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1、(10)申请公布号 CN 103131687 A (43)申请公布日 2013.06.05 CN 103131687 A *CN103131687A* (21)申请号 201310041937.9 (22)申请日 2013.02.04 C12N 9/96(2006.01) C12N 9/88(2006.01) A61K 38/51(2006.01) A61K 47/48(2006.01) A61P 31/04(2006.01) (71)申请人 杭州北望生物技术有限公司 地址 310011 浙江省杭州市祥园路39号5幢 5 楼 (72)发明人 王永 刘翔 刘沐荣 张加慧 封小燕 (74)专利代理。
2、机构 杭州丰禾专利事务所有限公 司 33214 代理人 王从友 (54) 发明名称 聚乙二醇共价修饰的溶葡萄球菌酶及其制备 方法和应用 (57) 摘要 本发明涉及用聚乙二醇修饰的溶葡萄球菌酶 及其制备方法和应用。聚乙二醇共价修饰的溶 葡萄球菌酶， 该溶葡萄球菌酶采用支化聚乙二醇 对溶葡萄球菌酶进行修饰， 支化聚乙二醇为含单 一活性功能基团的 Y 型单甲氧基聚乙二醇， 并且 单一活性功能基团设置在端点， 所述的含单一活 性功能基团的 Y 型单甲氧基聚乙二醇的结构式 如下 ：； 所述 的 n1、 n2、 n3 分别为大于等于 1 的正整数， 并且 n1+n2+n3 的总和为 802000 ； 所述。
3、的 R 为修饰溶 葡萄球菌酶的活性功能基团。本发明聚乙二醇修 饰的溶葡萄球菌酶免疫原性降低， 活性下降少， 半 衰期延长， 适合临床应用于葡萄球菌引起的感染。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103131687 A CN 103131687 A *CN103131687A* 1/1 页 2 1. 聚乙二醇共价修饰的溶葡萄球菌酶， 其特征在于 : 该溶葡萄球菌酶采用支化聚乙 二醇对溶葡萄球菌酶进行修饰， 支化聚乙二醇为含单一活性功能。
4、基团的 Y 型单甲氧基聚乙 二醇， 并且单一活性功能基团设置在端点， 所述的含单一活性功能基团的 Y 型单甲氧基聚 乙二醇的结构式如下 ： ； 所述的 n1、 n2、 n3 分别为大于等于 1 的正整数， 并且 n1+ n2+ n3 的总和为 802000 ； 所述的 R 为修饰溶葡萄球菌酶的活性功能基团。 2.根据权利要求1所述的聚乙二醇共价修饰的溶葡萄球菌酶， 其特征在于: 含单一活 性功能基团的 Y 型单甲氧基聚乙二醇的分子量为 5kDa-40kDa。 3. 根据权利要求 1 所述的聚乙二醇共价修饰的溶葡萄球菌酶， 其特征在于 : 活性功能 基团选自琥珀酸基碳酸酯、 琥珀酸基琥珀酸酯、 。
5、硝基苯酯和琥珀酰亚胺酯中的一种。 4.根据权利要求3所述的聚乙二醇共价修饰的溶葡萄球菌酶， 其特征在于: 活性功能 基团选用琥珀酸基碳酸酯。 5.根据权利要求1所述的聚乙二醇共价修饰的溶葡萄球菌酶， 其特征在于: 溶葡萄球 菌酶与含单一活性功能基团的 Y 型单甲氧基聚乙二醇采用单点或多点修饰构成。 6. 一种制备权利要求 15 任意一项权利要求所述的聚乙二醇共价修饰的溶葡萄球 菌酶的方法， 其特征在于 ： 该方法中含单一活性功能基团的 Y 型单甲氧基聚乙二醇与溶葡 萄球菌酶发生共价结合反应的重量比例为 1 ： 0.520， 缓冲液的 pH 值为 48， 反应温度为 2 37， 反应时间为 24。
