一种治疗白血病的药物组合物.pdf

摘要
申请专利号：	CN201410628570.5	申请日：	2014.11.11
公开号：	CN104473946A	公开日：	2015.04.01
当前法律状态：	撤回	有效性：	无权
法律详情：	发明专利申请公布后的视为撤回IPC(主分类):A61K 31/7032申请公布日:20150401\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):A61K 31/7032申请日:20141111\|\|\|公开
IPC分类号：	A61K31/7032; A61P35/02; A61K31/58(2006.01)N; A61K31/365(2006.01)N; A61K31/352(2006.01)N	主分类号：	A61K31/7032
申请人：	济南星懿医药技术有限公司
发明人：	孔倩倩
地址：	250101山东省济南市济南高新区工业南路51号
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内容摘要

本发明涉及一种治疗白血病的药物组合物，本发明药物是以桑色素、鬼臼毒素、肉珊瑚苷元、蜀羊泉次碱为原料药，配比而成，可按常规制剂工艺制成各种剂型，发明的药物组合物能提高NCK、IL-2、IL-6、IFN-γ活性，对治疗白血病具有良好的应用价值。

权利要求书

权利要求书
1.  一种治疗白血病的药物组合物，其特征在于制成该药物组合物的原料药的组成和重量份为：
桑色素10-30重量份  鬼臼毒素5-25重量份  肉珊瑚苷元15-20重量份蜀羊泉次碱2-18重量份。

2.  根据权利要求1所述：一种治疗白血病的药物组合物，其特征在于制成该药物组合物的原料药的组成和重量份为：
桑色素10重量份  鬼臼毒素25重量份肉珊瑚苷元15重量份蜀羊泉次碱18重量份。

3.  根据权利要求1所述：一种治疗白血病的药物组合物，其特征在于制成该药物组合物的原料药的组成和重量份为：
桑色素30重量份  鬼臼毒素5重量份肉珊瑚苷元20重量份蜀羊泉次碱2重量份。

4.  根据权利要求1所述：一种治疗白血病的药物组合物，其特征在于制成该药物组合物的原料药的组成和重量份为：
桑色素15重量份  鬼臼毒素20重量份肉珊瑚苷元17重量份蜀羊泉次碱18重量份。

5.  根据权利要求1所述：一种治疗白血病的药物组合物，其特征在于制成该药物组合物的原料药的组成和重量份为：
桑色素18重量份  鬼臼毒素15重量份  肉珊瑚苷元18重量份蜀羊泉次碱10重量份。

