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5- 碘代杀菌核素在制备抗肿瘤药物中的应用
    技术领域 本发明涉及医药领域， 特别涉及 5- 碘代杀菌核素 （5-Iodotubercidin） 在制备抗 肿瘤药物中的应用。
     背景技术 肿瘤是一类多基因改变、 多阶段发生、 多因素参与的复杂性疾病。全世界每年有 1000 万人患癌症， 并有 600 万人死于癌症。在中国每年约有 190 万人患癌症， 并有 150 万人 死于癌症。癌症死亡率居城镇居民死因的首位 ( 顾东风等 《新英格兰医学杂志》 2005)。
     目前已知的 104 种肿瘤中有 56 种恶性肿瘤都是因为抑癌基因 p53 发生突变引 起的。抑癌基因 p53 在正常情况下表达水平低且不稳定， 当 DNA 损伤时 （由核辐射等引 起） ， 细胞核内的抑癌基因 p53 水平会急速升高并激活， 抑癌基因 p53 作为转录调节因 子， 激活 p21WAF1/cip1(CDK 激酶的抑制因子 ) 的表达， p21 能够同时与 CyclinD-CDK4/6 和 CyclinE-CDK2 复合物结合， 抑制它们的激酶活性，诱发 G1/S 阻滞，同时过量表达的抑癌 基因 p53 及其下游效应蛋白 GADD45 的转录活化能抑制 Cdc2/CyclinB 复合物发挥功能， 使 细胞阻滞在 G2/M 期， 从而修复损伤 DNA 。否则受损伤的 DNA 继续随细胞分裂传代到下一 代细胞中， 可能导致肿瘤的形成。当 DNA 损伤无法修复时， 抑癌基因 p53 能够诱导下游许 多促细胞凋亡蛋白的表达， 如 BAX、 PUMA、 Apaf-1 等， 诱导细胞发生凋亡。根据对激活抑癌 基因 p53 以及对细胞损伤作用的原理， 许多抗肿瘤药物相继研发出来， 其中 “今又生” （由腺 病毒载体 DNA 和人抑癌基因 p53 基因重组， 形成有活性的腺病毒颗粒） 于 1998 年国家药监 局 （SFDA） 批准进入临床试验， 到 2004 年 1 月 20 日正式获批上市。
     目前， 作为肿瘤三大治疗手段之一的化疗具有不可替代的功效。临床上普遍使用 的化疗药物大多能引起 DNA 的损伤， 激活抑癌基因 p53 进而抑制细胞分裂或导致细胞死亡。 化疗药物包括一些核苷酸类似物的化合物， 可抑制 DNA 合成与修复， 激活抑癌基因 p53， 进 而对癌细胞表现出强大的杀伤力， 它们同时也是 DNA 合成反应中某些酶的抑制剂。
     核苷酸结构类似物 ( 他滨类药物 ) 已成熟应用于临床治疗中， 2005 年我国重点 城市样本医院用药以最小统计单位计算， 抗代谢类已占全部抗肿瘤用药的 30％， 用药金额 为 2.66 亿元， 吉西他滨、 卡培他滨、 替加氟、 阿糖胞苷、 氟达拉滨是居于前 5 位的药物， 占据 了这类药物的 87.40％， 而 “他滨类” 药物占据了 66.40％。推算国内总体市场上， 他滨类 药物已达到 14.8 亿元的规模， 进一步显示出该类药物在临床中的重要作用。如氟达拉滨 （Fluorodarabine） ， 其代谢产物可以通过抑制核糖核酸还原酶、 DNA 聚合酶、 DNA 引物酶和 DNA 连接酶的活性进而抑制 DNA 的合成， 也可部分抑制 RNA 聚合酶Ⅱ的活性从而减少蛋白 的合成。还有著名的细胞周期特异性抗肿瘤药—吉西他滨 (Gemcitabine) ： 主要杀伤处于 S期 （DNA 合成） 的细胞， 同时也阻断细胞增殖由 G1 向 S 期过渡的进程。在细胞内由核苷激 酶代谢成有活性的二磷酸核苷 （dFdCDP） 和三磷酸核苷 （dFdCTP） 。吉西他滨除了抑制核糖 核苷酸还原酶外， 三磷酸吉西他滨可与 dCTP 竞争性结合到 DNA 上， 使得一个核苷酸掺入到 合成过程的 DNA 链上， 从而阻止 DNA 的进一步合成。