6、8 小时。 7. 根据权利要求 6 所述的制备聚乙二醇共价修饰的溶葡萄球菌酶的方法， 其特征在 于 ： 修饰反应结束后采用分子筛柱 Sephacryl-200 去除未修饰的溶葡萄球菌酶以及游离的 聚乙二醇， 以 pH8.0、 20mM 的磷酸盐缓冲液为洗脱液， 流速 5ml/min， 收集第一个蛋白峰为修 饰蛋白峰。 8. 根据权利要求 7 所述的制备聚乙二醇共价修饰的溶葡萄球菌酶的方法， 其特征在 于 ： 该方法还包括纯化步骤， 纯化步骤将修饰后产物上样于 Sephacryl S-200 分子筛凝胶 层析柱， 以 40mM PB 进行洗脱， 分别收集洗脱峰。 9. 权利要求 15 任意一项权。
7、利要求所述的聚乙二醇共价修饰的溶葡萄球菌酶用于制 备治疗葡萄球菌引起的感染的药物中的应用。 权 利 要 求 书 CN 103131687 A 2 1/5 页 3 聚乙二醇共价修饰的溶葡萄球菌酶及其制备方法和应用 技术领域 0001 本发明涉及用聚乙二醇修饰的溶葡萄球菌酶及其制备方法和应用。 背景技术 0002 葡萄球菌 （Staphylococcus） 是革兰氏阳性球菌的一种， 广泛分布于自然界， 如空 气、 水、 土壤、 饲料和一些物品上， 也存在于人和动物的体表、 鼻咽部及肠道， 绝大多数不致 病， 少数可引起人和动物致病， 其中金黄色葡萄球菌致病力最强。 金黄色葡萄球菌是一种常 见病菌，。
8、 可引起皮肤、 肺部、 血液、 关节、 组织及器官感染， 是烧伤创面感染、 急性肝功能衰竭 和血源性肾炎等疾病的主要病源菌。 0003 目前主要采用抗生素治疗金黄色葡萄球菌的感染， 但随着抗生素的广泛使用， 耐 药菌比例不断增加， 开发新型抗菌剂显得尤为迫切。溶葡萄球菌酶 （Lysostaphin） 作为 葡萄球菌细胞壁裂解酶引起了人们的重视。Schindle 等 1964 年首次从 Staphyloccus simulans 培养物中发现溶葡萄球菌酶 （ “Lysostaphin a New Bacteriolytic Agent for the Staphylococcus.” Proc.。
9、 Natl. Acad. Sci. 1964， 51:414-421） , 该酶是含 246 个氨 基酸组成的单链分子 , 分子量为 27kDa， Zn2+为必须的辅助因子。溶葡萄球菌酶具有内切 肽酶活性 , 能特异性水解细菌胞壁肽聚糖交联结构 Gly 五肽桥联 ( 水解第 2 与第 3 位 Gly 形成的肽键 ) 而产生破壁溶菌作用。由于 Gly 五肽桥联结构仅大量存在于葡萄球菌细胞 壁 , 其中又以金黄色葡萄球菌细胞壁中分布最广 , 因此 , 溶葡萄球菌酶主要对葡萄球菌 尤其是金黄色葡萄球菌具有溶菌杀菌作用。 0004 但是溶葡萄球菌酶作为异源蛋白质， 在机体内的主要不良反应是产生免疫反应。
10、， 引起过敏反应。 静脉注射血浆半衰期短， 动物药代动力学研究表明该酶进入体内1小时95% 的酶已经降解。聚乙二醇 （poly(ethylene glycol)， 简称 PEG） 修饰技术的应用使 PEG 的许 多优良特性转移到修饰蛋白中去。当 PEG 偶联到蛋白质分子表面时， 可减少蛋白质药物的 酶解， 避免在肾脏的代谢中很快消除， 并使蛋白质药物不易被免疫系统的细胞识别。PEG 修 饰的蛋白质药物动力学性质也发生很大的改变， 半衰期延长。2003 年 Walsh 等报道用 PEG 修饰溶葡萄球菌酶， 采用支化的两臂单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯mPEG2-NHS。 但由于该 支化聚乙二醇的活。