6.  根据权利要求1所述的一种治疗白血病的药物组合物，可以采用制剂学的常规方法制备成片剂、胶囊剂、滴丸。

7.  根据权利要求1所述的一种治疗白血病的药物组合物，其特征在于用于治疗白血病。

说明书

说明书一种治疗白血病的药物组合物
技术领域
本发明属于医药领域，涉及一种治疗白血病的药物组合物。
背景技术
白血病（Leukemia）是一种造血系统的恶性肿瘤，其特征为白细胞及其幼稚细胞也有幼稚红细胞或巨核细胞（即白血病细胞）在骨髓或其它造血组织中进行性、失控性的异常增生，浸润全身各种组织与脏器，并进入外周血液中。根据白血病细胞成熟的程度和白血病的自然过程，白血病主要可分为急性白血病和慢性白血病两大类。急性白血病起病急骤，因正常红细胞的减少而导致贫血、出血、继发感染和发热等症状。另外，因白血病细胞广泛浸润各组织脏器，亦导致肝、脾、淋巴结肿大及其它器官功能障碍。慢性白血病起病缓，病程较长，早期患者可无临床症状，最早出现的自觉症状往往是乏力、低热、多汗、盗汗、体重减轻等代谢亢进的表现，个别患者多于体检或其他检查时被发现。
白血病较为常见，约占癌症总发病率的5%左右，尤其以儿童和青年居多。在我国各年龄组恶性肿瘤的死亡率中白血病占第6位（男性）和第8位（女性），在儿童及35岁以下的人群中则占第1位。白血病的分布是世界性的
中医无白血病这一名词，但对白血病在临床出现的发热、贫血、出血、肝脾及淋巴结肿大等症状却早有记载，属于“虚老”、“急老”、“热老”等范畴，由于有出血亦属于“血证”，而发热又类似于“温病”。肝脾肿大明显者，可称为“癥积”（阴阳不和，脏腑虚弱，风邪搏之，是以为积），淋巴结肿大明显者可称为：“痰核”。说明祖国医学对白血病的认识是阴虚火动病本是内在虚损，阴阳不和，在脏腑虚弱的基础上，风邪热毒乘虚而入所致，而临床表现为虚实挟杂的综合表现。
现代白血病的治疗手段主要是化学疗法和骨髓移植疗法。近年来，随着联合化疗用于临床及完全缓解后维持、巩固治疗等策略的逐渐完善，以及新的抗白血病药物如去甲氧基柔红霉素（IDA），米托蒽醌（MIT），鬼臼乙叉苷（VP-16）及阿糖胞苷（Ara-C）的出现，白血病的治疗水平有了突破性进展。但因为化疗药物的毒副作用和骨髓来源困难等许多未能解决的问题，迫使人们一直在寻找新的治疗策略。中医药治疗白血病来由已久，以清热解毒、益气养阴为基本大法。近来越来越多的研究表明，中药在诱导细胞凋亡、细胞分化、逆转白血病细胞多药耐药和免疫调节等方面有明显的优势和特色，为白血病的根治提供了新的研究思路和线索。从中药中提取、研制了较多的抗白血病药物和制剂，实验证实这些中药确实具有抗白血病的作用，其作用机制包括抑制白血病细胞DNA、RNA合成，促进凋亡或诱导分化等。
三尖杉酯：从三尖杉植物中提取出的三尖杉酯碱和高三尖杉酯碱，能抑
制DNA合成，是一种细胞周期非特异性药物。有三尖杉酯碱或高三尖杉酯碱与阿糖胞苷组成的HA方案广泛用于急性非淋巴细胞白血病的治疗，疗效较好。
羟基喜树碱，羟基喜树碱是从我国特有的植物喜树种子中分离提取的一种微量生物碱。在体外主要抑制核酸尤其DNA合成，为S期特异性药物，拓扑异构酶I是其主要的作用部位。对治疗CML有一定疗效。
紫杉醇，紫杉醇能与微管结合使微管稳定性增强，抑制微管解聚，使细胞周期阻滞于分裂期。对淋巴瘤Raji细胞的增殖有明显抑制作用，经紫杉醇（4μg/ml）作用48小时后，细胞生长抑制率达82.6%,经形态学及流式细胞仪分析显示，细胞呈G2/M期阻滞和细胞凋亡。
大蒜素，随着大蒜素浓度和作用时间的增加，人白血病细胞株K562的S期细胞含量明显下降，G2/M期细胞含量有明显上升趋势，提示大蒜素的作用是通过将细胞阻留于G2/M期的结果。
青黛、靛玉红、甲异靛，青黛是在当归芦荟丸治疗CML有效的基础上逐一筛选发现的有效成分之一。靛玉红是从青黛中分离出的有效成分，可经化学合成制得。靛玉红对未经治疗的慢粒幼稚粒细胞增殖有不同程度的抑制作用，其作用原理可能是通过抑制白血病细胞DNA合成而抑制其增殖。甲异靛是合成靛玉红的类似产物，疗效高于靛玉红。最近的研究表明，甲异靛治疗CML的机制可能与甲异靛引起白血病细胞增殖受抑和细胞发生凋亡有关。
砒霜，《本草纲目》早有记载：“砒乃大热大毒之药，而砒霜之毒尤烈”。砒石经过升华成为砒霜，而砒霜的主要化学成分为三氧化二砷或亚砷酸。三氧化二砷可诱导细胞凋亡，降低细胞中bcl-2基因的表达可能是其作用的分子机制之一。
葛根，对葛根有效成分S86019的研究发现，S86019可抑制HL-60细胞增殖，使细胞由早幼粒细胞阶段发育为趋向成熟的细胞，且作用随着药物浓度的增加亦趋增强。S86019确是一个有效的HL-60细胞诱导分化剂。
榄香烯，从莪术中提取的榄香烯对人原始巨核细胞白血病细胞系Himeg细胞周期有明显的影响，其作用环节主要是影响细胞周期S期向G2/M期的转变过程，将白血病细胞阻滞在S期，减少进入G2/M期的细胞数量，抑制白血病细胞生长代谢，减少其有丝分裂，并导致受影响的肿瘤细胞快速凋亡。
巴豆，有人通过302种中药对HL-60细胞诱导分化及细胞毒的筛选实验，初步证实巴豆具有较显著的诱导白血病细胞想正常细胞分化的作用，该结果提示巴豆中某些成分可望成为治疗白血病的有效药物。
苦参，苦参对老年急性非淋巴细胞性白血病有较好的治疗作用，其机制可能是：对肿瘤细胞的直接杀伤作用；直接作用于耙DNA发挥其抗肿瘤作用；通过影响细胞周期发挥其抗肿瘤作用；通过诱导肿瘤细胞凋亡而发挥其抗肿瘤作用；通过诱导微粒体细胞色素P450发挥协同作用；通过免疫机制增强机体的抗肿瘤活性等。
青黄散，青黄散【青黛、雄黄（As2S3）】。用青黄散治疗CML有良好的疗效，用药后症状明显好转或消失时间为11.4天，平均10.1天脾脏开始缩小。实验研究表明，青黄散对L615、S180细胞的DNA、RNA合成有不同程度的抑制作用，其特点是抑制作用快，药物作用于细胞30分钟即达高峰；药物作用存在量效关系；对DNA、RNA均有明显抑制作用。在治疗过程中，利用造血干细胞培养等实验方法观察青黄散及马利兰对小鼠多能干细胞、粒系及红系祖细胞、末梢血象等各种细胞的影响，结果表明马利兰对上述各类细胞有明显抑制作用，而青黄散则无抑制作用，提示青黄散对白血病细胞可能具有选择性抑制作用。对CML患者骨髓细胞进行超微结构动态观察，发现白血病细胞主要发生以核溶解、核固缩、破碎及混合性为特征的变性坏死，表明青黄散治疗CML产生的疗效与其促进白血病细胞变性坏死的药理作用有关，即通过变性最终导致白血病细胞死亡。
癌灵1号，癌灵1号（吡石、轻粉）是当前我国中医中药治疗白血病特别是早幼粒细胞白血病最为有效的药物之一。其药理原理为中医的以毒攻毒作用。砷剂为中药中传统毒药，辛温有大毒。实验研究证明，砷化合物能与组织（蛋白质）中的巯基（—SH）结合，使蛋白质失去活性，因而抑制了白血病细胞增殖，起到了治疗白血病的作用。其次，对癌细胞有选择性细胞毒作用。实验研究发现癌灵1号在癌细胞和正常细胞之间有选择性，即使长期用药对骨髓造血功能亦无抑制，反而刺激造血功能。第三，具有诱导分化作用。运用三氧化二砷注射液治疗APL，观察CR病人的血象及骨髓象是发现77.3%的患者治疗后白细胞逐渐上升，于7-20天达高峰，在白细胞升高的同时，发现分类中早幼粒细胞比例减少，而中、晚幼粒细胞可分别达到0.12和0.15。第四，有促进细胞凋亡的作用。运用砷剂治疗白血病时发现，治疗CR后的病人骨髓中可见到粒细胞退行性改变，胞浆及核有空泡变性，和染色质固缩，凝集不均及核破裂—“凋亡小体”，用流失细胞仪检测可见凋亡细胞峰。
六神丸，六神丸（珍珠粉、牛黄、麝香、蟾酥、冰片）具有清热解毒、化瘀止痛之功。药理证明六神丸中的牛黄含胆红素、麦角固醇，有促进红细胞新生、镇静、抗惊厥、强心等作用；蟾酥含蟾酥二烯醇、肾上腺素、麦角醇、儿茶酚胺类化合物，具有强心、升压、抗癌等作用；雄黄含三硫化二砷，能抑制巯基酶系统以影响细胞代谢，因而对肿瘤细胞的生长有抑制作用，其他尚有珍珠、冰片、麝香等有抗霉菌、抑制细菌、兴奋中枢神经系统等作用。六神丸治疗白血病，用于诱导缓解，对粒细胞系统有明显抑制作用，但对骨髓抑制则不甚明显，并可预防和治疗口腔溃疡、扁桃体炎等。
复方青黛片，复方青黛片（青黛、太子参、丹参、雄黄等）实验研究表明，雄黄具有诱导APL细胞（NB4）和HL-60细胞凋亡的作用。
血复康，血复康（青黛、莪术、葛根等）实验研究证实，血复康能抑制K562细胞生长并使其发生凋亡。
桑色素（morin）：CAS号：480-16-0，分子式：C15H10O7，化学名：3，5，7，2′，4′-pentahydroxyflavone,(3,5,7,2′,4′-五羟黄酮）。抗菌、抗癌、抑制酶活性、具有抗氧化、抗痛、抗菌、抗炎、抗动脉粥样硬化、降低血糖和抗应激等作用。
鬼臼毒素（podophyllotoxin）：CAS号518-28-5，分子式C22H22O8：分子量414.41，理化性质：白色针状结晶粉末。易溶于氯仿、丙酮、乙酸乙酯和苯，可溶于于乙醇，乙醚，不溶于水。鬼臼毒素是从小蘖科鬼臼属植物---华鬼臼（又称鸡苔素）的根和茎中提取到的木脂类抗肿瘤成份。为白色结晶性粉末，无嗅，有吸湿性。华鬼臼主要分布在我国的甘肃省等地。从华鬼臼（又称鸡苔素）中提取到的鬼臼毒素可以制成膏剂和酊剂。鬼臼毒素能有效抑制疱疹病毒，抑制细胞中期的有丝分裂，用于毒性性病。
肉珊瑚苷元（sarcostin）：CAS号18607-76-6，分子式C21H34O6，分子量382.50。
蜀羊泉次碱（soladulcidine）：又称蜀羊泉碱。CAS号511-98-8，分子式C27H45NO2，分子量415.66，熔点209～211℃。旋光度[α]D-50°(c=0.4，氯仿)。天然存在于茄科植物苦茄(蜀羊泉，千年不烂心)(Solanum dulcamara L.)的果实等植物中。具有抗真菌作用。对麦角菌、稻瘟病菌等有抑制活性。
本发明药物组合物的4种药物结构如下：

桑色素（morin）                鬼臼毒素（podophyllotoxin）

肉珊瑚苷元（sarcostin）         蜀羊泉次碱（soladulcidine）。
发明内容
本发明的目的是克服背景技术的不足，提供一种治疗白血病的药物组合物。
本发明是通过如下技术方案实现的：
本发明的一种治疗白血病的药物组合物的原料药的组成和重量份为：
桑色素10-30重量份  鬼臼毒素5-25重量份  肉珊瑚苷元15-20重量份蜀羊泉次碱2-18重量份。
本发明的一种治疗白血病的药物组合物可以采用制剂学的常规方法制备成片剂、胶囊剂、滴丸。
本发明的一种治疗白血病的药物组合物，其特征在于用于治疗白血病。

