13’乙酰基银线草醇C在制备抗肿瘤药物中的应用.pdf

摘要
申请专利号：	CN201110386991.8	申请日：	2011.11.28
公开号：	CN103127062A	公开日：	2013.06.05
当前法律状态：	撤回	有效性：	无权
法律详情：	发明专利申请公布后的视为撤回IPC(主分类):A61K 31/365申请公布日:20130605\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):A61K 31/365申请日:20111128\|\|\|公开
IPC分类号：	A61K31/365; A61P35/00; A61P35/02; C12Q1/02	主分类号：	A61K31/365
申请人：	复旦大学
发明人：	余龙; 刘祖龙; 胡立宏; 朱恒锐
地址：	200433 上海市杨浦区邯郸路220号
优先权：
专利代理机构：	上海元一成知识产权代理事务所(普通合伙) 31268	代理人：	吴桂琴
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内容摘要

本发明属于化工领域及医药领域，涉及13’-乙酰基银线草醇C在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明提供了13’-乙酰基银线草醇C在制备抗肿瘤药物中的应用，所述的肿瘤细胞包括肝癌细胞、白血病细胞、胃癌细胞和胰腺癌细胞。13’-乙酰基银线草醇C属于天然产物，毒副作用小、生物利用度高、性质稳定，具有临床使用价值。本发明的小分子化合物作为新的抗肿瘤药物或者其辅助成分进行开发，抑瘤效果明显，绿色环保，将为治疗和治愈肿瘤提供了一种新的途径和手段。

权利要求书

权利要求书13’‑乙酰基银线草醇C在制备抗肿瘤药物中的应用。
如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤是肝癌、胃癌、白血病或者胰腺癌。
如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤药物是抗胃癌药物。
如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤药物是抗胰腺癌药物。
如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤药物的剂型是针剂、片剂或者胶囊。
一种抑制体外肿瘤细胞增殖的方法，其特征在于，将13’‑乙酰基银线草醇C加入肿瘤细胞的培养液中。
如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的肿瘤细胞是胃癌细胞或者胰腺癌细胞。
如权利要求6所述的方法，其特征在于，加入13’‑乙酰基银线草醇C的终浓度为1‑100μM。
一种抗肿瘤药物，其特征在于，所述的抗肿瘤药物的活性成分是13’‑乙酰基银线草醇C。
如权利要求9所述的抗肿瘤药物，其特征在于，所述的肿瘤是胃癌或者胰腺癌。

