至少一种荧光染料为光敏剂。树枝状大分子有助于为缀合的荧光染料提供必须的几何结构，以确保未修饰的缀合物猝灭。关于US6,083,486，可代谢的基团可在骨架内，或处于使荧光染料与树枝状大分子骨架缀合的连接中。0007US2007/0036725A1公开用于标记活性蛋白酶的基于活性的探针，其具有下式0008说明书CN102325551ACN102325564A2/18页50009其中0010A肽为单个氨基酸、二肽、三肽或四肽，并还包含封端基团；0011BQU为猝灭剂或封端基团，其中封端基团选自脂族酯、芳族酯或杂环酯；0012CFLU为荧光团，前提条件为可交换荧光团猝灭剂对

13、的位置，使得猝灭剂在肽上，而荧光团在“Q”处；和0013D任何荧光团和猝灭剂都通过低级烷基、芳基或芳基低级烷基连接基团来连接。0014WO2007/008080阐述双靶向光学成像造影剂，其包含彼此在一个分子中缀合的0015靶标结合配体V；0016酶可裂解基团E；0017荧光团D；和0018猝灭剂Q。0019造影剂优选包含彼此缀合的结构单元IEQ和IIVD。最优选所述造影剂具有式QL1EL2VL3D，其中L1、L2和L3独立为接头基团。0020US7,329,505公开包含肽骨架的短肽序列，所述肽骨架具有与其缀合的荧光染料和色氨酸作为猝灭剂。经由外肽酶降解肽骨架来激活探针。该过程释放单独的肽片段

14、，其中荧光染料和色氨酸被分开，导致荧光显著增加。据信标记的肽可用于检测外肽酶。0021WO2008/078190公开可激活的探针，所述探针包含荧光团聚合物缀合物，其中荧光团经由可代谢的接头与聚合物结合，聚合物进一步包含水溶性基团。因荧光团从聚合物裂解而在特异性靶标位点产生荧光。据信水溶性基团有助于降低天然聚合物的固有荧光，使得在酶促裂解时的荧光变化更显著。0022本发明0023本发明提供通过生物化学过程激活的猝灭的荧光探针。设计探针使得在未被激活探针中发生分子内猝灭，但猝灭剂部分在限定条件下从探针裂解，这使探针发出荧光。0024现有技术的可激活荧光探针通常由与聚合物例如聚L赖氨酸通过酶例如通过

15、组织蛋白酶B可裂解的短序列共价结合的荧光染料组成。当荧光染料以彼此紧密接近的方式连接到聚合物上时，其荧光将遭受自动猝灭，使得聚合物构建体的荧光低但通常不是0。在通过酶作用释放荧光染料后，其荧光将大大增强。完整探针的背景荧光是不利因素。另一缺点是释放的荧光染料易于从激活位点扩散开这一事实。0025因此，US2007/0036725和WO2007/008080二者都阐述00261使荧光染料从猝灭中释放出；00272使活性荧光染料离开去猝灭的点的移动最小化。0028在US2007/0036725中，活性荧光染料与酶的活性位点共价连接第0009段，第1页，第1栏底部。在WO2007/008080中，活

16、性荧光染料与靶标结合配体连接。在本发明中，通过保持与高分子量聚合物的连接来阻止活性荧光染料的移动缓慢扩散。相比之说明书CN102325551ACN102325564A3/18页6下，本发明提供以以下间隔与聚合物骨架永久连接的荧光染料，所述间隔使得当仅有荧光染料与聚合物连接时，不发生由荧光共振能量转移引起的猝灭。荧光能量转移对荧光染料之间的距离极为敏感。在猝灭部分与酶接触时，其将被裂解下来，并从该位点扩散开，剩下缓慢扩散的大的荧光聚合物。这将改进探针的灵敏性和特异性，使其优于产生可自由扩散的荧光染料的探针。0029在US2007/0036725中，支架SCAFFOLD包含单肽、二肽、三肽或四肽第

17、0011段。在WO2007/008080中，可将寡聚物至多约10个单元用作接头第16页。在这两个现有技术公开内容中，光学显像剂与聚合物的连接都有不利之处，因为固定化第一种显像剂将可能因位阻而阻止随后的反应。未提及数种显像剂与高分子量聚合物的连接。在本公开内容中，高分子量支架00301阻止从产生荧光的点离开；00312倾向于将显像剂保持在具有高浓度的分裂出猝灭部分的酶的区域。0032发明详述0033在第一方面，本发明提供在分子内猝灭的荧光探针，所述探针包含分子量为10100KD的聚合物骨架和0034I若干Z种近红外荧光染料，每一种经由抗酶裂解和生物化学氧化的第一连接与骨架共价连接；0035II若