11、性基团位于该聚合物的中点， 由于位阻效应在同药物分子偶合时， 使药 物活性降低甚至消失。 0005 中国发明专利申请 （申请号 ： 200710068724.X 申请日 ： 2007-05-22） 公开了溶葡 萄球菌酶的制备方法和其衍生物及衍生物的制备方法。溶葡萄球菌酶的制备方法主要包 括 : 设计并合成优化的溶葡萄球菌酶基因 , 构建表达载体后转化大肠杆菌工程菌 , 筛选高 表达菌株 , 发酵培养工程菌 , 表达产物分离纯化。其中所述的表达载体质粒是 PET 系列载 体质粒。本发明的方法 , 表达方案简单 , 表达量高 , 纯化工艺简单 , 收率高 , 表达产物可 溶 , 不需要复性 , 直。
12、接用层析方法进行纯化 , 纯化收率大大提高 , 适合大规模制备。本发 明公开的溶葡萄球菌酶衍生物由 PEG 修饰后免疫原性降低 , 半衰期延长 , 适合临床应用于 葡萄球菌感染的治疗。 说 明 书 CN 103131687 A 3 2/5 页 4 0006 上述的方法采用直链的聚乙二醇修饰溶葡萄球菌酶， 为了降低免疫原性， 需要多 点修饰， 而修饰位点多使药物活性降低甚至消失。 为此， 有必要开发能够降低免疫原性同时 活性下降少的聚乙二醇修饰的溶葡萄球菌酶， 更好的满足溶葡萄球菌酶在临床应用方面的 需求。 发明内容 0007 为了解决上述的技术问题， 本发明的第一个目的是提供一种聚乙二醇共价修。
13、饰的 溶葡萄球菌酶， 该溶葡萄球菌酶免疫原性降低， 活性下降少， 半衰期延长， 适合临床应用于 葡萄球菌引起的感染。 本发明的第二个目的是提供上述的聚乙二醇共价修饰的溶葡萄球菌 酶的制备方法。 本发明的第三个目的是提供上述的聚乙二醇共价修饰的溶葡萄球菌酶的医 药用途。 0008 为了实现上述的第一个目的， 本发明采用了以下的技术方案 ： 聚乙二醇共价修饰的溶葡萄球菌酶， 该溶葡萄球菌酶采用支化聚乙二醇对溶葡萄球菌 酶进行修饰， 支化聚乙二醇为含单一活性功能基团的 Y 型单甲氧基聚乙二醇， 并且单一活 性功能基团设置在端点， 所述的含单一活性功能基团的 Y 型单甲氧基聚乙二醇的结构式如 下 ： 。
14、； 所述的 n1、 n2、 n3 分别为大于等于 1 的正整数， 并且 n1+ n2+ n3 的总和为 802000 ； 所述的 R 为修饰溶葡萄球菌酶的活性功能基团。 0009 作为优选， 上述的含单一活性功能基团的 Y 型单甲氧基聚乙二醇的分子量为 5kDa-40kDa。 0010 作为优选， 上述的活性功能基团选自琥珀酸基碳酸酯、 琥珀酸基琥珀酸酯、 硝基苯 酯和琥珀酰亚胺酯中的一种。作为再优选， 上述的活性功能基团选用琥珀酸基碳酸酯。 0011 作为优选， 上述的溶葡萄球菌酶与含单一活性功能基团的 Y 型单甲氧基聚乙二醇 采用单点或多点修饰构成。 0012 为了实现上述的第二个目的， 。
15、本发明采用了以下的技术方案 ： 一种制备上述任意一个技术方案所述的聚乙二醇共价修饰的溶葡萄球菌酶的方法， 该 方法中含单一活性功能基团的 Y 型单甲氧基聚乙二醇与溶葡萄球菌酶发生共价结合反应 的重量比例为 1 ： 0.520， 缓冲液的 pH 值为 48， 反应温度为 237， 反应时间为 248 小 时。 0013 作为优选， 在修饰反应结束后采用分子筛柱 Sephacryl-200 去除未修饰的溶葡萄 球菌酶以及游离的聚乙二醇， 以 pH8.0、 20mM 的磷酸盐缓冲液为洗脱液， 流速 5ml/min， 收集 第一个蛋白峰为修饰蛋白峰。 0014 作为优选， 该方法还包括纯化步骤， 纯化。