本发明所得药物组合物，可通过调节T细胞亚群比例及促进这些细胞因子的分泌发挥其免疫调节作用，恢复自身受抑的免疫功能来杀伤残留的白血病细胞，从而证实其具有诱生IL-2，IL-6和IFN-γ的作用，对白血病的治疗机免疫功能重建有一定的作用。我们的实验结果还表明，本发明所得药物组合物具有增强IL-2和NCK活性作用，说明本发明药物组合物对化疗后P388白血病小鼠的免疫抑制有一定的保护作用。推测其作用机理可能与增强红细胞免疫粘附功能，促使红细胞释放NCK激活因子，调节NCK-IFN-IL-2免疫网络有关。
具体实施方式
下面通过具体实验例和实施例对本发明的一种治疗白血病药物组合物及其制备方法做进一步说明，但不限于本发明。
实施例1：治疗白血病的药物组合物
治疗白血病的药物组合物的原料药的组成和重量份为：
桑色素10重量份  鬼臼毒素25重量份肉珊瑚苷元15重量份蜀羊泉次碱18重量份
实施例2：治疗白血病的药物组合物
治疗白血病的药物组合物的原料药的组成和重量份为：
桑色素30重量份  鬼臼毒素5重量份肉珊瑚苷元20重量份蜀羊泉次碱2重量份
实施例3：治疗白血病的药物组合物
治疗白血病的药物组合物的原料药的组成和重量份为：
桑色素15重量份  鬼臼毒素20重量份肉珊瑚苷元17重量份蜀羊泉次碱18重量份
实施例4：治疗白血病的药物组合物
治疗白血病的药物组合物的原料药的组成和重量份为：
桑色素18重量份  鬼臼毒素15重量份  肉珊瑚苷元18重量份蜀羊泉次碱10重量份
实施例5：片剂的制备
取实施例1组合物150g，加入淀粉75g，混匀，制粒，干燥，加微晶纤维素20g，硬脂酸镁2.5g，混匀，压制成1000片, 即得本发明组合物片剂。
实施例6：胶囊的制备
取实施例2组合物165g，加入淀粉65g，混匀，制粒，干燥，整粒，加入适量硬脂酸镁，混匀，装胶囊1000粒，即得本发明组合物胶囊。
实施例7：滴丸的制备
称取聚乙二醇 6000  200g水浴(80℃)加热煮熔，加入实施例3组合物50g，充分搅拌均匀，以液体石蜡为冷却剂，置玻璃管（4*80cm）中，冷却温度为10℃，滴口内外径为7.0/2.0(mm/mm)，滴口距液面为2cm，滴速以每分50滴为最佳条件，用棉布吸干滴丸表面的冷凝剂，即得本发明组合物滴丸。
实验例1：药物组合物对L615白血病小鼠的药效试验
1.造模方法：在无菌条件下取L615白血病小鼠脾制成25%生理盐水细胞悬液，给成年L615小鼠皮下接种，结果均发生白血病，用发病小鼠脾瘤细胞在同系小鼠连续移植，建立稳定的L615白血病模型。
L615白血病细胞株的建立，去L615白血病小鼠的脾，在Hanks液内将脾剪碎，使白血病细胞游离出来，通过离心收集游离细胞，然后用RPMI1640培养液（含10%小牛血清）稀释成8*106/ml的细胞液，在37℃下培养。培养20d发现培养物中有贴壁的棱形细胞，其周围有增殖的圆形细胞小岛。将两种形态不同的细胞分开培养时，梭形细胞可以正常贴壁生长，而悬浮细胞生长缓慢；再将两种细胞重新混合培养，两种细胞生长旺盛，45d后，将悬浮生长的圆形细胞再次单独培养，一直传到12代，细胞生长良好，从而建立此细胞株。
2.药物组合物治疗白血病药效试验。
材料：昆明种小鼠（山东省实验动物中心）。实施例1、实施例2、实施例4得到药物组合物，环磷酰胺（江苏恒瑞医药股份有限公司），标准重组人白介素-2（北京双鹭药业股份有限公司），Yackl及IL-2依赖细胞株CTLL（中国科学院上海生命科学院细胞资源中心），RPMII640细胞培养液及胎牛血清（华美生物工程公司）；四甲基偶氮唑盐（MTT），十二烷基磺酸钠及刀豆球蛋白，二甲基甲酰胺为(Sigma公司产品)；加样器，CO2培养箱，ELX-800酶标仪（美国Bio-Tek公司）；96孔平底细胞培养板，Epics流式细胞仪（美国Beckman公司）。
方法:按上述方法造模。实验分组第一组为正常对照组，20只615系小鼠，常规饲养1w后，腹腔注射生理盐水0.2ml/d，生理盐水灌肠0.3ml,上、下午各1次。第2组为模型组，常规饲养1w后，接种L615白血病细胞，接种后处理同正常对照组。第3组为西药组，20只常规饲养一周后，接种L615白血病细胞，接种后第3天开始ip环磷酰胺，200mg/kg，1次/d。第4组-第6组分别为药物组合物组（实施例1）、药物组合物组（实施例2）、药物组合物组（实施例4），分别取20只常规饲养1d后，接种L615白血病细胞，接种后第3天分别给予药物组合物组（实施例1）、药物组合物组（实施例2）、药物组合物组（实施例4）灌胃，0.3ml，上、下午各1次。以上各组动物每组取10只于第5天处死，取脾脏进行相关免疫指标检测，余下各动物进行生存期观察。
观察指标：①生存期观察。②T细胞亚群测定。③IL-2，IL-6，IFN-γ活性测定。
统计学方法：数据以X±s表示，采用Mi-crosoft Excel 进行t检验。
结果:
生存期:本发明药物组合物组生存期较模型组和西药组明显延长，统计学有显著差异P<0.01，见表1.
表1 各实验组生存期比较
组别只数生存时间（d）模型组 10 5.89±0.45 西药组 10 16.86±1.27* 药物组合物组（实施例1） 10 27.77±2.46*△ 药物组合物组（实施例2） 10 26.45±2.87*△ 药物组合物组（实施例4） 10 26.55±2.35*△
注：与模型组相比*P<0.01，与西药组相比△P<0.01。
IL-2，IL-6，IFN-γ活性:西药组白血病小鼠化疗后，其分泌IL-2，IL-6，IFN-γ的水平显著下降，而本发明药物组合物组IL-2，IL-6，IFN-γ的分泌水平明显增加，两者对比有显著性差异（P<0.01），见表2。
表2  各组IL-2，IL-6，IFN-γ活性变化
组别只数 IL-2 IL-6 IFN-γ 正常对照组 10 21.38±1.14 44.46±4.51 12.34±1.87 模型组 10 7.88±1.23* 16.45±4.32* 8.87±2.67* 西药组 10 6.25±1.34△ 11.27±4.11△ 5.65±1.76△ 药物组合物组（实施例1） 10 16.34±2.02▲ 32.54±1.67▲△ 10.02±1.34▲△ 药物组合物组（实施例2） 10 17.43±2.12▲ 34.56±2.80▲△ 10.34±1.66▲△ 药物组合物组（实施例4） 10 17.10±1.89▲ 33.14±2.07▲△ 10.29±1.89▲△