18、干Z个猝灭剂部分，每一个经由可通过酶代谢或生物化学氧化裂解的第二连接与骨架共价连接；0036其中Z为数值1150的整数，其中所述猝灭剂部分与所述荧光染料处于荧光猝灭能量转移关系。0037术语“探针”意指可用于体外或体内检测酶活性或生物化学活性组分的化合物。在诸如癌症和动脉粥样硬化病等疾病中，多种酶增量调节。这些及其它疾病伴随炎性病况，其中由激活的免疫细胞演变氧自由基，例如超氧阴离子。因此，可将检测特定酶和氧自由基的增加量的探针用于检测所述疾病。0038术语“聚合物骨架”意指荧光染料和猝灭剂所连接的生物相容的聚合物。聚合物骨架可为多肽，其可包含不同的氨基酸残基或相同的氨基酸即聚氨基酸；蛋白质；多

19、糖；聚酯；聚酰胺基胺POLYAMIDOAMINE；聚丙烯酸；聚醇或壳聚糖。聚合物骨架可包含D或L氨基酸。术语“生物相容的”意指生理学上可耐受的，即可给予哺乳动物体而无毒性或过分不适。聚合物骨架的分子量适当地为10100KDA10,000100,000DA。为了延迟扩散，探针分子量高，但未高到阻碍其从循环中转移至组织或肿瘤中。0039术语“荧光染料”具有其常规含义，即发荧光的染料。用于本发明的合适荧光染料，为具有6001000NM范围内的最大吸光度和6001200NM范围内的发射最大值的荧光染料。0040术语“荧光猝灭剂”意指这样的部分，其阻止荧光染料发荧光，使得连接有猝灭剂和荧光染料两者的未被

20、激活探针，具有极微的荧光。猝灭剂分子为本领域已知JOHANSSON，METHMOLBIOL，335，17292006和BULLOK等BIOCHEM，4613，405540652007。SHANKER等METHCELLBIOL，84，第8章，2132422008并在LAKOWICZ“PRINCIPLESOFFLUORESCENCESPECTROSCOPY”第二版，KLUWER，1999，第388页中阐述了易受荧光共振能量转移影响的荧光染料对。SHANKER和LAKOWICZ亦包括用于发现新的荧光染料/猝说明书CN102325551ACN102325564A4/18页7灭剂对的方法。0041术语“

21、分子内猝灭的”意指在完整探针分子内，安排荧光染料和猝灭剂部分使得猝灭来自荧光染料的任何荧光。0042术语“生物化学氧化”意指由哺乳动物体的细胞或器官在体内或体外产生的氧化过程。具有该性质的合适氧化过程包括由细胞外超氧阴离子、过氧化氢或羟基自由基进行的氧化，它们能够裂解二硫键以及呈某些构象的碳碳双键，例如在多不饱和脂肪酸中存在的那些。0043术语“抵抗酶促裂解或生物化学氧化的”，意指这样的共价键，其不是哺乳动物体的酶的底物，且不被上述生物化学氧化过程裂解。用于第一连接的合适的这类键的实例为碳碳键；醚键；硫醚键；磺酰胺键和酰胺键不包括肽键。显然的是，第一连接不包括那些落入第二连接定义范围内的可裂解

22、键参见以下。0044术语“可通过酶代谢或生物化学氧化裂解的”，意指第二连接可通过以下裂解A哺乳动物体内或体外的酶；或B如上所定义的生物化学氧化过程。A的酶促反应可裂解酶的天然底物或底物类似物。酶可包括酯酶、肽链内切酶、内切蛋白酶、脱烷基酶、糖苷酶、内切聚糖酶ENDOGLYCANASE、肝素酶、软骨素酶、透明质酸酶、RNA酶、DNA酶或磷酸二酯酶。0045术语“荧光猝灭能量转移关系”，意指荧光染料和猝灭剂相对于彼此保持在允许它们通过能量转移相互作用以允许发生猝灭的位置。0046术语“猝灭剂部分”意指阻止荧光染料发荧光使得完整的探针具有极微荧光的部分。因此，在用激发荧光染料的波长的光辐照时，猝灭剂

