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人源化 K33N 单克隆抗体的生成、 表达和表征
    1. 技术领域
     本发明涉及免疫特异性识别人 α9 整联蛋白的人源化抗体及其对与 α9 整联蛋白 有关或牵涉 α9 整联蛋白的各种疾病或病症 ( 包括癌症、 炎性疾病、 自身免疫性疾病、 由 α9 整联蛋白诱发的疾病状况、 等等 ) 的治疗和诊断用途。 2. 背景技术
     由一组称作整联蛋白的细胞表面受体介导， 细胞粘附于胞外基质 ( 下文缩写为 ECM)。整联蛋白通过形成 α 和 β 链的 1 ∶ 1 异二聚体来执行其功能。迄今为止， 已经鉴定 并确认至少 18 类 α 链、 8 类 β 链和 24 类 αβ 异二聚体。已知每种整联蛋白识别一种特 定的配体。 整联蛋白根据其配体特异性或功能而分类入亚家族中， 并分成胶原受体、 层粘连 蛋白受体、 识别存在于纤连蛋白、 玻连蛋白、 等中的 Arg-Gly-Asp(RGD) 序列的 RGD 受体、 和 仅存在于白细胞中的白细胞特异性受体 (Hynes， R.O.， 2002， Integrins ： Bidirectional， Allosteric Signaling Machines.Cell 110 ： 673-87 ； Miyasaka， M.， 2000， New edition of Adhesion Molecule Handbook， Shujunsya)。α4 和 α9 整联蛋白是不属于任何这些类 型并称作 α4 整联蛋白亚家族的亚家族的成员 (Elise L.Palmer， Curzio Rfiegg， Ronald Ferrando， Robert Pytela， Sheppard D.， 1993， Sequence and Tissue Distribution of the Integrin α9 Subunit， a Novel Partner of β1 That Is Widely Distributed in Epithelia and Muscle.The Journal of Cell Biology， 123 ： 1289-97)。同时， 迄今为止， 过去认为 ECM 仅充当细胞间的粘合物质。现在已经变得清楚的是， 整联蛋白介导的 ECM- 细 胞相互作用显著牵涉调节细胞的生长、 粘附、 运动、 等， 而且与疾病的发作 ( 包括癌症的进 展、 炎症的恶化、 等 ) 有关。
     例如， 作为 ECM 之一的骨桥蛋白 ( 下文缩写为 OPN) 是一种具有约 41kDa 分子量的 分泌性、 酸性磷酸化糖蛋白， 而且是一种在母乳、 尿液、 肾小管、 破骨细胞、 成骨细胞、 巨噬细 胞、 激活的 T 细胞、 肿瘤组织、 等等中广泛观察到其表达的分子。OPN 具有粘附序列， 即在其 分子中央的 GRGDS(SEQ IDNO ： 1)、 在人 OPN 中的 SVVYGLR(SEQ ID NO ： 2) 序列或小鼠 OPN 中 的 SLAYGLR(SEQ ID NO ： 3) 序列， 和与其极其接近的凝血酶切割位点， 并经由 GRGDS(SEQ ID NO ： 1) 序列结合 RGD 整联蛋白或经由 SVVYGLR(SEQ IDNO ： 2) 序列或 SLAYGLR(SEQ ID NO ： 3) 序列结合 α4(α4β1) 和 α9(α9β1) 整联蛋白。
     WO 02/081522 披露了使用 OPN 敲除小鼠或针对 OPN 的中和性抗体通过抑制 OPN 功 能实现的对类风湿性关节炎或肝炎的治疗效果。此外， 此公开文本披露了 SVVYGLR(SEQ ID NO ： 2) 序列由于识别 α9 和 α4 整联蛋白而对于炎性疾病的发病机制是至关重要的， 并且 OPN 的受体在免疫活性细胞等等中表达且与炎性疾病有关。
     已经找到了结合谱的差异， 其在于 α4β1 既结合未经凝血酶切割的 OPN( 未切割 的 OPN) 又结合经凝血酶切割的 OPN( 经切割的 OPN) 的 N 端片段， 而 α9β1 仅结合经切割 的 OPN(Y.Yokosaki 等， (1999)The Journal of Biological Chemistry， 274 ： 36328-36334 ； P.M.Green 等， (2001)FEBS Letters， 503 ： 75-79 ； S.T.Barry 等， (2000)Experimental CellResearch， 258 ： 342-351)。
     除 了 OPN 以 外， α4 和 α9 整 联 蛋 白 共 享 许 多 共 同 配 体。 已 知 的 配 体 有 纤 连 蛋 白 的 EDA 域、 前 肽 -von Willebrand 因 子 (pp-vWF)、 组 织 转 谷 氨 酰 胺 酶 (tTG)、 血液 凝 固 因 子 XIII、 血 管 细 胞 粘 附 分 子 -1(VCAM-1) 等。 另 外， 已 知 纤 连 蛋 白 的 CS-1 域、 MadCAM-1(α4β7)、 等为受到 α4 整联蛋白特异性识别的配体。已知生腱蛋白 -C、 纤溶酶、 等为受到 α9 整联蛋白特异性识别的配体。
     整联蛋白亚基 α9、 α4 和 β1 的氨基酸序列是众所周知的。例如， 在 GenBank， 人 α9 登记为 NM_002207， 小鼠 α9 为 NM_133721， 人 α4 为 NM_000885， 小鼠 α4 为 NM_010576， 人 β1 为 X07979， 而小鼠 β1 为 NM_010578。还已知这些整联蛋白在氨基酸序列方面在物 种间具有高度相似性。
     3. 发明概述
     虽然目前已知许多用于治疗癌症、 炎性疾病和自身免疫性疾病的药物， 但是期望 开发出对癌症、 炎性疾病和自身免疫性疾病具有更为改善的治疗效果的预防和 / 或治疗剂 等。本发明部分基于本发明人的发现， 即针对 α9 整联蛋白的特异性抑制性抗体具有抑癌 和消炎效果。 先前， 本发明人分离出免疫特异性识别人 α9 整联蛋白并由杂交瘤克隆 K33N( 保 藏登录号 FERM BP-10830) 生成的小鼠单克隆抗体。在本文中， 该杂交瘤克隆名称与由该克 隆生成的单克隆抗体的名称可互换使用。 小鼠抗人 α9 整联蛋白抗体是 IgG1 同种型的。 该 单克隆抗体抑制人和 / 或小鼠 α9 整联蛋白与 α9 整联蛋白的配体， 诸如骨桥蛋白之间的 结合。如此， 该抗 α9 整联蛋白抗体抑制 α9 整联蛋白的功能， 而且对癌症， 例如癌细胞的 生长或转移， 和对炎性疾病， 例如类风湿性关节炎、 骨关节炎、 肝炎、 支气管哮喘、 纤维化、 糖 尿病、 动脉硬化、 多发性硬化、 肉芽肿、 炎性肠病 ( 溃疡性结肠炎和克罗恩 (Crohn) 氏病 )、 自 身免疫性疾病、 由 α9 整联蛋白诱发的疾病状况、 等等展现出治疗效果。
     此外， 本发明的抗 α9 整联蛋白抗体可以作为体内诊断剂用于检测受试者中的 α9 整联蛋白表达的存在和水平， 由此诊断牵涉 α9 整联蛋白的病症或疾病。
     然而， 因为该单克隆抗体是小鼠起源的， 其在人中的免疫原性所致的可能的不利 影响已经阻碍了其直接应用于人的诊断或治疗用途。为了降低免疫原性， 本发明人已经制 备了人源化抗体， 其具有与衍生所述人源化抗体的初始小鼠抗 α9 整联蛋白抗体展现的生 物学活性对应的生物学活性。
     因而， 本发明提供了免疫特异性识别人 α9 整联蛋白的人源化抗体或其抗原结合 片段， 所述抗体包含部分自非人起源衍生和部分自人起源衍生的抗原结合区。在一个具体 的实施方案中， 本发明的人源化抗体或其抗原结合片段包含自非人来源 ( 供体 )， 诸如 K33N 单克隆抗体衍生的互补决定区 (CDR) 和自人来源 ( 接受体 ) 衍生的框架区 (FR)。在一个实 施方案中， 所述人源化抗体或其抗原结合片段抑制人 α9 整联蛋白与人 α9 整联蛋白的配 体之间的结合。
     在一个具体的实施方案中， 所述免疫特异性识别人 α9 整联蛋白的人源化抗体或 其抗体结合片段包含 ： (i) 重链 (H 链 )， 其包含至少一种自人 H 链的可变区 (V 区 ) 衍生的 H 链 FR(FRH) 和至少一种自免疫特异性识别人 α9 整联蛋白的非人抗体 K33N 的至少一种 CDRH 衍生的 H 链互补决定区 (CDRH) ； 或 (ii) 轻链 (L 链 )， 其包含至少一种自人 L 链的 V
     区衍生的 L 链 FR(FRL) 和至少一种自免疫特异性识别人 α9 整联蛋白的非人抗体 K33N 的 至少一种 CDRL 衍生的 L 链互补决定区 (CDRL) ； 或上文的 (i) 和 (ii) 两者。例如， 所述非 人抗体 ( 其衍生本发明的人源化抗体的至少一种 CDRH 和 / 或至少一种 CDRL) 是由登录号 FERMBP-10830 的杂交瘤生成的单克隆抗体。
     在一个优选的具体实施方案中， 本发明的人源化抗体或其抗原结合片段包含 ： (i) 至少一种自人 FRH 衍生的 FRH 和至少一种包含选自氨基酸序列 SEQID NO ： 4、 5 和 6 的氨基 酸序列的 CDRH ； 或 (ii) 至少一种自人 FRL 衍生的 FRL 和至少一种包含选自氨基酸序列 SEQ ID NO ： 11、 12 和 13 的氨基酸序列的 CDRL ； 或 (iii) 上文的 (i) 和 (ii) 两者。本发明的所 述人源化抗体或其抗原结合片段可以包含 CDRH1、 CDRH2 和 CDRH3， 它们分别包含氨基酸序 列 SEQ IDNO ： 4、 5 和 6。在备选中， 本发明的所述人源化抗体或其抗原结合片段包含 CDRL1、 CDRL2 和 CDRL3， 它们分别包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 11、 12 和 13。 在一个优选的实施方案 中， 本发明的所述人源化抗体或其抗原结合片段包含 CDRH1、 CDRH2、 CDRH3、 CDRL1、 CDRL2 和 CDRL3， 它们分别包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 4、 5、 6、 11、 12 和 13。在另一个备选中， 本发明 的所述人源化抗体或其抗原结合片段包含自由 GenBank 登录号 DA980102(SEQ ID NO ： 18) 编码的人 H 链的可变区衍生的 FRH， 或自由 GenBank 登录号 X72441(SEQ ID NO ： 23) 编码的 人 κ-L 链的可变区衍生的 FRL。在一个优选的实施方案中， 本发明的人源化抗体的 FRH 包 含至少一种选自氨基酸序列 SEQID NO ： 19、 20、 21 和 22( 分别由 DA980102 的相应部分编码 的 FRH1、 FRH2、 FRH3 和 FRH4) 的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中， 本发明的人源 化抗体的 FRL 包含至少一种选自氨基酸序列 SEQ ID NO ： 24、 25、 26 和 27( 分别由 X72441 的 相应部分编码的 FRL1、 FRL2、 FRL3 和 FRL4) 的氨基酸序列。在一个更优选的实施方案中， 本发明的人源化抗体或其抗原结合片段包含 ： (i)H 链可变区 (VH 区 )， 其包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 29 ； 或 (ii)L 链可变区 (VL 区 )， 其包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 31 ； 或 (iii) 上 文的 (i) 和 (ii) 两者。在一个最优选的实施方案中， 本发明的人源化抗体或其抗原结合片 段包含 ： (i)γ-1H 链， 其包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 37 ； 或 (ii)κL 链， 其包含氨基酸序列 SEQID NO ： 39 ； 或 (iii) 上文的 (i) 和 (ii) 两者。
     本发明进一步提供了一种分离的核酸分子， 其包含编码免疫特异性识别人 α9 整 联蛋白的本发明人源化抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。具体地， 本发明提供了一种 分离的核酸分子， 其包含编码包含至少一种选自 SEQID NO ： 4、 5 和 6 的氨基酸序列的人源化 H 链， 或包含至少一种选自 SEQ IDNO ： 11、 12 和 13 的氨基酸序列的人源化 L 链， 或所述人源 化 H 链和所述人源化 L 链两者的核苷酸序列。在一个优选的具体实施方案中， 此类分离的 核酸分子包含核苷酸序列 SEQ ID NO ： 28( 其编码 VH 区 ) 或编码氨基酸序列 SEQ IDNO ： 29 的核苷酸序列。在另一个优选的具体实施方案中， 此类分离的核酸分子包含核苷酸 SEQ ID NO ： 30( 其编码 VL 区 ) 或编码氨基酸序列 SEQ ID NO ： 31 的核苷酸序列。在又一个优选的 具体实施方案中， 本发明的分离的核酸分子包含核苷酸序列 SEQ ID NO ： 28 和 30 两者。在 一个优选的具体实施方案中， 此类分离的核酸分子包含核苷酸序列 SEQ ID NO ： 36( 其编码 γ-1H 链 ) 或编码氨基酸序列 SEQ ID NO ： 37 的核苷酸序列。 在另一个优选的具体实施方案 中， 此类分离的核酸分子包含核苷酸序列 SEQ ID NO ： 38( 其编码 κL 链 ) 或编码氨基酸序 列 SEQ ID NO ： 39 的核苷酸序列。 在又一个优选的具体实施方案中， 本发明的分离的核酸分 子包含核苷酸序列 SEQ ID NO ： 36 和 38 两者。在又一个优选的具体实施方案中， 本发明的分离的核酸分子进一步包含编码供体起源 ( 诸如分别为氨基酸序列 SEQ ID NO ： 10 和 17) 或异源起源的信号肽的核苷酸序列。
     本发明进一步提供了一种载体， 例如表达载体， 其包含编码免疫特异性识别人 α9 整联蛋白的本发明人源化抗体或其抗原结合片段的 H 链或 L 链或二者的核苷酸序列。在此 类载体中， 本发明的核苷酸序列可以与一种或多种调节元件可操作连接。本发明的核苷酸 序列可以包括编码对于衍生 CDR 的非人供体抗体而言天然的信号肽或异源起源的信号肽 的核苷酸序列。
     此外， 本发明提供了一种宿主细胞， 其包含本发明的核酸分子， 包括包含本发明的 核酸分子的载体。 在一个实施方案中， 本发明提供一种分离的宿主细胞， 其包含编码本发明 的人源化 H 链的第一核酸分子和编码本发明的人源化 L 链的第二核酸分子， 所述第一和第 二核酸分子各自以使得本发明的生物学功能性人源化抗体或其抗原结合片段表达的方式 与调节元件可操作连接。
     因而， 本发明进一步提供了一种用于制备本发明的人源化抗体的方法， 包括在使 得该人源化抗体表达的条件下培养本发明的宿主细胞 ； 并收集所生成的人源化抗体。
     本发明进一步提供了包含至少一种本发明的人源化抗体的组合物。另外， 本发明 提供了一种用于预防或治疗与 α9 整联蛋白有关的病症或疾病的药物组合物， 其包含至少 一种本发明的人源化抗体和药学可接受载体。 任一种所述组合物可以进一步包含另一种活 性化合物， 其能附加地或协同地改善该病症或疾病。 此类活性化合物包括 ( 但不作为限制 ) 消炎化合物、 化学治疗化合物、 等等， 以及抗体或其抗原结合片段， 诸如能免疫特异性结合 人 α4 整联蛋白的抗体。 在另一方面， 本发明提供了一种用于预防或治疗与 α9 整联蛋白有关或牵涉 α9 整联蛋白的病症或疾病的方法， 所述方法包括对有此需要的受试者施用预防或治疗有效量 的至少一种本发明的人源化抗体。对于此类用途， 本发明的人源化抗体可以与增强该人源 化抗体的生物学效果的治疗模块缀合。此类治疗模块的例子包括另一种抗体， 诸如抗 α4 抗体 ( 例如以形成双特异性抗体 )、 抑制细胞性或杀细胞性细胞毒素、 放射性元素、 和 / 或其 它治疗剂， 包括消炎剂、 抗生素、 等等。
     在又一发面， 本发明提供了一种用于在受试者中诊断与 α9 整联蛋白有关或牵涉 α9 整联蛋白的病症或疾病的方法， 所述方法包括对要检查的受试者施用诊断有效量的本 发明的人源化抗体。 对于此类诊断用途， 可以用可检测标志物， 诸如放射性元素标记本发明 的人源化抗体。
     3.1 定义
     如本文中所使用的， 术语 “抗体” 指能够免疫特异性结合期望的抗原， 诸如 α9 整 联蛋白的抗体分子， 而且涵盖完整的抗体分子或其片段， 包括抗原结合片段。
     本文中所使用的术语 “免疫特异性识别” 指抗体或其抗原结合片段特异性结合靶 多肽或蛋白质， 特别是人 α9 整联蛋白的能力。此类抗体并不非特异性结合其它多肽或蛋 白质。然而， 免疫特异性结合靶多肽或蛋白质 ( 例如人 α9 整联蛋白 ) 的抗体或其抗原结 合片段可以与其它抗原起交叉反应。例如， 免疫特异性识别人 α9 整联蛋白的本发明的人 源化抗体或抗原结合片段可以与例如其它物种的 α9 整联蛋白起交叉反应。优选地， 免疫 特异性结合人 α9 整联蛋白的抗体或其抗原结合片段不与其它抗原起交叉反应。
     本文中所使用的术语 “抗原结合片段” 指保留免疫特异性结合靶多肽或蛋白质， 特 别是人 α9 整联蛋白和 / 或非人 α9 整联蛋白的能力的任何抗体片段， 而且包括单链抗体、 Fab 片段、 F(ab’ )2 片段、 二硫化物连接的 Fv、 和含有特异性结合靶多肽或蛋白质的轻链可 变区 (VL) 和 / 或重链可变区 (VH) 或甚至互补决定区 (CDR) 的片段。如此， 人源化抗体的 此类抗原结合片段可以包含或不包含部分或全长人恒定区。 用于获得上文所描述的抗体片 段的各种方法是本领域中公知的。
     本文中所使用的术语 “自人来源衍生的” 或 “自非人来源衍生的” 指自人抗体或非 人抗体的相应部分衍生其氨基酸序列的抗体部分。
     本文中所使用的术语 “接受体序列” 指充当来自供体抗体 ( 其通常是非人抗体 ) 的 CDR 的接受体的， 来自人抗体 VH 或 VL 区的框架区的核苷酸序列或氨基酸序列。
     4. 附图简述
     图 1 显示了实验结果， 其中用人 α-9 整联蛋白表达细胞 ( 人黑素瘤细胞 G361) 和 OPNα-9 整联蛋白结合位点肽 (SVVYGLR) 测量抗人 α-9 整联蛋白抗体 ( 即本发明的两种克 隆 ( 即 K33N 和 M35A)、 五种其它克隆 (1K11、 21C5、 24I11、 25B6、 和 28S1)、 和 Y9A2) 的细胞粘 附抑制活性。使用针对人骨桥蛋白的单克隆抗体 (5A1) 作为阴性对照。 图 2 显示了实验结果， 其中用人 α-9 整联蛋白表达细胞 ( 人黑素瘤细胞 G361) 和 生腱蛋白 C 片段的 α-9 整联蛋白结合位点肽测量抗人 α-9 整联蛋白抗体 ( 即本发明的两 种克隆 ( 即 K33N 和 M35A)、 五种其它克隆 (1K11、 21C5、 24I11、 25B6、 和 28S1)、 和 Y9A2) 的细 胞粘附抑制活性。使用针对人骨桥蛋白的单克隆抗体 (5A1) 作为阴性对照。
     图 3 显示了小鼠 K33N VH cDNA 的核苷酸序列 (SEQ ID NO ： 7) 及推导的氨基酸序 列 (SEQ ID NO ： 8)。氨基酸残基以单字母代码显示。信号肽序列 (SEQID NO ： 10) 为斜体。 成熟 VH 的 N 端氨基酸残基 (Q) 加双下划线。依照 Kabat 等 (Sequences of Proteins of Immunological Interests， 第五版， NIH 出版 No.91-3242， U.S.Department of Health and Human Services， 1991) 定义的 CDR 序列加下划线。
     图 4 显示了小鼠 K33N VL cDNA 的核苷酸序列 (SEQ ID NO ： 14) 及推导的氨基酸 序列 (SEQ ID NO ： 15)。氨基酸残基以单字母代码显示。信号肽序列 (SEQ ID NO ： 17) 为斜 体。成熟 VL 的 N 端氨基酸残基 (D) 加双下划线。依照 Kabat 等 (1991) 定义的 CDR 序列加 下划线。
     图 5 显示了侧翼有 SpeI 和 HindIII 位点 ( 加下划线 ) 的设计 K33N VH(ChK33N VH) 基因的核苷酸序列 (SEQ ID NO ： 32) 及推导的氨基酸序列 (SEQID NO ： 8)。氨基酸残基以单 字母代码显示。信号肽序列 (SEQ ID NO ： 10) 为斜体。成熟 VH 的 N 端氨基酸残基 (Q) 加双 下划线。依照 Kabat 等 (1991) 定义的 CDR 序列加下划线。内含子序列为斜体。
     图 6 显示了侧翼有 NheI 和 EcoRI 位点 ( 加下划线 ) 的设计 K33N VL(ChK33N VL) 基因的核苷酸序列 (SEQ ID NO ： 33) 及推导的氨基酸序列 (SEQID NO ： 15)。氨基酸残基以 单字母代码显示。信号肽序列 (SEQ ID NO ： 17) 为斜体。成熟 VL 的 N 端氨基酸残基 (D) 加 双下划线。依照 Kabat 等 (1991) 定义的 CDR 序列加下划线。内含子序列为斜体。
     图 7 显示了 pChK33N 和 pHuK33N( 集体为表达载体 ) 的示意结构。从顶部的 SalI 位点顺时针方向前进， 该质粒含有重链转录单元， 其始自人巨细胞病毒 (CMV) 主要立即早 期启动子和增强子 (CMV 启动子 ) 以启动抗体重链基因的转录。CMV 启动子后面有 VH 外显
     子、 含有人 γ-1 重链恒定区 ( 包括 CH1、 铰链、 CH2 和 CH3 外显子及居间内含子 ) 的基因组 序列、 和 CH3 后面供 mRNA 加工用的 γ-1 基因多聚腺苷酸化位点。重链基因序列后面， 轻链 转录单元始自 CMV 启动子， 后面有 VL 外显子和含有人 κ 链恒定区外显子 (CL) 及其前面的 内含子一部分的基因组序列、 和 κ 基因的 polyA 信号。然后， 轻链基因后面有 SV40 早期启 动子 (SV40 启动子 )、 大肠杆菌黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因 (gpt)、 和含有 SV40 多 聚腺苷酸化位点的区段 (SV40 poly(A) 位点 )。最后， 该质粒含有质粒 pUC19 一部分， 其包 含细菌复制起点 (pUC ori) 和 β- 内酰胺酶基因 (β- 内酰胺酶 )。
     图 8 显示了 K33N VH(SEQ ID NO ： 9)、 人源化 K33N(HuK33N)VH(SEQID NO ： 29) 和 自由 GenBank 登录号 DA980102 的核苷酸序列编码的氨基酸序列衍生的人接受体序列的 FRH1(SEQ ID NO ： 19)、 FRH2(SEQ ID NO ： 20)、 FRH3(SEQ ID NO ： 21) 和 FRH4(SEQ ID NO ： 22) 的氨基酸序列的比对。氨基酸残基以单字母代码显示。序列上方的数字标示依照 Kabat 等 (1991) 的位置。由 Kabat 等 (1991) 限定的 CDR 序列加下划线。加双下划线的残基预测为 与 CDR 接触， 而且小鼠残基在人源化形式中的这些位置处得到保留。 将 DA980102 中的第 82 位处的 Met( 加下划线 )( 其在人 VH 序列中的此位置处是非典型的 ) 用典型的残基 Leu 替 换以降低潜在的免疫原性。图中省略 DA980102 中的 CDR 残基。 图 9 显 示 了 K33N VL(SEQ ID NO ： 16)、 人 源 化 K33N(HuK33N)VL(SEQID NO ： 31) 和自由 GenBank 登录号 X72441 的核苷酸序列编码的氨基酸序列衍生的人接受体序列的 FRL1(SEQ ID NO ： 24)、 FRL2(SEQ ID NO ： 25)、 FRL3(SEQ ID NO ： 26) 和 FRL4(SEQ ID NO ： 27) 的氨基酸序列的比对。氨基酸残基以单字母代码显示。序列上方的数字标示依照 Kabat 等 (1991) 的位置。由 Kabat 等 (1991) 限定的 CDR 序列加下划线。加双下划线的残基预测为 与 CDR 接触， 而且小鼠残基在人源化形式中的这些位置处得到保留。图中省略 X72441 中的 CDR 残基。
     图 10 显示了用于构建 HuK33N VH 基因的寡核苷酸。
     图 11 显示了用于构建 HuK33N VL 基因的寡核苷酸。
     图 12 显示了用于构建 HuK33N VH 基因的寡核苷酸。箭表示每种寡核苷酸的位置 和取向 (5’ 至 3’ )。VH 区 (SEQ ID NO ： 29) 的氨基酸残基以单字母代码显示。
     图 13 显示了用于构建 HuK33N VL 基因的寡核苷酸。箭表示每种寡核苷酸的位置 和取向 (5’ 至 3’ )。VL 区 (SEQ ID NO ： 31) 的氨基酸残基以单字母代码显示。
     图 14 显示了侧翼有 SpeI 和 HindIII 位点 ( 加下划线 ) 的 HuK33N VH 基因的核苷 酸序列 (SEQ ID NO ： 34) 及信号肽 (SEQ ID NO ： 58 ； 以斜体显示 ) 和 VH 区 (SEQ ID NO ： 29) 的推导的氨基酸序列。氨基酸残基以单字母代码显示。信号肽序列为斜体。成熟 VH 的 N 端氨基酸残基 (Q) 加双下划线。依照 Kabat 等 (1991) 定义的 CDR 序列加下划线。内含子 序列为斜体。