注：与正常对照组相比*P<0.01，与模型组相比△P<0.01，与西药组相比▲P<0.01。
免疫功能的正常与否是肿瘤发生发展的重要因素之一，而免疫功能是通过免疫细胞所分泌的细胞因子所执行的，白血病小鼠化疗后T细胞亚群比例失调，IL-2，IL-6，IFN-γ等细胞因子分泌水平下降，提示此时机体的免疫功能处于抑制状态。而通过使用本发明药物组合物治疗后， IL-2，IL-6，IFN-γ等细胞因子分泌水平回升，说明本发明药物组合物可通过促进这些细胞因子的分泌发挥其免疫调节作用，恢复自身受抑的免疫功能来杀伤残留的白血病细胞，从而证实本发明药物组合物具有诱生IL-2，IL-6和IFN-γ的作用，对白血病的治疗机免疫功能重建有一定的作用。
实验例2：药物组合物对P388白血病小鼠的药效学试验
1.造模方法：取腹水型P388白血病小鼠，脱颈椎处死，腹部消毒，抽吸腹水，加入生理盐水混匀，显微镜下调整细胞浓度为（1-1.5）*107个/ml，每鼠0.2ml（昆明种小鼠的接种浓度和剂量）进行腹腔注射。
2.药物组合物对P388白血病小鼠化疗后自然杀伤细胞（NCK）、白介素-2(IL-2)活性的影响。
材料：昆明种一级小鼠（山东省实验动物中心），50只，雌雄各半，体重18-22g。实施例4制备的药物组合物，环磷酰胺（江苏恒瑞医药股份有限公司），标准重组人白介素-2（北京双鹭药业股份有限公司），Yackl及IL-2依赖细胞株CTLL（中国科学院上海生命科学院细胞资源中心），RPMII640细胞培养液及胎牛血清（华美生物工程公司）；四甲基偶氮唑盐（MTT），十二烷基磺酸钠及刀豆球蛋白，二甲基甲酰胺为(Sigma公司产品)；加样器，CO2培养箱，ELX-800酶标仪（美国Bio-Tek公司）；96孔平底细胞培养板，Epics流式细胞仪（美国Beckman公司）。
造模与分组方法：取40只小鼠，接种P388 淋巴细胞白血病瘤株（接种方法：取腹水型P388白血病小鼠，脱颈椎处死，腹部消毒，抽吸腹水，加入生理盐水混匀，显微镜下调整细胞浓度为1.5*107个/ml，每只小鼠右腋下注射0.2ml），随机分为4组。另10只为正常空白组。
处理方法：①正常空白组：以0.4ml/20g生理盐水ig；②P388白血病模型组：以0.4ml/20g生理盐水ig；③单纯化疗组：以0.4ml/20g生理盐水ig；④化疗加药物组合物低剂量组：分别以50mg药物组合物于0.4ml生理盐水ig；⑤化疗加药物组合物高剂量组：以100mg提取物溶于0.4ml生理盐水ig。以上各组连续ig14d，同时给予③、④、⑤组ip环磷酰胺35mg/kg/d，连用6d。于第15天脱颈椎处死，在无菌条件下取脾脏NCK、IL-2活性。
检测方法：NCK活性检测参照蒋中华法，IL-2活性检测方法参照钱玉坤法。
统计学方法：采用多组均数比较，即先作方差分析，再作q检验。
结果：结果表明，本发明药物组合物能提高NCK及IL-2活性。见表3
表3  各组NCK及IL-2活性比较
组别 n NCK活性（%） IL-2活性（Iu/ml）正常对照组 8 42.10±2.45 18.66±2.56 模型对照组 8 34.34±2.34* 14.34±2.08* 化疗组 8 26.07±2.25**△△ 10.22±2.38**△△ 化疗加药物组合物低剂量组 8 35.33±2.36** 14.05±2.56** 化疗加药物组合物高剂量组 8 38.33±2.57** 16.76±2.55##
注：与正常组比较，*P<0.05，** P<0.01；与模型组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与化疗组比较，# P<0.05，##P<0.01。
NCK是三大类淋巴细胞之一，是机体早期抗肿瘤免疫监督功能的重要组成成分，是一群广谱抗肿瘤细胞，其杀伤活性不需要抗原事先致敏，不依赖抗体和胸腺，也不受主要组织相容性抗原（MHC）的限制。NCK在体内针对病毒感染细胞和肿瘤细胞不需要特异抗原刺激，免疫复合物和靶细胞表面结构均可直接诱发NCK的免疫反应，迅速分泌大量细胞因子如干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、粒单细胞集落刺激因子（GM CSF）、IL-2等，调节吞噬细胞及T、B细胞功能。同时IL-2、IFN又可增加NCK的活性，故有学者认为机体存在NCK-IFN-IL-2免疫网络。IL-2主要是由T细胞产生的15KD的糖蛋白，并作用于T细胞，促使T细胞增殖。IL -2是机体内最主要、最强有力的T细胞生长因子。IL-2可诱导或促进多种细胞毒性细胞的活性，如NCK、细胞毒性T淋巴细胞（CTL）、淋巴因子活化的杀伤细胞（LAK）和肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）等，这些细胞在机体的免疫监视和抗肿瘤免疫方面至关重要。我们的实验结果表明，P388白血病小鼠自身及化疗后免疫功能受到抑制，NCK及IL-2活性均有不同程度的降低，化疗后P388白血病小鼠明显低于正常组及模型组。这是由于化疗药对免疫系统的影响，在杀伤肿瘤细胞的同时也杀伤或抑制了LAK细胞所致。近年来研究发现，荷瘤机体的NCK活性降低，可能与机体荷瘤时，其免疫细胞的细胞因子网络抗肿瘤作用失常有关，如血清中免疫抑制因子存在且活性增强，免疫促进因子活性下降。在此基础上给予化疗药后可能通过抑制IFN的生成从而使     NCK活性进一步受到抑制。在正常机体，IL-2具有自身正向免疫调节作用，但在大多数荷瘤机体，IL-2系统存在明显抑制或紊乱。多数研究者认为，肿瘤患者产生IL-2的能力和对IL-2反应性皆有不同程度降低，可能与IL-2分解代谢亢进或宿主体内抑制性巨噬细胞和抑制性T细胞功能增强有关。给予化疗药后IL-2的诱生进一步受到抑制，从而加重荷瘤机体免疫力的下降。给予本发明药物组合物治疗后，高剂量组NCK及IL-2均有明显升高。我们的实验结果表明，毛莲菜提取物具有增强IL-2和NCK活性作用，说明本发明药物组合物对化疗后P388白血病小鼠的免疫抑制有一定的保护作用。推测其作用机理可能与增强红细胞免疫粘附功能，促使红细胞释放NCK激活因子，调节NCK-IFN-IL-2免疫网络有关。