     蛋白激酶与恶性肿瘤关系密切， 蛋白激酶过度活跃是导致某些肿瘤的病因， 所以 蛋白激酶抑制剂的开发是抗肿瘤药物的研究热点之一。例如受体酪氨酸激酶的 ErbB 家 族， 在很多肿瘤中都有表达。喹唑啉类是一类 EGFR 酪氨酸激酶抑制物， 通过可逆性竞争受 体上 ATP 结合位点抑制 EGFR 激酶活性。近年来 ,2 种喹唑啉类衍生物 ： ZD1839（吉非替尼 Gefitinib） 和 OSI774（埃罗替尼 Erlotinib） 已被 FDA 批准上市。 类似的激酶抑制剂还 有很多， 如凡德他尼 (Vandetanib) 是一种合成的苯胺喹唑啉化合物， 可同时作用于肿瘤细 胞的 EGFR、 VEGFR 和 RET 酪氨酸激酶， 还可选择性的抑制其他的酪氨酸激酶， 以及丝氨酸 / 苏氨酸激酶。
     基 于 上 述 原 理， 发 明 人 对 80 种 激 酶 抑 制 剂 和 33 种 蛋 白 磷 酸 酶 抑 制 剂 进 行 研 究， 研 究 发 现， 其 中 的 5-Iodotubercidin 具 有 显 著 抑 制 肿 瘤 细 胞 繁 殖 的 作 用， 5-Iodotubercidin 的化学结构式如Ⅰ所示， 为他滨类药物的结构类似物 （如Ⅱ所示的氟 达拉滨的化学结构式） ， 其作用机制可能与以下因素有关 ： 5-Iodotubercidin 具有激活 抑癌基因 p53 的作用。并且研究已证实 5-Iodotubercidin 是 MAPK ERK2(Ki=530nM) 的 竞争性抑制剂， 同时也是腺苷激酶 （Ki=30nM） ， 酪蛋白激酶 I， PKA 以及胰岛素受体激酶 （IC50=0.4-28mM） 的抑制剂。目前为止， 关于 5-Iodotubercidin 可抑制肿瘤生长的研究， 国 内外尚未见报道。
     发明内容 本发明目的是提供 5-Iodotubercidin 在制药中的新用途。
     本发明提出了 5-Iodotubercidin 在制备抗肿瘤药物中的应用。
     本发明的应用是利用 5-Iodotubercidin 能抑制肿瘤细胞生长、 诱导肿瘤细胞凋 亡， 来达到抗肿瘤的目的， 因此， 本发明的 5-Iodotubercidin 在制备抗肿瘤药物中的应用， 具体是指 5-Iodotubercidin 在制备肿瘤细胞生长的抑制剂和肿瘤细胞凋亡的诱导剂中的 应用。
     本发明的优点在于 5-Iodotubercidin 能具有激活抑癌基因 p53 的作用， 抑癌基 因 p53 被激活后能抑制细胞分裂或导致细胞死亡， 所以其应用于抗肿瘤药物是具备理论基 础的。
     附图说明 （本发明中的照片都是激光共聚焦显微镜照片。放大倍数均为 ： 63 倍油 镜放大 8 倍效果图） 图 1 为 Western blot 实验不同浓度 5-Iodotubercidin 处理的电泳图 ； 图 2 为 Western blot 实验 5-Iodotubercidin 不同处理时间的电泳图 ； 图 3 5-Iodotubercidin 进行细胞损伤后免疫荧光检验 ； 图 4 5-Iodotubercidin 处理 24 小时对细胞周期的影响 ； 图 5 5-Iodotubercidin 处理 24 小时对细胞周期的影响 ； 图 6 为 5-Iodotubercidin 作用于不同细胞、 不同细胞状态的效果图 ； 图 7 5-Iodotubercidin 对裸鼠肿瘤大小的影响。 具体实施方式
     下面通过实验证明本发明的 5-Iodotubercidin 具有的技术效果。
     一、 5-Iodotubercidin 进行细胞损伤的 Western blot 检验 实验材料和方法 主要实验材料 ： 细胞株 HCT116， HCT116(p53-/-)， 细胞株 MEF(WT)， MEF(ATM-/-)， MEF(P53-/-)， MEF( 原 代细胞 )， 5-Iodotubercidin 购自 sigma 公司， 胎牛血清购自 Hyclone 公司， 无水乙醇为国 药分析纯。
     实验方法 ： 1、 无水乙醇溶解 5-Iodotubercidin， 配成储液浓度 1mM。
     2、 取相应的 MEF(WT)、 MEF(ATM-/-)、 HCT116 的细胞接种到六孔板中， 每孔加入 2ml 含 10% 胎牛血清的 DMEM 培养基。