说明书

说明书13’‑乙酰基银线草醇C在制备抗肿瘤药物中的应用
技术领域
本发明属于化工领域及医药领域，涉及13’‑乙酰基银线草醇C在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
银线草为金粟兰科植物银线草(Chloranthus Japonicus Sieb)的全草或根及根茎。倍半萜类化合物是金粟兰科植物中比较重要的一类化合物，在整个金粟兰科植物中均有分布，具有消炎解痉、抑制微生物等生物活性。银线草中得到半萜类化合物结构复杂其骨架可分为桉叶烷型、环桉烷型、吉马烷型、菖蒲烷型等数种类型，同时它们具有内酯、酮、醇、多聚体等多种形式。
2008年，Yang等从全缘金粟兰(也有称为毛脉金粟兰)的植物中提取获得了13’‑乙酰基银线草醇C，并认为其可能是钾离子通道的封阻剂(即文中的化合物2，Chlorahololides C‑F：a new class of potent and selective potassium channel blockers from Chloranthus holostegius.，Tetrahedron，64(9)，2027‑2034.，2008)。2009年，Lee等从宽叶金粟兰中提取了13’‑乙酰基银线草醇C，分析了该化合物的结构，并通过实验证明其有抗真菌作用(即文中的CHE‑23C，Antifungal Activity of CHE‑23C，a Dimeric Sesquiterpene from Chloranthus henryi.，Journal of Agricultural and Food Chemistry，57(13)，5750‑5755.，2009)。但是，关于13’‑乙酰基银线草醇C的功能报道仍属少数，需要进一步探索。
13’‑乙酰基银线草醇C是天然产物，生物利用度较高、性质较稳定，具有临床使用价值。随着人们对此类化合物的化学和生物学研究的深入，其分子作用机制将逐步明确，这将进一步推动此类化合物的化学结构修饰和构效关系研究，并有助于提高此类化合物的药用价值。
发明内容
本发明的目的是提供13’‑乙酰基银线草醇C的新的药物用途。
本发明提供了13’‑乙酰基银线草醇C在制备抗肿瘤药物中的应用。所述的抗肿瘤药物可以是抗肝癌、白血病、胰腺癌或者胃癌药物。该抗肿瘤药物可以是针剂或者片剂。
本发明提供了一种抑制体外肿瘤细胞增殖的方法，将13’‑乙酰基银线草醇C加入肿瘤细胞的培养液中。所述的肿瘤细胞可以是肝癌细胞、血癌细胞、宫颈癌细胞、乳腺癌细胞或者胰腺癌细胞。本发明的一个实施例中采用的肝癌细胞是HepG2。一般而言，加入13’‑乙酰基银线草醇C的终浓度为1‑100μM。例如，1‑2μM，1‑10μM，1‑5μM，5‑20μM，2‑30μM，5‑60μM，5‑90μM，10‑80μM，10‑50μM，10‑60μM，10‑20μM，10‑30μM，1‑60μM，5‑10μM，等等。
本发明还提供了一种抗肿瘤药物，所述的抗肿瘤药物的活性成分是13’‑乙酰基银线草醇C。所述的肿瘤可以是肝癌、胃癌、胰腺癌或者血癌。
本发明的小分子化合物可以采用各种常规的制备方法制备。例如，采用人工化学合成的方法。
利用本发明小分子化合物，通过各种常规筛选方法，可筛选出与13’‑乙酰基银线草醇C发生相互作用的物质，如受体、抑制剂或拮抗剂等。
本发明及其抑制剂、拮抗剂等，在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5‑8，较佳地pH约为6‑8，pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、腹膜内、皮下、皮内、或局部给药。
以本发明的13’‑乙酰基银线草醇C为例，可以将其与合适的药学上可接受的载体联用。这类药物组合物含有治疗有效量的化合物和药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的13’‑乙酰基银线草醇C可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重‑约5毫克/千克体重。此外，本发明的13’‑乙酰基银线草醇C还可与其他治疗剂一起使用。
当本发明的13’‑乙酰基银线草醇C被用作药物时，可将治疗有效剂量的13’‑乙酰基银线草醇C施用于哺乳动物，其中该治疗有效剂量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重‑约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明提供了13’‑乙酰基银线草醇C在制备抗肿瘤药物中的应用。13’‑乙酰基银线草醇C是天然产物，副作用较小，能够明显抑制肿瘤细胞的增殖。本发明的小分子化合物作为新的抗肿瘤药物或者其辅助成分进行开发，抑瘤效果明显，绿色环保，将为治疗和治愈肿瘤提供了一种新的途径和手段。
具体实施方式
实验方法：
1.细胞复苏
1)从液氮罐中取出冻存管，直接投入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。
2)从37℃水浴中取出冻存管，用吸管吸出细胞悬液，注入离心管并加入10倍以上培养液，混合后低速离心，弃上清，再重复用培养液洗一次。
3)用培养液适当稀释后，接种培养瓶，放在37℃培养箱静置培养，次日更换培养液，继续培养。培养至一定浓度时进行传代。PANC‑1细胞培养在含10％Gibico胎牛血清的DMEM高糖培养基中，A549和HepG2细胞培养在含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基中，培养基中含100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素。
2.细胞传代培养
每天观察细胞生长的情况，当细胞在培养瓶中长至约90％汇合时传代，约每隔2‑4天传代一次。一瓶传代成三瓶，或一个25cm2传代于一个75cm2的培养瓶中。方法：
1)用1×磷酸缓冲液洗涤细胞一次。
2)加入2‑3ml胰酶消化液消化，置于37℃培养箱中数分钟。用手拍打细胞培养瓶，使细胞分离。
3)用含10‑15％的Gibico胎牛血清的合适培养基终止胰酶消化。将细胞分装于新的培养瓶中，继续培养。
3.细胞冻存
1)取培养至对数生长期的细胞胰蛋白酶消化，收集于离心管中并计数，离心。
2)弃除胰蛋白酶及旧的培养液，加入配置好的冻存培养液(含10％DMSO，40％DMEM和50％Gibico胎牛血清)，冻存液中细胞的最终浓度为0.5‑1×107/ml。用吸管轻轻吹打使细胞均匀，然后分装入无菌冻存管中，每管加1‑1.5ml。
3)将冻存管放入冻存盒置‑80℃速冻，5小时后移入液氮罐中保存。
4.药物准备：
13’‑乙酰基银线草醇C溶于DMSO(二甲基亚砜)，配制成100mM或50mM的母液备用。
实施例1MTS法测定13’‑乙酰基银线草醇C对肝癌细胞的生长抑制作用
HepG2(购自ATCC)3×103/孔接种至96孔板，培养24小时使之贴壁后加入13’‑乙酰基银线草醇C(购自中国科学院上海药物研究所)，设6个浓度梯度，每个浓度设3个复孔。细胞在37℃，5％CO2条件下培养72小时后，倒掉培养液，用MTS试剂盒(Promega公司)测定细胞存活率。
测试方法为：将细胞用无血清培养基洗一遍，按照100μl/well的量加入预先配制好的MTS显色溶液(10ml无血清培养基中加入2ml溶液1和100μl溶液2，充分混匀)。将一个没有细胞的孔设为本底孔，用以校正溶液的背景光吸收。把细胞放入细胞培养箱中继续培养2～4小时，然后用酶标仪读取光吸收值(参考波长630‑700nm，测定波长490nm)，计算细胞存活率，以测定孔光吸收值/对照孔光吸收值作为细胞存活率的数值。根据细胞存活率，计算13’‑乙酰基银线草醇C对HepG2细胞的IC50值。
IC50是指被抑制一半时抑制剂的浓度。这里即为HepG2细胞数量为对照的一半时13’‑乙酰基银线草醇C的浓度。IC50的计算一般需要测定5个以上的剂量效应，再通过曲线拟合得到函数计算而得。
结果：13’‑乙酰基银线草醇C对HepG2细胞的IC50值为103μM。
实施例213’‑乙酰基银线草醇C对人胰腺癌细胞的生长抑制作用
利用cck‑8试剂盒(日本同仁化学研究所)检测。
步骤：
1)将PANC‑1细胞(购自中国科学院细胞库)均匀的种在96孔板里，每孔细胞数为3×103个。
2)待贴壁，过夜后加药，加药(13’‑乙酰基银线草醇C浓度分别为50、16.67、5.56、1.85、0.62μM)，每个浓度有3个复孔。
3)培养48小时，将完全培养基替换成无血清培养基与CCK8的混合物(10∶1)，于37℃培养箱孵育2小时。
4)以450nm为测量波长，以650nm为对照波长，于酶标仪上测出读数。
结果：13’‑乙酰基银线草醇C对PANC‑1细胞的IC50值为5.38μM。
实施例313’‑乙酰基银线草醇C对人白血病细胞的生长抑制作用
按照实施例2的方法检测13’‑乙酰基银线草醇C对K562的作用，结果显示13’‑乙酰基银线草醇C对K562细胞的IC50值为1.75μM。
实施例413’‑乙酰基银线草醇C对人胃癌细胞的生长抑制作用
按照实施例2的方法检测13’‑乙酰基银线草醇C对HGC的作用，结果显示13’‑乙酰基银线草醇C对HGC细胞的IC50值为9.68μM。