23、吸收被激发的荧光染料的能量，使得大体上完整探针具有极微荧光。适用于本发明的猝灭剂包括0047A非荧光染料，例如DABCYL44二甲基氨基苯偶氮苯甲酸；其在360560NM区内吸收和其它偶氮染料；DANSYL、QSY7、黑洞猝灭剂BLACKHOLEQUENCHER等；0048B具合适的吸收光谱的荧光团；0049C硝基取代的苯基部分，包括对硝基苯甲酸、间硝基苯甲酸、邻硝基苯甲酸、3，5二硝基苯甲酸和2，4，6三硝基苯磺酸；0050D甘菊环二聚物。0051猝灭剂分子为本领域已知JOHANSSON，METHMOLBIOL，335，17292006；MARRAS，同前，335，3162006和BULLO

24、K等见上。0052将本发明探针设计为使得经裂解的探针中即除掉一个或多个猝灭剂部分后荧光染料对不处于自猝灭的关系。要注意的是，即使荧光染料的某种自猝灭在完整探针中出现，那也不是问题，因为反正对于完整探针期需要极微荧光。在图1中图示探针的激活0053图1探针的激活0054说明书CN102325551ACN102325564A5/18页80055其中0056B为聚合物骨架；0057L1为第一连接；0058L2为第二连接；0059LC为裂解的第二连接的残基；0060Q为猝灭剂部分；0061QC为裂解的猝灭剂部分，包括裂解的第二连接的任何残基；0062FQ为与Q处于猝灭关系的荧光染料；0063FM为处于

25、可发荧光的环境中的荧光染料。0064每一探针的荧光染料和猝灭剂部分对的数目合适地介于1150之间。优选探针具有至少2或3对所述对。对于上限150，探针将具有大约100KDA的分子量。0065第一方面的探针优选用于适于体内成像的光学显像剂，如在第二方面见下面所述。然而，探针亦可有体外应用例如定量测定生物学样品中的裂解酶的测定或所述酶在组织样品中的可视化。0066本发明探针可任选还包含生物学靶向部分。生物学靶向部分可与骨架、图1的L1或荧光染料连接。术语“生物学靶向部分”BTM，意指体内给予后被选择性吸收或定位在哺乳动物体的特定部位的化合物。所述部位可例如涉及特定疾病状态，其指示器官或代谢过程如何

26、起作用。生物学靶向部分优选包含3100聚体的肽、肽类似物、拟肽或肽模拟物，其可为线性肽或环状肽或其组合；或酶底物、酶拮抗剂或酶抑制剂；合成的结合受体的化合物；寡核苷酸或寡DNA或寡RNA片段。0067术语“肽”意指包含由肽键连接的如下定义的两个或更多个氨基酸的化合物，所述肽键即让一个氨基酸的胺官能团与另一氨基酸的羧基以及与各个氨基酸的C2或“碳”连接的羧基连接的酰胺键。术语“肽模拟物”或“模拟物”，是指模仿肽或蛋白质的生物学活性但在化学特性上不再是肽的生物学活性化合物，也就是说，它们不再含有任何肽键即氨基酸之间的酰胺键。本文术语肽模拟物以更广泛的含义使用，包括在性质上不再是完整肽的分子，例如假

27、肽、半肽和拟肽。术语“肽类似物”是指如下所述包含一个或多个氨基酸类似物的肽。亦参见“SYNTHESISOFPEPTIDESANDPEPTIDOMIMETICS”，MGOODMAN等，HOUBENWEYLE22C，THIEME。0068术语“氨基酸”意指L或D氨基酸、氨基酸类似物例如萘基丙氨酸或氨基酸模拟物，其可为天然存在的或纯合成来源的，并可为光学纯的，即单对映异构体，并因此为手性的，或为对映异构体的混合物。本文采用氨基酸的常规3字母或单字母缩写。优选本发明氨基酸为光学纯的。术语“氨基酸模拟物”意指天然存在的氨基酸的合成类似物，其为电子等排物，即已被设计为模仿天然化合物的空间和电子结构。所述电