     3、 用无水乙醇分别配制 25μM、 50μM、 100μM、 250μM 的 5-Iodotubercidin 溶 液。
     4、 待细胞稳定生长到约占培养皿面积 70-80% 时， 进行加药处理。
     步骤如下 ： A、按 照 1 ： 100 稀 释 加 入 到 2ml 培 养 基 中 的 5-Iodotubercidin 溶 液，使 5-Iodotubercidin 终浓度分别达到 0.25, 0.5, 1, 2.5μM， 同时设定乙醇对照组 （加入培 养液和同样体积的乙醇） ， 培养 8h 后， 弃去培养基， 用预冷的 PBS 清洗细胞 2 遍后用 RIPA 裂 解液裂解细胞提取蛋白， 上样进行 Western blot 分析， 如图 1。
     B、 加 100μM （1:100 稀释， 终浓度为 1μM） 5-Iodotubercidin 20μl 到 2ml 培 养基中分别处理 8h, 4h,2h ,1h,0h。提取蛋白， 上样进行 Western blot 分析 p-ATM、 ATM、 p-chk2、 chk2 and p-p53(ser15)、 p53 蛋白的表达丰度， 如图 2。
     实验结果显示 ： 5-Iodotubercidin 可激活 DNA 损伤应激反应中起关键作用的 ATM-Chk2- 抑癌基因 p53 通路， 进而激活抑癌基因 p53， 随着药物浓度逐渐增大会达到 一个最大表达量， 然后表达量下降。相应的 p-ATM， p-chk2 也有类似的表达情况， 说明5-Iodotubercidin 对 ATM 磷酸化水平有刺激作用。
     二、 5-Iodotubercidin 进行细胞损伤的免疫荧光检验 主要实验材料 ： 细 胞 株 HCT116， HCT116(p53-/-)，细 胞 株 MEF(WT)， MEF(ATM-/-)， MEF(P53-/-)， 5-Iodotubercidin 购自 sigma 公司， 胎牛血清购自 Hyclone 公司， 无水乙醇为国药分析纯。
     实验方法 ： 1、 取相应 MEF(WT)、 HCT116(WT) 的细胞接种到已铺有无菌盖玻片的十二孔板中， 每孔 加入 1ml 含 10% 胎牛血清的 DMEM 培养基。
     2、 用无水乙醇配制 100μM 5-Iodotubercidin 溶液。
     3、 待细胞稳定生长到约占培养皿面积 70-80% 时， 在 1ml 培养基中按照 1 ： 100 加药 处理 8h（以相同体积的无水乙醇作为阴性对照， 以 hydroxyurea（HU） 或 1μM doxorubicin 处理作为阳性对照） 。
     4、 对细胞爬片进行免疫组化染色， 用激光共聚焦显微镜检测细胞损伤的特异蛋白 H2AX， TOPBP1， p-ATM。
     实验结果显示 ： 5-Iodotubercidin 可以在 HCT116 以及 MEFs 中诱导 H2AX、 p-ATM、 TopBP1 阳性的核内焦点 （Foci） ， Foci 染色部位代表 DNA 损伤位点， 表明 5-Iodotubercidin 可损伤 DNA。在咖啡因 （可抑制 ATM 以及 ATM 家族成员） 的作用下， 5-Iodotubercidin 不能 激活 p-ATM， 同时也不能激活 H2AX 以及 TopBp1。 三、 5-Iodotubercidin 对细胞周期的影响 主要实验材料 ： 细胞株 HCT116， HCT116(p53-/-)， 细胞株 MEF(WT)， MEF(ATM-/-)， MEF(P53-/-)， MEF( 原 代细胞 )， 5-Iodotubercidin 购自 sigma 公司， 胎牛血清购自 Hyclone 公司， 无水乙醇为国 药分析纯。
     实验方法 ： 将处于对数生长期的细胞 MEF(WT)、 MEF(P53-/-)、 HCT116、 HCT116(P53-/-) 按每孔 103-104 的数量范围接种于 96 孔板中 （3 个复孔） ， 每孔加入细胞悬液 100μl， 待细胞贴壁 后加入不同浓度的 5-Iodotubercidin 使其终浓度分别为 （0.25,0.5,1,2.5μM） , 培养 24h 后加入 10μl Wst-1 检测液， 继续培养培养 4h， 使用酶标仪在 440nm 波长下测定 96 孔板， 测 定不同浓度药物处理的细胞的吸光度值。