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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410628570.5 (22)申请日 2014.11.11 A61K 31/7032(2006.01) A61P 35/02(2006.01) A61K 31/58(2006.01) A61K 31/365(2006.01) A61K 31/352(2006.01) (71)申请人济南星懿医药技术有限公司地址 250101 山东省济南市济南高新区工业南路 51 号 (72)发明人孔倩倩 (54) 发明名称一种治疗白血病的药物组合物 (57) 摘要本发明涉及一种治疗白血病的药物组合物，本发明药物是以桑色素、鬼臼毒素、。

2、肉珊瑚苷元、蜀羊泉次碱为原料药，配比而成，可按常规制剂工艺制成各种剂型，发明的药物组合物能提高 NCK、 IL-2、 IL-6、 IFN- 活性，对治疗白血病具有良好的应用价值。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书1页说明书9页 (10)申请公布号 CN 104473946 A (43)申请公布日 2015.04.01 CN 104473946 A 1/1 页 2 1.一种治疗白血病的药物组合物，其特征在于制成该药物组合物的原料药的组成和重量份为：桑色素 10-30 重量份鬼臼毒素 5-25 重量份肉珊瑚。

3、苷元 15-20 重量份蜀羊泉次碱 2-18 重量份。 2.根据权利要求 1 所述：一种治疗白血病的药物组合物，其特征在于制成该药物组合物的原料药的组成和重量份为：桑色素10重量份鬼臼毒素25重量份肉珊瑚苷元15重量份蜀羊泉次碱18重量份。 3.根据权利要求 1 所述：一种治疗白血病的药物组合物，其特征在于制成该药物组合物的原料药的组成和重量份为：桑色素 30 重量份鬼臼毒素 5 重量份肉珊瑚苷元 20 重量份蜀羊泉次碱 2 重量份。 4.根据权利要求 1 所述：一种治疗白血病的药物组合物，其特征在于制成该药物组合物的原料药的组成和重量份为：桑。

4、色素15重量份鬼臼毒素20重量份肉珊瑚苷元17重量份蜀羊泉次碱18重量份。 5.根据权利要求 1 所述：一种治疗白血病的药物组合物，其特征在于制成该药物组合物的原料药的组成和重量份为：桑色素 18 重量份鬼臼毒素 15 重量份肉珊瑚苷元 18 重量份蜀羊泉次碱 10 重量份。 6.根据权利要求 1 所述的一种治疗白血病的药物组合物，可以采用制剂学的常规方法制备成片剂、胶囊剂、滴丸。 7.根据权利要求 1 所述的一种治疗白血病的药物组合物，其特征在于用于治疗白血病。权利要求书 CN 104473946 A 2 1/9 页 3 一种治疗白血病的药物组。

5、合物技术领域 0001 本发明属于医药领域，涉及一种治疗白血病的药物组合物。背景技术 0002 白血病（Leukemia）是一种造血系统的恶性肿瘤，其特征为白细胞及其幼稚细胞也有幼稚红细胞或巨核细胞（即白血病细胞）在骨髓或其它造血组织中进行性、失控性的异常增生，浸润全身各种组织与脏器，并进入外周血液中。根据白血病细胞成熟的程度和白血病的自然过程，白血病主要可分为急性白血病和慢性白血病两大类。急性白血病起病急骤，因正常红细胞的减少而导致贫血、出血、继发感染和发热等症状。另外，因白血病细胞广泛浸润各组织脏器，亦导致肝、脾、淋巴结肿大及其它器官功能。

6、障碍。慢性白血病起病缓，病程较长，早期患者可无临床症状，最早出现的自觉症状往往是乏力、低热、多汗、盗汗、体重减轻等代谢亢进的表现，个别患者多于体检或其他检查时被发现。 0003 白血病较为常见，约占癌症总发病率的 5% 左右，尤其以儿童和青年居多。在我国各年龄组恶性肿瘤的死亡率中白血病占第 6 位（男性）和第 8 位（女性），在儿童及 35 岁以下的人群中则占第 1 位。白血病的分布是世界性的中医无白血病这一名词，但对白血病在临床出现的发热、贫血、出血、肝脾及淋巴结肿大等症状却早有记载，属于 “虚老” 、“急老” 、“热老” 等范畴，由于。

7、有出血亦属于 “血证” ，而发热又类似于 “温病” 。肝脾肿大明显者，可称为 “癥积” （阴阳不和，脏腑虚弱，风邪搏之，是以为积），淋巴结肿大明显者可称为：“痰核” 。说明祖国医学对白血病的认识是阴虚火动病本是内在虚损，阴阳不和，在脏腑虚弱的基础上，风邪热毒乘虚而入所致，而临床表现为虚实挟杂的综合表现。 0004 现代白血病的治疗手段主要是化学疗法和骨髓移植疗法。近年来，随着联合化疗用于临床及完全缓解后维持、巩固治疗等策略的逐渐完善，以及新的抗白血病药物如去甲氧基柔红霉素（IDA），米托蒽醌（MIT），鬼臼乙叉苷（VP-16）及阿糖胞苷。

8、（Ara-C）的出现，白血病的治疗水平有了突破性进展。但因为化疗药物的毒副作用和骨髓来源困难等许多未能解决的问题，迫使人们一直在寻找新的治疗策略。中医药治疗白血病来由已久，以清热解毒、益气养阴为基本大法。近来越来越多的研究表明，中药在诱导细胞凋亡、细胞分化、逆转白血病细胞多药耐药和免疫调节等方面有明显的优势和特色，为白血病的根治提供了新的研究思路和线索。从中药中提取、研制了较多的抗白血病药物和制剂，实验证实这些中药确实具有抗白血病的作用，其作用机制包括抑制白血病细胞 DNA、 RNA 合成，促进凋亡或诱导分化等。 0005 三尖杉酯：从三尖杉。

9、植物中提取出的三尖杉酯碱和高三尖杉酯碱，能抑制 DNA 合成，是一种细胞周期非特异性药物。有三尖杉酯碱或高三尖杉酯碱与阿糖胞苷组成的 HA 方案广泛用于急性非淋巴细胞白血病的治疗，疗效较好。 0006 羟基喜树碱，羟基喜树碱是从我国特有的植物喜树种子中分离提取的一种微量生物碱。在体外主要抑制核酸尤其 DNA 合成，为 S 期特异性药物，拓扑异构酶 I 是其主要的作说明书 CN 104473946 A 3 2/9 页 4 用部位。对治疗 CML 有一定疗效。 0007 紫杉醇，紫杉醇能与微管结合使微管稳定性增强，抑制微管解聚，使细胞周期阻滞于分裂期。对淋巴瘤 Ra。

10、ji 细胞的增殖有明显抑制作用，经紫杉醇（4g/ml）作用 48 小时后，细胞生长抑制率达 82.6%, 经形态学及流式细胞仪分析显示，细胞呈 G2/M 期阻滞和细胞凋亡。 0008 大蒜素，随着大蒜素浓度和作用时间的增加，人白血病细胞株 K562的 S 期细胞含量明显下降， G2/M 期细胞含量有明显上升趋势，提示大蒜素的作用是通过将细胞阻留于 G2/M 期的结果。 0009 青黛、靛玉红、甲异靛，青黛是在当归芦荟丸治疗 CML 有效的基础上逐一筛选发现的有效成分之一。靛玉红是从青黛中分离出的有效成分，可经化学合成制得。靛玉红对未经治疗的慢粒幼稚粒细胞增殖有。

11、不同程度的抑制作用，其作用原理可能是通过抑制白血病细胞 DNA 合成而抑制其增殖。甲异靛是合成靛玉红的类似产物，疗效高于靛玉红。最近的研究表明，甲异靛治疗 CML 的机制可能与甲异靛引起白血病细胞增殖受抑和细胞发生凋亡有关。 0010 砒霜，本草纲目早有记载：“砒乃大热大毒之药，而砒霜之毒尤烈” 。砒石经过升华成为砒霜，而砒霜的主要化学成分为三氧化二砷或亚砷酸。三氧化二砷可诱导细胞凋亡，降低细胞中 bcl-2 基因的表达可能是其作用的分子机制之一。 0011 葛根，对葛根有效成分S86019的研究发现， S86019可抑制HL-60细胞增殖，使细胞由早幼粒细胞阶。