28、子等排物为本领域技术人员所熟知，包括但不限于酯肽、逆反肽RETROINVERSOPEPTIDE、硫代酰胺、环链说明书CN102325551ACN102325564A6/18页9烷或1，5二取代四唑参见MGOODMAN，BIOPOLYMERS，24，137，1985。0069合适的酶底物、拮抗剂或抑制剂包括葡萄糖和葡萄糖类似物，例如氟脱氧葡萄糖；脂肪酸或弹性蛋白酶、血管紧张素II或金属蛋白酶抑制剂。优选非肽血管紧张素II拮抗剂为依那普利。氯沙坦为血管紧张素II受体的非肽拮抗剂。合适的合成的受体结合化合物包括雌二醇、雌激素、黄体酮、孕酮和其它类固醇激素；多巴胺D1或D2受体的配体或多巴胺转运蛋白例

29、如托烷；和血清素受体的配体。0070优选特征0071聚合物骨架的分子量优选为950KDA，更优选为1040KDA，最优选为1135KDA。本发明探针优选具有约3050KDA的分子量，这有利于减慢经由肾脏的排除。探针优选适于体内应用。0072本发明探针优选亲水，以便提高在水中的溶解度及减少聚集。探针亦应该优选具有净负电荷，以便减少与细胞表面其总是带负电荷的非特异性连接，并促进体内肾脏清除。0073猝灭剂部分优选为与荧光染料不同的化学物质。猝灭剂部分最优选为非荧光的，即当用适于激发荧光染料的波长的光辐照时不发出荧光，当用荧光染料发射的光辐照时其也不发出荧光。那样的话，一旦猝灭剂从探针裂解，其也不提

30、供任何竞争荧光任何荧光全部由激活的探针产生。对于体内应用，猝灭剂合适地为生物相容的如上所定义，因此释放的猝灭剂对哺乳动物体无毒性。因此，用于体内应用的优选猝灭剂部分既是非荧光的又是生物相容的。优选的非荧光猝灭剂包括由WEISSLEDER等ANGCHEMINTEDENG，41，365936622002和WO04/028449所教导的甘菊环二聚物。远红外猝灭剂QSY21由BULLOK等BIOCHEM，4613，405540652007教导。因为发射近红外范围的光的荧光染料尤其适于体内应用，因此优选在该范围吸收的猝灭剂。猝灭剂应该通过肾快速排除。排除可能伴随缀合反应，例如肝脏中的葡糖苷酸化。0074

31、优选选择这样的探针，其使得可通过一种或多种酶的作用来裂解第二连接。优选所述酶为水解酶，更优选肽酶或蛋白酶。最优选用于本发明的裂解酶包括组织蛋白酶B、D、K、L和S；基质金属蛋白酶；尿激酶型纤溶酶原激活剂；激肽释放酶；HEPSIN；弗林蛋白酶；蛋白裂解酶MATRIPTASE；前胶原转化酶；骨形态生成蛋白1；和TOLLOID样蛋白酶1和2。这些酶中的很多参与肿瘤侵袭。特异性酶底物连接示于表1和2中0075表10076说明书CN102325551ACN102325564A7/18页1000770078其中NVAL正缬氨酸；AHX氨基己酸；DPAN32，4二硝基苯基L2，3二氨基丙酰基猝灭剂部分；PN

32、A对硝基苯胺和AMC氨基甲基香豆素0079蛋白酶敏感序列示于表2中0080表2说明书CN102325551ACN102325564A8/18页1100810082裂解点；X任何氨基酸；POH羟脯氨酸；DNP二硝基苯基0083COOMBS等，SUBSTRATESPECIFICITYOFPROSTATESPECIFICANTIGENPSA前列腺特异性抗原PSA的底物特异性CHEMISTRYBIOLOGY5，第9期4754881998。0084KHATIB等，PROPROTEINCONVERTASESINTUMORPROGRESSIONANDMALIGNANCYNOVELTARGETSINCANCE

33、RTHERAPY肿瘤发展及恶性中的前蛋白转化酶癌症治疗的新靶标AMJPATHO160，第6期192119352002。0085MATSUMURA等，SUBSTRATESOFTHEPROSTATESPECIFICSERINEPROTEASEPROSTASE/KLK4DEFINEDBYPOSITIONALSCANNINGPEPTIDELIBRARIES由位置扫描肽库确定的前列腺特异性丝氨酸蛋白酶前列腺酶/KLK4的底物THEPROSTATE62，第1期1132005。0086MELO等，SYNTHESISANDHYDROLYSISBYCYSTEINEANDSERINEPROTEASESOFSHOR