     图 15 显示了侧翼有 NheI 和 EcoRI 位点 ( 加下划线 ) 的 HuK33N VL 基因的核苷酸 序列 (SEQ ID NO ： 35) 及信号肽 (SEQ ID NO ： 59 ； 以斜体显示 ) 和 VL 区 (SEQ ID NO ： 31) 的 推导的氨基酸序列。氨基酸残基以单字母代码显示。信号肽序列为斜体。成熟 VL 的 N 端 氨基酸残基 (D) 加双下划线。依照 Kabat 等 (1991) 定义的 CDR 序列加下划线。内含子序 列为斜体。
     图 16 显示了嵌合的与人源化的 K33N 抗体对人 α9 整联蛋白的亲和力的比较。通
     过细胞 ELISA 检查 1 和 0.5μg/ml 嵌合的和人源化的 K33N 对 CHO/α9 细胞的结合。一式 三份实施实验。图中显示了均值吸光度值及 SEM。
     图 17 显示了用于 HuK33N 重链和轻链 cDNA 的 PCR 扩增和测序的寡核苷酸的序列 (SEQ ID NO ： 44-50)。
     图 18 显示了 pHuK33N 中的 HuK33Nγ-1 重链编码区的核苷酸序列 (SEQID NO ： 36) 及推导的氨基酸序列 (SEQ ID NO ： 37)。氨基酸残基以单字母代码显示。终止密码子以 “ · ” 表示。
     图 19 显示了 pHuK33N 中的 HuK33Nκ 轻链编码区的核苷酸序列 (SEQ IDNO ： 38) 及 推导的氨基酸序列 (SEQ ID NO ： 39)。氨基酸残基以单字母代码显示。终止密码子以 “·” 表示。
     图 20 显示了对纯化的抗体的 SDS-PAGE 分析的结果。 依照 Sambrook 等 (Molecular Cloning， A Laboratory Manual， 第 2 版， 1989， Cold Spring Harbor Laboratory Press， Cold Spring Harbor， NY) 在还原条件下在存在 SDS 的情况中在 10％聚丙烯酰胺凝胶上运 行 6μg 嵌合的和人源化的 IgG1/κ 抗体 ( 分别为 ChK33N 和 HuK33N)。使用宽范围蛋白质 标志物 (MW ； New England Biolabs， Ipswich， MA) 作为大小标志物。右侧显示的数字表示 按千道尔顿 (kDa) 计的标志物大小。
     图 21 显示了对小鼠 K33N 抗体对人 α9 整联蛋白的结合的 FACS 分析的结果。 在多 个浓度 ( 以 1.67μg/ml 开始且连续 3 倍稀释 ) 对小鼠 K33N 抗体测试对 CHO/huα9 细胞的 结合。在图中在测试的每个抗体浓度 (X 轴 ) 为几何平均通道荧光数值 (MCF ； Y 轴 ) 绘图。 使用 GraphPad Prism(GraphPad Software， San Diego， CA) 来计算 EC50 值。
     图 22 显示了对嵌合的和人源化的 K33N 抗体对人 α9 整联蛋白的结合的 FACS 分 析的结果。在多个浓度 ( 以 5μg/ml 开始且连续 3 倍稀释 ) 对每种抗体测试对 CHO/huα9 细胞的结合。在图中在测试的每个抗体浓度 (X 轴 ) 为几何平均通道荧光数值 (MCF ； Y轴) 绘图。使用 GraphPad Prism(GraphPad Software， San Diego， CA) 来计算 EC50 值。
     图 23 显示了针对人 α9 整联蛋白的小鼠的、 嵌合的和人源化的 K33N 抗体和小 鼠抗人 α9 整联蛋白抗体 Y9A2 的剂量响应细胞粘附抑制率。在 5、 1、 0.2、 0.04、 0.008 和 0.0016μg/mL 的浓度对每种抗体测试对人 α9 整联蛋白表达细胞系 G-361 的细胞粘附。 一 式四份实施实验。图中显示了均值抑制率值。
     5. 发明详述
     5.1. 针对人 α9 整联蛋白的抗体的制备
     可通过本领域中已知的任何合适的方法来生成免疫特异性识别人 α9 整联蛋白 或其任何表位的抗体。
     在本发明中作为抗原使用的 α9 整联蛋白可以是 (1) 自表达 α9 整联蛋白的所有 来自人的细胞， 或其中存在这些细胞的所有组织衍生的蛋白质， (2) 重组蛋白， 其中将编码 α9 整联蛋白的基因 DNA， 优选地 cDNA 转染入细菌、 酵母、 细胞系 ( 包括动物细胞 )、 等中， 并 表达， 或 (3) 合成的蛋白质。
     α9 整联蛋白包括包含与人 α9 整联蛋白的氨基酸序列 (SEQ ID NO ： 55， 其中残基 1-29 是信号肽 ) 基本上相同的氨基酸序列的多肽。
     在本文中， 术语 “包含基本上相同的氨基酸序列的多肽” 指包含如下氨基酸序列的变体多肽， 其中多个氨基酸， 优选地 1 至 10 个氨基酸且更优选地 1 至几个 ( 例如 1 至 5 个 ) 氨基酸被替代、 删除和 / 或修饰， 只要这些变体多肽与天然存在的人 α9 整联蛋白具有基本 上等同的生物学特性 ； 和包含如下氨基酸序列的变体多肽， 其中多个氨基酸， 优选地 1 至 10 个氨基酸且更优选地 1 至几个 ( 例如 1 至 5 个 ) 氨基酸被添加至天然存在的人 α9 整联蛋 白的氨基酸序列。此外， 变体多肽可以是那些具有这些氨基酸替代、 删除、 修饰和添加中多 处的。
     在基因重组技术外， 可以通过本领域中公知的方法， 诸如化学合成法、 细胞培养 法、 等， 或其修改方案来生成在本发明中作为抗原的人 α9 整联蛋白。
     用于生成变体多肽的方法的例子包括合成寡核苷酸定点诱变 ( 缺口双链体法 )、 牵涉通过用亚硝酸盐或亚硫酸盐处理来随机引入点突变的点诱变法、 牵涉用 Bal31 酶或 其它酶制备缺失突变体的方法、 盒式诱变、 接头扫描法、 误掺入法 (miss incorporation method)、 错配引物法、 DNA 区段合成法、 等等。
     要在本发明中作为抗原使用的人 α9 整联蛋白还包括所述 α9 整联蛋白一 “部 分” 。 如本文中所使用的， “部分” 指包含结合 α9 整联蛋白配体， 例如 OPN、 VCAM-1、 生腱蛋白 C、 等所需要的区域的部分 ； 具体地， 成熟人 α9 整联蛋白 (SEQ ID NO ： 55 的第 30- 第 1035 氨基酸残基 ) 中包含第 14- 第 980 氨基酸残基的部分， 和包含第 11- 第 981 氨基酸残基的 部分。所述 α9 整联蛋白一 “部分” 可以依照下文所描述的本领域中已知的方法或其修改 方案通过基因重组或化学合成来生成， 或者可以通过用蛋白水解酶等等适当消化通过细胞 培养法分离的人 α9 整联蛋白来生成。 在细胞膜上过表达 α9 整联蛋白的细胞本身或其膜级分也可以作为抗原使用。可 以通过本领域中公知的重组 DNA 技术来制备过表达人 α9 整联蛋白的细胞。
     使用如上文所描述的那样制备的合适的抗原， 可以通过本领域中公知的多种方 法来制备对人 α9 整联蛋白或其任何表位特异性的抗体。针对人 α9 整联蛋白的多克隆 抗体可以通过本领域中公知的多种规程来生成。例如， 可以对多种宿主动物 ( 包括但不 限于家兔、 小鼠、 大鼠、 等 ) 施用感兴趣的抗原， 以诱导含有对抗原特异性的多克隆抗体的 抗血清生成。根据宿主物种， 可以使用各种佐剂来提高免疫学应答， 并且包括但不限于弗 (Freund) 氏 ( 完全和不完全 ) 佐剂、 矿物凝胶诸如氢氧化铝、 表面活性物质诸如溶血卵磷
     脂、 Pluronic 多元醇、 聚阴离子、 肽、 油乳剂、 匙孔血蓝蛋白、 二硝基苯酚、 和对人潜在有用的佐剂诸如 BCG( 卡介苗 ) 和小棒杆菌 (Corynebacterium parvum)。此类佐剂也是本领 域中公知的。
     可以使用本领域中已知的极其多种技术 ( 包括使用杂交瘤、 重组体、 和噬菌体展 示技术， 或其组合 ) 来制备单克隆抗体。例如， 可以使用杂交瘤技术来生成单克隆抗体， 所 述杂交瘤技术包括那些在本领域中已知的和在例如 Harlow 等， Antibodies ： A Laboratory Manual， (Cold Spring Harbor Laboratory Press，第 2 版 1988) ； Hammerling 等，于 ： Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas， 第 563 页 - 第 681 页 (Elsevier， N.Y.， 1981)( 通过提及而完整收录这两者 ) 中教导的。如本文中所使用的， 术语 “单克隆抗体” 不 限于经由杂交瘤技术生成的抗体。术语 “单克隆抗体” 指自单克隆， 包括任何真核、 原核、 或 噬菌体克隆衍生的抗体， 而非生成其的方法。
     使用杂交瘤技术来生成和筛选特异性抗体的方法是本领域中公知的且常规的。在一个非限制性例子中， 可以用感兴趣的抗原或表达此类抗原的细胞来免疫小鼠。一旦 检测出免疫应答， 例如在小鼠血清中检测出对抗原特异性的抗体， 收获小鼠脾， 并分离脾 细胞。然后， 通过公知的技术将脾细胞与任何合适的骨髓瘤细胞 ( 例如 P3U1、 P3X63-Ag8、 P3X63-Ag8-U1、 P3NS1-Ag4、 SP2/0-Ag14、 P3X63-Ag8-653 等 ) 融合。选择杂交瘤， 并通过有 限稀释将其克隆。然后， 通过本领域中已知的方法对杂交瘤克隆测定分泌能够结合抗原的 抗体的细胞。可以通过给小鼠腹膜内接种阳性杂交瘤克隆来生成腹水， 其一般含有高水平 的抗体。
     可以通过已知的技术来生成识别特定表位的抗体片段。例如， 可以通过使用诸如 木瓜蛋白酶 ( 以生成 Fab 片段 ) 或胃蛋白酶 ( 以生成 F(ab’ )2 片段 ) 等酶来蛋白水解切割 免疫球蛋白分子， 从而生成 Fab 和 F(ab’ )2 片段。F(ab’ )2 片段含有完整的轻链和重链的 可变区、 CH1 区和铰链区。
     本发明的抗体或其抗原结合片段也可以通过本领域中已知的用于合成抗体的任 何方法， 特别是通过化学合成或者优选地， 通过重组表达技术来生成。
     编码抗体的核苷酸序列可以自本领域技术人员可得的任何信息 ( 即自 Genbank、 文献、 或者通过常规的克隆和序列分析 ) 获得。若不可获得含有编码特定抗体或其表位结 合片段的核酸的克隆， 但是抗体分子或其表位结合片段的序列是已知的， 则编码免疫球蛋 白的核酸可以化学合成或者使用与序列的 3’ 和 5’ 端可杂交的合成引物通过 PCR 扩增或者 使用对特定基因序列特异性的寡核苷酸探针以鉴定例如来自 cDNA 文库的编码抗体的 cDNA 克隆通过克隆自合适的来源 ( 例如抗体 cDNA 文库、 或自表达抗体的任何组织或细胞诸如选 择为表达抗体的杂交瘤细胞生成的 cDNA 文库、 或自表达抗体的任何组织或细胞分离的核 酸， 优选地 polyA+RNA) 获得。然后， 可以使用本领域中公知的任何方法来将通过 PCR 生成 的扩增核酸克隆入可复制克隆载体中。
     5.2. 重组抗体的制备
     一旦确定抗体的核苷酸序列， 便可以使用本领域中公知的用于操作核苷酸序列的 方法， 例如重组 DNA 技术、 定点诱变、 PCR、 等 ( 参见例如 Sambrook 等， 见上文 ； 及 Ausubel 等 编， 1998， Current Protocols in Molecular Biology， John Wiley & Sons， NY 中所记载的 技术， 通过提及而将这两篇文献完整收入本文 ) 来操作抗体的核苷酸序列， 以通过例如将 氨基酸替代、 删除、 和 / 或插入引入抗体的表位结合域区或抗体中可以提高或降低抗体的 生物学活性的任何部分中来生成具有不同氨基酸序列的抗体。
     抗体的重组表达需要构建含有编码抗体的核苷酸序列的表达载体。 一旦获得了编 码抗体分子或抗体的重链或轻链或其部分的核苷酸序列， 便可以使用本领域中公知的技术 通过重组 DNA 技术来生成供生成抗体分子用的载体， 如先前的小节中所讨论的。可以使用 本领域技术人员公知的方法来构建含有抗体编码序列和合适的转录和翻译控制信号的表 达载体。这些方法包括例如体外重组 DNA 技术、 合成技术、 和体内遗传重组。可以将编码抗 体的重链可变区、 轻链可变区、 重链和轻链可变区两者、 重链和 / 或轻链可变区的表位结合 片段、 或一个或多个互补决定区 (CDR) 的核苷酸序列克隆入此类载体中进行表达。可以将 此类序列与编码对于初始抗体而言天然的信号肽或异源信号肽的多核苷酸融合。然后， 可 以将如此制备的表达载体导入合适的宿主细胞中以表达抗体。因而， 本发明包括含有编码 免疫特异性识别人 α9 整联蛋白的人源化抗体或其抗原结合片段的多核苷酸的宿主细胞。可以用本发明的两种表达载体 ( 第一种载体编码重链衍生的多肽， 而第二种载体 编码轻链衍生的多肽 ) 共转染宿主细胞。两种载体可以含有相同的选择标志 ( 其使重链和 轻链多肽能够相等表达 ) 或不同的选择标志以确保维持这两种质粒。或者， 可以使用单一 载体， 其编码并能够表达重链和轻链多肽两者。重链和轻链的编码序列可以包含 cDNA 或基 因组 DNA。
     在另一个实施方案中， 也可以使用本领域中已知的多种噬菌体展示法来生成抗 体。在噬菌体展示法中， 功能性抗体域在携带编码它们的多核苷酸序列的噬菌体颗粒表 面上展示。在一个特别的实施方案中， 可以利用此类噬菌体来展示自全集或组合抗体文 库 ( 例如人的或鼠的 ) 表达的抗原结合域， 诸如 Fab 和 Fv 或二硫键稳定化的 Fv。可以 用抗原， 例如使用经标记的抗原或被固体表面或珠结合或捕获的抗原来选择或鉴定表达 结合感兴趣抗原的抗原结合域的噬菌体。这些方法中使用的噬菌体通常是丝状噬菌体， 包括 fd 和 M13。抗原结合域作为与噬菌体基因 III 或基因 VIII 蛋白的重组融合蛋白表 达。可以用于生成本发明的免疫球蛋白或其片段的噬菌体展示法的例子包括那些披露于 Brinkman 等， J.Immunol.Methods， 182 ： 41-50， 1995 ； Ames 等， J.Immunol.Methods， 184 ： 177-186， 1995 ； Kettleborough 等， Eur.J.Immunol.， 24 ： 952-958， 1994 ； Persic 等， Gene， 187 ： 9-18， 1997 ； Burton 等， Advances in Immunology， 57 ： 191-280， 1994 ； PCT 申请 No.PCT/ GB91/01134 ； PCT 公 开 文 本 WO 90/02809 ； WO 91/10737 ； WO 92/01047 ； WO 92/18619 ； WO 93/11236 ； WO95/15982 ； WO 95/20401 ； 及美国专利 No.5,698,426 ； 5,223,409 ； 5,403,484 ； 5,580,717 ； 5,427,908 ； 5,750,753 ； 5,821,047 ； 5,571,698 ； 5,427,908 ； 5,516,637 ； 5,780,225 ； 5,658,727 ； 5,733,743 和 5,969,108 的 ； 通过提及而将每篇完整收入本文。
     如上述参考文献中所记载的， 噬菌体选择后， 可以分离来自噬菌体的抗体编码区， 并使用其来生成完整抗体， 包括人抗体， 或任何其它期望的片段， 并在任何期望的宿主 ( 包 括哺乳动物细胞、 昆虫细胞、 植物细胞、 酵母、 和细菌 ) 中表达， 例如如下文更为详细地描述 的。例如， 也可以采用用于重组生成 Fab、 Fab’ 和 F(ab’ )2 片段的技术， 其使用本领域中 已知的方法， 诸如那些披露于 PCT 公开文本 WO 92/22324 ； Mullinax 等， BioTechniques， 12(6) ： 864-869， 1992 ； 及 Sawai 等， AJRI， 34 ： 26-34， 1995 ； 及 Better 等， Science， 240 ： 1041-1043， 1988( 通过提及而完整收录每篇 ) 的方法进行。 可以用于生成单链 Fv 和抗体的 技术的例子包括那些记载于美国专利 No.4,946,778 和 5,258,498 ； Huston 等， Methods in Enzymology， 203 ： 46-88， 1991 ； Shu 等， PNAS， 90 ： 7995-7999， 1993 ； 及 Skerra 等， Science， 240 ： 1038-1040， 1988 的。
     一旦通过上文所描述的任何方法生成了本发明的抗体分子， 然后便可以通过本领 域中已知的用于纯化免疫球蛋白分子的任何方法， 例如通过层析 ( 例如离子交换、 亲和、 特 别是在蛋白 A 或蛋白 G 纯化后通过对特定抗原的亲和、 和筛分柱层析 )、 离心、 差别溶解度、 或者通过任何其它用于纯化蛋白质的标准技术来将其纯化。此外， 可以将本发明的抗体或 其片段与本文中所描述的或者在其它情况中在本领域中已知的异源多肽序列融合以便于 纯化。
     对于一些用途 ( 包括抗体在人中的体内用途和体外检测测定法 )， 可以优选使用 嵌合的、 人源化的、 或人的抗体。在下文 5.3 一节中详细讨论了嵌合抗体和人源化抗体。
     与其它化合物或异源多肽融合或缀合的抗体可以在体外免疫测定法中、 在纯化法 ( 例如亲和层析 ) 中、 及在体内治疗或诊断用途中使用。参见例如 PCT 公开文本 No.WO 93/21232 ； EP 439,095 ； Naramura 等， Immunol.Lett.， 39 ： 91-99， 1994 ；美 国 专 利 5,474,981 ； Gillies 等， PNAS， 89 ： 1428-1432， 1992 ； 及 Fell 等， J.Immunol.， 146 ： 2446-2452， 1991， 通过提及而将它们完整收入本文。 例如， 可以使用已知的方法或商品化试 剂盒 ( 例如生物素标记、 FITC 标记、 APC 标记 ) 以多种方式来标记抗体。作为另一个例子， 可以将抗体与提高抗体的体内生物学效果的治疗模块缀合。 此类治疗模块的例子包括另一 种抗体、 抑制细胞性或杀细胞性细胞毒素、 放射性元素、 和 / 或其它治疗剂， 包括消炎剂、 抗 生素、 等等。在本发明中， 可以将人源化抗人 α9 整联蛋白与另一种抗体， 诸如抗 α4 抗体 缀合 ( 例如以形成双特异性抗体 )。作为另一个例子， 对于体内诊断用途， 可以用可检测标 志物， 诸如放射性元素标记本发明的人源化抗体。
     5.3. 嵌合的和人源化的抗体
     嵌合抗体是一种自不同动物物种衍生抗体的不同部分的分子， 诸如具有自鼠单克 隆抗体衍生的可变区和自人免疫球蛋白衍生的恒定区的抗体。 用于生成嵌合抗体的方法是 本领域中已知的。参见例如 Morrison， Science， 229 ： 1202， 1985 ； Oi 等， BioTechniques， 4： 214， 1986 ； Gillies 等， J.Immunol.Methods， 125 ： 191-202， 1989 ； 美国专利 No.5,807,715 ； 4,816,567 ； 及 4,816,397， 通过提及而将它们完整收入本文。
     人源化抗体是一种结合期望的抗原且包含含有一种或多种自非人物种衍生的互 补决定区 (CDR) 和一种或多种自人免疫球蛋白分子衍生的框架区的可变区的分子。用于 使非人抗体人源化的典型方法已经记载于多份参考文献， 诸如如下那些 ： Queen 等， 1989， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86 ： 10029-10033 和 美 国 专 利 No.5,585,089 和 5,693,762 ； Riechmann 等， Nature， 332 ： 323， 1988 ； 及 Tsurushita 等， Methods 36 ： 69-83， 2005， 通过提 及而将它们都完整收入本文。 例如， Tsurushita 等 (2005， 见上文 ； 下文称为 “Tsurushita” ) 的参考文献提供了一种用于使小鼠单克隆抗体人源化的实用且指导性的方案， 其基于最初 由 Queen 等 (1989， 见上文 ) 开发的抗体人源化方法。下文简要汇总了 Tsurushita 中所披 露的通用方案。
     5.3.1. 用于制备人源化抗体的通用方案
     小鼠 V 基因的克隆和测序
     有多种方法可用于克隆编码目标小鼠单克隆抗体的 VH 和 VL 区的 cDNA。例如， 通 常 使 用 5’ RACE(cDNA 末 端 快 速 扩 增 ) 法， 其 使 用 SMART RACE cDNA 扩 增 试 剂 盒 (BD Biosciences， CA) 或 GeneRacer 试剂盒 (Invitrogen， CA) 进行。可以基于目标单克隆抗体 的 H 链和 L 链的同种型来制备用于 5’ RACE 的基因特异性引物， 从而它可以刚好在 H 链和 L 链之每种的可变区下游结合。如此， 5’ RACE 引物可以设计为对小鼠中的每种亚型， 诸如 γ1、 γ2a、 γ2b 或 γ3 特异的。或者， 可以基于亚型间共有的或高度同源的区域来设计所 有亚型的共同引物。在 Tsurushita 中， 下列 5’ RACE 引物作为例子被披露 ：
     (i)5’ -GCCAGTGGATAGACTGATGG-(SEQ ID NO ： 56)( 用于克隆小鼠 γ1、 γ2a、 γ2b 和 γ3H 链 )
     (ii)5’ -GATGGATACAGTTGGTGCAGC-(SEQ ID NO ： 57)( 用于克隆小鼠 κ 轻链 )。
     可以例如使用 Zero Blunt TOPO PCR 克隆试剂盒 (Invitrogen) 来将 PCR 扩增的 V 基因片段直接克隆入质粒载体中， 并测定其 DNA 序列。获得的序列应当通过例如比较其编码氨基酸序列与使用例如 241 型蛋白质测序仪 (Hewlett-Packard， CA) 通过 N 端氨基酸测 序测定的目标单克隆抗体的氨基酸序列来确认。通常， 通过例如埃德曼 (Edman) 降解测定 在目标抗体 N 端的至少 15-20 个氨基酸残基足以确认克隆 DNA 序列的真实性。Tsurushita 告诫， 在谷氨酰胺 ( 其是小鼠中两种最常见的 N 端氨基酸之一 ) 是 N 端氨基酸时， 其可能已 经转变成焦谷氨酰胺并封闭 N 端的测序。在该情况中， 有必要使 N 端去封闭以获得序列。
     V 区的三维建模
     基 于 VH 和 VL 区 的 序 列， 首 先 通 过 例 如 由 R.Levy 等， 1989， Biochemistry 28 ： 7168-7175 ； 及 B.Zilber 等， 1990， Biochemistry 29 ： 10032-10041 记载的方法来鉴定靶 抗体中对于维持 CDR 的构象结构潜在重要的框架残基。通常， 将 VH 和 VL 区之每种分成 14 个结构上有意义的区段， 其是构成免疫球蛋白超家族域结构的 β 链和环样结构。将来 自目标抗体的每个区段的氨基酸序列与 PDB 数据库 ( 参见 H.M.Berman 等， 2000， Nucleic Acids Res.28 ： 235-342) 中的已知结构的抗体的相应区段比对。通过多序列比对， 选择 与每个靶区段具有最高序列同源性的相应区段， 并构建 V 区的三维模型。为了优化结 构， 将模型进行多轮共轭梯度能量最小化 ( 例如使用 ENCAD， 或者如由 Press 等， 1990， 于 “Numerical Recipes” ， Cambridge University Press， Cambridge 中所记载的 ； Weiner 等， 1981， J.Comp.Chem.2 ： 287-303 的 AMBER ； 由英国癌症研究中心 (Cancer Research UK) 运 行的 BioMolecularModelling 或 “BMM” 网站上可获得的 3D-JIG-SAW ； 或在由瑞士生物信息 学研究所 (Swiss Institute of Bioinformatics， Geneva) 运行的 ExPASy 蛋白质组学服务 器网站上可获得的 SWISS-MODEL 进行 )。
     人框架的选择
     与对 V 区结构建模并行， 将自小鼠 VH 和 VL 区的 cDNA 克隆推导的氨基酸序列分别 与数据库， 例如 Kabat 数据库 ( 参见 Johnson 等， 2000， Nucleic Acids Res.28 ： 214-218.)、 GenBank、 等等中的人 V 区序列比较。 可以使用例如 Smith-Waterman 算法 (Gusfield， 1997， 于 “Algorithms on Strings， Trees， and Sequences” ， Cambridge University Press， Cambridge)、 或 BLAST(Karlin 等， 1990， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87 ： 2264-2268)、 等等来 搜索与小鼠序列具有至少约 65 ％、 至少约 70 ％、 至少约 75 ％、 至少约 80 ％、 至少约 85 ％、 至少约 90％、 或至少 95％同一性的总体序列同一性的人框架区。这些人序列可以根据基 于 cDNA 的和蛋白质衍生的序列 ； 然而， 种系的使用常常是优选的， 因为它可以用于消除与 基于 cDNA 的、 蛋白质衍生的序列中的体细胞高度突变有关的潜在免疫原性。在备选中， 如 Queen 等 (1989， 见上文 ) 中所记载的， 共有框架序列的使用也可以在自基于 cDNA 的或蛋白 质衍生的序列获得的框架中鉴定并清除此类高度突变残基。在使用种系 VH 区段作为接受 体框架的情况中， 应当使用染色体 14， 而非 15 和 16 上编码的 VH 区段， 因为只有染色体 14 上的那些生成功能性 VH 区。