12、段发育为趋向成熟的细胞，且作用随着药物浓度的增加亦趋增强。S86019 确是一个有效的 HL-60 细胞诱导分化剂。 0012 榄香烯，从莪术中提取的榄香烯对人原始巨核细胞白血病细胞系 Himeg 细胞周期有明显的影响，其作用环节主要是影响细胞周期 S 期向 G2/M 期的转变过程，将白血病细胞阻滞在 S 期，减少进入 G2/M 期的细胞数量，抑制白血病细胞生长代谢，减少其有丝分裂，并导致受影响的肿瘤细胞快速凋亡。 0013 巴豆，有人通过302种中药对HL-60细胞诱导分化及细胞毒的筛选实验，初步证实巴豆具有较显著的诱导白血病细胞想正常细胞分化的作用，该结果提示。

13、巴豆中某些成分可望成为治疗白血病的有效药物。 0014 苦参，苦参对老年急性非淋巴细胞性白血病有较好的治疗作用，其机制可能是：对肿瘤细胞的直接杀伤作用；直接作用于耙 DNA 发挥其抗肿瘤作用；通过影响细胞周期发挥其抗肿瘤作用；通过诱导肿瘤细胞凋亡而发挥其抗肿瘤作用；通过诱导微粒体细胞色素 P450 发挥协同作用；通过免疫机制增强机体的抗肿瘤活性等。 0015 青黄散，青黄散【青黛、雄黄（As2S3）】。用青黄散治疗 CML 有良好的疗效，用药后症状明显好转或消失时间为 11.4 天，平均 10.1 天脾脏开始缩小。实验研究表明，青黄散对 L6。

14、15、 S180细胞的 DNA、 RNA 合成有不同程度的抑制作用，其特点是抑制作用快，药物作用于细胞 30 分钟即达高峰；药物作用存在量效关系；对 DNA、 RNA 均有明显抑制作用。在治疗过程中，利用造血干细胞培养等实验方法观察青黄散及马利兰对小鼠多能干细胞、粒系及红系祖细胞、末梢血象等各种细胞的影响，结果表明马利兰对上述各类细胞有明显抑制作用，而青黄散则无抑制作用，提示青黄散对白血病细胞可能具有选择性抑制作用。对 CML 患者骨髓细胞进行超微结构动态观察，发现白血病细胞主要发生以核溶解、核固缩、破碎及混合性说明书 CN 104473946 A。

15、 4 3/9 页 5 为特征的变性坏死，表明青黄散治疗 CML 产生的疗效与其促进白血病细胞变性坏死的药理作用有关，即通过变性最终导致白血病细胞死亡。 0016 癌灵 1 号，癌灵 1 号（吡石、轻粉）是当前我国中医中药治疗白血病特别是早幼粒细胞白血病最为有效的药物之一。其药理原理为中医的以毒攻毒作用。砷剂为中药中传统毒药，辛温有大毒。实验研究证明，砷化合物能与组织（蛋白质）中的巯基（SH）结合，使蛋白质失去活性，因而抑制了白血病细胞增殖，起到了治疗白血病的作用。其次，对癌细胞有选择性细胞毒作用。实验研究发现癌灵 1 号在癌细胞和正常细胞之间有选择性，。

16、即使长期用药对骨髓造血功能亦无抑制，反而刺激造血功能。第三，具有诱导分化作用。运用三氧化二砷注射液治疗 APL，观察 CR 病人的血象及骨髓象是发现 77.3% 的患者治疗后白细胞逐渐上升，于 7-20 天达高峰，在白细胞升高的同时，发现分类中早幼粒细胞比例减少，而中、晚幼粒细胞可分别达到 0.12 和 0.15。第四，有促进细胞凋亡的作用。运用砷剂治疗白血病时发现，治疗 CR 后的病人骨髓中可见到粒细胞退行性改变，胞浆及核有空泡变性，和染色质固缩，凝集不均及核破裂“凋亡小体” ，用流失细胞仪检测可见凋亡细胞峰。 0017 六神丸，六神丸（珍珠粉、。

17、牛黄、麝香、蟾酥、冰片）具有清热解毒、化瘀止痛之功。药理证明六神丸中的牛黄含胆红素、麦角固醇，有促进红细胞新生、镇静、抗惊厥、强心等作用；蟾酥含蟾酥二烯醇、肾上腺素、麦角醇、儿茶酚胺类化合物，具有强心、升压、抗癌等作用；雄黄含三硫化二砷，能抑制巯基酶系统以影响细胞代谢，因而对肿瘤细胞的生长有抑制作用，其他尚有珍珠、冰片、麝香等有抗霉菌、抑制细菌、兴奋中枢神经系统等作用。六神丸治疗白血病，用于诱导缓解，对粒细胞系统有明显抑制作用，但对骨髓抑制则不甚明显，并可预防和治疗口腔溃疡、扁桃体炎等。 0018 复方青黛片，复方。

18、青黛片（青黛、太子参、丹参、雄黄等）实验研究表明，雄黄具有诱导 APL 细胞（NB4）和 HL-60 细胞凋亡的作用。 0019 血复康，血复康（青黛、莪术、葛根等）实验研究证实，血复康能抑制 K562细胞生长并使其发生凋亡。 0020 桑色素（morin）： CAS 号： 480-16-0，分子式： C15H10O7，化学名： 3， 5， 7， 2， 4 -pen tahydroxyflavone,(3,5,7,2,4-五羟黄酮）。抗菌、抗癌、抑制酶活性、具有抗氧化、抗痛、抗菌、抗炎、抗动脉粥样硬化、降低血糖和抗应激等作用。。

19、 0021 鬼臼毒素（podophyllotoxin）： CAS号518-28-5，分子式C22H22O8：分子量414.41，理化性质：白色针状结晶粉末。易溶于氯仿、丙酮、乙酸乙酯和苯，可溶于于乙醇，乙醚，不溶于水。鬼臼毒素是从小蘖科鬼臼属植物 - 华鬼臼（又称鸡苔素）的根和茎中提取到的木脂类抗肿瘤成份。为白色结晶性粉末，无嗅，有吸湿性。华鬼臼主要分布在我国的甘肃省等地。从华鬼臼（又称鸡苔素）中提取到的鬼臼毒素可以制成膏剂和酊剂。鬼臼毒素能有效抑制疱疹病毒，抑制细胞中期的有丝分裂，用于毒性性病。 0022 肉珊瑚苷元（sarcostin）。

20、： CAS 号 18607-76-6，分子式 C21H34O6，分子量 382.50。 0023 蜀羊泉次碱（soladulcidine）：又称蜀羊泉碱。CAS 号 511-98-8，分子式 C27H45NO2，分子量 415.66，熔点 209 211。旋光度 D-50 (c=0.4，氯仿 )。天然存在于茄科植物苦茄 ( 蜀羊泉，千年不烂心 )(Solanum dulcamara L.) 的果实等植物中。具有抗真菌作用。对麦角菌、稻瘟病菌等有抑制活性。 0024 本发明药物组合物的 4 种药物结构如下：说明书 CN 104473946 A 5 4/9 页。

21、6 桑色素（morin）鬼臼毒素（podophyllotoxin）肉珊瑚苷元（sarcostin）蜀羊泉次碱（soladulcidine）。发明内容 0025 本发明的目的是克服背景技术的不足，提供一种治疗白血病的药物组合物。 0026 本发明是通过如下技术方案实现的：本发明的一种治疗白血病的药物组合物的原料药的组成和重量份为：桑色素 10-30 重量份鬼臼毒素 5-25 重量份肉珊瑚苷元 15-20 重量份蜀羊泉次碱 2-18 重量份。 0027 本发明的一种治疗白血病的药物组合物可以采用制剂学的常规方法制备成片剂、胶囊剂、滴丸。 0028 本发明的一种。