34、TINTERNALLYQUENCHEDFLUOROGENICPEPTIDES内部猝灭的产荧光短肽通过半胱氨酸和丝氨酸蛋白酶的合成及水解ANALYTICALBIOCHEMISTRY293，第1期71772001。0087可用于本情境中的其它肽酶和蛋白酶包括纤溶酶、尿激酶纤溶酶原激活剂、PROSTATIN、睾蛋白TESTISIN、TSP50、GPISP13、TESP12、DISP、类胰蛋白酶1、蛋白裂解酶1、2和3、HEPSIN、TMPRSS2、3和4、脊骨蛋白SPINESIN、HAT、MSPL、激肽释放酶14、多聚丝氨酸酶POLYSERASE1、弗林蛋白酶、PACE4、PC1、PC5、PC7、激

35、肽释放酶5、胱天蛋白酶9、组织蛋白酶H、K和L以及DESC1。说明书CN102325551ACN102325564A9/18页120088优选探针骨架抵抗酶裂解，即其在体内稳定。这可例如通过使用非天然氨基酸例如2，3二氨基丙酸或2，4二氨基丁酸的聚合物来实现。或者，肽的一端或两端优选两端具有与其缀合的代谢抑制基团MIG。术语“代谢抑制基团”MIG意指抑制或阻抑酶活性尤其是肽酶例如羧肽酶活性的生物相容性基团，否则所述酶可从肽的氨基末端或羧基末端裂解氨基酸。所述基团对于体内应用尤其重要，并为本领域技术人员所知，对于肽胺末端，所述基团合适地选自0089N酰化的基团NHCORG，其中酰基CORG具有选

36、自C16烷基、C310芳基的RG，或包含聚乙二醇PEG结构单元。合适的PEG基团如下所述。优选所述PEG基团为式BIO1或BIO2见下面的生物改性剂。优选所述氨基末端MIG基团为乙酰基、苄氧基羰基或三氟乙酰基，最优选乙酰基。0090用于肽羧基末端的合适代谢抑制基团包括甲酰胺、叔丁酯、苄酯、环己酯、氨基醇或聚乙二醇PEG结构单元。用于BTM肽羧基末端氨基酸残基的合适的MIG基团，为其中氨基酸残基的末端胺被C14烷基优选甲基N烷基化的MIG基团。优选所述MIG基团为甲酰胺或PEG，最优选所述基团为甲酰胺。0091优选PEG基团包含由下式BIO1或BIO2的单分散性PEG样结构寡聚化获得的单元009

37、20093式BIO1的17氨基5氧代6氮杂3，9，12，15四氧杂十七烷酸0094其中P为110的整数。或者，可使用基于式BIO2的丙酸衍生物的PEG样结构00950096其中P如式BIO1所定义，Q为315的整数。0097在式BIO2中，P优选为1或2，Q优选为512。0098探针骨架对裂解的这类抗性具有优势，即一旦被激活，含相对高分子量荧光染料的部分不易扩散开，而含相对低分子量猝灭剂的片段更迅速地扩散开。因此，探针将倾向于保持与目的靶标接近，因此获得靶标选择性成像。骨架优选包含多肽和/或共聚物。共聚物具有以下优势可选择共聚物的两个组分以具有不同的官能团，这使得在第一和第二连接之间有化学区别

38、。优选的这类共聚物包括赖氨酸谷氨酸共聚物。那样的话，可让荧光团与赖氨酸残基连接例如经由磺酰胺或甲酰胺键，而可裂解的短序列与猝灭部分的谷氨酸残基末端连接。可通过包括“间隔基”例如另外的氨基酸或乙二醇寡聚物以增加酶促作用后荧光团之间的距离，来改善性能说明书CN102325551ACN102325564A10/18页130099LYSL1FQGLUL2QALAALANLYSL1FMGLULCALAALANQC0100其中0101FQ如对图1所定义，并经由L1在赖氨酸的6位连接；0102L1、L2、LC、FM、Q和QC如对图1所定义；0103N为数值2150的整数。0104在右侧的裂解产物中，荧光染料

39、FM由三个氨基酸分开，因此对自猝灭具有最小易感性。共振能量转移的效能以距离的6次幂方式降低SHANKER等，METHCELLBIOL，84，第8章，2132422008。0105可任选如下进一步改进探针通过选择取代基，以使底物聚合物带负电荷并易溶解，而裂解的产物探针带正电荷，从而赋予裂解的探针粘附到细胞表面的倾向。这可通过选择被大量磺化或羧化的可释放的猝灭剂来实现。0106优选的荧光染料具有大量的离域电子系统，例如花青染料、部花青染料、吲哚菁、酞菁、萘酞菁、三苯次甲基TRIPHENYLMETHINES、卟啉、吡喃PYRILIUM染料、噻喃染料、方酸染料、克酮酸染料、薁AZULENIUM染料、靛