     人源化 V 区的设计
     依照 Queen 等 (1989， 见上文 )， 有必要鉴定距 CDR 约 4-6 埃内的框架氨基酸， 因为 认为这些残基是支持正确 CDR 结构的潜在的关键框架残基。此类方法可以使用计算机程 序， 诸如由国家科学基金会 (National Science Foundation， NSF) 支持的分子可视化免费 软件 (Molecular Visualization Freeware) 网站上可获得的 RASMOL( 其通过原子坐标或 者经由计算机模型的手工检查来计算原子间距离 ) 来实现。若关键框架位置处的氨基酸在小鼠供体和人接受体序列之间不同， 则通常用小鼠供体的那些替换人残基。 然后， 若此类残 基对支持 CDR 结构具有最小的贡献， 则通常使用相应的人残基。还有， 若选定的人接受体含 有 “非典型的” 氨基酸 ( 其在小于约 10-20％的 V 区序列中发生 )， 则它们可以是亲和力成熟 过程中体细胞高度突变的结果， 而且应当用供体残基替换以避免在人中的潜在免疫原性。
     另外， 在设计人源化 V 区时需要仔细考虑其它因素， 诸如潜在的 N 连接的糖基化信 号的残基 ( 关于详情， 参见 Tsurushita)。
     根据治疗用途需要的或要消除的效应器功能， 人源化抗体可以含有来自人抗体的 人 κ 或 λ 轻链、 和 / 或 γ1、 γ2、 γ3、 γ4、 μ、 α1、 α2、 δ、 或 ε 重链、 或其变体的人恒 定区或其部分。例如， 可以将含有突变的恒定区的 Fc 部分与本发明的嵌合的或人源化的抗 体的可变区融合， 从而降低抗体对 Fc 受体的结合和 / 或降低其固定补体的能力 ( 参见例如 Winter 等， GB 2,209,757B ； Morrison 等， WO 89/07142 ； Morgan 等， WO 94/29351)。可以通 过重组 DNA 技术来实施对抗体分子的此类操作， 如 5.2 一节中所描述的。
     优选地， 所得的嵌合或人源化抗体具有与非人供体抗体相同的特异性和与非人 供体抗体的亲和力相似或非人供体抗体的亲和力的至少约 1/3、 至少约 1/2、 或至少约 2/3 7 -1 的亲和力。在另一方面， 所得的嵌合或人源化抗体具有至少约 1x10 M 、 优选地至少约 8 -1 9 -1 1x10 M 、 且最优选地至少约 1x10 M 的亲和常数。 在上文所描述的通用方案外， 可以使用本领域中已知的多种技术来使抗体人 源 化， 所 述 技 术 包 括 例 如 CDR 嫁 接 (EP 239,400 ； PCT 公 开 文 本 WO91/09967 ； 美国专利 No.5,225,539 ； 5,530,101 和 5,585,089)、 镶 饰 (veneering) 或 重 修 表 面 (resurfacing) (EP 592,106 ； EP 519,596 ； Padlan， Molecular Immunology， 28(4/5) ： 489-498， 1991 ； Studnicka 等， Protein Engineering， 7(6) ： 805-814， 1994 ； Roguska 等， Proc Natl.Acad. Sci.USA， 91 ： 969-973， 1994)、 和链改组 ( 美国专利 No.5,565,332)， 在此通过提及而将它们 都完整收录。
     5.3.2. 将人源化抗体制备为药物的其它考虑因素
     为了作为药物来供应人源化抗体， 需要制备有效且一致的其生产系统。 例如， 通过 插入 H 和 L 链序列来制备适合于人源化抗体的表达载体， 并可以获得经表达载体转染的高 生产率细胞系作为主细胞库 (MCB) 的种子细胞， 其充当工作细胞库 (WCB) 的稳定且半永久 来源。然后， 可以通过培养来自 WCB 的工作细胞， 并收集培养液来制备人源化抗体。
     可以使用具有合适调节基因的多种表达载体来制备此类生产细胞系。 作为宿主细 胞， 可以使用通常用于表达哺乳动物蛋白质的宿主细胞来表达人源化抗体。此类宿主细胞 的例子包括但不限于中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞、 SP2/0-Ag14.19 细胞、 NSO 细胞、 等等。可以 通过选择表达载体和宿主细胞的最好组合来使人源化抗体的生产率最大化。此外， 应当探 索培养基的组成以从多种无血清培养基和补充物选择合适的培养基， 从而可以优化宿主细 胞的人源化抗体表达。
     基于效率和最终的产率， 可以使用本领域中公知的多种方法来自培养物上清液纯 化由宿主细胞生成的人源化抗体， 所述方法包括亲和层析、 离子交换层析、 疏水相互作用层 析、 等等。
     5.4. 药物组合物和治疗用途
     本发明提供了一种包含免疫特异性识别人 α9 整联蛋白的上述人源化抗体或其
     抗原结合片段的药物组合物。 包含本发明的人源化抗体作为活性成分的药物组合物可以作 为药剂用于预防和 / 或治疗与 α9 整联蛋白有关的病症或疾病， 包括但不限于癌症， 例如癌 细胞的生长或转移， 和炎性疾病， 例如类风湿性关节炎、 骨关节炎、 肝炎、 支气管哮喘、 纤维 化、 糖尿病、 动脉硬化、 多发性硬化、 肉芽肿、 炎性肠病 ( 溃疡性结肠炎和克罗恩氏病 )、 自身 免疫性疾病、 等等。
     也可以使用包含本发明的人源化抗体的药物组合物来治疗器官移植后慢性排斥 反应、 和自身免疫性疾病诸如系统性自身免疫性疾病、 全身性红斑狼疮 (erythematosus)、 葡萄膜炎、 贝切特 (Behcet) 氏病、 多肌炎、 肾小球增殖性肾炎 (glomerular proliferative nephritis)、 结节病、 由 α9 整联蛋白诱发的疾病状况、 等等。
     用于预防或治疗上文所描述的病症或疾病的预防和 / 或治疗剂 ( 其包含本发明的 人源化抗体 ) 具有低毒性， 而且可以作为通过在合适的溶剂中混合得到的液体制剂， 或者 作为合适剂量形式的药物组合物直接给人口服或胃肠外施用。
     用于上文所描述的施用的药物组合物含有上述抗体或其盐和药学可接受载体、 稀 释剂或赋形剂。此类组合物以适合于口服或胃肠外施用的剂量形式提供。
     剂量可以随要施用的受试者的年龄和体型、 目标疾病、 状况、 施用路径、 等等而所 有变化。在使用抗体来预防和 / 或治疗例如成年患者中的类风湿性关节炎时， 有利的是， 通 常以约 0.01 至约 20mg/kg 体重、 优选地约 0.1 至约 10mg/kg 体重、 且更优选地约 0.1 至约 5mg/kg 体重的单剂每天约 1 至 5 次、 优选地每天约 1 至 3 次静脉内施用本发明的抗体。在 其它胃肠外施用和口服施用中， 可以以与上文给定的剂量对应的剂量施用抗体。在状况特 别严重时， 可以根据状况增加剂量。 多种投递系统是已知的， 并且可以用于施用本发明的药物组合物， 例如脂质体中 的包囊、 微粒、 微囊剂、 能够表达突变体病毒的重组细胞、 受体介导的胞吞 ( 参见例如 Wu 和 Wu， 1987， J.Biol.Chem.262 ： 4429-4432)。导入的方法包括但不限于皮内、 肌肉内、 腹膜内、 静脉内、 皮下、 鼻内、 硬膜外、 和口服路径。化合物可以通过任何方便的路径， 例如通过输注 或推注， 通过经由上皮或粘膜皮肤衬里 ( 例如口腔粘膜、 直肠和肠粘膜、 等 ) 的吸收来施用， 而且可以与其它生物学活性剂一起施用。 施用可以是全身的或局部的。 还可采用肺部施用， 例如通过使用吸入器或喷雾器和含雾化剂的配制剂来实现。
     在一个具体的实施方案中， 可期望对需要治疗的区域局部施用本发明的药物组合 物； 这可以通过例如 ( 而不作为限制 ) 手术过程中的局部输注、 表面应用 ( 例如与手术后的 伤口敷料一起 )、 通过注射、 依靠导管、 依靠栓剂、 依靠鼻喷雾、 或者依靠植入物来进行， 所述 植入物是多孔的、 非多孔的、 或凝胶状的材料， 包括膜， 诸如硅橡胶膜、 或纤维。在一个实施 方案中， 可以通过在受感染组织部位 ( 或以前的部位 ) 直接注射进行施用。
     在另一个实施方案中， 药物组合物可以在囊泡， 特别是脂质体中投递 ( 参见 Langer， 1990， Science 249 ： 1527-1533 ； Treat 等， 于 Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer， Lopez Berestein 和 Fidler( 编 )， Liss， New York， 第 353 页 - 第 365 页 (1989) ； Lopez-Berestein， 同上， 第 317 页 - 第 327 页 ； 通常参见如上 )。
     在又一个实施方案中， 药物组合物可以在受控释放系统中投递。在一个实施方 案 中， 可 使 用 泵 ( 参 见 Langer， 见上文； Sefton， 1987， CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14 ： 201 ； Buchwald 等， 1980， Surgery 88 ： 507 ； 及 Saudek 等， 1989， N.Engl.J.Med.321 ： 574)。
     在另一个实施方案中， 可使用聚合材料 ( 参见 Medical Applications of Controlled Release， Langer 和 Wise( 编 )， CRC Pres.， Boca Raton， Florida(1974) ； Controlled Drug Bioavailability， Drug Product Design and Performance， Smolen 和 Ball( 编 )， Wiley， New York(1984) ； Ranger 和 Peppas， J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23 ： 61(1983) ； 还可参见 Levy 等， 1985， Science 228 ： 190 ； During 等， 1989， Ann.Neurol.25 ： 351 ； Howard 等， 1989， J.Neurosurg.71 ： 105)。在又一个实施方案中， 受控释放系统可以放置在组合物 的靶物附近， 如此仅需要系统剂量的一部分 ( 参见例如 Goodson， 于 Medical Applications of Controlled Release， 见上文， 第 2 卷， 第 115 页 - 第 138 页 (1984))。Langer(Science 249 ： 1527-1533(1990)) 的综述中讨论了其它受控释放系统。
     供口服施用的组合物的例子包括固体或液体剂量形式， 具体有片剂 ( 包括糖衣片 和薄膜衣片剂 )、 丸剂、 颗粒剂、 粉状制剂、 胶囊 ( 包括软胶囊 )、 糖浆剂、 乳剂、 悬浮液、 等。 此 类组合物通过众所周知的方法来制造备， 而且含有药用制剂领域中常规使用的媒介、 稀释 剂或赋形剂。供片剂用的媒介或赋形剂的例子有乳糖、 淀粉、 蔗糖、 硬脂酸镁、 等等。
     可注射制剂可以包括用于静脉内、 皮下、 皮内和肌肉内注射、 点滴输注、 等的剂量 形式。这些可注射制剂可以通过众所周知的方法来制备。可以例如通过在常规用于注射 的无菌水性介质或油性介质中溶解、 悬浮或乳化上文所描述的抗体或其盐来制备可注射制 剂。 作为供注射用的水性介质， 有例如生理盐水、 含有葡萄糖和其它辅助剂的等张溶液、 等， 其可以与合适的增溶剂诸如醇 ( 例如乙醇 )、 多元醇 ( 例如丙二醇、 聚乙二醇 )、 非离子型表 面活性剂 [ 例如聚山梨酯 80、 HCO-50( 氢化蓖麻油的聚氧乙烯 (50mol) 加合物 )]、 等组合 使用。作为油性介质， 有采用例如芝麻油、 大豆油、 等， 其可以与增溶剂诸如苯甲酸苄酯、 苯 甲醇、 等组合使用。优选地， 在合适的安瓿中装满如此制备的注射剂。可以通过将上述抗体 或其盐与供栓剂用的常规基质混合来制备用于直肠施用的栓剂。
     有利地， 将上文所描述的供口服或胃肠外使用的药物组合物制备成单位剂量的剂 量形式， 其适合于配合活性组分的剂量。此类单位剂量的剂量形式包括例如片剂、 丸剂、 胶 囊、 注射剂 ( 安瓿 )、 栓剂、 等。所含有的上述抗体量一般是每单位剂量的剂量形式约 5 至 500mg ； 尤其在注射剂形式中， 优选的是以约 5 至 100mg 包含上述抗体， 而对于其它剂量形式 以约 10 至 250mg 包含上述抗体。
     上文所描述的每种组合物可以进一步含有其它活性成分， 除非配制剂引起与上文 所描述的抗体的任何不利的相互作用。
     本发明还涉及用于细胞和 / 或组织重塑的抑制剂和 / 或促进剂， 其包含 α9 整联 蛋白结合性功能分子 ( 例如 OPN、 VCAM-1、 生腱蛋白 -C、 纤连蛋白、 pp-vWF、 tTG、 等 ) 作为活 性组分 ； 和用于抑制和 / 或促进细胞和 / 或组织重塑的方法， 其包括使表达 α9 整联蛋白的 细胞和 / 或组织 ( 例如肿瘤细胞、 嗜中性粒细胞、 平滑肌、 等 ) 与 α9 整联蛋白结合性功能 分子接触。 可以通过参照包含本发明人源化抗体的药物的前述描述适当地确定此类治疗剂 中的活性组分的剂量、 施用方法、 药用制剂、 等。
     如上文所描述的， 本发明进一步提供了一种用于预防或治疗与 α9 整联蛋白有关 或牵涉 α9 整联蛋白的病症或疾病的方法， 所述方法包括对有此需要的受试者施用有效量 的至少一种本发明的人源化抗体。
     5.5. 诊断用途包含本发明的人源化抗体的药物组合物可以作为癌症 ( 例如癌细胞的生长或转 移 )， 和炎性疾病 ( 例如类风湿性关节炎、 骨关节炎、 肝炎、 支气管哮喘、 纤维化、 糖尿病、 癌症转移、 动脉硬化、 多发性硬化、 肉芽肿、 等 ) 的诊断剂， 或者作为器官移植后慢性排斥 反应、 自身免疫性疾病诸如系统性自身免疫性疾病、 系统性红斑狼疮、 葡萄膜炎、 贝切特氏 病、 多肌炎、 肾小球增殖性肾炎、 结节病、 由 α9 整联蛋白诱发的疾病状况、 等等的诊断剂使 用。本发明的人源化抗体能够特异性识别 α9 整联蛋白， 因此可以用于量化测试流体中的 α9 整联蛋白， 尤其是用于通过三明治式免疫测定法、 竞争性测定法、 免疫测量法、 肾测量法 (nephrometry)、 等、 免疫染色、 等等进行的量化。 在将这些免疫学方法应用于本发明的测定 方法时， 不需要列出任何特定的条件、 规程、 等。通过向常规的条件和规程添加本领域中普 通的技术考虑因素足以构建测定系统。 关于这些通用技术手段的详情， 可以参照综述、 教科 书、 等等。
     如上文所描述的， 可以通过使用本发明的抗体以高灵敏度量化 α9 整联蛋白。本 发明的人源化抗体特别可用于诊断与 α9 整联蛋白有关的各种疾病， 其通过应用用于在体 内量化 α9 整联蛋白的方法来实现。例如， 在检测出 α9 整联蛋白表达水平升高或降低的 情况中， 可以诊断很有可能现在患有与 α9 整联蛋白有关的疾病， 例如癌症或炎性疾病， 或 者很有可能将来会患有这些疾病。如此， 本发明还提供了一种用于在受试者中诊断与 α9 整联蛋白有关或牵涉 α9 整联蛋白的病症或疾病的方法， 所述方法包括对有此需要的受试 者施用有效量的至少一种本发明的人源化抗体或两者。 此类体内诊断需要的剂量可以小于 治疗用途所需要的， 而且可以由本领域技术人员依照常规规程确定。
     还可以使用本发明的人源化抗体来特异性检测测试流体诸如体液、 组织、 等中存 在的 α9 整联蛋白。还可以使用人源化抗体来制备用于纯化 α9 整联蛋白的抗体柱， 检测 纯化时每个级分中含有的 α9 整联蛋白或分析 α9 整联蛋白在要测试的细胞中的行为。 6. 实施例
     以下实施例例示了免疫特异性识别人和 / 或小鼠 α9 整联蛋白的单克隆抗体的制 备、 单克隆抗体的可变区的测序和抗体的其它表征及此类抗体的嵌合化和人源化， 以及所 得的嵌合和人源化抗体的表征。这些实施例不应解释为限制性的。
     6.1. 针对人 α9 整联蛋白的小鼠抗体的制备
     依照扣除免疫法 (Williams C.V. 等， 1992， Biotechniques 12 ： 842-847) 来制备 6 针对人 α9 整联蛋白的小鼠单克隆抗体。 简言之， 以每只小鼠 3x10 个给 3 只 Balb/c 小鼠腹 膜内注射表达人 α9 整联蛋白的 NIH-3T3 细胞 ( 人 α9/NIH-3T3 细胞 )。 在注射后 1 和 2 周 6 时， 给小鼠腹膜内注射 3x10 个细胞 / 小鼠的人 α9/NIH-3T3 细胞， 接着是一周后， 以 2x106 个细胞 / 小鼠再次静脉内注射相同细胞。通过本领域中公知的方法制备杂交瘤 ( 参见例如 Harlow 等， Antibodies ： A Laboratory Manual， (Cold Spring Harbor Laboratory Press， 第 2 版 1988) ； Hammerling 等， 于： Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas， 第 563 页 - 第 681 页 (Elsevier， N.Y.， 1981))。建立生成与表达人 α9 整联蛋白的人 α9/CHO-K1 细胞和内源表达人 α9 整联蛋白的人黑素瘤细胞而非表达人 α4 整联蛋白的 CHO K1 细胞 有免疫特异性反应的单克隆抗体的杂交瘤克隆， 并分离生成免疫特异性识别人 α9 整联蛋 白的单克隆抗体的杂交瘤克隆 ( 即 K33N)。6.2. 对抗人 α9 整联蛋白抗体的 CDR 分析
     通过逆转录自相应的杂交瘤提取的 mRNA 以制备 cDNA 来测定单克隆抗体 ( 即 K33N) 的 CDR 的氨基酸序列。使用 cDNA 作为模板， 使用 ScFv 克隆引物 ( 轻链引物混合物和 重链引物混合物 ； Amersham Biosciences Corp.， IL) 通过 PCR 来延伸并扩增 H 链和 L 链的 可变区。将 PCR 产物克隆入 pCRII TOPO 载体中， 测序， 并确定氨基酸序列。将此过程重复 三次。表 1 中显示了结果。
     表1
     CDR CDRH1 CDRH2 CDRH3 CDRL1 CDRL2 CDRL3
     氨基酸序列 SYYMN WIFPGSGNTKYNEKFKG SWVSYERGYYFDY RASENIYYSLA NANSLED KQAYDVPYT SEQ ID NO ： 4 5 6 11 12 136.3. 细胞粘附抑制活性
     (1) 因为已知细胞粘附牵涉 α9 整联蛋白与其配体， 即各种 ECM( 包括 OPN、 纤连蛋 白、 生腱蛋白 -C、 VCAM-1、 等等 ) 的结合， 通过使用表达人 α9 整联蛋白的细胞 ( 人黑素瘤 G361 细胞 ) 与配体的结合来对分离的抗人 α9 整联蛋白抗体检查其细胞粘附抑制活性。
     简言之， 以牛血清清蛋白 (BSA)- 融合 SVVYGLR(SEQ ID NO ： 2) 肽来制备 OPN 肽。 通过在大肠杆菌宿主细胞中表达， 以人生腱蛋白 C 中的纤连蛋白 III 型重复的第三区制备 TN-C fn3(RAA)， 其中已经用 RAA 序列替换该肽的 GRD 序列。
     以 5μg/mL 将 OPN 肽和生腱蛋白 C 片段 (TN-C fn3(RAA)) 添加至 96 孔板， 并于 37℃温育 1 小时以包被平板， 然后用封闭溶液 (0.5％ BSA/PBS) 封闭平板。 将人黑素瘤 G361 5 细胞在 0.25％ BSA/DMEM 中悬浮 (1x10 个细胞 /mL)， 并将每个浓度的抗人 α9 整联蛋白抗 体添加至细胞悬浮液。将 0.25％ BSA/DMEM 中的人黑素瘤 G361 细胞 (1x105 个细胞 /mL) 和 抗体的混合物以 200μL/ 孔添加至 96 孔板， 并于 37℃在 5％ CO2 下温育 1 小时。用 PBS 洗 去非粘附细胞， 将粘附细胞固定， 并用 0.5％结晶紫 (WAKO， Osaka， Japan)/20％甲醇染色。 用蒸馏水将经染色的细胞清洗三次， 然后向其添加 20％乙酸溶液以实现溶解。通过测量 590nm 波长的 OD 来量化粘附活性。使用抗人 OPN 单克隆抗体 (5A1) 作为阴性对照和先前制 备的抗人 α9 整联蛋白抗体 (1K11、 21C5、 24I11、 25B6 和 28S1) 作为阳性对照。
     图 1 中显示了抗人 α9 整联蛋白抗体对 G361 细胞结合 OPN 肽的影响， 而图 2 中显 示了抗人 α9 整联蛋白抗体对 G361 细胞结合生腱蛋白 C 片段的影响。如图 1 中所显示的， 牵涉 OPN 的细胞粘附受与阳性对照 21C5 和 24I11 相比低浓度的和与 Y9A2 相同浓度的 K33N 抑制。牵涉生腱蛋白 C 的细胞粘附受低浓度的和与 Y9A2 相同浓度的 K33N 抑制， 抑制效果显著强于阳性对照 21C5 和 24I11。
     6.4. 非人抗体的人源化
     6.4.1. 小鼠 K33N V 基因的克隆和测序
     将小鼠 K33N 杂交瘤细胞在含有 10％胎牛血清 (FBS ； HyClone， Logan， UT) 的 TIL 培养基 I(Immuno-Biological Laboratories， Gunma， Japan) 中于 37℃在 7.5％ CO2 培养箱 中培养。使用 TRIzol 试剂 (Invitrogen， Carlsbad， CA) 依照供应商的方案自约 107 个杂 交瘤细胞提取总 RNA。使用 GeneRacer 试剂盒 (Invitrogen) 遵循供应商的方案来合成寡 聚 dT 引发的 cDNA。使用分别与小鼠 γ-1 和 κ 链恒定区退火的 3’ 引物和 GeneRacer 试 剂盒中提供的 GeneRacer 5’ 引物 (5’ -CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3’ )(SEQ ID NO ： 51) 用 Phusion DNA 聚合酶 (New England Biolabs， Beverly， MA) 通过聚合酶链式反应 (PCR) 来 扩增 K33N 重链和轻链的可变区 cDNA。为了重链可变区 (VH) 的 PCR 扩增， 3’ 引物具有序 列 5’ -GCCAGTGGATAGACAGATGG-3’ (SEQ ID NO ： 52)。为了轻链可变区 (VL) 的 PCR 扩增， 3’ 引物具有序列 5’ -GATGGATACAGTTGGTGCAGC-3’ (SEQ ID NO ： 53)。将扩增的 VH 和 VL cDNA 亚克隆入 pCR4Blunt-TOPO 载体 (Invitrogen) 中以进行序列测定。可变区的 DNA 测序在 Tocore(Menlo Park， CA) 实施。对数个重链和轻链克隆测序， 并鉴定与典型的小鼠重链和 轻链可变区同源的独特序列。图 3 和图 4 中分别显示了 K33N VH 和 VL 的共有 cDNA 序列及 推导的氨基酸序列。
     6.4.2. 嵌合 K33N IgG1/κ 抗体的构建
     使 用 K33N VH cDNA 作 为 模 板、 5’-GGGACTAGTACCACCATGGGATG GAGCTGGATCTTTCTC-3’ (SpeI 位点加下划线 )(SEQ ID NO ： 40) 作为 5’ 引物、 和 5’ -GGGAAG CTTGTTTTAAGGACTCACCTGAGGAGACTCTGAGACTG GTGCC-3’ (SEQ ID NO ： 41)(HindIII 位点加 下划线 ) 作为 3’ 引物通过 PCR 以包含剪接供体信号和合适的侧翼限制酶位点的外显子生 成编码 K33N VH 的基因 ( 图 5)。类似地， 使用 K33N VL cDNA 作为模板、 5’ -GGGGCTAGCACCA CCATGAGTGTGCCCACTCAACTCCTG-3’ (SEQ ID NO ： 42)(NheI 位点加下划线 ) 作为 5’ 引物、 和 5’ -GGGGAATTCTGAGAAGAC TACTTACGTTTTATTTCCAGCTTGGTCCCCCC-3’ (SEQ ID NO ： 43)(EcoRI 位点加下划线 ) 作为 3’ 引物通过 PCR 以包含剪接供体信号和合适的侧翼限制酶位点的外显 子生成编码 K33N VL 的基因 ( 图 6)。K33N VH 和 VL 外显子的剪接供体信号分别衍生自小 鼠种系 JH4 和 Jκ2 序列。使用 QIAquick 凝胶提取试剂盒 (Qiagen， Valencia， CA) 将 PCR 扩增的片段进行凝胶纯化， 用 SpeI 和 HindIII( 对于 VH) 或 NheI 和 EcoRI( 对于 VL) 将其 消化， 并克隆入携带人 γ-1 和 κ 恒定区的哺乳动物表达载体中以生成嵌合 K33N IgG1/κ 抗体。图 7 中显示了所得的表达载体 pChK33N 的示意结构。
     6.4.3. 人源化 K33N V 基因的生成