16、步骤将修饰后产物上样于 Sephacryl S-200 分子筛凝胶层析柱， 以 40mM PB 进行洗脱， 分别收集洗脱峰。 0015 为了实现上述的第三个目的， 本发明采用了以下的技术方案 ： 说 明 书 CN 103131687 A 4 3/5 页 5 上述任意一个技术方案所述的聚乙二醇共价修饰的溶葡萄球菌酶用于制备治疗葡萄 球菌引起的感染的药物中的应用。 0016 本发明由于采用了上述的技术方案， 采用支化的 Y 型单甲氧基聚乙二醇， 与直链 的聚乙二醇相比， 在同样降低免疫原性的情况下， 可以减少修饰位点的个数， 但由于该支化 聚乙二醇的活性基团位于该聚合物的中点， 由于位阻效应在同药。
17、物分子偶合时， 使药物活 性降低。本发明聚乙二醇修饰的溶葡萄球菌酶免疫原性降低， 活性下降少， 半衰期延长， 适 合临床应用于葡萄球菌引起的感染。 附图说明 0017 图 1 为聚乙二醇修饰的溶葡萄球菌酶的 SDS-PAGE 图谱 （M 为标准蛋白， 1 为溶葡 萄球菌酶， 2 为 Y 型甲氧基聚乙二醇 5kDa 修饰的溶葡萄球菌酶， 3 为 Y 型甲氧基聚乙二醇 10kDa 修饰的溶葡萄球菌酶， 4 为 Y 型甲氧基聚乙二醇 20kDa 修饰的溶葡萄球菌酶） 。 具体实施方式 0018 实施例 1 溶葡萄球菌酶基因的合成、 克隆和表达 表达载体采用 pET-22b(Invitrogen)， 。
18、宿主菌为大肠杆菌 BL21(DE3)。 0019 根 据 Genebank 公 布 的 Staphylococcus simulans 的 Lysostaphin 基 因 序 列 （AX828346） 及专利 WO03074689 的溶葡萄球菌酶基因序列， 根据大肠杆菌高效表达的需要 优化设计溶葡萄球菌酶基因序列， 基因编码产物的氨基酸序列， 基因序列和氨基酸序列分 别参见中国发明专利 （申请号 ： 200710068724.X 申请日 ： 2007-05-22） 公开的 SEQ ID NO.1 和 SEQ ID NO.2。合成 20 段互补的寡核苷酸， 并在 5，端和 3，端分别引入酶切位点。
19、 Nde I、 BamH I， 按分子克隆的常规方法以等摩尔混合， 94变性 5min， 立即 65退火 10 min， 然后 加入 T4 连接酶， 16连接过夜。取连接产物用下述引物进行扩增 ： 引物 1:5TATACATATGGCTGCAACACATGAACA 引物 2:3TCTGGATCCTCAGTTACTTTATAGTTCCCCAAA 扩增条件 ： 95、 30s ； 55、 30s ； 70、 60s， 循环次数 ： 30 次。最后 70保温延伸 10 min。用 Nde I 和 BamH I 双酶切回收大片段， 与合成的溶葡萄球菌酶基因片段连接， 20L 反应体系基因片段与载体大片。
20、段的比例为 10:1， 加 T4DNA 连接酶 300 单位， 15连接过夜， 取 10L 连接产物直接转化大肠杆菌宿主菌 BL21（DE3） 感受态细胞， 涂布于氨苄青霉素抗 性平板， 37培养过夜， 获得工程菌经进一步筛选。 氨苄青霉素做抗性筛选， 得到阳性克隆。 提取质粒， 用限制性内切酶进行鉴定。 阳性转化子用通用引物进行序列分析， 结果克隆序列 与设计序列完全一致。 0020 接种阳性克隆进行培养， 经 1mmol/L 的 IPTG 诱导。 0021 实施例 2 不同培养条件对表达的影响 采用培养基 （0.5% Yeast Extract,1.0% Peptone,0.5%Nacl,。
21、0.05mg/Lamp,pH7.4） 研 究了不同温度条件诱导对产物表达状态的影响。接种量 ： 5%（种子液体积占培养基体积的 比例） ， 诱导前培养温度 37， 采用 IPTG 诱导， 剂量 1mmol/L。培养后 4 个温度进行诱导， 结 果见下表。 诱导温度表达量 目标蛋白上清 %目标蛋白沉淀 % 说 明 书 CN 103131687 A 5 4/5 页 6 2020%90%10% 2530%90%10% 3030%65%35% 3730%50%50% 0022 总结 ： 加诱导剂后 25培养 4 小时， 表达量可以达到 30%， 而且目标蛋白主要表达 在破菌上清中， 如果延长表达时间，。