     实验结果显示 ： 5-Iodotubercidin 随着浓度的增大， 在 24h 的作用时间下， G2/M 期 并没有发生太大的改变， 维持相对恒定的比例， S 期随着浓度增大相应的细胞数变多， 表明 其进入 G2 期受到抑制， 但超过一定时间， 细胞周期控制失效， G2/M 期细胞增多， 如图 4、 5。 可知 5-Iodotubercidin 能抑制肿瘤细胞的繁殖。
     四、 5-Iodotubercidin 对细胞凋亡的影响 主要实验材料 ： 细胞株 HCT116， HCT116(p53-/-)， 细胞株 MEF(WT)， MEF(ATM-/-)， MEF(P53-/-)， MEF( 原 代细胞 )， 5-Iodotubercidin 购自 sigma 公司， 胎牛血清购自 Hyclone 公司， 无水乙醇为国 药分析纯。
     实验方法 ：
     将处于对数生长期的细胞 MEF(WT)、 MEF(P53-/-)、 HCT116、 HCT116(P53-/-) 按每孔 4 10 -10 的数量范围接种于 96 孔板中 （3 个复孔） ， 每孔加入细胞悬液 100μl， 待细胞贴壁后 加入不同浓度的 5-Iodotubercidin 使其终浓度分别为 （0.25,0.5,1,2.5μM） , 培养 24h 后 加入 10μl Wst-1 检测液， 继续培养培养 4h， 使用酶标仪在 440nm 波长下测定 96 孔板， 测定 不同浓度药物处理的细胞的吸光度值。
     实验结果显示 ： 在 血 清 饥 饿 和 细 胞 种 植 过 满 的 情 况 下， 5-Iodotubercidin 无 法 进 行 细 胞 损 伤， 不 能 杀 死 细 胞， 作 用 效 果 与 抑 癌 基 因 p53 基 因 缺 失 一 样， 说明 5-Iodotubercidin 通过抑癌基因 p53 作用于肿瘤细胞， 从而诱导肿瘤细胞凋亡。
     五、 5-Iodotubercidin 对裸鼠肿瘤大小的影响 主要实验材料 ： 4 周龄的雄性裸鼠， 购自上海斯莱克公司。
     实验方法 ： 在饲养期间稳定生长 2 周后进行肿瘤细胞接种。分别将 200μl 含有约 106 个 HCT116， HCT116(P53-/-) 接种于裸鼠大腿背面左右两侧皮下。 饲养 12 天后将其分为 2 组， 阴性对照 组 3 只， 5-Iodotubercidin 组 5 只分别饲养在两个鼠笼中， 阴性对照组注射含有与加药浓度 相同含量乙醇的生理盐水， 加药组注射 2.5mg/kg， 0.625mg/kg 的 5-Iodotubercin 溶液， 按 照公式肿瘤体积 =1/2 长轴 × 短轴 × 短轴计算肿瘤体积。每天测量组内各鼠的肿瘤大小， 取平均值做折线图。3实验结果显示 ： 低剂量的 5-Iodotubercidin(0.625mg/kg) 可以控制肿瘤的增长 速度， 抑癌基因 p53 的缺失降低药物效果， 但在高剂量注射 5-Iodotubercidin（2.5mg/kg） 可以明显杀死肿瘤细胞， 同时抑癌基因 p53 缺失的细胞中， 5-Iodotubercidin 的效能降低， 如图 7。 可知， 5-Iodotubercidin 通过激活抑癌基因 p53 从而抑制肿瘤细胞生长、 诱导肿瘤 细胞凋亡。
     本项研究发现， 5-Iodotubercidin 是一个强有力的遗传毒性 （genotoxic） 物质， 在细胞中可引起 DNA 损伤， 激活 DNA 损伤应激反应中起关键作用的 ATM-Chk2- 抑癌基因 p53 通路， 引起依赖于抑癌基因 p53 的肿瘤细胞凋亡， 以及细胞周期停滞于 S 期及 G2/M 期。 5-Iodotubercidin 具有体内抑制肿瘤生长的功能， 可以开发为癌症化疗药物。
     以上公开的仅为本申请的几个具体实施例， 但本申请并非局限于此， 任何本领域 的技术人员能思之的变化， 都应落在本申请的保护范围内。