     如由 Queen 等 (Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86 ： 10029-10033， 1989) 所概述的那样 实施 K33N 可变区的人源化。首先， 借助于计算机程序来构建 K33N 可变区的分子模型。接 着， 基于针对人可变区序列的同源性搜索， 选择自 DA980102(GenBank 登录号 ) 衍生的人氨 基酸序列 ( 其与 K33N VH 具有高度同源性 ) 作为接受体以为人源化 K33N VH 提供框架。 小鼠 K33N 与 DA980102 VH 区之间的框架氨基酸同一性是 74.7％ (65/87)。类似地， 选择 X72441(GenBank 登录号 ) 的人氨基酸序列作为接受体以使 K33N VL 人源化。小鼠 K33N 和 X72441VL 区之间的框架氨基酸同一性是 76.3％ (61/80)。在计算机模型提示了与互补决定区 (CDR) 的显著接触的框架位置处， 用来自 K33N 可变区的氨基酸替换人框架氨基酸。这在第 28 位、 第 48 位、 第 66 位、 第 67 位和第 71 位 进行以生成人源化 K33N(HuK33N)VH( 图 8)。另外， 发现人 DA980102 接受体的第 82 位处的 Met 在人 VH 序列的相同亚组中是非典型的， 因此用最常见的氨基酸残基 (Leu) 替换以降低 潜在的免疫原性。对于轻链， 在残基 70 和 71 处进行替换以生成 HuK33N VL( 图 9)。图 8 中 对 VH 和图 9 中对 VL 显示了 K33N( 称作 HuK33N) 与人接受体氨基酸序列的比对。
     将编码 HuK33N VH 和 VL 之每种的基因设计为包含信号肽、 剪接供体信号、 和合适 的限制酶位点 ( 用于随后将其克隆入哺乳动物表达载体中 ) 的外显子。HuK33N VH 和 VL 外 显子的剪接供体信号分别衍生自人种系 JH4 和 Jκ1 序列。通过 SIG-Pred 信号肽预测软件 (http://bmbpcu36.leeds.ac.uk/prot_analysis/Signal.html) 指明小鼠 K33N VH 基因的 信号肽序列对于精确切割是亚最佳的。因此， 在 HuK33N VH 基因中使用小鼠抗人 α9 整联 蛋白单克隆抗体 24I11(Gene Techno Scienee) 的 VH 基因的信号肽序列， 其通过 SIG-Pred 软件预测为被有效且精确切割。人源化 K33N VL 外显子中的信号肽序列衍生自相应的小鼠 K33N VL 序列。SIG-Pred 软件指明 HuK33N VL 基因的信号肽被有效且精确切割。
     使用 ThermalAce DNA 聚合酶 (Invitrogen) 通过数种交叠的合成寡核苷酸引物的 延伸和 PCR 扩增来构建 HuK33N VH 和 VL 基因， 如由 He 等 (J.Immunol.160 ： 1029-1035， 1998) 所概述的。图 10 和图 11 中分别列出了用于构建 HuK33NVH 和 VL 基因的寡核苷酸。图 12 和图 13 中分别显示了寡核苷酸在 HuK33N VH 和 VL 基因中的位置。使用 QIAquick 凝胶提 取试剂盒 (Qiagen) 来将 PCR 扩增的片段进行凝胶纯化， 并将其克隆入 pCR4Blunt-TOPO 载 体中以进行序列测定。用 SpeI 和 HindIII( 对于 VH) 或 NheI 和 EcoRI( 对于 VL) 消化后， 将 HuK33NVH 和 VL 基因亚克隆入哺乳动物表达载体中的相应位点中以便以人 IgG1/κ 形式 生成。图 7 中显示了所得的表达载体 pHuK33N 的示意结构。图 14 和图 15 中分别显示了所 获得的 HuK33N VH 和 VL 基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列。
     6.4.4. 嵌合的和人源化的 K33N IgG1/κ 的瞬时表达
     依 照 Durocher 等 (Nucl.Acids Res.30 ： e9， 2002) 使 用 聚 乙 烯 亚 胺 来 分 别 将 pChK33N 和 pHuK33N 质粒 DNA 转染至 HEK293 细胞， 从而瞬时表达嵌合的和人源化的 K33N IgG1/κ 抗体。 将经瞬时转染的 HEK293 细胞在含有 10％ FBS 的 DMEM 中于 37℃在 7.5％ CO2 培养箱中维持 4 天。通过三明治式 ELISA 来测量培养物上清液中 ChK33N 和 HuK33N IgG1/ κ 抗体之每种的表达水平。用 100μl/ 孔 PBS 中 1/2,000 稀释的山羊抗人 IgG Fcγ 链特 异性多克隆抗体 (SouthernBiotech， Birmingham， AL) 于 4℃包被 ELISA 板过夜， 用清洗缓冲 液 ( 含有 0.05％ Tween 20 的 PBS) 清洗， 并用 300ul/ 孔的封闭缓冲液 ( 含有 2％脱脂奶和 0.05％ Tween 20 的 PBS) 于室温封闭 1 小时。用清洗缓冲液清洗后， 将 100μl/ 孔在 ELISA 缓冲液 ( 含有 1％脱脂奶和 0.025％ Tween 20 的 PBS) 中适当稀释的样品应用于 ELISA 板。 使用自人骨髓瘤血清纯化的人 IgG1/κ 抗体 (SouthernBiotech) 作为标准品。于室温将 ELISA 板温育 2 小时并用清洗缓冲液清洗后， 使用 100μl/ 孔的 1/2,000 稀释的偶联有 HRP 的山羊抗人 κ 链多克隆抗体 (SouthernBiotech) 来检测所结合的抗体。于室温温育 1 小 时并用清洗缓冲液清洗后， 通过添加 100μl/ 孔的 ABTS 底物 (bio WORLD， Dublin， OH) 来进 行显色。通过添加 100μl/ 孔的 2％草酸来停止显色。以 405nm 读取吸光度。
     通过细胞 ELISA 来检查瞬时表达的 ChK33N 和 HuK33N 抗体对人 α9 整联蛋白的结合。 将在表面上表达重组人 α9 整联蛋白的 CHO-K1 稳定转染子 (CHO/huα9 ； 由 Gene Techno 5 Science 提供 ) 以 2x10 个细胞 / 孔在 50μl 含有 10％ FBS 的 F12/DMEM(HyClone) 中在 96 孔 组织培养板中接种， 并于 37℃在 7.5％ CO2 培养箱中培养过夜。 为了测试对人 α9 整联蛋白 的结合， 将 50μl 含有 10％ FBS 的 F12/DMEM 中的 ChK33N、 HuK33N 或无关的人 IgG1/κ 骨髓 瘤抗体 (SouthernBiotech) 添加至每孔。 于 4℃温育 1 小时并用冰冷的 PBS 将细胞清洗两次 后， 将 100μl 1/1,000 稀释的偶联有 HRP 的山羊抗人 IgG 多克隆抗体 (SouthernBiotech) 添加至每孔。于 4℃温育 1 小时后， 用冰冷的 PBS 将细胞清洗三次。为了显色， 添加 100μl ABTS 底物。通过添加 100μl 2％草酸来停止显色。以 405nm 读取吸光度。结果显示了在 0.5 和 1μl/ml 两者， ChK33N 抗体对人 α9 整联蛋白的结合几乎与 HuK33N 抗体对人 α9 整 联蛋白的结合相同 ( 图 16)。
     6.4.5. 生成 ChK33N 和 HuK33N IgG1/κ 抗体之每种的 NS0 稳定转染子的生成
     为了获得稳定生成 ChK33N 和 HuK33N IgG1/κ 抗体的细胞系， 分别将表达载体 pChK33N 和 pHuK33N 导入小鼠骨髓瘤细胞系 NS0( 欧洲动物细胞培养物保藏中心 (European Collection of Animal Cell Cultures)， Salisbury， Wiltshire， UK) 的染色体中。将 NS0 细胞在含有 10％ FBS 的 DME 培养基中于 37℃在 7.5％ CO2 培养箱中培养。通过电穿孔来实 施进入 NS0 中的稳定转染， 如 Bebbington 等 (Bio/Technology 10 ： 169-175， 1992) 中所记 载的。转染前， 使用 FspI 来使表达载体线性化。用 10μg 线性化质粒转染约 107 个细胞， 将 其在含有 10％ FBS 的 DME 培养基中悬浮， 并分配入数块 96 孔板中。24 小时后， 应用选择培 养基 ( 含有 10％ FBS、 HT 培养基补充物 (Sigma， St.Louis， MO)、 0.25mg/ml 黄嘌呤和 1μg/ ml 霉酚酸的 DME 培养基 )。启动选择后约 10 天， 对培养物上清液测定抗体生成。
     通过三明治式 ELISA 本质上依照 6.4.3 一节中所描述的规程来测量 ChK33N 和 HuK33N IgGl/κ 抗体的表达。使用杂交瘤 SFM(Invitrogen) 来使生成高水平 ChK33N 抗 体的 NS0 稳定转染子 (NS0-ChK33N 3D11) 适应于在无血清培养基中的生长。通过有限稀 释将生成高水平 HuK33N 抗体的 NS0 稳定转染子在 96 孔板中进一步亚克隆。使亚克隆之 一 (NS0-HuK33N 8G8-11) 适应于在杂交瘤 SFM 中生长。用 PCR 枝原体检测组 (Takara Bio USA， Madison， WI) 进行的测试指明， NS0-ChK33N 3D11 和 NS0-HuK33N 8G8-11 两者在枝原 体存在方面呈阴性。
     通 过 cDNA 测 序 来 确 认 NS0-HuK33N 6D5-11 中 生 成 的 HuK33N 重 链 和 轻 链 的 真 实 性。 使 用 TRIzol 试 剂 (Invitrogen) 自 NS0-HuK33N 6D5-11 细 胞 提 取 总 RNA， 并使用 GeneRacer 试剂盒 (Invitrogen) 遵循制造商的方案来合成寡聚 dT 引发的 cDNA。使用 CMV2 和 JNT098 作为引物 ( 图 17) 和 Phusion 聚合酶 (New England Biolabs) 通过 PCR 扩增 γ-1 重链的编码区。将 PCR 片段进行凝胶纯化， 并用 CMV2、 JNT082、 JNT097 和 JNT098 作为引物 用 CMV2、 ( 图 17) 进行测序。 类似地， 使用 CMV2 和 JNT026( 图 17) 来扩增 κ 轻链的编码区。 JNT026、 JNT080 和 JNT084 作为引物 ( 图 17) 对凝胶纯化的 DNA 片段进行测序。HuK33N 重 链和轻链之每种的编码区获得的核苷酸序列与 pHuK33N 载体中的相应序列完全匹配 ( 分别 为图 18 和图 19)。
     6.4.6.ChK33N 和 HuK33N 抗体的纯化
     将 NS0-ChK33N 3D11 和 NS0-HuK33N 8G8-11 细胞在滚瓶中在杂交瘤 SFM 中培养 至耗尽。离心并过滤后， 将培养物上清液加载至蛋白 A Sepharose 柱 (GE Healthcare，Piscataway， NJ) 上。用 PBS 清洗柱， 之后用 0.1M 甘氨酸 -HCl(pH 3.0) 洗脱抗体。用 1M Tris-HCl(pH 8) 中和后， 通过透析将洗脱抗体的缓冲液更换成 PBS。 通过测量 280nm 的吸光 度来测定抗体浓度 (1mg/ml ＝ 1.4 个 OD)。 NS0-ChK33N 3D11 细胞的抗体表达水平是 50μg/ ml， 而 NS0-HuK33N8G8-11 细胞的抗体表达水平是 12μg/ml。
     通过 SDS-PAGE 依照标准的规程来表征纯化的 ChK33N 和 HuK33N 抗体。还原条件 下的分析指明 ChK33N 和 HuK33N 抗体之每种由具有约 50kDa 分子量的重链和具有约 25kDa 分子量的轻链构成 ( 图 20)。每种抗体的纯度表现为超过 95％。
     6.4.7.ChK33N 和 HuK33N 抗体的表征
     在用 CHO/huα9 细胞进行的 FACS 结合测定法中检查小鼠的、 嵌合的和人源化的 K33N 抗体对人 α9 整联蛋白的结合。用 FACS 结合缓冲液 ( 含有 0.5％ BSA 和 0.05％ NaN3 的 PBS) 清洗约 5x105 个 CHO/huα9 细胞 / 测试， 并在 200μl 含有多个量的测试抗体的 FACS 结合缓冲液中悬浮。在冰上 30 分钟后， 用 FACS 结合缓冲液清洗细胞。然后， 将用小鼠 K33N 染色的细胞在 100μl FACS 结合缓冲液中 1/200 稀释的经 FITC 标记的山羊抗小鼠 IgG 多 克隆抗体 (SouthernBiotech) 中悬浮。 将用嵌合或人源化 K33N 染色的细胞在 100μl FACS 结合缓冲液中 1/200 稀释的经 FITC 标记的山羊抗人 IgG 多克隆抗体 (SouthernBiotech) 中悬浮。在冰上 30 分钟后， 将细胞用 FACS 结合缓冲液清洗， 在 200μl FACS 结合缓冲液中 悬浮， 并使用 FACScan 流式细胞仪 (BD Biosciences， Franklin Lakes， NJ) 来分析。小鼠 K33N 抗体结合 CHO/huα9 细胞的 EC50 值是 104ng/ml( 图 21)。在 ChK33N 和 HuK33N 抗体 之间， 结合样式彼此非常相似 ( 图 22)。另外， ChK33N 和 HuK33N 抗体的 EC50 值彼此几乎相 同 (ChK33N 抗体为 143ng/ml， 而 HuK33N 抗体为 151ng/ml)。此结果指明小鼠 K33N 抗体在 不损失抗原结合亲和力的情况中成功人源化。
     6.4.8. 细胞粘附测定法
     用 50μL 5μg/mL hTNC(AEIDGIEL)-BSA 溶液于 37℃在 CO2 培养箱中将 96 孔平底 微量滴定板 (Nunc) 包被 1 小时。用 50μL 5μg/mL BSA 溶液包被对照孔。包被反应后， 用 200μL 0.5w/v％ BSA( 封闭 ) 溶液更换孔中的溶液， 并于室温温育 1 小时。封闭反应后， 用 PBS 清洗孔。将 150μL 含有 0.25w/v％ BSA 的 TIL 培养基中悬浮的 2.5x105 个细胞 /mL G-361 细胞和 50μL 测试抗体溶液 (0.25w/v％ BSA/TIL) 在孔中分配， 并于 37℃在 CO2 培养 箱中温育 1 小时。温育后， 用 PBS 溶液将每孔小心清洗三次以除去非粘附细胞。添加 50μL 0.5w/v％结晶紫溶液以将粘附细胞固定并染色。30 分钟后， 通过用一盆水清洗三次来除去 过量的染料， 并用 50μL 20v/v％乙酸溶解孔中的染料。使用吸收分光光度计来测量每孔 在 595nm 的吸光度。通过下式计算细胞粘附抑制率 ； (1-(A-B)/(C-B))x100(％ )。A ： 在存 在抗体的情况中用 hTNC-BSA 包被的孔的吸光度， B： 在没有任何测试抗体的情况中用 BSA 包 被的孔的吸光度， C： 在存在正常人 IgG( 阴性对照 ) 的情况中用 hTNC-BSA 包被的孔的吸光 度 ( 图 23)。
     结果
     Y9A2 的 IC50 是 0.053μg/ml(95 ％ CI ： 0.032-0.089)。K33N、 ChK33N 和 HuK33N 的 IC50 分 别 是 0.075μM(0.053-0.106)、 0.090μg/ml(0.063-0.128)、 0.084μg/ ml(0.055-0.129)， 指明测试抗体的 IC50 值与 Y9A2 的 IC50 值在相同水平上。
     7. 保藏本文中称为 K33N 的生成小鼠抗人 α9 整联蛋白单克隆抗体的杂交瘤依照微生 物保藏布达佩斯条约于 2007 年 5 月 29 日保藏于位于中心 6， 1-1-1Higashi， Tsukuba， Ibaraki( 邮 政 编 码 ： 305-8566) 的 国 际 专 利 生 物 体 保 藏 中 心 (International Patent Organisms Depository)， 国 家 先 进 工 业 科 学 技 术 研 究 所 (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology)， 并记录为登录号 FERM BP-10830， 通过提 及而将其完整收入本文。
     8. 工业实用性
     本发明的人源化单克隆抗体抑制 α9 整联蛋白的功能以对癌症， 例如癌细胞的生 长或转移， 和炎性疾病， 例如类风湿性关节炎、 骨关节炎、 肝炎、 支气管哮喘、 纤维化、 糖尿 病、 癌症转移、 动脉硬化、 多发性硬化、 肉芽肿、 炎性肠病 ( 溃疡性结肠炎和克罗恩氏病 )、 自 身免疫性疾病、 等等展现出治疗效果。
     9. 序列表
     下文汇总了贯穿整个说明书所提及的序列。
     本发明涉及免疫特异性识别人 α9 整联蛋白的人源化抗体及其对与 α9 整联蛋白 有关或牵涉 α9 整联蛋白的各种疾病或病症 ( 包括癌症、 炎性疾病、 自身免疫性疾病、 由 α9 整联蛋白诱发的疾病状况、 等等 ) 的治疗和诊断用途。 2. 背景技术
     由一组称作整联蛋白的细胞表面受体介导， 细胞粘附于胞外基质 ( 下文缩写为 ECM)。整联蛋白通过形成 α 和 β 链的 1 ∶ 1 异二聚体来执行其功能。迄今为止， 已经鉴定 并确认至少 18 类 α 链、 8 类 β 链和 24 类 αβ 异二聚体。已知每种整联蛋白识别一种特 定的配体。 整联蛋白根据其配体特异性或功能而分类入亚家族中， 并分成胶原受体、 层粘连 蛋白受体、 识别存在于纤连蛋白、 玻连蛋白、 等中的 Arg-Gly-Asp(RGD) 序列的 RGD 受体、 和 仅存在于白细胞中的白细胞特异性受体 (Hynes， R.O.， 2002， Integrins ： Bidirectional， Allosteric Signaling Machines.Cell 110 ： 673-87 ； Miyasaka， M.， 2000， New edition of Adhesion Molecule Handbook， Shujunsya)。α4 和 α9 整联蛋白是不属于任何这些类 型并称作 α4 整联蛋白亚家族的亚家族的成员 (Elise L.Palmer， Curzio Rfiegg， Ronald Ferrando， Robert Pytela， Sheppard D.， 1993， Sequence and Tissue Distribution of the Integrin α9 Subunit， a Novel Partner of β1 That Is Widely Distributed in Epithelia and Muscle.The Journal of Cell Biology， 123 ： 1289-97)。同时， 迄今为止， 过去认为 ECM 仅充当细胞间的粘合物质。现在已经变得清楚的是， 整联蛋白介导的 ECM- 细 胞相互作用显著牵涉调节细胞的生长、 粘附、 运动、 等， 而且与疾病的发作 ( 包括癌症的进 展、 炎症的恶化、 等 ) 有关。
     例如， 作为 ECM 之一的骨桥蛋白 ( 下文缩写为 OPN) 是一种具有约 41kDa 分子量的 分泌性、 酸性磷酸化糖蛋白， 而且是一种在母乳、 尿液、 肾小管、 破骨细胞、 成骨细胞、 巨噬细 胞、 激活的 T 细胞、 肿瘤组织、 等等中广泛观察到其表达的分子。OPN 具有粘附序列， 即在其 分子中央的 GRGDS(SEQ IDNO ： 1)、 在人 OPN 中的 SVVYGLR(SEQ ID NO ： 2) 序列或小鼠 OPN 中 的 SLAYGLR(SEQ ID NO ： 3) 序列， 和与其极其接近的凝血酶切割位点， 并经由 GRGDS(SEQ ID NO ： 1) 序列结合 RGD 整联蛋白或经由 SVVYGLR(SEQ IDNO ： 2) 序列或 SLAYGLR(SEQ ID NO ： 3) 序列结合 α4(α4β1) 和 α9(α9β1) 整联蛋白。
     WO 02/081522 披露了使用 OPN 敲除小鼠或针对 OPN 的中和性抗体通过抑制 OPN 功 能实现的对类风湿性关节炎或肝炎的治疗效果。此外， 此公开文本披露了 SVVYGLR(SEQ ID NO ： 2) 序列由于识别 α9 和 α4 整联蛋白而对于炎性疾病的发病机制是至关重要的， 并且 OPN 的受体在免疫活性细胞等等中表达且与炎性疾病有关。
     已经找到了结合谱的差异， 其在于 α4β1 既结合未经凝血酶切割的 OPN( 未切割 的 OPN) 又结合经凝血酶切割的 OPN( 经切割的 OPN) 的 N 端片段， 而 α9β1 仅结合经切割 的 OPN(Y.Yokosaki 等， (1999)The Journal of Biological Chemistry， 274 ： 36328-36334 ； P.M.Green 等， (2001)FEBS Letters， 503 ： 75-79 ； S.T.Barry 等， (2000)Experimental CellResearch， 258 ： 342-351)。
     除 了 OPN 以 外， α4 和 α9 整 联 蛋 白 共 享 许 多 共 同 配 体。 已 知 的 配 体 有 纤 连 蛋 白 的 EDA 域、 前 肽 -von Willebrand 因 子 (pp-vWF)、 组 织 转 谷 氨 酰 胺 酶 (tTG)、 血液 凝 固 因 子 XIII、 血 管 细 胞 粘 附 分 子 -1(VCAM-1) 等。 另 外， 已 知 纤 连 蛋 白 的 CS-1 域、 MadCAM-1(α4β7)、 等为受到 α4 整联蛋白特异性识别的配体。已知生腱蛋白 -C、 纤溶酶、 等为受到 α9 整联蛋白特异性识别的配体。
     整联蛋白亚基 α9、 α4 和 β1 的氨基酸序列是众所周知的。例如， 在 GenBank， 人 α9 登记为 NM_002207， 小鼠 α9 为 NM_133721， 人 α4 为 NM_000885， 小鼠 α4 为 NM_010576， 人 β1 为 X07979， 而小鼠 β1 为 NM_010578。还已知这些整联蛋白在氨基酸序列方面在物 种间具有高度相似性。
     3. 发明概述
     虽然目前已知许多用于治疗癌症、 炎性疾病和自身免疫性疾病的药物， 但是期望 开发出对癌症、 炎性疾病和自身免疫性疾病具有更为改善的治疗效果的预防和 / 或治疗剂 等。本发明部分基于本发明人的发现， 即针对 α9 整联蛋白的特异性抑制性抗体具有抑癌 和消炎效果。 先前， 本发明人分离出免疫特异性识别人 α9 整联蛋白并由杂交瘤克隆 K33N( 保 藏登录号 FERM BP-10830) 生成的小鼠单克隆抗体。在本文中， 该杂交瘤克隆名称与由该克 隆生成的单克隆抗体的名称可互换使用。 小鼠抗人 α9 整联蛋白抗体是 IgG1 同种型的。 该 单克隆抗体抑制人和 / 或小鼠 α9 整联蛋白与 α9 整联蛋白的配体， 诸如骨桥蛋白之间的 结合。如此， 该抗 α9 整联蛋白抗体抑制 α9 整联蛋白的功能， 而且对癌症， 例如癌细胞的 生长或转移， 和对炎性疾病， 例如类风湿性关节炎、 骨关节炎、 肝炎、 支气管哮喘、 纤维化、 糖 尿病、 动脉硬化、 多发性硬化、 肉芽肿、 炎性肠病 ( 溃疡性结肠炎和克罗恩 (Crohn) 氏病 )、 自 身免疫性疾病、 由 α9 整联蛋白诱发的疾病状况、 等等展现出治疗效果。
     此外， 本发明的抗 α9 整联蛋白抗体可以作为体内诊断剂用于检测受试者中的 α9 整联蛋白表达的存在和水平， 由此诊断牵涉 α9 整联蛋白的病症或疾病。
     然而， 因为该单克隆抗体是小鼠起源的， 其在人中的免疫原性所致的可能的不利 影响已经阻碍了其直接应用于人的诊断或治疗用途。为了降低免疫原性， 本发明人已经制 备了人源化抗体， 其具有与衍生所述人源化抗体的初始小鼠抗 α9 整联蛋白抗体展现的生 物学活性对应的生物学活性。
     因而， 本发明提供了免疫特异性识别人 α9 整联蛋白的人源化抗体或其抗原结合 片段， 所述抗体包含部分自非人起源衍生和部分自人起源衍生的抗原结合区。在一个具体 的实施方案中， 本发明的人源化抗体或其抗原结合片段包含自非人来源 ( 供体 )， 诸如 K33N 单克隆抗体衍生的互补决定区 (CDR) 和自人来源 ( 接受体 ) 衍生的框架区 (FR)。在一个实 施方案中， 所述人源化抗体或其抗原结合片段抑制人 α9 整联蛋白与人 α9 整联蛋白的配 体之间的结合。
     在一个具体的实施方案中， 所述免疫特异性识别人 α9 整联蛋白的人源化抗体或 其抗体结合片段包含 ： (i) 重链 (H 链 )， 其包含至少一种自人 H 链的可变区 (V 区 ) 衍生的 H 链 FR(FRH) 和至少一种自免疫特异性识别人 α9 整联蛋白的非人抗体 K33N 的至少一种 CDRH 衍生的 H 链互补决定区 (CDRH) ； 或 (ii) 轻链 (L 链 )， 其包含至少一种自人 L 链的 V
     此外， 本发明的抗 α9 整联蛋白抗体可以作为体内诊断剂用于检测受试者中的 α9 整联蛋白表达的存在和水平， 由此诊断牵涉 α9 整联蛋白的病症或疾病。
     然而， 因为该单克隆抗体是小鼠起源的， 其在人中的免疫原性所致的可能的不利 影响已经阻碍了其直接应用于人的诊断或治疗用途。为了降低免疫原性， 本发明人已经制 备了人源化抗体， 其具有与衍生所述人源化抗体的初始小鼠抗 α9 整联蛋白抗体展现的生 物学活性对应的生物学活性。
     因而， 本发明提供了免疫特异性识别人 α9 整联蛋白的人源化抗体或其抗原结合 片段， 所述抗体包含部分自非人起源衍生和部分自人起源衍生的抗原结合区。在一个具体 的实施方案中， 本发明的人源化抗体或其抗原结合片段包含自非人来源 ( 供体 )， 诸如 K33N 单克隆抗体衍生的互补决定区 (CDR) 和自人来源 ( 接受体 ) 衍生的框架区 (FR)。在一个实 施方案中， 所述人源化抗体或其抗原结合片段抑制人 α9 整联蛋白与人 α9 整联蛋白的配 体之间的结合。