22、 如表达8小时， 则目标蛋白超过80%在破菌后的沉淀中， 因此优选的条件是 37培养后， 25诱导表达 4 小时， 目标蛋白主要在破菌后上清中， 有利 于分离纯化。 0023 实施例 3 表达产物的分离、 纯化 用菌体破碎缓冲液 （40mM Tris-cl,0.2M Nacl,0.5mM EDTA,pH8.0） 按照 20ml/g 的比 例悬浮湿菌体。超声波法破碎菌体 （220V， 20khz,900W, 冰水浴条件下超声破碎） 。 0024 将破菌液用高速离心进行离心 （10000g,30min,4） , 去掉沉淀， 收集上清。收集 到的破菌上清液用离子交换层析法分离纯化， 其过程为用 pH。
23、 值为 8.5 的 20mmol/L Tris. CL 缓冲液稀释， 使其电导率小于 5mS/cm。用同样的缓冲液平衡层析柱 （50mm10cm） ， 层 析凝胶可选用 CM-Sepharose Fast Flow、 SP-Sepharose Fast Flow、 Mono-S(Amersham Pharmacia)。上样后用平衡缓冲液洗至基线， 用缓冲液 （0.01-0.5mol/L Nacl， 20mM Tris-cl， pH8.0） 进行梯度洗脱， 当 Nacl 浓度达到 30% 时出现目标蛋白， 收集目标蛋白峰。 0025 洗脱出来的蛋白样品纯度在 85-90%。将离子交换目标蛋白峰补。
24、加 （NH4） 2SO4使终 浓度为 0.6-0.8mol/L， 疏水层析柱 （XK26/20） 用缓冲体系 A（20mM Tris-cl， pH8.5,0.6M （NH4） 2SO4） 平衡， 疏水凝胶可选用 Phenyl-Sepharose Fast Flow、 Phenyl-Sepharose High Perforance 及 Butyl-Sepharose Fast Flow， 流速 10ml/min， 上样后用缓冲液 B（20mM Tris-cl， pH8.5） 通过降低盐浓度梯度洗脱， 收集目标蛋白峰， 目标蛋白电泳纯度 95%。 0026 得到的疏水层析峰经 Sephadex 。
25、G-25 脱盐， 平衡液为 20 mmol/L PB， pH7.4。样品 脱盐后即为纯化的溶葡萄球菌酶。 0027 实施例 4 聚乙二醇修饰的溶葡萄球菌酶 将纯化的溶葡萄球菌酶溶于 pH8.0、 100mM 的磷酸盐缓冲液中， 按溶葡萄球菌酶 ： Y 型单 甲氧基聚乙二醇琥珀酸基碳酸酯 5000=1:5（W/W） 的比例加入溶解后， 加入甘氨酸使其终浓 度为 8mM， 冰箱 2-8反应 16-24 小时。修饰反应结束后采用分子筛柱 （Sephacryl-200） 去 除未修饰的溶葡萄球菌酶以及游离的聚乙二醇。以 pH8.0、 20mM 的磷酸盐缓冲液为洗脱液， 流速 5ml/min， 收集第一。
26、个蛋白峰为修饰蛋白峰。 0028 上述的 Y 型单甲氧基聚乙二醇琥珀酸基碳酸酯具有以下的结构 ： 。 0029 实施例 5 修饰产物的分离、 纯化 将实施例 4 修饰后产物上样于 Sephacryl S-200 分子筛凝胶层析柱， 以 40mM PB 进行 洗脱， 分别收集洗脱峰。电泳分析图谱见图 1。 0030 实施例 6 生物活性 （比活力） 测定 说 明 书 CN 103131687 A 6 5/5 页 7 酶活性分析采用比浊法， 受试菌为金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus。活化的 金黄色葡萄球菌在 LB 培养基中 37培养至 OD620nm 为 0.25， 加入。