22、治疗白血病的药物组合物，其特征在于用于治疗白血病。 0029 本发明所得药物组合物，可通过调节 T 细胞亚群比例及促进这些细胞因子的分泌发挥其免疫调节作用，恢复自身受抑的免疫功能来杀伤残留的白血病细胞，从而证实其具有诱生 IL-2， IL-6 和 IFN- 的作用，对白血病的治疗机免疫功能重建有一定的作用。我们的实验结果还表明，本发明所得药物组合物具有增强 IL-2 和 NCK 活性作用，说明本发明药物组合物对化疗后 P388 白血病小鼠的免疫抑制有一定的保护作用。推测其作用机理可能与增强红细胞免疫粘附功能，促使红细胞释放 NCK 激活因子，调节 NCK-IFN-I。

23、L-2 免疫网络有关。具体实施方式 0030 下面通过具体实验例和实施例对本发明的一种治疗白血病药物组合物及其制备方法做进一步说明，但不限于本发明。 0031 实施例 1 ：治疗白血病的药物组合物治疗白血病的药物组合物的原料药的组成和重量份为：桑色素 10 重量份鬼臼毒素 25 重量份肉珊瑚苷元 15 重量份蜀羊泉次碱 18 重量份说明书 CN 104473946 A 6 5/9 页 7 实施例 2 ：治疗白血病的药物组合物治疗白血病的药物组合物的原料药的组成和重量份为：桑色素 30 重量份鬼臼毒素 5 重量份肉珊瑚苷元 20 重量份蜀羊泉次碱 2 重。

24、量份实施例 3 ：治疗白血病的药物组合物治疗白血病的药物组合物的原料药的组成和重量份为：桑色素 15 重量份鬼臼毒素 20 重量份肉珊瑚苷元 17 重量份蜀羊泉次碱 18 重量份实施例 4 ：治疗白血病的药物组合物治疗白血病的药物组合物的原料药的组成和重量份为：桑色素 18 重量份鬼臼毒素 15 重量份肉珊瑚苷元 18 重量份蜀羊泉次碱 10 重量份实施例 5 ：片剂的制备取实施例 1 组合物 150g，加入淀粉 75g，混匀，制粒，干燥，加微晶纤维素 20g，硬脂酸镁 2.5g，混匀，压制成 1000 片 , 即得本发明组合物片剂。 0。

25、032 实施例 6 ：胶囊的制备取实施例 2 组合物 165g，加入淀粉 65g，混匀，制粒，干燥，整粒，加入适量硬脂酸镁，混匀，装胶囊 1000 粒，即得本发明组合物胶囊。 0033 实施例 7 ：滴丸的制备称取聚乙二醇 6000 200g 水浴 (80 ) 加热煮熔，加入实施例 3 组合物 50g，充分搅拌均匀，以液体石蜡为冷却剂，置玻璃管（4*80cm）中，冷却温度为 10，滴口内外径为 7.0/2.0(mm/mm)，滴口距液面为 2cm，滴速以每分 50 滴为最佳条件，用棉布吸干滴丸表面的冷凝剂，即得本发明组合物滴丸。 0034 。

26、实验例 1 ：药物组合物对 L615白血病小鼠的药效试验 1. 造模方法：在无菌条件下取 L615白血病小鼠脾制成 25% 生理盐水细胞悬液，给成年 L615小鼠皮下接种，结果均发生白血病，用发病小鼠脾瘤细胞在同系小鼠连续移植，建立稳定的 L615白血病模型。 0035 L615白血病细胞株的建立，去 L 615白血病小鼠的脾，在 Hanks 液内将脾剪碎，使白血病细胞游离出来，通过离心收集游离细胞，然后用 RPMI1640 培养液（含 10% 小牛血清）稀释成 8*106/ml 的细胞液，在 37下培养。培养 20d 发现培养物中有贴壁的棱形细胞，其周。

27、围有增殖的圆形细胞小岛。将两种形态不同的细胞分开培养时，梭形细胞可以正常贴壁生长，而悬浮细胞生长缓慢；再将两种细胞重新混合培养，两种细胞生长旺盛， 45d 后，将悬浮生长的圆形细胞再次单独培养，一直传到 12 代，细胞生长良好，从而建立此细胞株。 0036 2. 药物组合物治疗白血病药效试验。 0037 材料：昆明种小鼠（山东省实验动物中心）。实施例 1、实施例 2、实施例 4 得到药物组合物，环磷酰胺（江苏恒瑞医药股份有限公司），标准重组人白介素 -2 （北京双鹭药业股份有限公司）， Yackl 及 IL-2 依赖细胞株 CTLL（中国科学院上。

28、海生命科学院细胞资源中心）， RPMII640 细胞培养液及胎牛血清（华美生物工程公司）；四甲基偶氮唑盐（MTT），十二烷基磺酸钠及刀豆球蛋白，二甲基甲酰胺为 (Sigma 公司产品 ) ；加样器， CO2培养箱， ELX-800 酶标仪（美国 Bio-Tek 公司）； 96 孔平底细胞培养板， Epics 流式细胞仪（美国 Beckman 公司）。 0038 方法:按上述方法造模。实验分组第一组为正常对照组， 20只615系小鼠，常规饲说明书 CN 104473946 A 7 6/9 页 8 养 1w 后，腹腔注射生理盐水 0.2ml/d，生理盐水。

29、灌肠 0.3ml, 上、下午各 1 次。第 2 组为模型组，常规饲养 1w 后，接种 L615白血病细胞，接种后处理同正常对照组。第 3 组为西药组， 20 只常规饲养一周后，接种 L615白血病细胞，接种后第 3 天开始 ip 环磷酰胺， 200mg/kg， 1 次 / d。第 4 组 - 第 6 组分别为药物组合物组（实施例 1）、药物组合物组（实施例 2）、药物组合物组（实施例 4），分别取 20 只常规饲养 1d 后，接种 L615白血病细胞，接种后第 3 天分别给予药物组合物组（实施例 1）、药物组合物组（实施例 2）、药物组合物组。

30、（实施例 4）灌胃， 0.3ml，上、下午各 1 次。以上各组动物每组取 10 只于第 5 天处死，取脾脏进行相关免疫指标检测，余下各动物进行生存期观察。 0039 观察指标：生存期观察。 T 细胞亚群测定。 IL-2， IL-6， IFN- 活性测定。 0040 统计学方法：数据以 Xs 表示，采用 Mi-crosoft Excel 进行 t 检验。 0041 结果 : 生存期 : 本发明药物组合物组生存期较模型组和西药组明显延长，统计学有显著差异 P0.01，见表 1. 表 1 各实验组生存期比较说明书 CN 104473946 A 8 7/9 页 9 组别。

31、只数生存时间（d）模型组105.890.45 西药组1016.861.27* 药物组合物组（实施例 1） 1027.772.46* 药物组合物组（实施例 2） 1026.452.87* 药物组合物组（实施例 4） 1026.552.35* 说明书 CN 104473946 A 9 8/9 页 10 注：与模型组相比 *P0.01，与西药组相比P0.01。 0042 IL-2， IL-6， IFN- 活性 : 西药组白血病小鼠化疗后，其分泌 IL-2， IL-6， IFN- 的水平显著下降，而本发明药物组合物组 IL-2， IL-6， IFN- 的分泌水平明显增加，两者。

32、对比有显著性差异（P0.01），见表 2。 0043 表 2 各组 IL-2， IL-6， IFN- 活性变化组别只数IL-2IL-6IFN- 正常对照组1021.381.1444.464.5112.341.87 模型组107.881.23*16.454.32*8.872.67* 西药组106.251.3411.274.115.651.76 药物组合物组（实施例 1）1016.342.0232.541.6710.021.34 药物组合物组（实施例 2）1017.432.1234.562.8010.341.66 药物组合物组（实施例 4）1017.101.8933.142.071。