     在一个具体的实施方案中， 所述免疫特异性识别人 α9 整联蛋白的人源化抗体或 其抗体结合片段包含 ： (i) 重链 (H 链 )， 其包含至少一种自人 H 链的可变区 (V 区 ) 衍生的 H 链 FR(FRH) 和至少一种自免疫特异性识别人 α9 整联蛋白的非人抗体 K33N 的至少一种 CDRH 衍生的 H 链互补决定区 (CDRH) ； 或 (ii) 轻链 (L 链 )， 其包含至少一种自人 L 链的 V
     区衍生的 L 链 FR(FRL) 和至少一种自免疫特异性识别人 α9 整联蛋白的非人抗体 K33N 的 至少一种 CDRL 衍生的 L 链互补决定区 (CDRL) ； 或上文的 (i) 和 (ii) 两者。例如， 所述非 人抗体 ( 其衍生本发明的人源化抗体的至少一种 CDRH 和 / 或至少一种 CDRL) 是由登录号 FERMBP-10830 的杂交瘤生成的单克隆抗体。
     在一个优选的具体实施方案中， 本发明的人源化抗体或其抗原结合片段包含 ： (i) 至少一种自人 FRH 衍生的 FRH 和至少一种包含选自氨基酸序列 SEQID NO ： 4、 5 和 6 的氨基 酸序列的 CDRH ； 或 (ii) 至少一种自人 FRL 衍生的 FRL 和至少一种包含选自氨基酸序列 SEQ ID NO ： 11、 12 和 13 的氨基酸序列的 CDRL ； 或 (iii) 上文的 (i) 和 (ii) 两者。本发明的所 述人源化抗体或其抗原结合片段可以包含 CDRH1、 CDRH2 和 CDRH3， 它们分别包含氨基酸序 列 SEQ IDNO ： 4、 5 和 6。在备选中， 本发明的所述人源化抗体或其抗原结合片段包含 CDRL1、 CDRL2 和 CDRL3， 它们分别包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 11、 12 和 13。 在一个优选的实施方案 中， 本发明的所述人源化抗体或其抗原结合片段包含 CDRH1、 CDRH2、 CDRH3、 CDRL1、 CDRL2 和 CDRL3， 它们分别包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 4、 5、 6、 11、 12 和 13。在另一个备选中， 本发明 的所述人源化抗体或其抗原结合片段包含自由 GenBank 登录号 DA980102(SEQ ID NO ： 18) 编码的人 H 链的可变区衍生的 FRH， 或自由 GenBank 登录号 X72441(SEQ ID NO ： 23) 编码的 人 κ-L 链的可变区衍生的 FRL。在一个优选的实施方案中， 本发明的人源化抗体的 FRH 包 含至少一种选自氨基酸序列 SEQID NO ： 19、 20、 21 和 22( 分别由 DA980102 的相应部分编码 的 FRH1、 FRH2、 FRH3 和 FRH4) 的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中， 本发明的人源 化抗体的 FRL 包含至少一种选自氨基酸序列 SEQ ID NO ： 24、 25、 26 和 27( 分别由 X72441 的 相应部分编码的 FRL1、 FRL2、 FRL3 和 FRL4) 的氨基酸序列。在一个更优选的实施方案中， 本发明的人源化抗体或其抗原结合片段包含 ： (i)H 链可变区 (VH 区 )， 其包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 29 ； 或 (ii)L 链可变区 (VL 区 )， 其包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 31 ； 或 (iii) 上 文的 (i) 和 (ii) 两者。在一个最优选的实施方案中， 本发明的人源化抗体或其抗原结合片 段包含 ： (i)γ-1H 链， 其包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 37 ； 或 (ii)κL 链， 其包含氨基酸序列 SEQID NO ： 39 ； 或 (iii) 上文的 (i) 和 (ii) 两者。
     本发明进一步提供了一种分离的核酸分子， 其包含编码免疫特异性识别人 α9 整 联蛋白的本发明人源化抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。具体地， 本发明提供了一种 分离的核酸分子， 其包含编码包含至少一种选自 SEQID NO ： 4、 5 和 6 的氨基酸序列的人源化 H 链， 或包含至少一种选自 SEQ IDNO ： 11、 12 和 13 的氨基酸序列的人源化 L 链， 或所述人源 化 H 链和所述人源化 L 链两者的核苷酸序列。在一个优选的具体实施方案中， 此类分离的 核酸分子包含核苷酸序列 SEQ ID NO ： 28( 其编码 VH 区 ) 或编码氨基酸序列 SEQ IDNO ： 29 的核苷酸序列。在另一个优选的具体实施方案中， 此类分离的核酸分子包含核苷酸 SEQ ID NO ： 30( 其编码 VL 区 ) 或编码氨基酸序列 SEQ ID NO ： 31 的核苷酸序列。在又一个优选的 具体实施方案中， 本发明的分离的核酸分子包含核苷酸序列 SEQ ID NO ： 28 和 30 两者。在 一个优选的具体实施方案中， 此类分离的核酸分子包含核苷酸序列 SEQ ID NO ： 36( 其编码 γ-1H 链 ) 或编码氨基酸序列 SEQ ID NO ： 37 的核苷酸序列。 在另一个优选的具体实施方案 中， 此类分离的核酸分子包含核苷酸序列 SEQ ID NO ： 38( 其编码 κL 链 ) 或编码氨基酸序 列 SEQ ID NO ： 39 的核苷酸序列。 在又一个优选的具体实施方案中， 本发明的分离的核酸分 子包含核苷酸序列 SEQ ID NO ： 36 和 38 两者。在又一个优选的具体实施方案中， 本发明的分离的核酸分子进一步包含编码供体起源 ( 诸如分别为氨基酸序列 SEQ ID NO ： 10 和 17) 或异源起源的信号肽的核苷酸序列。
     本发明进一步提供了一种载体， 例如表达载体， 其包含编码免疫特异性识别人 α9 整联蛋白的本发明人源化抗体或其抗原结合片段的 H 链或 L 链或二者的核苷酸序列。在此 类载体中， 本发明的核苷酸序列可以与一种或多种调节元件可操作连接。本发明的核苷酸 序列可以包括编码对于衍生 CDR 的非人供体抗体而言天然的信号肽或异源起源的信号肽 的核苷酸序列。
     此外， 本发明提供了一种宿主细胞， 其包含本发明的核酸分子， 包括包含本发明的 核酸分子的载体。 在一个实施方案中， 本发明提供一种分离的宿主细胞， 其包含编码本发明 的人源化 H 链的第一核酸分子和编码本发明的人源化 L 链的第二核酸分子， 所述第一和第 二核酸分子各自以使得本发明的生物学功能性人源化抗体或其抗原结合片段表达的方式 与调节元件可操作连接。
     因而， 本发明进一步提供了一种用于制备本发明的人源化抗体的方法， 包括在使 得该人源化抗体表达的条件下培养本发明的宿主细胞 ； 并收集所生成的人源化抗体。
     本发明进一步提供了包含至少一种本发明的人源化抗体的组合物。另外， 本发明 提供了一种用于预防或治疗与 α9 整联蛋白有关的病症或疾病的药物组合物， 其包含至少 一种本发明的人源化抗体和药学可接受载体。 任一种所述组合物可以进一步包含另一种活 性化合物， 其能附加地或协同地改善该病症或疾病。 此类活性化合物包括 ( 但不作为限制 ) 消炎化合物、 化学治疗化合物、 等等， 以及抗体或其抗原结合片段， 诸如能免疫特异性结合 人 α4 整联蛋白的抗体。 在另一方面， 本发明提供了一种用于预防或治疗与 α9 整联蛋白有关或牵涉 α9 整联蛋白的病症或疾病的方法， 所述方法包括对有此需要的受试者施用预防或治疗有效量 的至少一种本发明的人源化抗体。对于此类用途， 本发明的人源化抗体可以与增强该人源 化抗体的生物学效果的治疗模块缀合。此类治疗模块的例子包括另一种抗体， 诸如抗 α4 抗体 ( 例如以形成双特异性抗体 )、 抑制细胞性或杀细胞性细胞毒素、 放射性元素、 和 / 或其 它治疗剂， 包括消炎剂、 抗生素、 等等。
     在又一发面， 本发明提供了一种用于在受试者中诊断与 α9 整联蛋白有关或牵涉 α9 整联蛋白的病症或疾病的方法， 所述方法包括对要检查的受试者施用诊断有效量的本 发明的人源化抗体。 对于此类诊断用途， 可以用可检测标志物， 诸如放射性元素标记本发明 的人源化抗体。
     3.1 定义
     如本文中所使用的， 术语 “抗体” 指能够免疫特异性结合期望的抗原， 诸如 α9 整 联蛋白的抗体分子， 而且涵盖完整的抗体分子或其片段， 包括抗原结合片段。
     本文中所使用的术语 “免疫特异性识别” 指抗体或其抗原结合片段特异性结合靶 多肽或蛋白质， 特别是人 α9 整联蛋白的能力。此类抗体并不非特异性结合其它多肽或蛋 白质。然而， 免疫特异性结合靶多肽或蛋白质 ( 例如人 α9 整联蛋白 ) 的抗体或其抗原结 合片段可以与其它抗原起交叉反应。例如， 免疫特异性识别人 α9 整联蛋白的本发明的人 源化抗体或抗原结合片段可以与例如其它物种的 α9 整联蛋白起交叉反应。优选地， 免疫 特异性结合人 α9 整联蛋白的抗体或其抗原结合片段不与其它抗原起交叉反应。
     在又一发面， 本发明提供了一种用于在受试者中诊断与 α9 整联蛋白有关或牵涉 α9 整联蛋白的病症或疾病的方法， 所述方法包括对要检查的受试者施用诊断有效量的本 发明的人源化抗体。 对于此类诊断用途， 可以用可检测标志物， 诸如放射性元素标记本发明 的人源化抗体。
     3.1 定义
     本发明涉及免疫特异性识别人 α9 整联蛋白的人源化抗体及其对与 α9 整联蛋白 有关或牵涉 α9 整联蛋白的各种疾病或病症 ( 包括癌症、 炎性疾病、 自身免疫性疾病、 由 α9 整联蛋白诱发的疾病状况、 等等 ) 的治疗和诊断用途。 2. 背景技术
     由一组称作整联蛋白的细胞表面受体介导， 细胞粘附于胞外基质 ( 下文缩写为 ECM)。整联蛋白通过形成 α 和 β 链的 1 ∶ 1 异二聚体来执行其功能。迄今为止， 已经鉴定 并确认至少 18 类 α 链、 8 类 β 链和 24 类 αβ 异二聚体。已知每种整联蛋白识别一种特 定的配体。 整联蛋白根据其配体特异性或功能而分类入亚家族中， 并分成胶原受体、 层粘连 蛋白受体、 识别存在于纤连蛋白、 玻连蛋白、 等中的 Arg-Gly-Asp(RGD) 序列的 RGD 受体、 和 仅存在于白细胞中的白细胞特异性受体 (Hynes， R.O.， 2002， Integrins ： Bidirectional， Allosteric Signaling Machines.Cell 110 ： 673-87 ； Miyasaka， M.， 2000， New edition of Adhesion Molecule Handbook， Shujunsya)。α4 和 α9 整联蛋白是不属于任何这些类 型并称作 α4 整联蛋白亚家族的亚家族的成员 (Elise L.Palmer， Curzio Rfiegg， Ronald Ferrando， Robert Pytela， Sheppard D.， 1993， Sequence and Tissue Distribution of the Integrin α9 Subunit， a Novel Partner of β1 That Is Widely Distributed in Epithelia and Muscle.The Journal of Cell Biology， 123 ： 1289-97)。同时， 迄今为止， 过去认为 ECM 仅充当细胞间的粘合物质。现在已经变得清楚的是， 整联蛋白介导的 ECM- 细 胞相互作用显著牵涉调节细胞的生长、 粘附、 运动、 等， 而且与疾病的发作 ( 包括癌症的进 展、 炎症的恶化、 等 ) 有关。
     例如， 作为 ECM 之一的骨桥蛋白 ( 下文缩写为 OPN) 是一种具有约 41kDa 分子量的 分泌性、 酸性磷酸化糖蛋白， 而且是一种在母乳、 尿液、 肾小管、 破骨细胞、 成骨细胞、 巨噬细 胞、 激活的 T 细胞、 肿瘤组织、 等等中广泛观察到其表达的分子。OPN 具有粘附序列， 即在其 分子中央的 GRGDS(SEQ IDNO ： 1)、 在人 OPN 中的 SVVYGLR(SEQ ID NO ： 2) 序列或小鼠 OPN 中 的 SLAYGLR(SEQ ID NO ： 3) 序列， 和与其极其接近的凝血酶切割位点， 并经由 GRGDS(SEQ ID NO ： 1) 序列结合 RGD 整联蛋白或经由 SVVYGLR(SEQ IDNO ： 2) 序列或 SLAYGLR(SEQ ID NO ： 3) 序列结合 α4(α4β1) 和 α9(α9β1) 整联蛋白。
     WO 02/081522 披露了使用 OPN 敲除小鼠或针对 OPN 的中和性抗体通过抑制 OPN 功 能实现的对类风湿性关节炎或肝炎的治疗效果。此外， 此公开文本披露了 SVVYGLR(SEQ ID NO ： 2) 序列由于识别 α9 和 α4 整联蛋白而对于炎性疾病的发病机制是至关重要的， 并且 OPN 的受体在免疫活性细胞等等中表达且与炎性疾病有关。
     已经找到了结合谱的差异， 其在于 α4β1 既结合未经凝血酶切割的 OPN( 未切割 的 OPN) 又结合经凝血酶切割的 OPN( 经切割的 OPN) 的 N 端片段， 而 α9β1 仅结合经切割 的 OPN(Y.Yokosaki 等， (1999)The Journal of Biological Chemistry， 274 ： 36328-36334 ； P.M.Green 等， (2001)FEBS Letters， 503 ： 75-79 ； S.T.Barry 等， (2000)Experimental CellResearch， 258 ： 342-351)。
     除 了 OPN 以 外， α4 和 α9 整 联 蛋 白 共 享 许 多 共 同 配 体。 已 知 的 配 体 有 纤 连 蛋 白 的 EDA 域、 前 肽 -von Willebrand 因 子 (pp-vWF)、 组 织 转 谷 氨 酰 胺 酶 (tTG)、 血液 凝 固 因 子 XIII、 血 管 细 胞 粘 附 分 子 -1(VCAM-1) 等。 另 外， 已 知 纤 连 蛋 白 的 CS-1 域、 MadCAM-1(α4β7)、 等为受到 α4 整联蛋白特异性识别的配体。已知生腱蛋白 -C、 纤溶酶、 等为受到 α9 整联蛋白特异性识别的配体。
     整联蛋白亚基 α9、 α4 和 β1 的氨基酸序列是众所周知的。例如， 在 GenBank， 人 α9 登记为 NM_002207， 小鼠 α9 为 NM_133721， 人 α4 为 NM_000885， 小鼠 α4 为 NM_010576， 人 β1 为 X07979， 而小鼠 β1 为 NM_010578。还已知这些整联蛋白在氨基酸序列方面在物 种间具有高度相似性。
     3. 发明概述
     虽然目前已知许多用于治疗癌症、 炎性疾病和自身免疫性疾病的药物， 但是期望 开发出对癌症、 炎性疾病和自身免疫性疾病具有更为改善的治疗效果的预防和 / 或治疗剂 等。本发明部分基于本发明人的发现， 即针对 α9 整联蛋白的特异性抑制性抗体具有抑癌 和消炎效果。 先前， 本发明人分离出免疫特异性识别人 α9 整联蛋白并由杂交瘤克隆 K33N( 保 藏登录号 FERM BP-10830) 生成的小鼠单克隆抗体。在本文中， 该杂交瘤克隆名称与由该克 隆生成的单克隆抗体的名称可互换使用。 小鼠抗人 α9 整联蛋白抗体是 IgG1 同种型的。 该 单克隆抗体抑制人和 / 或小鼠 α9 整联蛋白与 α9 整联蛋白的配体， 诸如骨桥蛋白之间的 结合。如此， 该抗 α9 整联蛋白抗体抑制 α9 整联蛋白的功能， 而且对癌症， 例如癌细胞的 生长或转移， 和对炎性疾病， 例如类风湿性关节炎、 骨关节炎、 肝炎、 支气管哮喘、 纤维化、 糖 尿病、 动脉硬化、 多发性硬化、 肉芽肿、 炎性肠病 ( 溃疡性结肠炎和克罗恩 (Crohn) 氏病 )、 自 身免疫性疾病、 由 α9 整联蛋白诱发的疾病状况、 等等展现出治疗效果。
     此外， 本发明的抗 α9 整联蛋白抗体可以作为体内诊断剂用于检测受试者中的 α9 整联蛋白表达的存在和水平， 由此诊断牵涉 α9 整联蛋白的病症或疾病。
     然而， 因为该单克隆抗体是小鼠起源的， 其在人中的免疫原性所致的可能的不利 影响已经阻碍了其直接应用于人的诊断或治疗用途。为了降低免疫原性， 本发明人已经制 备了人源化抗体， 其具有与衍生所述人源化抗体的初始小鼠抗 α9 整联蛋白抗体展现的生 物学活性对应的生物学活性。
     因而， 本发明提供了免疫特异性识别人 α9 整联蛋白的人源化抗体或其抗原结合 片段， 所述抗体包含部分自非人起源衍生和部分自人起源衍生的抗原结合区。在一个具体 的实施方案中， 本发明的人源化抗体或其抗原结合片段包含自非人来源 ( 供体 )， 诸如 K33N 单克隆抗体衍生的互补决定区 (CDR) 和自人来源 ( 接受体 ) 衍生的框架区 (FR)。在一个实 施方案中， 所述人源化抗体或其抗原结合片段抑制人 α9 整联蛋白与人 α9 整联蛋白的配 体之间的结合。
     在一个具体的实施方案中， 所述免疫特异性识别人 α9 整联蛋白的人源化抗体或 其抗体结合片段包含 ： (i) 重链 (H 链 )， 其包含至少一种自人 H 链的可变区 (V 区 ) 衍生的 H 链 FR(FRH) 和至少一种自免疫特异性识别人 α9 整联蛋白的非人抗体 K33N 的至少一种 CDRH 衍生的 H 链互补决定区 (CDRH) ； 或 (ii) 轻链 (L 链 )， 其包含至少一种自人 L 链的 V
     区衍生的 L 链 FR(FRL) 和至少一种自免疫特异性识别人 α9 整联蛋白的非人抗体 K33N 的 至少一种 CDRL 衍生的 L 链互补决定区 (CDRL) ； 或上文的 (i) 和 (ii) 两者。例如， 所述非 人抗体 ( 其衍生本发明的人源化抗体的至少一种 CDRH 和 / 或至少一种 CDRL) 是由登录号 FERMBP-10830 的杂交瘤生成的单克隆抗体。
     在一个优选的具体实施方案中， 本发明的人源化抗体或其抗原结合片段包含 ： (i) 至少一种自人 FRH 衍生的 FRH 和至少一种包含选自氨基酸序列 SEQID NO ： 4、 5 和 6 的氨基 酸序列的 CDRH ； 或 (ii) 至少一种自人 FRL 衍生的 FRL 和至少一种包含选自氨基酸序列 SEQ ID NO ： 11、 12 和 13 的氨基酸序列的 CDRL ； 或 (iii) 上文的 (i) 和 (ii) 两者。本发明的所 述人源化抗体或其抗原结合片段可以包含 CDRH1、 CDRH2 和 CDRH3， 它们分别包含氨基酸序 列 SEQ IDNO ： 4、 5 和 6。在备选中， 本发明的所述人源化抗体或其抗原结合片段包含 CDRL1、 CDRL2 和 CDRL3， 它们分别包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 11、 12 和 13。 在一个优选的实施方案 中， 本发明的所述人源化抗体或其抗原结合片段包含 CDRH1、 CDRH2、 CDRH3、 CDRL1、 CDRL2 和 CDRL3， 它们分别包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 4、 5、 6、 11、 12 和 13。在另一个备选中， 本发明 的所述人源化抗体或其抗原结合片段包含自由 GenBank 登录号 DA980102(SEQ ID NO ： 18) 编码的人 H 链的可变区衍生的 FRH， 或自由 GenBank 登录号 X72441(SEQ ID NO ： 23) 编码的 人 κ-L 链的可变区衍生的 FRL。在一个优选的实施方案中， 本发明的人源化抗体的 FRH 包 含至少一种选自氨基酸序列 SEQID NO ： 19、 20、 21 和 22( 分别由 DA980102 的相应部分编码 的 FRH1、 FRH2、 FRH3 和 FRH4) 的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中， 本发明的人源 化抗体的 FRL 包含至少一种选自氨基酸序列 SEQ ID NO ： 24、 25、 26 和 27( 分别由 X72441 的 相应部分编码的 FRL1、 FRL2、 FRL3 和 FRL4) 的氨基酸序列。在一个更优选的实施方案中， 本发明的人源化抗体或其抗原结合片段包含 ： (i)H 链可变区 (VH 区 )， 其包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 29 ； 或 (ii)L 链可变区 (VL 区 )， 其包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 31 ； 或 (iii) 上 文的 (i) 和 (ii) 两者。在一个最优选的实施方案中， 本发明的人源化抗体或其抗原结合片 段包含 ： (i)γ-1H 链， 其包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 37 ； 或 (ii)κL 链， 其包含氨基酸序列 SEQID NO ： 39 ； 或 (iii) 上文的 (i) 和 (ii) 两者。
     本发明进一步提供了一种分离的核酸分子， 其包含编码免疫特异性识别人 α9 整 联蛋白的本发明人源化抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。具体地， 本发明提供了一种 分离的核酸分子， 其包含编码包含至少一种选自 SEQID NO ： 4、 5 和 6 的氨基酸序列的人源化 H 链， 或包含至少一种选自 SEQ IDNO ： 11、 12 和 13 的氨基酸序列的人源化 L 链， 或所述人源 化 H 链和所述人源化 L 链两者的核苷酸序列。在一个优选的具体实施方案中， 此类分离的 核酸分子包含核苷酸序列 SEQ ID NO ： 28( 其编码 VH 区 ) 或编码氨基酸序列 SEQ IDNO ： 29 的核苷酸序列。在另一个优选的具体实施方案中， 此类分离的核酸分子包含核苷酸 SEQ ID NO ： 30( 其编码 VL 区 ) 或编码氨基酸序列 SEQ ID NO ： 31 的核苷酸序列。在又一个优选的 具体实施方案中， 本发明的分离的核酸分子包含核苷酸序列 SEQ ID NO ： 28 和 30 两者。在 一个优选的具体实施方案中， 此类分离的核酸分子包含核苷酸序列 SEQ ID NO ： 36( 其编码 γ-1H 链 ) 或编码氨基酸序列 SEQ ID NO ： 37 的核苷酸序列。 在另一个优选的具体实施方案 中， 此类分离的核酸分子包含核苷酸序列 SEQ ID NO ： 38( 其编码 κL 链 ) 或编码氨基酸序 列 SEQ ID NO ： 39 的核苷酸序列。 在又一个优选的具体实施方案中， 本发明的分离的核酸分 子包含核苷酸序列 SEQ ID NO ： 36 和 38 两者。在又一个优选的具体实施方案中， 本发明的分离的核酸分子进一步包含编码供体起源 ( 诸如分别为氨基酸序列 SEQ ID NO ： 10 和 17) 或异源起源的信号肽的核苷酸序列。
     本发明进一步提供了一种载体， 例如表达载体， 其包含编码免疫特异性识别人 α9 整联蛋白的本发明人源化抗体或其抗原结合片段的 H 链或 L 链或二者的核苷酸序列。在此 类载体中， 本发明的核苷酸序列可以与一种或多种调节元件可操作连接。本发明的核苷酸 序列可以包括编码对于衍生 CDR 的非人供体抗体而言天然的信号肽或异源起源的信号肽 的核苷酸序列。
     此外， 本发明提供了一种宿主细胞， 其包含本发明的核酸分子， 包括包含本发明的 核酸分子的载体。 在一个实施方案中， 本发明提供一种分离的宿主细胞， 其包含编码本发明 的人源化 H 链的第一核酸分子和编码本发明的人源化 L 链的第二核酸分子， 所述第一和第 二核酸分子各自以使得本发明的生物学功能性人源化抗体或其抗原结合片段表达的方式 与调节元件可操作连接。
     因而， 本发明进一步提供了一种用于制备本发明的人源化抗体的方法， 包括在使 得该人源化抗体表达的条件下培养本发明的宿主细胞 ； 并收集所生成的人源化抗体。
     本发明进一步提供了包含至少一种本发明的人源化抗体的组合物。另外， 本发明 提供了一种用于预防或治疗与 α9 整联蛋白有关的病症或疾病的药物组合物， 其包含至少 一种本发明的人源化抗体和药学可接受载体。 任一种所述组合物可以进一步包含另一种活 性化合物， 其能附加地或协同地改善该病症或疾病。 此类活性化合物包括 ( 但不作为限制 ) 消炎化合物、 化学治疗化合物、 等等， 以及抗体或其抗原结合片段， 诸如能免疫特异性结合 人 α4 整联蛋白的抗体。 在另一方面， 本发明提供了一种用于预防或治疗与 α9 整联蛋白有关或牵涉 α9 整联蛋白的病症或疾病的方法， 所述方法包括对有此需要的受试者施用预防或治疗有效量 的至少一种本发明的人源化抗体。对于此类用途， 本发明的人源化抗体可以与增强该人源 化抗体的生物学效果的治疗模块缀合。此类治疗模块的例子包括另一种抗体， 诸如抗 α4 抗体 ( 例如以形成双特异性抗体 )、 抑制细胞性或杀细胞性细胞毒素、 放射性元素、 和 / 或其 它治疗剂， 包括消炎剂、 抗生素、 等等。
     在又一发面， 本发明提供了一种用于在受试者中诊断与 α9 整联蛋白有关或牵涉 α9 整联蛋白的病症或疾病的方法， 所述方法包括对要检查的受试者施用诊断有效量的本 发明的人源化抗体。 对于此类诊断用途， 可以用可检测标志物， 诸如放射性元素标记本发明 的人源化抗体。
     3.1 定义