40、苯胺类、苯并吩嗪染料、苯并噻吩并噻嗪染料、蒽醌类、萘醌类、阴丹士林、邻苯二甲酰吖啶酮类、三苯酚合苯醌、偶氮染料、分子内和分子间电荷转移染料和染料络合物、环庚三烯酮、四嗪类、双二硫醇烯DITHIOLENE络合物、双苯二硫醇盐络合物、靛苯胺染料、双S，O二硫醇烯络合物。荧光蛋白例如绿色荧光蛋白GFP和具有不同的吸收/发射特性的GFP修饰物亦有用。某些稀土金属例如铕、钐、铽或镝络合物用于某些情境中，作为荧光纳米晶体量子点。0107可使用的生色团的具体实例包括荧光素、磺酰罗丹明101TEXASRED、罗丹明B、罗丹明6G、罗丹明19、吲哚菁绿、CY2、CY3B、CY35、CY5、CY55、CY7、CY

41、75、MARINA蓝、太平洋蓝PACIFICBLUE、俄勒冈绿OREGONGREEN488、俄勒冈绿514、四甲基罗丹明和ALEXAFLUOR350、ALEXAFLUOR430、ALEXAFLUOR532、ALEXAFLUOR546、ALEXAFLUOR555、ALEXAFLUOR568、ALEXAFLUOR594、ALEXAFLUOR633、ALEXAFLUOR647、ALEXAFLUOR660、ALEXAFLUOR680、ALEXAFLUOR700和ALEXAFLUOR750。尤其优选花青染料。LICHA等综述了用于体内光学成像的染料和染料缀合物TOPICSCURRCHEM，222，129

42、2002；ADVDRUGDELIVREV，57，108711082005。0108作为荧光团的优选花青染料具有下式II0109说明书CN102325551ACN102325564A11/18页140110其中0111每一个X独立选自CCH32、S、O或CCH2ACH3CH2BM，其中A为数值05的整数，B为数值15的整数，M为基团G或选自SO3M1或H；0112每一个Y独立代表14个选自以下的基团0113H、CH2NH2、SO3M1、CH2COOM1、NCS和F，其中将Y基团置于芳环的任意位置；0114Q独立选自H、SO3M1、NH2、COOM1、铵、酯基、苄基和基团G；0115M1为H或BC

43、，其中BC为生物相容的阳离子；0116L为13的整数；0117M为15的整数；0118其中X、Y和Q中的至少一个包含基团G；0119G为适于连接骨架的活性基团或官能团。0120术语“生物相容的阳离子”BC，意指带正电荷的反荷离子，其与电离的带负电荷的基团形成盐，其中所述带正电荷的反荷离子亦无毒性，因此适于给予哺乳动物体，尤其是人体。合适的生物相容的阳离子实例包括碱金属钠或钾；碱土金属钙和镁；和铵离子。优选生物相容的阳离子为钠和钾，最优选钠。0121当连接生物学靶向分子BTM时，BTM可为人工合成或天然来源的，但优选人工合成的。术语“人工合成的”具有其常规含义，即与从天然来源例如从哺乳动物体分离

44、的相反，为人造的。所述化合物具有可完全控制其制备及杂质分布的优点。因此，天然来源的单克隆抗体及其片段在本文所用术语“人工合成的”的范围之外。当BTM为肽时，优选的这类肽包括0122促生长素抑制素、奥曲肽OCTREOTIDE及类似物；0123与ST受体结合的肽，其中ST是指由大肠杆菌及其它微生物产生的热稳定毒素；0124层粘连蛋白片段，例如YIGSR、PDSGR、IKVAV、LRE和KCQAGTFALRGDPQG；0125靶向白细胞聚集位点的N甲酰基肽；0126血小板因子4PF4及其片段；0127含有RGDARGGLYASP的肽，其可例如靶向血管发生RPASQUALINI等，NATBIOTECH