27、适量纯化溶葡萄球菌酶 （10L， 约1g） ， 37保温10min， 将6ml金黄色葡萄球菌悬液OD620nm为0.25降至0.125 所需的酶量为 1 个单位。溶葡萄球菌酶、 Y 型单甲氧基聚乙二醇琥珀酸基碳酸酯 5kDa 修饰 的溶葡萄球菌酶及直链单甲氧基聚乙二醇琥珀酸基碳酸酯 5kDa 修饰的溶葡萄球菌酶的生 物活性见表一。 0031 表 1 溶葡萄球菌酶及聚乙二醇修饰的溶葡萄球菌酶的生物活性 样品比活力 （U/mg） 溶葡萄球菌酶420 Y 型单甲氧基聚乙二醇琥珀酸基碳酸酯 5kDa 修饰的溶葡萄球菌酶309 直链单甲氧基聚乙二醇琥珀酸基碳酸酯 5kDa 修饰的溶葡萄球菌酶117 实施。
28、例 7 热稳定性研究 取溶葡萄球菌酶和实施例 4 聚乙二醇修饰的溶葡萄球菌酶液体， 分别置于 25、 60 条件下， 定时取样测定其生物活性。 结果表明， 溶葡萄球菌酶在60条件下15min内活性不 变， 而聚乙二醇修饰的溶葡萄球菌酶在 90 min 内活性不变。在 25条件下溶葡萄球菌酶 7 天内活性不变， 而聚乙二醇修饰的溶葡萄球菌酶在 25 天内活性不变。因此， 可以初步认为 聚乙二醇修饰的溶葡萄球菌酶可以明显增加溶葡萄球菌酶的热稳定性。 0032 实施例 8 免疫原性的研究 以家兔作为制备抗血清的实验动物， 采用福氏佐剂免疫法， 并分别以溶葡萄球菌酶、 Y 型单甲氧基聚乙二醇琥珀酸基碳。
29、酸酯 5kDa 修饰的溶葡萄球菌酶及直链单甲氧基聚乙二醇 琥珀酸基碳酸酯 5kDa 修饰的溶葡萄球菌酶作为抗原， 剂量均为 6U/kg/ 次， 每周一次， 共 5 次。 0033 分别以溶葡萄球菌酶、 Y 型单甲氧基聚乙二醇琥珀酸基碳酸酯 5kDa 修饰的溶葡萄 球菌酶及直链单甲氧基聚乙二醇琥珀酸基碳酸酯 5kDa 修饰的溶葡萄球菌酶作为抗原， 用 双向免疫扩散法测定他们各自抗血清的效价， 测定结果为 ： 溶葡萄球菌酶组抗血清的效价 为1:16 ； Y型单甲氧基聚乙二醇琥珀酸基碳酸酯5kDa修饰的溶葡萄球菌酶和直链单甲氧基 聚乙二醇琥珀酸基碳酸酯 5kDa 修饰的溶葡萄球菌酶抗血清的效价测不出。
30、。 0034 分别以溶葡萄球菌酶、 Y 型单甲氧基聚乙二醇琥珀酸基碳酸酯 5kDa 修饰的溶葡萄 球菌酶及直链单甲氧基聚乙二醇琥珀酸基碳酸酯 5kDa 修饰的溶葡萄球菌酶作为抗原， 然 后用溶葡萄球菌酶的抗血清作为第一抗体， 再以辣根过氧化酶 （HRP） 标记的羊抗兔 IgG 作 为第二抗体， 用酶联免疫吸附法 （ELISA） 测定他们各自的免疫原性， 测定结果为 ： 溶葡萄球 菌酶组为阳性， Y 型单甲氧基聚乙二醇琥珀酸基碳酸酯 5kDa 修饰的溶葡萄球菌酶及直链单 甲氧基聚乙二醇琥珀酸基碳酸酯 5kDa 修饰的溶葡萄球菌酶为阴性。 0035 以上结果表明， 同溶葡萄球菌酶比较， Y 型单甲氧基聚乙二醇琥珀酸基碳酸酯 5kDa 修饰的溶葡萄球菌酶及直链单甲氧基聚乙二醇琥珀酸基碳酸酯 5kDa 修饰的溶葡萄球 菌酶的免疫原性显著降低， 这样更有利于作为治疗药物进行使用。 0036 实施例 9 用Y型单甲氧基聚乙二醇琥珀酸基碳酸酯10kDa、 Y型单甲氧基聚乙二醇琥珀酸基碳酸 酯 20kDa 和 Y 型单甲氧基聚乙二醇琥珀酸基琥珀酸酯 20kDa 代替实施例 4 中的 Y 型单甲氧 基聚乙二醇琥珀酸基碳酸酯 5kDa, 得到了实施例中 6-8 相似的结果。 说 明 书 CN 103131687 A 7 1/1 页 8 图 1 说 明 书 附 图 CN 103131687 A 8 。