     如本文中所使用的， 术语 “抗体” 指能够免疫特异性结合期望的抗原， 诸如 α9 整 联蛋白的抗体分子， 而且涵盖完整的抗体分子或其片段， 包括抗原结合片段。
     本文中所使用的术语 “免疫特异性识别” 指抗体或其抗原结合片段特异性结合靶 多肽或蛋白质， 特别是人 α9 整联蛋白的能力。此类抗体并不非特异性结合其它多肽或蛋 白质。然而， 免疫特异性结合靶多肽或蛋白质 ( 例如人 α9 整联蛋白 ) 的抗体或其抗原结 合片段可以与其它抗原起交叉反应。例如， 免疫特异性识别人 α9 整联蛋白的本发明的人 源化抗体或抗原结合片段可以与例如其它物种的 α9 整联蛋白起交叉反应。优选地， 免疫 特异性结合人 α9 整联蛋白的抗体或其抗原结合片段不与其它抗原起交叉反应。
     本文中所使用的术语 “抗原结合片段” 指保留免疫特异性结合靶多肽或蛋白质， 特 别是人 α9 整联蛋白和 / 或非人 α9 整联蛋白的能力的任何抗体片段， 而且包括单链抗体、 Fab 片段、 F(ab’ )2 片段、 二硫化物连接的 Fv、 和含有特异性结合靶多肽或蛋白质的轻链可 变区 (VL) 和 / 或重链可变区 (VH) 或甚至互补决定区 (CDR) 的片段。如此， 人源化抗体的 此类抗原结合片段可以包含或不包含部分或全长人恒定区。 用于获得上文所描述的抗体片 段的各种方法是本领域中公知的。
     本文中所使用的术语 “自人来源衍生的” 或 “自非人来源衍生的” 指自人抗体或非 人抗体的相应部分衍生其氨基酸序列的抗体部分。
     本文中所使用的术语 “接受体序列” 指充当来自供体抗体 ( 其通常是非人抗体 ) 的 CDR 的接受体的， 来自人抗体 VH 或 VL 区的框架区的核苷酸序列或氨基酸序列。
     4. 附图简述
     图 1 显示了实验结果， 其中用人 α-9 整联蛋白表达细胞 ( 人黑素瘤细胞 G361) 和 OPNα-9 整联蛋白结合位点肽 (SVVYGLR) 测量抗人 α-9 整联蛋白抗体 ( 即本发明的两种克 隆 ( 即 K33N 和 M35A)、 五种其它克隆 (1K11、 21C5、 24I11、 25B6、 和 28S1)、 和 Y9A2) 的细胞粘 附抑制活性。使用针对人骨桥蛋白的单克隆抗体 (5A1) 作为阴性对照。 图 2 显示了实验结果， 其中用人 α-9 整联蛋白表达细胞 ( 人黑素瘤细胞 G361) 和 生腱蛋白 C 片段的 α-9 整联蛋白结合位点肽测量抗人 α-9 整联蛋白抗体 ( 即本发明的两 种克隆 ( 即 K33N 和 M35A)、 五种其它克隆 (1K11、 21C5、 24I11、 25B6、 和 28S1)、 和 Y9A2) 的细 胞粘附抑制活性。使用针对人骨桥蛋白的单克隆抗体 (5A1) 作为阴性对照。
     图 3 显示了小鼠 K33N VH cDNA 的核苷酸序列 (SEQ ID NO ： 7) 及推导的氨基酸序 列 (SEQ ID NO ： 8)。氨基酸残基以单字母代码显示。信号肽序列 (SEQID NO ： 10) 为斜体。 成熟 VH 的 N 端氨基酸残基 (Q) 加双下划线。依照 Kabat 等 (Sequences of Proteins of Immunological Interests， 第五版， NIH 出版 No.91-3242， U.S.Department of Health and Human Services， 1991) 定义的 CDR 序列加下划线。
     图 4 显示了小鼠 K33N VL cDNA 的核苷酸序列 (SEQ ID NO ： 14) 及推导的氨基酸 序列 (SEQ ID NO ： 15)。氨基酸残基以单字母代码显示。信号肽序列 (SEQ ID NO ： 17) 为斜 体。成熟 VL 的 N 端氨基酸残基 (D) 加双下划线。依照 Kabat 等 (1991) 定义的 CDR 序列加 下划线。
     图 5 显示了侧翼有 SpeI 和 HindIII 位点 ( 加下划线 ) 的设计 K33N VH(ChK33N VH) 基因的核苷酸序列 (SEQ ID NO ： 32) 及推导的氨基酸序列 (SEQID NO ： 8)。氨基酸残基以单 字母代码显示。信号肽序列 (SEQ ID NO ： 10) 为斜体。成熟 VH 的 N 端氨基酸残基 (Q) 加双 下划线。依照 Kabat 等 (1991) 定义的 CDR 序列加下划线。内含子序列为斜体。
     图 6 显示了侧翼有 NheI 和 EcoRI 位点 ( 加下划线 ) 的设计 K33N VL(ChK33N VL) 基因的核苷酸序列 (SEQ ID NO ： 33) 及推导的氨基酸序列 (SEQID NO ： 15)。氨基酸残基以 单字母代码显示。信号肽序列 (SEQ ID NO ： 17) 为斜体。成熟 VL 的 N 端氨基酸残基 (D) 加 双下划线。依照 Kabat 等 (1991) 定义的 CDR 序列加下划线。内含子序列为斜体。
     图 7 显示了 pChK33N 和 pHuK33N( 集体为表达载体 ) 的示意结构。从顶部的 SalI 位点顺时针方向前进， 该质粒含有重链转录单元， 其始自人巨细胞病毒 (CMV) 主要立即早 期启动子和增强子 (CMV 启动子 ) 以启动抗体重链基因的转录。CMV 启动子后面有 VH 外显
     子、 含有人 γ-1 重链恒定区 ( 包括 CH1、 铰链、 CH2 和 CH3 外显子及居间内含子 ) 的基因组 序列、 和 CH3 后面供 mRNA 加工用的 γ-1 基因多聚腺苷酸化位点。重链基因序列后面， 轻链 转录单元始自 CMV 启动子， 后面有 VL 外显子和含有人 κ 链恒定区外显子 (CL) 及其前面的 内含子一部分的基因组序列、 和 κ 基因的 polyA 信号。然后， 轻链基因后面有 SV40 早期启 动子 (SV40 启动子 )、 大肠杆菌黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因 (gpt)、 和含有 SV40 多 聚腺苷酸化位点的区段 (SV40 poly(A) 位点 )。最后， 该质粒含有质粒 pUC19 一部分， 其包 含细菌复制起点 (pUC ori) 和 β- 内酰胺酶基因 (β- 内酰胺酶 )。
     图 8 显示了 K33N VH(SEQ ID NO ： 9)、 人源化 K33N(HuK33N)VH(SEQID NO ： 29) 和 自由 GenBank 登录号 DA980102 的核苷酸序列编码的氨基酸序列衍生的人接受体序列的 FRH1(SEQ ID NO ： 19)、 FRH2(SEQ ID NO ： 20)、 FRH3(SEQ ID NO ： 21) 和 FRH4(SEQ ID NO ： 22) 的氨基酸序列的比对。氨基酸残基以单字母代码显示。序列上方的数字标示依照 Kabat 等 (1991) 的位置。由 Kabat 等 (1991) 限定的 CDR 序列加下划线。加双下划线的残基预测为 与 CDR 接触， 而且小鼠残基在人源化形式中的这些位置处得到保留。 将 DA980102 中的第 82 位处的 Met( 加下划线 )( 其在人 VH 序列中的此位置处是非典型的 ) 用典型的残基 Leu 替 换以降低潜在的免疫原性。图中省略 DA980102 中的 CDR 残基。 图 9 显 示 了 K33N VL(SEQ ID NO ： 16)、 人 源 化 K33N(HuK33N)VL(SEQID NO ： 31) 和自由 GenBank 登录号 X72441 的核苷酸序列编码的氨基酸序列衍生的人接受体序列的 FRL1(SEQ ID NO ： 24)、 FRL2(SEQ ID NO ： 25)、 FRL3(SEQ ID NO ： 26) 和 FRL4(SEQ ID NO ： 27) 的氨基酸序列的比对。氨基酸残基以单字母代码显示。序列上方的数字标示依照 Kabat 等 (1991) 的位置。由 Kabat 等 (1991) 限定的 CDR 序列加下划线。加双下划线的残基预测为 与 CDR 接触， 而且小鼠残基在人源化形式中的这些位置处得到保留。图中省略 X72441 中的 CDR 残基。
     图 10 显示了用于构建 HuK33N VH 基因的寡核苷酸。
     图 11 显示了用于构建 HuK33N VL 基因的寡核苷酸。
     图 12 显示了用于构建 HuK33N VH 基因的寡核苷酸。箭表示每种寡核苷酸的位置 和取向 (5’ 至 3’ )。VH 区 (SEQ ID NO ： 29) 的氨基酸残基以单字母代码显示。
     图 13 显示了用于构建 HuK33N VL 基因的寡核苷酸。箭表示每种寡核苷酸的位置 和取向 (5’ 至 3’ )。VL 区 (SEQ ID NO ： 31) 的氨基酸残基以单字母代码显示。
     图 14 显示了侧翼有 SpeI 和 HindIII 位点 ( 加下划线 ) 的 HuK33N VH 基因的核苷 酸序列 (SEQ ID NO ： 34) 及信号肽 (SEQ ID NO ： 58 ； 以斜体显示 ) 和 VH 区 (SEQ ID NO ： 29) 的推导的氨基酸序列。氨基酸残基以单字母代码显示。信号肽序列为斜体。成熟 VH 的 N 端氨基酸残基 (Q) 加双下划线。依照 Kabat 等 (1991) 定义的 CDR 序列加下划线。内含子 序列为斜体。
     图 15 显示了侧翼有 NheI 和 EcoRI 位点 ( 加下划线 ) 的 HuK33N VL 基因的核苷酸 序列 (SEQ ID NO ： 35) 及信号肽 (SEQ ID NO ： 59 ； 以斜体显示 ) 和 VL 区 (SEQ ID NO ： 31) 的 推导的氨基酸序列。氨基酸残基以单字母代码显示。信号肽序列为斜体。成熟 VL 的 N 端 氨基酸残基 (D) 加双下划线。依照 Kabat 等 (1991) 定义的 CDR 序列加下划线。内含子序 列为斜体。
     图 16 显示了嵌合的与人源化的 K33N 抗体对人 α9 整联蛋白的亲和力的比较。通
     过细胞 ELISA 检查 1 和 0.5μg/ml 嵌合的和人源化的 K33N 对 CHO/α9 细胞的结合。一式 三份实施实验。图中显示了均值吸光度值及 SEM。
     图 17 显示了用于 HuK33N 重链和轻链 cDNA 的 PCR 扩增和测序的寡核苷酸的序列 (SEQ ID NO ： 44-50)。
     图 18 显示了 pHuK33N 中的 HuK33Nγ-1 重链编码区的核苷酸序列 (SEQID NO ： 36) 及推导的氨基酸序列 (SEQ ID NO ： 37)。氨基酸残基以单字母代码显示。终止密码子以 “ · ” 表示。
     图 19 显示了 pHuK33N 中的 HuK33Nκ 轻链编码区的核苷酸序列 (SEQ IDNO ： 38) 及 推导的氨基酸序列 (SEQ ID NO ： 39)。氨基酸残基以单字母代码显示。终止密码子以 “·” 表示。
     图 20 显示了对纯化的抗体的 SDS-PAGE 分析的结果。 依照 Sambrook 等 (Molecular Cloning， A Laboratory Manual， 第 2 版， 1989， Cold Spring Harbor Laboratory Press， Cold Spring Harbor， NY) 在还原条件下在存在 SDS 的情况中在 10％聚丙烯酰胺凝胶上运 行 6μg 嵌合的和人源化的 IgG1/κ 抗体 ( 分别为 ChK33N 和 HuK33N)。使用宽范围蛋白质 标志物 (MW ； New England Biolabs， Ipswich， MA) 作为大小标志物。右侧显示的数字表示 按千道尔顿 (kDa) 计的标志物大小。
     图 21 显示了对小鼠 K33N 抗体对人 α9 整联蛋白的结合的 FACS 分析的结果。 在多 个浓度 ( 以 1.67μg/ml 开始且连续 3 倍稀释 ) 对小鼠 K33N 抗体测试对 CHO/huα9 细胞的 结合。在图中在测试的每个抗体浓度 (X 轴 ) 为几何平均通道荧光数值 (MCF ； Y 轴 ) 绘图。 使用 GraphPad Prism(GraphPad Software， San Diego， CA) 来计算 EC50 值。
     图 22 显示了对嵌合的和人源化的 K33N 抗体对人 α9 整联蛋白的结合的 FACS 分 析的结果。在多个浓度 ( 以 5μg/ml 开始且连续 3 倍稀释 ) 对每种抗体测试对 CHO/huα9 细胞的结合。在图中在测试的每个抗体浓度 (X 轴 ) 为几何平均通道荧光数值 (MCF ； Y轴) 绘图。使用 GraphPad Prism(GraphPad Software， San Diego， CA) 来计算 EC50 值。
     图 23 显示了针对人 α9 整联蛋白的小鼠的、 嵌合的和人源化的 K33N 抗体和小 鼠抗人 α9 整联蛋白抗体 Y9A2 的剂量响应细胞粘附抑制率。在 5、 1、 0.2、 0.04、 0.008 和 0.0016μg/mL 的浓度对每种抗体测试对人 α9 整联蛋白表达细胞系 G-361 的细胞粘附。 一 式四份实施实验。图中显示了均值抑制率值。
     5. 发明详述
     5.1. 针对人 α9 整联蛋白的抗体的制备
     可通过本领域中已知的任何合适的方法来生成免疫特异性识别人 α9 整联蛋白 或其任何表位的抗体。
     在本发明中作为抗原使用的 α9 整联蛋白可以是 (1) 自表达 α9 整联蛋白的所有 来自人的细胞， 或其中存在这些细胞的所有组织衍生的蛋白质， (2) 重组蛋白， 其中将编码 α9 整联蛋白的基因 DNA， 优选地 cDNA 转染入细菌、 酵母、 细胞系 ( 包括动物细胞 )、 等中， 并 表达， 或 (3) 合成的蛋白质。
     α9 整联蛋白包括包含与人 α9 整联蛋白的氨基酸序列 (SEQ ID NO ： 55， 其中残基 1-29 是信号肽 ) 基本上相同的氨基酸序列的多肽。
     在本文中， 术语 “包含基本上相同的氨基酸序列的多肽” 指包含如下氨基酸序列的变体多肽， 其中多个氨基酸， 优选地 1 至 10 个氨基酸且更优选地 1 至几个 ( 例如 1 至 5 个 ) 氨基酸被替代、 删除和 / 或修饰， 只要这些变体多肽与天然存在的人 α9 整联蛋白具有基本 上等同的生物学特性 ； 和包含如下氨基酸序列的变体多肽， 其中多个氨基酸， 优选地 1 至 10 个氨基酸且更优选地 1 至几个 ( 例如 1 至 5 个 ) 氨基酸被添加至天然存在的人 α9 整联蛋 白的氨基酸序列。此外， 变体多肽可以是那些具有这些氨基酸替代、 删除、 修饰和添加中多 处的。
     在基因重组技术外， 可以通过本领域中公知的方法， 诸如化学合成法、 细胞培养 法、 等， 或其修改方案来生成在本发明中作为抗原的人 α9 整联蛋白。
     用于生成变体多肽的方法的例子包括合成寡核苷酸定点诱变 ( 缺口双链体法 )、 牵涉通过用亚硝酸盐或亚硫酸盐处理来随机引入点突变的点诱变法、 牵涉用 Bal31 酶或 其它酶制备缺失突变体的方法、 盒式诱变、 接头扫描法、 误掺入法 (miss incorporation method)、 错配引物法、 DNA 区段合成法、 等等。
     要在本发明中作为抗原使用的人 α9 整联蛋白还包括所述 α9 整联蛋白一 “部 分” 。 如本文中所使用的， “部分” 指包含结合 α9 整联蛋白配体， 例如 OPN、 VCAM-1、 生腱蛋白 C、 等所需要的区域的部分 ； 具体地， 成熟人 α9 整联蛋白 (SEQ ID NO ： 55 的第 30- 第 1035 氨基酸残基 ) 中包含第 14- 第 980 氨基酸残基的部分， 和包含第 11- 第 981 氨基酸残基的 部分。所述 α9 整联蛋白一 “部分” 可以依照下文所描述的本领域中已知的方法或其修改 方案通过基因重组或化学合成来生成， 或者可以通过用蛋白水解酶等等适当消化通过细胞 培养法分离的人 α9 整联蛋白来生成。 在细胞膜上过表达 α9 整联蛋白的细胞本身或其膜级分也可以作为抗原使用。可 以通过本领域中公知的重组 DNA 技术来制备过表达人 α9 整联蛋白的细胞。
     使用如上文所描述的那样制备的合适的抗原， 可以通过本领域中公知的多种方 法来制备对人 α9 整联蛋白或其任何表位特异性的抗体。针对人 α9 整联蛋白的多克隆 抗体可以通过本领域中公知的多种规程来生成。例如， 可以对多种宿主动物 ( 包括但不 限于家兔、 小鼠、 大鼠、 等 ) 施用感兴趣的抗原， 以诱导含有对抗原特异性的多克隆抗体的 抗血清生成。根据宿主物种， 可以使用各种佐剂来提高免疫学应答， 并且包括但不限于弗 (Freund) 氏 ( 完全和不完全 ) 佐剂、 矿物凝胶诸如氢氧化铝、 表面活性物质诸如溶血卵磷
    脂、 Pluronic 多元醇、 聚阴离子、 肽、 油乳剂、 匙孔血蓝蛋白、 二硝基苯酚、 和对人潜在有用的佐剂诸如 BCG( 卡介苗 ) 和小棒杆菌 (Corynebacterium parvum)。此类佐剂也是本领 域中公知的。
     可以使用本领域中已知的极其多种技术 ( 包括使用杂交瘤、 重组体、 和噬菌体展 示技术， 或其组合 ) 来制备单克隆抗体。例如， 可以使用杂交瘤技术来生成单克隆抗体， 所 述杂交瘤技术包括那些在本领域中已知的和在例如 Harlow 等， Antibodies ： A Laboratory Manual， (Cold Spring Harbor Laboratory Press，第 2 版 1988) ； Hammerling 等，于 ： Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas， 第 563 页 - 第 681 页 (Elsevier， N.Y.， 1981)( 通过提及而完整收录这两者 ) 中教导的。如本文中所使用的， 术语 “单克隆抗体” 不 限于经由杂交瘤技术生成的抗体。术语 “单克隆抗体” 指自单克隆， 包括任何真核、 原核、 或 噬菌体克隆衍生的抗体， 而非生成其的方法。
     使用杂交瘤技术来生成和筛选特异性抗体的方法是本领域中公知的且常规的。在一个非限制性例子中， 可以用感兴趣的抗原或表达此类抗原的细胞来免疫小鼠。一旦 检测出免疫应答， 例如在小鼠血清中检测出对抗原特异性的抗体， 收获小鼠脾， 并分离脾 细胞。然后， 通过公知的技术将脾细胞与任何合适的骨髓瘤细胞 ( 例如 P3U1、 P3X63-Ag8、 P3X63-Ag8-U1、 P3NS1-Ag4、 SP2/0-Ag14、 P3X63-Ag8-653 等 ) 融合。选择杂交瘤， 并通过有 限稀释将其克隆。然后， 通过本领域中已知的方法对杂交瘤克隆测定分泌能够结合抗原的 抗体的细胞。可以通过给小鼠腹膜内接种阳性杂交瘤克隆来生成腹水， 其一般含有高水平 的抗体。
     可以通过已知的技术来生成识别特定表位的抗体片段。例如， 可以通过使用诸如 木瓜蛋白酶 ( 以生成 Fab 片段 ) 或胃蛋白酶 ( 以生成 F(ab’ )2 片段 ) 等酶来蛋白水解切割 免疫球蛋白分子， 从而生成 Fab 和 F(ab’ )2 片段。F(ab’ )2 片段含有完整的轻链和重链的 可变区、 CH1 区和铰链区。
     本发明的抗体或其抗原结合片段也可以通过本领域中已知的用于合成抗体的任 何方法， 特别是通过化学合成或者优选地， 通过重组表达技术来生成。
     编码抗体的核苷酸序列可以自本领域技术人员可得的任何信息 ( 即自 Genbank、 文献、 或者通过常规的克隆和序列分析 ) 获得。若不可获得含有编码特定抗体或其表位结 合片段的核酸的克隆， 但是抗体分子或其表位结合片段的序列是已知的， 则编码免疫球蛋 白的核酸可以化学合成或者使用与序列的 3’ 和 5’ 端可杂交的合成引物通过 PCR 扩增或者 使用对特定基因序列特异性的寡核苷酸探针以鉴定例如来自 cDNA 文库的编码抗体的 cDNA 克隆通过克隆自合适的来源 ( 例如抗体 cDNA 文库、 或自表达抗体的任何组织或细胞诸如选 择为表达抗体的杂交瘤细胞生成的 cDNA 文库、 或自表达抗体的任何组织或细胞分离的核 酸， 优选地 polyA+RNA) 获得。然后， 可以使用本领域中公知的任何方法来将通过 PCR 生成 的扩增核酸克隆入可复制克隆载体中。
     5.2. 重组抗体的制备
     一旦确定抗体的核苷酸序列， 便可以使用本领域中公知的用于操作核苷酸序列的 方法， 例如重组 DNA 技术、 定点诱变、 PCR、 等 ( 参见例如 Sambrook 等， 见上文 ； 及 Ausubel 等 编， 1998， Current Protocols in Molecular Biology， John Wiley & Sons， NY 中所记载的 技术， 通过提及而将这两篇文献完整收入本文 ) 来操作抗体的核苷酸序列， 以通过例如将 氨基酸替代、 删除、 和 / 或插入引入抗体的表位结合域区或抗体中可以提高或降低抗体的 生物学活性的任何部分中来生成具有不同氨基酸序列的抗体。
     抗体的重组表达需要构建含有编码抗体的核苷酸序列的表达载体。 一旦获得了编 码抗体分子或抗体的重链或轻链或其部分的核苷酸序列， 便可以使用本领域中公知的技术 通过重组 DNA 技术来生成供生成抗体分子用的载体， 如先前的小节中所讨论的。可以使用 本领域技术人员公知的方法来构建含有抗体编码序列和合适的转录和翻译控制信号的表 达载体。这些方法包括例如体外重组 DNA 技术、 合成技术、 和体内遗传重组。可以将编码抗 体的重链可变区、 轻链可变区、 重链和轻链可变区两者、 重链和 / 或轻链可变区的表位结合 片段、 或一个或多个互补决定区 (CDR) 的核苷酸序列克隆入此类载体中进行表达。可以将 此类序列与编码对于初始抗体而言天然的信号肽或异源信号肽的多核苷酸融合。然后， 可 以将如此制备的表达载体导入合适的宿主细胞中以表达抗体。因而， 本发明包括含有编码 免疫特异性识别人 α9 整联蛋白的人源化抗体或其抗原结合片段的多核苷酸的宿主细胞。可以用本发明的两种表达载体 ( 第一种载体编码重链衍生的多肽， 而第二种载体 编码轻链衍生的多肽 ) 共转染宿主细胞。两种载体可以含有相同的选择标志 ( 其使重链和 轻链多肽能够相等表达 ) 或不同的选择标志以确保维持这两种质粒。或者， 可以使用单一 载体， 其编码并能够表达重链和轻链多肽两者。重链和轻链的编码序列可以包含 cDNA 或基 因组 DNA。
     在另一个实施方案中， 也可以使用本领域中已知的多种噬菌体展示法来生成抗 体。在噬菌体展示法中， 功能性抗体域在携带编码它们的多核苷酸序列的噬菌体颗粒表 面上展示。在一个特别的实施方案中， 可以利用此类噬菌体来展示自全集或组合抗体文 库 ( 例如人的或鼠的 ) 表达的抗原结合域， 诸如 Fab 和 Fv 或二硫键稳定化的 Fv。可以 用抗原， 例如使用经标记的抗原或被固体表面或珠结合或捕获的抗原来选择或鉴定表达 结合感兴趣抗原的抗原结合域的噬菌体。这些方法中使用的噬菌体通常是丝状噬菌体， 包括 fd 和 M13。抗原结合域作为与噬菌体基因 III 或基因 VIII 蛋白的重组融合蛋白表 达。可以用于生成本发明的免疫球蛋白或其片段的噬菌体展示法的例子包括那些披露于 Brinkman 等， J.Immunol.Methods， 182 ： 41-50， 1995 ； Ames 等， J.Immunol.Methods， 184 ： 177-186， 1995 ； Kettleborough 等， Eur.J.Immunol.， 24 ： 952-958， 1994 ； Persic 等， Gene， 187 ： 9-18， 1997 ； Burton 等， Advances in Immunology， 57 ： 191-280， 1994 ； PCT 申请 No.PCT/ GB91/01134 ； PCT 公 开 文 本 WO 90/02809 ； WO 91/10737 ； WO 92/01047 ； WO 92/18619 ； WO 93/11236 ； WO95/15982 ； WO 95/20401 ； 及美国专利 No.5,698,426 ； 5,223,409 ； 5,403,484 ； 5,580,717 ； 5,427,908 ； 5,750,753 ； 5,821,047 ； 5,571,698 ； 5,427,908 ； 5,516,637 ； 5,780,225 ； 5,658,727 ； 5,733,743 和 5,969,108 的 ； 通过提及而将每篇完整收入本文。
     如上述参考文献中所记载的， 噬菌体选择后， 可以分离来自噬菌体的抗体编码区， 并使用其来生成完整抗体， 包括人抗体， 或任何其它期望的片段， 并在任何期望的宿主 ( 包 括哺乳动物细胞、 昆虫细胞、 植物细胞、 酵母、 和细菌 ) 中表达， 例如如下文更为详细地描述 的。例如， 也可以采用用于重组生成 Fab、 Fab’ 和 F(ab’ )2 片段的技术， 其使用本领域中 已知的方法， 诸如那些披露于 PCT 公开文本 WO 92/22324 ； Mullinax 等， BioTechniques， 12(6) ： 864-869， 1992 ； 及 Sawai 等， AJRI， 34 ： 26-34， 1995 ； 及 Better 等， Science， 240 ： 1041-1043， 1988( 通过提及而完整收录每篇 ) 的方法进行。 可以用于生成单链 Fv 和抗体的 技术的例子包括那些记载于美国专利 No.4,946,778 和 5,258,498 ； Huston 等， Methods in Enzymology， 203 ： 46-88， 1991 ； Shu 等， PNAS， 90 ： 7995-7999， 1993 ； 及 Skerra 等， Science， 240 ： 1038-1040， 1988 的。