45、NOL1997年6月；1565426；ERUOSLAHTI，KIDNEYINT1997年5月；51514137；01282抗纤溶酶、纤连蛋白或酪蛋白、血纤蛋白原或血小板反应蛋白的肽片段。可在以下参考文献中发现2抗纤溶酶、纤连蛋白、酪蛋白、血纤蛋白原及血小板反应蛋白的氨基酸序列2抗纤溶酶前体MTONE等，JBIOCHEM，102，1033，1987；酪蛋白LHANSSON等，GENE，139，193，1994；纤连蛋白AGUTMAN等，FEBSLETT，207，145，1996；血小板反应蛋白1前体VDIXIT等，PROCNATLACADSCI，USA，83，5449，1986；RFDOOLIT

46、TLE，ANNREVBIOCHEM，53，195，1984；0129作为血管紧张素的底物或抑制剂的肽，例如0130血管紧张素IIASPARGVALTYRILEHISPROPHEECJORGENSEN等，JMEDCHEM，1979，VOL22，9，10381044；SAR，ILE血管紧张素IISARARGVALTYRILEHISPROILERKTURKER等，SCIENCE，1972，177，1203；0131血管紧张素I说明书CN102325551ACN102325564A12/18页150132ASPARGVALTYRILEHISPROPHEHISLEU；0133内皮缩血管肽，例如内皮缩血管

47、肽10134CYSSERCYSSERSERLEUMETASPLYSGLUCYSVALTYRPHECYSHISLEUASPILEILETRP；0135铃蟾肽0136XAAGLNARGLEUGLYASNGLNTRPALAVALGLYHISLEUMETNH2；0137胃泌素焦谷氨酰基0138GLYPROTRPLEUGLUGLUGLUGLUGLUALATYRGLYTRPMETASPPHENH2；0139促性腺激素释放激素焦谷氨酰基0140HISTRPSERTYRGLYLEUARGPROGLYNH2。0141BTM作为探针的部分的使用具有进一步提高探针特异性的优点。0142当BTM为肽时，所述肽的一端或

48、两端优选两端具有与其缀合的如上所述的代谢抑制基团MIG。0143可通过如下文中所述的固相肽合成法来合成无市售的本发明肽PLLOYDWILLIAMS，FALBERICIO和EGIRALD；CHEMICALAPPROACHESTOTHESYNTHESISOFPEPTIDESANDPROTEINS，CRCPRESS，1997。0144本发明探针可如下制备市购聚L赖氨酸、葡聚糖、淀粉酶聚D葡萄糖、壳聚糖、RNA、DNA、聚乳酸、聚乳酸/乙醇、硫酸肝素和硫酸软骨素。为了让氨基可用于反应并增加活性基团的数量，可让壳聚糖、硫酸肝素和硫酸软骨素去乙酰化或脱硫酸盐；所述方法在本领域众所周知。需要合成含侧链氨基的

49、氨基酸聚合物。合适的方法概述如下将封端基团引入侧链氨基，在稍微酸性PH的水溶液中用水溶性碳二亚胺让被取代的氨基酸聚合。除掉封端基团，并在大小排阻柱上除掉副产物，同时缩小了产物分子量范围。0145为了促进与骨架的缀合，荧光染料和/或猝灭剂部分各自适当地连接活性官能团QA。将QA基团设计为使其与骨架的互补官能团反应，从而形成共价键。骨架的互补官能团可为骨架的内在部分，或可通过用本领域已知的双官能团衍生来引入。表3显示活性基团及其互补对应物的实例0146表3活性取代基和与其反应的互补基团0147活性基团QA互补基团活化酯伯氨基、仲氨基酸酐、酸性卤化物伯氨基、仲氨基、羟基异硫氰酸酯氨基乙烯砜氨基二氯三嗪氨基卤代乙酰胺、马来酰亚胺硫醇、咪唑、羟基、胺、硫代磷酸酯说明书CN102325551ACN102325564A13/18页16碳二亚胺羧酸肼、酰肼羰基，包括醛和酮亚磷酰胺羟基0148术语“活化酯”或“活性酯”意指羧酸的酯衍生物，将其设计为具有更好的离去基团，并因此使得其更易于与亲核试剂例如胺反应。合适的活性酯实例为N羟基琥珀酰亚胺NHS、五氟苯酚、五氟苯硫酚、对硝基苯酚和羟基苯并三唑。优选活性酯为N羟基琥珀酰亚胺或五氟苯酚酯。0149存在于骨架中的官能团的实例包括羟基、氨基、巯基、羰基包括醛和酮和硫代磷酸酯。合适的QA基团可选自羧基；