33、0.291.89 注：与正常对照组相比 *P0.01，与模型组相比P0.01，与西药组相比P0.01。 0044 免疫功能的正常与否是肿瘤发生发展的重要因素之一，而免疫功能是通过免疫细胞所分泌的细胞因子所执行的，白血病小鼠化疗后 T 细胞亚群比例失调， IL-2， IL-6， IFN- 等细胞因子分泌水平下降，提示此时机体的免疫功能处于抑制状态。而通过使用本发明药物组合物治疗后， IL-2， IL-6， IFN- 等细胞因子分泌水平回升，说明本发明药物组合物可通过促进这些细胞因子的分泌发挥其免疫调节作用，恢复自身受抑的免疫功能来杀伤残留的白血病细胞，从而证实本发明药。

34、物组合物具有诱生 IL-2， IL-6 和 IFN- 的作用，对白血病的治疗机免疫功能重建有一定的作用。 0045 实验例 2 ：药物组合物对 P388 白血病小鼠的药效学试验 1. 造模方法：取腹水型 P388白血病小鼠，脱颈椎处死，腹部消毒，抽吸腹水，加入生理盐水混匀，显微镜下调整细胞浓度为（1-1.5） *107个 /ml，每鼠 0.2ml（昆明种小鼠的接种浓度和剂量）进行腹腔注射。 0046 2. 药物组合物对 P388白血病小鼠化疗后自然杀伤细胞（NCK）、白介素 -2(IL-2) 活性的影响。 0047 材料：昆明种一级小鼠（山东省实验动物。

35、中心）， 50 只，雌雄各半，体重 18-22g。实施例 4 制备的药物组合物，环磷酰胺（江苏恒瑞医药股份有限公司），标准重组人白介素 -2 （北京双鹭药业股份有限公司）， Yackl 及 IL-2 依赖细胞株 CTLL（中国科学院上海生命科学院细胞资源中心）， RPMII640 细胞培养液及胎牛血清（华美生物工程公司）；四甲基偶氮唑盐（MTT），十二烷基磺酸钠及刀豆球蛋白，二甲基甲酰胺为 (Sigma 公司产品 ) ；加样器， CO2培养箱， ELX-800 酶标仪（美国 Bio-Tek 公司）； 96 孔平底细胞培养板， Epics 流式细胞仪。

36、（美国 Beckman 公司）。 0048 造模与分组方法：取 40 只小鼠，接种 P388 淋巴细胞白血病瘤株（接种方法：取腹水型 P388 白血病小鼠，脱颈椎处死，腹部消毒，抽吸腹水，加入生理盐水混匀，显微镜下调整细胞浓度为 1.5*107 个 /ml，每只小鼠右腋下注射 0.2ml），随机分为 4 组。另 10 只为正常空白组。 0049 处理方法：正常空白组：以 0.4ml/20g 生理盐水 ig ； P388白血病模型组：以 0.4ml/20g生理盐水ig ；单纯化疗组：以0.4ml/20g生理盐水ig ；化疗加药物组合物低剂。

37、量组：分别以 50mg 药物组合物于 0.4ml 生理盐水 ig ；化疗加药物组合物高剂量组：以 100mg 提取物溶于 0.4ml 生理盐水 ig。以上各组连续 ig14d，同时给予、、组 ip 环磷酰胺 35mg/kg/d，连用 6d。于第 15 天脱颈椎处死，在无菌条件下取脾脏 NCK、 IL-2 活性。说明书 CN 104473946 A 10 9/9 页 11 0050 检测方法： NCK 活性检测参照蒋中华法， IL-2 活性检测方法参照钱玉坤法。 0051 统计学方法：采用多组均数比较，即先作方差分析，再作 q 检验。 0052 结果：结。

38、果表明，本发明药物组合物能提高 NCK 及 IL-2 活性。见表 3 表 3 各组 NCK 及 IL-2 活性比较组别nNCK 活性（%）IL-2 活性（Iu/ml）正常对照组842.102.4518.662.56 模型对照组834.342.34*14.342.08* 化疗组826.072.25*10.222.38* 化疗加药物组合物低剂量组 835.332.36*14.052.56* 化疗加药物组合物高剂量组 838.332.57*16.762.55# 注：与正常组比较， *P0.05，* P0.01 ；与模型组比较，P0.05，P0.01 ；与化疗组比较， # P0.0。

39、5，#P0.01。 0053 NCK 是三大类淋巴细胞之一，是机体早期抗肿瘤免疫监督功能的重要组成成分，是一群广谱抗肿瘤细胞，其杀伤活性不需要抗原事先致敏，不依赖抗体和胸腺，也不受主要组织相容性抗原（MHC）的限制。NCK 在体内针对病毒感染细胞和肿瘤细胞不需要特异抗原刺激，免疫复合物和靶细胞表面结构均可直接诱发 NCK 的免疫反应，迅速分泌大量细胞因子如干扰素 -（IFN-）、肿瘤坏死因子 -（TNF-）、粒单细胞集落刺激因子（GM CSF）、 IL-2 等，调节吞噬细胞及 T、 B 细胞功能。同时 IL-2、 IFN 又可增加 NCK 的活性，故有。

40、学者认为机体存在NCK-IFN-IL-2免疫网络。 IL-2主要是由T细胞产生的15KD的糖蛋白，并作用于 T 细胞，促使 T 细胞增殖。IL -2 是机体内最主要、最强有力的 T 细胞生长因子。IL-2 可诱导或促进多种细胞毒性细胞的活性，如 NCK、细胞毒性 T 淋巴细胞（CTL）、淋巴因子活化的杀伤细胞（LAK）和肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）等，这些细胞在机体的免疫监视和抗肿瘤免疫方面至关重要。我们的实验结果表明， P388 白血病小鼠自身及化疗后免疫功能受到抑制， NCK 及IL-2活性均有不同程度的降低，化疗后P388白血病小鼠明显低于正常组及模型组。

41、。这是由于化疗药对免疫系统的影响，在杀伤肿瘤细胞的同时也杀伤或抑制了 LAK 细胞所致。近年来研究发现，荷瘤机体的 NCK 活性降低，可能与机体荷瘤时，其免疫细胞的细胞因子网络抗肿瘤作用失常有关，如血清中免疫抑制因子存在且活性增强，免疫促进因子活性下降。在此基础上给予化疗药后可能通过抑制IFN的生成从而使 NCK活性进一步受到抑制。在正常机体， IL-2 具有自身正向免疫调节作用，但在大多数荷瘤机体， IL-2 系统存在明显抑制或紊乱。多数研究者认为，肿瘤患者产生 IL-2 的能力和对 IL-2 反应性皆有不同程度降低，可能与 IL-2 分解代谢亢进或宿主体内抑制性巨噬细胞和抑制性 T 细胞功能增强有关。给予化疗药后 IL-2 的诱生进一步受到抑制，从而加重荷瘤机体免疫力的下降。给予本发明药物组合物治疗后，高剂量组 NCK 及 IL-2 均有明显升高。我们的实验结果表明，毛莲菜提取物具有增强 IL-2 和 NCK 活性作用，说明本发明药物组合物对化疗后 P388 白血病小鼠的免疫抑制有一定的保护作用。推测其作用机理可能与增强红细胞免疫粘附功能，促使红细胞释放 NCK 激活因子，调节 NCK-IFN-IL-2 免疫网络有关。说明书 CN 104473946 A 11 。

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