     一旦通过上文所描述的任何方法生成了本发明的抗体分子， 然后便可以通过本领 域中已知的用于纯化免疫球蛋白分子的任何方法， 例如通过层析 ( 例如离子交换、 亲和、 特 别是在蛋白 A 或蛋白 G 纯化后通过对特定抗原的亲和、 和筛分柱层析 )、 离心、 差别溶解度、 或者通过任何其它用于纯化蛋白质的标准技术来将其纯化。此外， 可以将本发明的抗体或 其片段与本文中所描述的或者在其它情况中在本领域中已知的异源多肽序列融合以便于 纯化。
     对于一些用途 ( 包括抗体在人中的体内用途和体外检测测定法 )， 可以优选使用 嵌合的、 人源化的、 或人的抗体。在下文 5.3 一节中详细讨论了嵌合抗体和人源化抗体。
     与其它化合物或异源多肽融合或缀合的抗体可以在体外免疫测定法中、 在纯化法 ( 例如亲和层析 ) 中、 及在体内治疗或诊断用途中使用。参见例如 PCT 公开文本 No.WO 93/21232 ； EP 439,095 ； Naramura 等， Immunol.Lett.， 39 ： 91-99， 1994 ；美 国 专 利 5,474,981 ； Gillies 等， PNAS， 89 ： 1428-1432， 1992 ； 及 Fell 等， J.Immunol.， 146 ： 2446-2452， 1991， 通过提及而将它们完整收入本文。 例如， 可以使用已知的方法或商品化试 剂盒 ( 例如生物素标记、 FITC 标记、 APC 标记 ) 以多种方式来标记抗体。作为另一个例子， 可以将抗体与提高抗体的体内生物学效果的治疗模块缀合。 此类治疗模块的例子包括另一 种抗体、 抑制细胞性或杀细胞性细胞毒素、 放射性元素、 和 / 或其它治疗剂， 包括消炎剂、 抗 生素、 等等。在本发明中， 可以将人源化抗人 α9 整联蛋白与另一种抗体， 诸如抗 α4 抗体 缀合 ( 例如以形成双特异性抗体 )。作为另一个例子， 对于体内诊断用途， 可以用可检测标 志物， 诸如放射性元素标记本发明的人源化抗体。
     5.3. 嵌合的和人源化的抗体
     嵌合抗体是一种自不同动物物种衍生抗体的不同部分的分子， 诸如具有自鼠单克 隆抗体衍生的可变区和自人免疫球蛋白衍生的恒定区的抗体。 用于生成嵌合抗体的方法是 本领域中已知的。参见例如 Morrison， Science， 229 ： 1202， 1985 ； Oi 等， BioTechniques， 4： 214， 1986 ； Gillies 等， J.Immunol.Methods， 125 ： 191-202， 1989 ； 美国专利 No.5,807,715 ； 4,816,567 ； 及 4,816,397， 通过提及而将它们完整收入本文。
     人源化抗体是一种结合期望的抗原且包含含有一种或多种自非人物种衍生的互 补决定区 (CDR) 和一种或多种自人免疫球蛋白分子衍生的框架区的可变区的分子。用于 使非人抗体人源化的典型方法已经记载于多份参考文献， 诸如如下那些 ： Queen 等， 1989， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86 ： 10029-10033 和 美 国 专 利 No.5,585,089 和 5,693,762 ； Riechmann 等， Nature， 332 ： 323， 1988 ； 及 Tsurushita 等， Methods 36 ： 69-83， 2005， 通过提 及而将它们都完整收入本文。 例如， Tsurushita 等 (2005， 见上文 ； 下文称为 “Tsurushita” ) 的参考文献提供了一种用于使小鼠单克隆抗体人源化的实用且指导性的方案， 其基于最初 由 Queen 等 (1989， 见上文 ) 开发的抗体人源化方法。下文简要汇总了 Tsurushita 中所披 露的通用方案。
     5.3.1. 用于制备人源化抗体的通用方案
     小鼠 V 基因的克隆和测序
     有多种方法可用于克隆编码目标小鼠单克隆抗体的 VH 和 VL 区的 cDNA。例如， 通 常 使 用 5’ RACE(cDNA 末 端 快 速 扩 增 ) 法， 其 使 用 SMART RACE cDNA 扩 增 试 剂 盒 (BD Biosciences， CA) 或 GeneRacer 试剂盒 (Invitrogen， CA) 进行。可以基于目标单克隆抗体 的 H 链和 L 链的同种型来制备用于 5’ RACE 的基因特异性引物， 从而它可以刚好在 H 链和 L 链之每种的可变区下游结合。如此， 5’ RACE 引物可以设计为对小鼠中的每种亚型， 诸如 γ1、 γ2a、 γ2b 或 γ3 特异的。或者， 可以基于亚型间共有的或高度同源的区域来设计所 有亚型的共同引物。在 Tsurushita 中， 下列 5’ RACE 引物作为例子被披露 ：
     (i)5’ -GCCAGTGGATAGACTGATGG-(SEQ ID NO ： 56)( 用于克隆小鼠 γ1、 γ2a、 γ2b 和 γ3H 链 )
     (ii)5’ -GATGGATACAGTTGGTGCAGC-(SEQ ID NO ： 57)( 用于克隆小鼠 κ 轻链 )。
     可以例如使用 Zero Blunt TOPO PCR 克隆试剂盒 (Invitrogen) 来将 PCR 扩增的 V 基因片段直接克隆入质粒载体中， 并测定其 DNA 序列。获得的序列应当通过例如比较其编码氨基酸序列与使用例如 241 型蛋白质测序仪 (Hewlett-Packard， CA) 通过 N 端氨基酸测 序测定的目标单克隆抗体的氨基酸序列来确认。通常， 通过例如埃德曼 (Edman) 降解测定 在目标抗体 N 端的至少 15-20 个氨基酸残基足以确认克隆 DNA 序列的真实性。Tsurushita 告诫， 在谷氨酰胺 ( 其是小鼠中两种最常见的 N 端氨基酸之一 ) 是 N 端氨基酸时， 其可能已 经转变成焦谷氨酰胺并封闭 N 端的测序。在该情况中， 有必要使 N 端去封闭以获得序列。
     V 区的三维建模
     基 于 VH 和 VL 区 的 序 列， 首 先 通 过 例 如 由 R.Levy 等， 1989， Biochemistry 28 ： 7168-7175 ； 及 B.Zilber 等， 1990， Biochemistry 29 ： 10032-10041 记载的方法来鉴定靶 抗体中对于维持 CDR 的构象结构潜在重要的框架残基。通常， 将 VH 和 VL 区之每种分成 14 个结构上有意义的区段， 其是构成免疫球蛋白超家族域结构的 β 链和环样结构。将来 自目标抗体的每个区段的氨基酸序列与 PDB 数据库 ( 参见 H.M.Berman 等， 2000， Nucleic Acids Res.28 ： 235-342) 中的已知结构的抗体的相应区段比对。通过多序列比对， 选择 与每个靶区段具有最高序列同源性的相应区段， 并构建 V 区的三维模型。为了优化结 构， 将模型进行多轮共轭梯度能量最小化 ( 例如使用 ENCAD， 或者如由 Press 等， 1990， 于 “Numerical Recipes” ， Cambridge University Press， Cambridge 中所记载的 ； Weiner 等， 1981， J.Comp.Chem.2 ： 287-303 的 AMBER ； 由英国癌症研究中心 (Cancer Research UK) 运 行的 BioMolecularModelling 或 “BMM” 网站上可获得的 3D-JIG-SAW ； 或在由瑞士生物信息 学研究所 (Swiss Institute of Bioinformatics， Geneva) 运行的 ExPASy 蛋白质组学服务 器网站上可获得的 SWISS-MODEL 进行 )。
     人框架的选择
     与对 V 区结构建模并行， 将自小鼠 VH 和 VL 区的 cDNA 克隆推导的氨基酸序列分别 与数据库， 例如 Kabat 数据库 ( 参见 Johnson 等， 2000， Nucleic Acids Res.28 ： 214-218.)、 GenBank、 等等中的人 V 区序列比较。 可以使用例如 Smith-Waterman 算法 (Gusfield， 1997， 于 “Algorithms on Strings， Trees， and Sequences” ， Cambridge University Press， Cambridge)、 或 BLAST(Karlin 等， 1990， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87 ： 2264-2268)、 等等来 搜索与小鼠序列具有至少约 65 ％、 至少约 70 ％、 至少约 75 ％、 至少约 80 ％、 至少约 85 ％、 至少约 90％、 或至少 95％同一性的总体序列同一性的人框架区。这些人序列可以根据基 于 cDNA 的和蛋白质衍生的序列 ； 然而， 种系的使用常常是优选的， 因为它可以用于消除与 基于 cDNA 的、 蛋白质衍生的序列中的体细胞高度突变有关的潜在免疫原性。在备选中， 如 Queen 等 (1989， 见上文 ) 中所记载的， 共有框架序列的使用也可以在自基于 cDNA 的或蛋白 质衍生的序列获得的框架中鉴定并清除此类高度突变残基。在使用种系 VH 区段作为接受 体框架的情况中， 应当使用染色体 14， 而非 15 和 16 上编码的 VH 区段， 因为只有染色体 14 上的那些生成功能性 VH 区。
     人源化 V 区的设计
     依照 Queen 等 (1989， 见上文 )， 有必要鉴定距 CDR 约 4-6 埃内的框架氨基酸， 因为 认为这些残基是支持正确 CDR 结构的潜在的关键框架残基。此类方法可以使用计算机程 序， 诸如由国家科学基金会 (National Science Foundation， NSF) 支持的分子可视化免费 软件 (Molecular Visualization Freeware) 网站上可获得的 RASMOL( 其通过原子坐标或 者经由计算机模型的手工检查来计算原子间距离 ) 来实现。若关键框架位置处的氨基酸在小鼠供体和人接受体序列之间不同， 则通常用小鼠供体的那些替换人残基。 然后， 若此类残 基对支持 CDR 结构具有最小的贡献， 则通常使用相应的人残基。还有， 若选定的人接受体含 有 “非典型的” 氨基酸 ( 其在小于约 10-20％的 V 区序列中发生 )， 则它们可以是亲和力成熟 过程中体细胞高度突变的结果， 而且应当用供体残基替换以避免在人中的潜在免疫原性。
     另外， 在设计人源化 V 区时需要仔细考虑其它因素， 诸如潜在的 N 连接的糖基化信 号的残基 ( 关于详情， 参见 Tsurushita)。
     根据治疗用途需要的或要消除的效应器功能， 人源化抗体可以含有来自人抗体的 人 κ 或 λ 轻链、 和 / 或 γ1、 γ2、 γ3、 γ4、 μ、 α1、 α2、 δ、 或 ε 重链、 或其变体的人恒 定区或其部分。例如， 可以将含有突变的恒定区的 Fc 部分与本发明的嵌合的或人源化的抗 体的可变区融合， 从而降低抗体对 Fc 受体的结合和 / 或降低其固定补体的能力 ( 参见例如 Winter 等， GB 2,209,757B ； Morrison 等， WO 89/07142 ； Morgan 等， WO 94/29351)。可以通 过重组 DNA 技术来实施对抗体分子的此类操作， 如 5.2 一节中所描述的。
     优选地， 所得的嵌合或人源化抗体具有与非人供体抗体相同的特异性和与非人 供体抗体的亲和力相似或非人供体抗体的亲和力的至少约 1/3、 至少约 1/2、 或至少约 2/3 7 -1 的亲和力。在另一方面， 所得的嵌合或人源化抗体具有至少约 1x10 M 、 优选地至少约 8 -1 9 -1 1x10 M 、 且最优选地至少约 1x10 M 的亲和常数。 在上文所描述的通用方案外， 可以使用本领域中已知的多种技术来使抗体人 源 化， 所 述 技 术 包 括 例 如 CDR 嫁 接 (EP 239,400 ； PCT 公 开 文 本 WO91/09967 ； 美国专利 No.5,225,539 ； 5,530,101 和 5,585,089)、 镶 饰 (veneering) 或 重 修 表 面 (resurfacing) (EP 592,106 ； EP 519,596 ； Padlan， Molecular Immunology， 28(4/5) ： 489-498， 1991 ； Studnicka 等， Protein Engineering， 7(6) ： 805-814， 1994 ； Roguska 等， Proc Natl.Acad. Sci.USA， 91 ： 969-973， 1994)、 和链改组 ( 美国专利 No.5,565,332)， 在此通过提及而将它们 都完整收录。
     5.3.2. 将人源化抗体制备为药物的其它考虑因素
     为了作为药物来供应人源化抗体， 需要制备有效且一致的其生产系统。 例如， 通过 插入 H 和 L 链序列来制备适合于人源化抗体的表达载体， 并可以获得经表达载体转染的高 生产率细胞系作为主细胞库 (MCB) 的种子细胞， 其充当工作细胞库 (WCB) 的稳定且半永久 来源。然后， 可以通过培养来自 WCB 的工作细胞， 并收集培养液来制备人源化抗体。
     可以使用具有合适调节基因的多种表达载体来制备此类生产细胞系。 作为宿主细 胞， 可以使用通常用于表达哺乳动物蛋白质的宿主细胞来表达人源化抗体。此类宿主细胞 的例子包括但不限于中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞、 SP2/0-Ag14.19 细胞、 NSO 细胞、 等等。可以 通过选择表达载体和宿主细胞的最好组合来使人源化抗体的生产率最大化。此外， 应当探 索培养基的组成以从多种无血清培养基和补充物选择合适的培养基， 从而可以优化宿主细 胞的人源化抗体表达。
     基于效率和最终的产率， 可以使用本领域中公知的多种方法来自培养物上清液纯 化由宿主细胞生成的人源化抗体， 所述方法包括亲和层析、 离子交换层析、 疏水相互作用层 析、 等等。
     5.4. 药物组合物和治疗用途
     本发明提供了一种包含免疫特异性识别人 α9 整联蛋白的上述人源化抗体或其
     抗原结合片段的药物组合物。 包含本发明的人源化抗体作为活性成分的药物组合物可以作 为药剂用于预防和 / 或治疗与 α9 整联蛋白有关的病症或疾病， 包括但不限于癌症， 例如癌 细胞的生长或转移， 和炎性疾病， 例如类风湿性关节炎、 骨关节炎、 肝炎、 支气管哮喘、 纤维 化、 糖尿病、 动脉硬化、 多发性硬化、 肉芽肿、 炎性肠病 ( 溃疡性结肠炎和克罗恩氏病 )、 自身 免疫性疾病、 等等。
     也可以使用包含本发明的人源化抗体的药物组合物来治疗器官移植后慢性排斥 反应、 和自身免疫性疾病诸如系统性自身免疫性疾病、 全身性红斑狼疮 (erythematosus)、 葡萄膜炎、 贝切特 (Behcet) 氏病、 多肌炎、 肾小球增殖性肾炎 (glomerular proliferative nephritis)、 结节病、 由 α9 整联蛋白诱发的疾病状况、 等等。
     用于预防或治疗上文所描述的病症或疾病的预防和 / 或治疗剂 ( 其包含本发明的 人源化抗体 ) 具有低毒性， 而且可以作为通过在合适的溶剂中混合得到的液体制剂， 或者 作为合适剂量形式的药物组合物直接给人口服或胃肠外施用。
     用于上文所描述的施用的药物组合物含有上述抗体或其盐和药学可接受载体、 稀 释剂或赋形剂。此类组合物以适合于口服或胃肠外施用的剂量形式提供。
     剂量可以随要施用的受试者的年龄和体型、 目标疾病、 状况、 施用路径、 等等而所 有变化。在使用抗体来预防和 / 或治疗例如成年患者中的类风湿性关节炎时， 有利的是， 通 常以约 0.01 至约 20mg/kg 体重、 优选地约 0.1 至约 10mg/kg 体重、 且更优选地约 0.1 至约 5mg/kg 体重的单剂每天约 1 至 5 次、 优选地每天约 1 至 3 次静脉内施用本发明的抗体。在 其它胃肠外施用和口服施用中， 可以以与上文给定的剂量对应的剂量施用抗体。在状况特 别严重时， 可以根据状况增加剂量。 多种投递系统是已知的， 并且可以用于施用本发明的药物组合物， 例如脂质体中 的包囊、 微粒、 微囊剂、 能够表达突变体病毒的重组细胞、 受体介导的胞吞 ( 参见例如 Wu 和 Wu， 1987， J.Biol.Chem.262 ： 4429-4432)。导入的方法包括但不限于皮内、 肌肉内、 腹膜内、 静脉内、 皮下、 鼻内、 硬膜外、 和口服路径。化合物可以通过任何方便的路径， 例如通过输注 或推注， 通过经由上皮或粘膜皮肤衬里 ( 例如口腔粘膜、 直肠和肠粘膜、 等 ) 的吸收来施用， 而且可以与其它生物学活性剂一起施用。 施用可以是全身的或局部的。 还可采用肺部施用， 例如通过使用吸入器或喷雾器和含雾化剂的配制剂来实现。
     在一个具体的实施方案中， 可期望对需要治疗的区域局部施用本发明的药物组合 物； 这可以通过例如 ( 而不作为限制 ) 手术过程中的局部输注、 表面应用 ( 例如与手术后的 伤口敷料一起 )、 通过注射、 依靠导管、 依靠栓剂、 依靠鼻喷雾、 或者依靠植入物来进行， 所述 植入物是多孔的、 非多孔的、 或凝胶状的材料， 包括膜， 诸如硅橡胶膜、 或纤维。在一个实施 方案中， 可以通过在受感染组织部位 ( 或以前的部位 ) 直接注射进行施用。
     在另一个实施方案中， 药物组合物可以在囊泡， 特别是脂质体中投递 ( 参见 Langer， 1990， Science 249 ： 1527-1533 ； Treat 等， 于 Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer， Lopez Berestein 和 Fidler( 编 )， Liss， New York， 第 353 页 - 第 365 页 (1989) ； Lopez-Berestein， 同上， 第 317 页 - 第 327 页 ； 通常参见如上 )。
     在又一个实施方案中， 药物组合物可以在受控释放系统中投递。在一个实施方 案 中， 可 使 用 泵 ( 参 见 Langer， 见上文； Sefton， 1987， CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14 ： 201 ； Buchwald 等， 1980， Surgery 88 ： 507 ； 及 Saudek 等， 1989， N.Engl.J.Med.321 ： 574)。
     在另一个实施方案中， 可使用聚合材料 ( 参见 Medical Applications of Controlled Release， Langer 和 Wise( 编 )， CRC Pres.， Boca Raton， Florida(1974) ； Controlled Drug Bioavailability， Drug Product Design and Performance， Smolen 和 Ball( 编 )， Wiley， New York(1984) ； Ranger 和 Peppas， J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23 ： 61(1983) ； 还可参见 Levy 等， 1985， Science 228 ： 190 ； During 等， 1989， Ann.Neurol.25 ： 351 ； Howard 等， 1989， J.Neurosurg.71 ： 105)。在又一个实施方案中， 受控释放系统可以放置在组合物 的靶物附近， 如此仅需要系统剂量的一部分 ( 参见例如 Goodson， 于 Medical Applications of Controlled Release， 见上文， 第 2 卷， 第 115 页 - 第 138 页 (1984))。Langer(Science 249 ： 1527-1533(1990)) 的综述中讨论了其它受控释放系统。
     供口服施用的组合物的例子包括固体或液体剂量形式， 具体有片剂 ( 包括糖衣片 和薄膜衣片剂 )、 丸剂、 颗粒剂、 粉状制剂、 胶囊 ( 包括软胶囊 )、 糖浆剂、 乳剂、 悬浮液、 等。 此 类组合物通过众所周知的方法来制造备， 而且含有药用制剂领域中常规使用的媒介、 稀释 剂或赋形剂。供片剂用的媒介或赋形剂的例子有乳糖、 淀粉、 蔗糖、 硬脂酸镁、 等等。
     可注射制剂可以包括用于静脉内、 皮下、 皮内和肌肉内注射、 点滴输注、 等的剂量 形式。这些可注射制剂可以通过众所周知的方法来制备。可以例如通过在常规用于注射 的无菌水性介质或油性介质中溶解、 悬浮或乳化上文所描述的抗体或其盐来制备可注射制 剂。 作为供注射用的水性介质， 有例如生理盐水、 含有葡萄糖和其它辅助剂的等张溶液、 等， 其可以与合适的增溶剂诸如醇 ( 例如乙醇 )、 多元醇 ( 例如丙二醇、 聚乙二醇 )、 非离子型表 面活性剂 [ 例如聚山梨酯 80、 HCO-50( 氢化蓖麻油的聚氧乙烯 (50mol) 加合物 )]、 等组合 使用。作为油性介质， 有采用例如芝麻油、 大豆油、 等， 其可以与增溶剂诸如苯甲酸苄酯、 苯 甲醇、 等组合使用。优选地， 在合适的安瓿中装满如此制备的注射剂。可以通过将上述抗体 或其盐与供栓剂用的常规基质混合来制备用于直肠施用的栓剂。
     有利地， 将上文所描述的供口服或胃肠外使用的药物组合物制备成单位剂量的剂 量形式， 其适合于配合活性组分的剂量。此类单位剂量的剂量形式包括例如片剂、 丸剂、 胶 囊、 注射剂 ( 安瓿 )、 栓剂、 等。所含有的上述抗体量一般是每单位剂量的剂量形式约 5 至 500mg ； 尤其在注射剂形式中， 优选的是以约 5 至 100mg 包含上述抗体， 而对于其它剂量形式 以约 10 至 250mg 包含上述抗体。
     上文所描述的每种组合物可以进一步含有其它活性成分， 除非配制剂引起与上文 所描述的抗体的任何不利的相互作用。
     本发明还涉及用于细胞和 / 或组织重塑的抑制剂和 / 或促进剂， 其包含 α9 整联 蛋白结合性功能分子 ( 例如 OPN、 VCAM-1、 生腱蛋白 -C、 纤连蛋白、 pp-vWF、 tTG、 等 ) 作为活 性组分 ； 和用于抑制和 / 或促进细胞和 / 或组织重塑的方法， 其包括使表达 α9 整联蛋白的 细胞和 / 或组织 ( 例如肿瘤细胞、 嗜中性粒细胞、 平滑肌、 等 ) 与 α9 整联蛋白结合性功能 分子接触。 可以通过参照包含本发明人源化抗体的药物的前述描述适当地确定此类治疗剂 中的活性组分的剂量、 施用方法、 药用制剂、 等。
     如上文所描述的， 本发明进一步提供了一种用于预防或治疗与 α9 整联蛋白有关 或牵涉 α9 整联蛋白的病症或疾病的方法， 所述方法包括对有此需要的受试者施用有效量 的至少一种本发明的人源化抗体。
     5.5. 诊断用途包含本发明的人源化抗体的药物组合物可以作为癌症 ( 例如癌细胞的生长或转 移 )， 和炎性疾病 ( 例如类风湿性关节炎、 骨关节炎、 肝炎、 支气管哮喘、 纤维化、 糖尿病、 癌症转移、 动脉硬化、 多发性硬化、 肉芽肿、 等 ) 的诊断剂， 或者作为器官移植后慢性排斥 反应、 自身免疫性疾病诸如系统性自身免疫性疾病、 系统性红斑狼疮、 葡萄膜炎、 贝切特氏 病、 多肌炎、 肾小球增殖性肾炎、 结节病、 由 α9 整联蛋白诱发的疾病状况、 等等的诊断剂使 用。本发明的人源化抗体能够特异性识别 α9 整联蛋白， 因此可以用于量化测试流体中的 α9 整联蛋白， 尤其是用于通过三明治式免疫测定法、 竞争性测定法、 免疫测量法、 肾测量法 (nephrometry)、 等、 免疫染色、 等等进行的量化。 在将这些免疫学方法应用于本发明的测定 方法时， 不需要列出任何特定的条件、 规程、 等。通过向常规的条件和规程添加本领域中普 通的技术考虑因素足以构建测定系统。 关于这些通用技术手段的详情， 可以参照综述、 教科 书、 等等。
     如上文所描述的， 可以通过使用本发明的抗体以高灵敏度量化 α9 整联蛋白。本 发明的人源化抗体特别可用于诊断与 α9 整联蛋白有关的各种疾病， 其通过应用用于在体 内量化 α9 整联蛋白的方法来实现。例如， 在检测出 α9 整联蛋白表达水平升高或降低的 情况中， 可以诊断很有可能现在患有与 α9 整联蛋白有关的疾病， 例如癌症或炎性疾病， 或 者很有可能将来会患有这些疾病。如此， 本发明还提供了一种用于在受试者中诊断与 α9 整联蛋白有关或牵涉 α9 整联蛋白的病症或疾病的方法， 所述方法包括对有此需要的受试 者施用有效量的至少一种本发明的人源化抗体或两者。 此类体内诊断需要的剂量可以小于 治疗用途所需要的， 而且可以由本领域技术人员依照常规规程确定。
     还可以使用本发明的人源化抗体来特异性检测测试流体诸如体液、 组织、 等中存 在的 α9 整联蛋白。还可以使用人源化抗体来制备用于纯化 α9 整联蛋白的抗体柱， 检测 纯化时每个级分中含有的 α9 整联蛋白或分析 α9 整联蛋白在要测试的细胞中的行为。 6. 实施例
     以下实施例例示了免疫特异性识别人和 / 或小鼠 α9 整联蛋白的单克隆抗体的制 备、 单克隆抗体的可变区的测序和抗体的其它表征及此类抗体的嵌合化和人源化， 以及所 得的嵌合和人源化抗体的表征。这些实施例不应解释为限制性的。
     6.1. 针对人 α9 整联蛋白的小鼠抗体的制备
     依照扣除免疫法 (Williams C.V. 等， 1992， Biotechniques 12 ： 842-847) 来制备 6 针对人 α9 整联蛋白的小鼠单克隆抗体。 简言之， 以每只小鼠 3x10 个给 3 只 Balb/c 小鼠腹 膜内注射表达人 α9 整联蛋白的 NIH-3T3 细胞 ( 人 α9/NIH-3T3 细胞 )。 在注射后 1 和 2 周 6 时， 给小鼠腹膜内注射 3x10 个细胞 / 小鼠的人 α9/NIH-3T3 细胞， 接着是一周后， 以 2x106 个细胞 / 小鼠再次静脉内注射相同细胞。通过本领域中公知的方法制备杂交瘤 ( 参见例如 Harlow 等， Antibodies ： A Laboratory Manual， (Cold Spring Harbor Laboratory Press， 第 2 版 1988) ； Hammerling 等， 于： Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas， 第 563 页 - 第 681 页 (Elsevier， N.Y.， 1981))。建立生成与表达人 α9 整联蛋白的人 α9/CHO-K1 细胞和内源表达人 α9 整联蛋白的人黑素瘤细胞而非表达人 α4 整联蛋白的 CHO K1 细胞 有免疫特异性反应的单克隆抗体的杂交瘤克隆， 并分离生成免疫特异性识别人 α9 整联蛋 白的单克隆抗体的杂交瘤克隆 ( 即 K33N)。6.2. 对抗人 α9 整联蛋白抗体的 CDR 分析
     通过逆转录自相应的杂交瘤提取的 mRNA 以制备 cDNA 来测定单克隆抗体 ( 即 K33N) 的 CDR 的氨基酸序列。使用 cDNA 作为模板， 使用 ScFv 克隆引物 ( 轻链引物混合物和 重链引物混合物 ； Amersham Biosciences Corp.， IL) 通过 PCR 来延伸并扩增 H 链和 L 链的 可变区。将 PCR 产物克隆入 pCRII TOPO 载体中， 测序， 并确定氨基酸序列。将此过程重复 三次。表 1 中显示了结果。
     表1
     CDR CDRH1 CDRH2 CDRH3 CDRL1 CDRL2 CDRL3
     氨基酸序列 SYYMN WIFPGSGNTKYNEKFKG SWVSYERGYYFDY RASENIYYSLA NANSLED KQAYDVPYT SEQ ID NO ： 4 5 6 11 12 136.3. 细胞粘附抑制活性
     (1) 因为已知细胞粘附牵涉 α9 整联蛋白与其配体， 即各种 ECM( 包括 OPN、 纤连蛋 白、 生腱蛋白 -C、 VCAM-1、 等等 ) 的结合， 通过使用表达人 α9 整联蛋白的细胞 ( 人黑素瘤 G361 细胞 ) 与配体的结合来对分离的抗人 α9 整联蛋白抗体检查其细胞粘附抑制活性。
     简言之， 以牛血清清蛋白 (BSA)- 融合 SVVYGLR(SEQ ID NO ： 2) 肽来制备 OPN 肽。 通过在大肠杆菌宿主细胞中表达， 以人生腱蛋白 C 中的纤连蛋白 III 型重复的第三区制备 TN-C fn3(RAA)， 其中已经用 RAA 序列替换该肽的 GRD 序列。
     以 5μg/mL 将 OPN 肽和生腱蛋白 C 片段 (TN-C fn3(RAA)) 添加至 96 孔板， 并于 37℃温育 1 小时以包被平板， 然后用封闭溶液 (0.5％ BSA/PBS) 封闭平板。 将人黑素瘤 G361 5 细胞在 0.25％ BSA/DMEM 中悬浮 (1x10 个细胞 /mL)， 并将每个浓度的抗人 α9 整联蛋白抗 体添加至细胞悬浮液。将 0.25％ BSA/DMEM 中的人黑素瘤 G361 细胞 (1x105 个细胞 /mL) 和 抗体的混合物以 200μL/ 孔添加至 96 孔板， 并于 37℃在 5％ CO2 下温育 1 小时。用 PBS 洗 去非粘附细胞， 将粘附细胞固定， 并用 0.5％结晶紫 (WAKO， Osaka， Japan)/20％甲醇染色。 用蒸馏水将经染色的细胞清洗三次， 然后向其添加 20％乙酸溶液以实现溶解。通过测量 590nm 波长的 OD 来量化粘附活性。使用抗人 OPN 单克隆抗体 (5A1) 作为阴性对照和先前制 备的抗人 α9 整联蛋白抗体 (1K11、 21C5、 24I11、 25B6 和 28S1) 作为阳性对照。
     图 1 中显示了抗人 α9 整联蛋白抗体对 G361 细胞结合 OPN 肽的影响， 而图 2 中显 示了抗人 α9 整联蛋白抗体对 G361 细胞结合生腱蛋白 C 片段的影响。如图 1 中所显示的， 牵涉 OPN 的细胞粘附受与阳性对照 21C5 和 24I11 相比低浓度的和与 Y9A2 相同浓度的 K33N 抑制。牵涉生腱蛋白 C 的细胞粘附受低浓度的和与 Y9A2 相同浓度的 K33N 抑制， 抑制效果显著强于阳性对照 21C5 和 24I11。
     6.4. 非人抗体的人源化
     6.4.1. 小鼠 K33N V 基因的克隆和测序
     将小鼠 K33N 杂交瘤细胞在含有 10％胎牛血清 (FBS ； HyClone， Logan， UT) 的 TIL 培养基 I(Immuno-Biological Laboratories， Gunma， Japan) 中于 37℃在 7.5％ CO2 培养箱 中培养。使用 TRIzol 试剂 (Invitrogen， Carlsbad， CA) 依照供应商的方案自约 107 个杂 交瘤细胞提取总 RNA。使用 GeneRacer 试剂盒 (Invitrogen) 遵循供应商的方案来合成寡 聚 dT 引发的 cDNA。使用分别与小鼠 γ-1 和 κ 链恒定区退火的 3’ 引物和 GeneRacer 试 剂盒中提供的 GeneRacer 5’ 引物 (5’ -CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3’ )(SEQ ID NO ： 51) 用 Phusion DNA 聚合酶 (New England Biolabs， Beverly， MA) 通过聚合酶链式反应 (PCR) 来 扩增 K33N 重链和轻链的可变区 cDNA。为了重链可变区 (VH) 的 PCR 扩增， 3’ 引物具有序 列 5’ -GCCAGTGGATAGACAGATGG-3’ (SEQ ID NO ： 52)。为了轻链可变区 (VL) 的 PCR 扩增， 3’ 引物具有序列 5’ -GATGGATACAGTTGGTGCAGC-3’ (SEQ ID NO ： 53)。将扩增的 VH 和 VL cDNA 亚克隆入 pCR4Blunt-TOPO 载体 (Invitrogen) 中以进行序列测定。可变区的 DNA 测序在 Tocore(Menlo Park， CA) 实施。对数个重链和轻链克隆测序， 并鉴定与典型的小鼠重链和 轻链可变区同源的独特序列。图 3 和图 4 中分别显示了 K33N VH 和 VL 的共有 cDNA 序列及 推导的氨基酸序列。
     6.4.2. 嵌合 K33N IgG1/κ 抗体的构建
     使 用 K33N VH cDNA 作 为 模 板、 5’-GGGACTAGTACCACCATGGGATG GAGCTGGATCTTTCTC-3’ (SpeI 位点加下划线 )(SEQ ID NO ： 40) 作为 5’ 引物、 和 5’ -GGGAAG CTTGTTTTAAGGACTCACCTGAGGAGACTCTGAGACTG GTGCC-3’ (SEQ ID NO ： 41)(HindIII 位点加 下划线 ) 作为 3’ 引物通过 PCR 以包含剪接供体信号和合适的侧翼限制酶位点的外显子生 成编码 K33N VH 的基因 ( 图 5)。类似地， 使用 K33N VL cDNA 作为模板、 5’ -GGGGCTAGCACCA CCATGAGTGTGCCCACTCAACTCCTG-3’ (SEQ ID NO ： 42)(NheI 位点加下划线 ) 作为 5’ 引物、 和 5’ -GGGGAATTCTGAGAAGAC TACTTACGTTTTATTTCCAGCTTGGTCCCCCC-3’ (SEQ ID NO ： 43)(EcoRI 位点加下划线 ) 作为 3’ 引物通过 PCR 以包含剪接供体信号和合适的侧翼限制酶位点的外显 子生成编码 K33N VL 的基因 ( 图 6)。K33N VH 和 VL 外显子的剪接供体信号分别衍生自小 鼠种系 JH4 和 Jκ2 序列。使用 QIAquick 凝胶提取试剂盒 (Qiagen， Valencia， CA) 将 PCR 扩增的片段进行凝胶纯化， 用 SpeI 和 HindIII( 对于 VH) 或 NheI 和 EcoRI( 对于 VL) 将其 消化， 并克隆入携带人 γ-1 和 κ 恒定区的哺乳动物表达载体中以生成嵌合 K33N IgG1/κ 抗体。图 7 中显示了所得的表达载体 pChK33N 的示意结构。
     6.4.3. 人源化 K33N V 基因的生成
     如由 Queen 等 (Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86 ： 10029-10033， 1989) 所概述的那样 实施 K33N 可变区的人源化。首先， 借助于计算机程序来构建 K33N 可变区的分子模型。接 着， 基于针对人可变区序列的同源性搜索， 选择自 DA980102(GenBank 登录号 ) 衍生的人氨 基酸序列 ( 其与 K33N VH 具有高度同源性 ) 作为接受体以为人源化 K33N VH 提供框架。 小鼠 K33N 与 DA980102 VH 区之间的框架氨基酸同一性是 74.7％ (65/87)。类似地， 选择 X72441(GenBank 登录号 ) 的人氨基酸序列作为接受体以使 K33N VL 人源化。小鼠 K33N 和 X72441VL 区之间的框架氨基酸同一性是 76.3％ (61/80)。在计算机模型提示了与互补决定区 (CDR) 的显著接触的框架位置处， 用来自 K33N 可变区的氨基酸替换人框架氨基酸。这在第 28 位、 第 48 位、 第 66 位、 第 67 位和第 71 位 进行以生成人源化 K33N(HuK33N)VH( 图 8)。另外， 发现人 DA980102 接受体的第 82 位处的 Met 在人 VH 序列的相同亚组中是非典型的， 因此用最常见的氨基酸残基 (Leu) 替换以降低 潜在的免疫原性。对于轻链， 在残基 70 和 71 处进行替换以生成 HuK33N VL( 图 9)。图 8 中 对 VH 和图 9 中对 VL 显示了 K33N( 称作 HuK33N) 与人接受体氨基酸序列的比对。
     将编码 HuK33N VH 和 VL 之每种的基因设计为包含信号肽、 剪接供体信号、 和合适 的限制酶位点 ( 用于随后将其克隆入哺乳动物表达载体中 ) 的外显子。HuK33N VH 和 VL 外 显子的剪接供体信号分别衍生自人种系 JH4 和 Jκ1 序列。通过 SIG-Pred 信号肽预测软件 (http://bmbpcu36.leeds.ac.uk/prot_analysis/Signal.html) 指明小鼠 K33N VH 基因的 信号肽序列对于精确切割是亚最佳的。因此， 在 HuK33N VH 基因中使用小鼠抗人 α9 整联 蛋白单克隆抗体 24I11(Gene Techno Scienee) 的 VH 基因的信号肽序列， 其通过 SIG-Pred 软件预测为被有效且精确切割。人源化 K33N VL 外显子中的信号肽序列衍生自相应的小鼠 K33N VL 序列。SIG-Pred 软件指明 HuK33N VL 基因的信号肽被有效且精确切割。
     使用 ThermalAce DNA 聚合酶 (Invitrogen) 通过数种交叠的合成寡核苷酸引物的 延伸和 PCR 扩增来构建 HuK33N VH 和 VL 基因， 如由 He 等 (J.Immunol.160 ： 1029-1035， 1998) 所概述的。图 10 和图 11 中分别列出了用于构建 HuK33NVH 和 VL 基因的寡核苷酸。图 12 和图 13 中分别显示了寡核苷酸在 HuK33N VH 和 VL 基因中的位置。使用 QIAquick 凝胶提 取试剂盒 (Qiagen) 来将 PCR 扩增的片段进行凝胶纯化， 并将其克隆入 pCR4Blunt-TOPO 载 体中以进行序列测定。用 SpeI 和 HindIII( 对于 VH) 或 NheI 和 EcoRI( 对于 VL) 消化后， 将 HuK33NVH 和 VL 基因亚克隆入哺乳动物表达载体中的相应位点中以便以人 IgG1/κ 形式 生成。图 7 中显示了所得的表达载体 pHuK33N 的示意结构。图 14 和图 15 中分别显示了所 获得的 HuK33N VH 和 VL 基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列。
     6.4.4. 嵌合的和人源化的 K33N IgG1/κ 的瞬时表达
     依 照 Durocher 等 (Nucl.Acids Res.30 ： e9， 2002) 使 用 聚 乙 烯 亚 胺 来 分 别 将 pChK33N 和 pHuK33N 质粒 DNA 转染至 HEK293 细胞， 从而瞬时表达嵌合的和人源化的 K33N IgG1/κ 抗体。 将经瞬时转染的 HEK293 细胞在含有 10％ FBS 的 DMEM 中于 37℃在 7.5％ CO2 培养箱中维持 4 天。通过三明治式 ELISA 来测量培养物上清液中 ChK33N 和 HuK33N IgG1/ κ 抗体之每种的表达水平。用 100μl/ 孔 PBS 中 1/2,000 稀释的山羊抗人 IgG Fcγ 链特 异性多克隆抗体 (SouthernBiotech， Birmingham， AL) 于 4℃包被 ELISA 板过夜， 用清洗缓冲 液 ( 含有 0.05％ Tween 20 的 PBS) 清洗， 并用 300ul/ 孔的封闭缓冲液 ( 含有 2％脱脂奶和 0.05％ Tween 20 的 PBS) 于室温封闭 1 小时。用清洗缓冲液清洗后， 将 100μl/ 孔在 ELISA 缓冲液 ( 含有 1％脱脂奶和 0.025％ Tween 20 的 PBS) 中适当稀释的样品应用于 ELISA 板。 使用自人骨髓瘤血清纯化的人 IgG1/κ 抗体 (SouthernBiotech) 作为标准品。于室温将 ELISA 板温育 2 小时并用清洗缓冲液清洗后， 使用 100μl/ 孔的 1/2,000 稀释的偶联有 HRP 的山羊抗人 κ 链多克隆抗体 (SouthernBiotech) 来检测所结合的抗体。于室温温育 1 小 时并用清洗缓冲液清洗后， 通过添加 100μl/ 孔的 ABTS 底物 (bio WORLD， Dublin， OH) 来进 行显色。通过添加 100μl/ 孔的 2％草酸来停止显色。以 405nm 读取吸光度。
     通过细胞 ELISA 来检查瞬时表达的 ChK33N 和 HuK33N 抗体对人 α9 整联蛋白的结合。 将在表面上表达重组人 α9 整联蛋白的 CHO-K1 稳定转染子 (CHO/huα9 ； 由 Gene Techno 5 Science 提供 ) 以 2x10 个细胞 / 孔在 50μl 含有 10％ FBS 的 F12/DMEM(HyClone) 中在 96 孔 组织培养板中接种， 并于 37℃在 7.5％ CO2 培养箱中培养过夜。 为了测试对人 α9 整联蛋白 的结合， 将 50μl 含有 10％ FBS 的 F12/DMEM 中的 ChK33N、 HuK33N 或无关的人 IgG1/κ 骨髓 瘤抗体 (SouthernBiotech) 添加至每孔。 于 4℃温育 1 小时并用冰冷的 PBS 将细胞清洗两次 后， 将 100μl 1/1,000 稀释的偶联有 HRP 的山羊抗人 IgG 多克隆抗体 (SouthernBiotech) 添加至每孔。于 4℃温育 1 小时后， 用冰冷的 PBS 将细胞清洗三次。为了显色， 添加 100μl ABTS 底物。通过添加 100μl 2％草酸来停止显色。以 405nm 读取吸光度。结果显示了在 0.5 和 1μl/ml 两者， ChK33N 抗体对人 α9 整联蛋白的结合几乎与 HuK33N 抗体对人 α9 整 联蛋白的结合相同 ( 图 16)。
     6.4.5. 生成 ChK33N 和 HuK33N IgG1/κ 抗体之每种的 NS0 稳定转染子的生成
     为了获得稳定生成 ChK33N 和 HuK33N IgG1/κ 抗体的细胞系， 分别将表达载体 pChK33N 和 pHuK33N 导入小鼠骨髓瘤细胞系 NS0( 欧洲动物细胞培养物保藏中心 (European Collection of Animal Cell Cultures)， Salisbury， Wiltshire， UK) 的染色体中。将 NS0 细胞在含有 10％ FBS 的 DME 培养基中于 37℃在 7.5％ CO2 培养箱中培养。通过电穿孔来实 施进入 NS0 中的稳定转染， 如 Bebbington 等 (Bio/Technology 10 ： 169-175， 1992) 中所记 载的。转染前， 使用 FspI 来使表达载体线性化。用 10μg 线性化质粒转染约 107 个细胞， 将 其在含有 10％ FBS 的 DME 培养基中悬浮， 并分配入数块 96 孔板中。24 小时后， 应用选择培 养基 ( 含有 10％ FBS、 HT 培养基补充物 (Sigma， St.Louis， MO)、 0.25mg/ml 黄嘌呤和 1μg/ ml 霉酚酸的 DME 培养基 )。启动选择后约 10 天， 对培养物上清液测定抗体生成。
     通过三明治式 ELISA 本质上依照 6.4.3 一节中所描述的规程来测量 ChK33N 和 HuK33N IgGl/κ 抗体的表达。使用杂交瘤 SFM(Invitrogen) 来使生成高水平 ChK33N 抗 体的 NS0 稳定转染子 (NS0-ChK33N 3D11) 适应于在无血清培养基中的生长。通过有限稀 释将生成高水平 HuK33N 抗体的 NS0 稳定转染子在 96 孔板中进一步亚克隆。使亚克隆之 一 (NS0-HuK33N 8G8-11) 适应于在杂交瘤 SFM 中生长。用 PCR 枝原体检测组 (Takara Bio USA， Madison， WI) 进行的测试指明， NS0-ChK33N 3D11 和 NS0-HuK33N 8G8-11 两者在枝原 体存在方面呈阴性。
     通 过 cDNA 测 序 来 确 认 NS0-HuK33N 6D5-11 中 生 成 的 HuK33N 重 链 和 轻 链 的 真 实 性。 使 用 TRIzol 试 剂 (Invitrogen) 自 NS0-HuK33N 6D5-11 细 胞 提 取 总 RNA， 并使用 GeneRacer 试剂盒 (Invitrogen) 遵循制造商的方案来合成寡聚 dT 引发的 cDNA。使用 CMV2 和 JNT098 作为引物 ( 图 17) 和 Phusion 聚合酶 (New England Biolabs) 通过 PCR 扩增 γ-1 重链的编码区。将 PCR 片段进行凝胶纯化， 并用 CMV2、 JNT082、 JNT097 和 JNT098 作为引物 用 CMV2、 ( 图 17) 进行测序。 类似地， 使用 CMV2 和 JNT026( 图 17) 来扩增 κ 轻链的编码区。 JNT026、 JNT080 和 JNT084 作为引物 ( 图 17) 对凝胶纯化的 DNA 片段进行测序。HuK33N 重 链和轻链之每种的编码区获得的核苷酸序列与 pHuK33N 载体中的相应序列完全匹配 ( 分别 为图 18 和图 19)。
     6.4.6.ChK33N 和 HuK33N 抗体的纯化
     将 NS0-ChK33N 3D11 和 NS0-HuK33N 8G8-11 细胞在滚瓶中在杂交瘤 SFM 中培养 至耗尽。离心并过滤后， 将培养物上清液加载至蛋白 A Sepharose 柱 (GE Healthcare，Piscataway， NJ) 上。用 PBS 清洗柱， 之后用 0.1M 甘氨酸 -HCl(pH 3.0) 洗脱抗体。用 1M Tris-HCl(pH 8) 中和后， 通过透析将洗脱抗体的缓冲液更换成 PBS。 通过测量 280nm 的吸光 度来测定抗体浓度 (1mg/ml ＝ 1.4 个 OD)。 NS0-ChK33N 3D11 细胞的抗体表达水平是 50μg/ ml， 而 NS0-HuK33N8G8-11 细胞的抗体表达水平是 12μg/ml。
     通过 SDS-PAGE 依照标准的规程来表征纯化的 ChK33N 和 HuK33N 抗体。还原条件 下的分析指明 ChK33N 和 HuK33N 抗体之每种由具有约 50kDa 分子量的重链和具有约 25kDa 分子量的轻链构成 ( 图 20)。每种抗体的纯度表现为超过 95％。
     6.4.7.ChK33N 和 HuK33N 抗体的表征
     在用 CHO/huα9 细胞进行的 FACS 结合测定法中检查小鼠的、 嵌合的和人源化的 K33N 抗体对人 α9 整联蛋白的结合。用 FACS 结合缓冲液 ( 含有 0.5％ BSA 和 0.05％ NaN3 的 PBS) 清洗约 5x105 个 CHO/huα9 细胞 / 测试， 并在 200μl 含有多个量的测试抗体的 FACS 结合缓冲液中悬浮。在冰上 30 分钟后， 用 FACS 结合缓冲液清洗细胞。然后， 将用小鼠 K33N 染色的细胞在 100μl FACS 结合缓冲液中 1/200 稀释的经 FITC 标记的山羊抗小鼠 IgG 多 克隆抗体 (SouthernBiotech) 中悬浮。 将用嵌合或人源化 K33N 染色的细胞在 100μl FACS 结合缓冲液中 1/200 稀释的经 FITC 标记的山羊抗人 IgG 多克隆抗体 (SouthernBiotech) 中悬浮。在冰上 30 分钟后， 将细胞用 FACS 结合缓冲液清洗， 在 200μl FACS 结合缓冲液中 悬浮， 并使用 FACScan 流式细胞仪 (BD Biosciences， Franklin Lakes， NJ) 来分析。小鼠 K33N 抗体结合 CHO/huα9 细胞的 EC50 值是 104ng/ml( 图 21)。在 ChK33N 和 HuK33N 抗体 之间， 结合样式彼此非常相似 ( 图 22)。另外， ChK33N 和 HuK33N 抗体的 EC50 值彼此几乎相 同 (ChK33N 抗体为 143ng/ml， 而 HuK33N 抗体为 151ng/ml)。此结果指明小鼠 K33N 抗体在 不损失抗原结合亲和力的情况中成功人源化。
     6.4.8. 细胞粘附测定法
     用 50μL 5μg/mL hTNC(AEIDGIEL)-BSA 溶液于 37℃在 CO2 培养箱中将 96 孔平底 微量滴定板 (Nunc) 包被 1 小时。用 50μL 5μg/mL BSA 溶液包被对照孔。包被反应后， 用 200μL 0.5w/v％ BSA( 封闭 ) 溶液更换孔中的溶液， 并于室温温育 1 小时。封闭反应后， 用 PBS 清洗孔。将 150μL 含有 0.25w/v％ BSA 的 TIL 培养基中悬浮的 2.5x105 个细胞 /mL G-361 细胞和 50μL 测试抗体溶液 (0.25w/v％ BSA/TIL) 在孔中分配， 并于 37℃在 CO2 培养 箱中温育 1 小时。温育后， 用 PBS 溶液将每孔小心清洗三次以除去非粘附细胞。添加 50μL 0.5w/v％结晶紫溶液以将粘附细胞固定并染色。30 分钟后， 通过用一盆水清洗三次来除去 过量的染料， 并用 50μL 20v/v％乙酸溶解孔中的染料。使用吸收分光光度计来测量每孔 在 595nm 的吸光度。通过下式计算细胞粘附抑制率 ； (1-(A-B)/(C-B))x100(％ )。A ： 在存 在抗体的情况中用 hTNC-BSA 包被的孔的吸光度， B： 在没有任何测试抗体的情况中用 BSA 包 被的孔的吸光度， C： 在存在正常人 IgG( 阴性对照 ) 的情况中用 hTNC-BSA 包被的孔的吸光 度 ( 图 23)。
     结果
     Y9A2 的 IC50 是 0.053μg/ml(95 ％ CI ： 0.032-0.089)。K33N、 ChK33N 和 HuK33N 的 IC50 分 别 是 0.075μM(0.053-0.106)、 0.090μg/ml(0.063-0.128)、 0.084μg/ ml(0.055-0.129)， 指明测试抗体的 IC50 值与 Y9A2 的 IC50 值在相同水平上。
     7. 保藏本文中称为 K33N 的生成小鼠抗人 α9 整联蛋白单克隆抗体的杂交瘤依照微生 物保藏布达佩斯条约于 2007 年 5 月 29 日保藏于位于中心 6， 1-1-1Higashi， Tsukuba， Ibaraki( 邮 政 编 码 ： 305-8566) 的 国 际 专 利 生 物 体 保 藏 中 心 (International Patent Organisms Depository)， 国 家 先 进 工 业 科 学 技 术 研 究 所 (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology)， 并记录为登录号 FERM BP-10830， 通过提 及而将其完整收入本文。
     8. 工业实用性
     本发明的人源化单克隆抗体抑制 α9 整联蛋白的功能以对癌症， 例如癌细胞的生 长或转移， 和炎性疾病， 例如类风湿性关节炎、 骨关节炎、 肝炎、 支气管哮喘、 纤维化、 糖尿 病、 癌症转移、 动脉硬化、 多发性硬化、 肉芽肿、 炎性肠病 ( 溃疡性结肠炎和克罗恩氏病 )、 自 身免疫性疾病、 等等展现出治疗效果。
     9. 序列表
     下文汇总了贯穿整个说明书所提及的序列。
    
    
    
    
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