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1、(10)申请公布号 CN 103127062 A (43)申请公布日 2013.06.05 CN 103127062 A *CN103127062A* (21)申请号 201110386991.8 (22)申请日 2011.11.28 A61K 31/365(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 35/02(2006.01) C12Q 1/02(2006.01) (71)申请人复旦大学地址 200433 上海市杨浦区邯郸路 220 号 (72)发明人余龙刘祖龙胡立宏朱恒锐 (74)专利代理机构上海元一成知识产权代理事务所 ( 普通合伙 ) 3126。

2、8 代理人吴桂琴 (54) 发明名称 13 - 乙酰基银线草醇 C 在制备抗肿瘤药物中的应用 (57) 摘要本发明属于化工领域及医药领域，涉及 13 - 乙酰基银线草醇 C 在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明提供了 13 - 乙酰基银线草醇 C 在制备抗肿瘤药物中的应用，所述的肿瘤细胞包括肝癌细胞、白血病细胞、胃癌细胞和胰腺癌细胞。 13 - 乙酰基银线草醇 C 属于天然产物，毒副作用小、生物利用度高、性质稳定，具有临床使用价值。本发明的小分子化合物作为新的抗肿瘤药物或者其辅助成分进行开发，抑瘤效果明显，绿色环保，将为治疗和治愈肿瘤提供了一种新的途径和手。

3、段。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页说明书 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书1页说明书4页 (10)申请公布号 CN 103127062 A CN 103127062 A *CN103127062A* 1/1 页 2 1.13 - 乙酰基银线草醇 C 在制备抗肿瘤药物中的应用。 2. 如权利要求 1 所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤是肝癌、胃癌、白血病或者胰腺癌。 3. 如权利要求 1 所述的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤药物是抗胃癌药物。 4. 如权利要求 1 所述的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤药物是抗胰腺癌。

4、药物。 5. 如权利要求 1 所述的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤药物的剂型是针剂、片剂或者胶囊。 6. 一种抑制体外肿瘤细胞增殖的方法，其特征在于，将 13 - 乙酰基银线草醇 C 加入肿瘤细胞的培养液中。 7. 如权利要求 6 所述的方法，其特征在于，所述的肿瘤细胞是胃癌细胞或者胰腺癌细胞。 8. 如权利要求 6 所述的方法，其特征在于，加入 13 - 乙酰基银线草醇 C 的终浓度为 1-100M。 9. 一种抗肿瘤药物，其特征在于，所述的抗肿瘤药物的活性成分是 13 - 乙酰基银线草醇 C。 10. 如权利要求 9 所述的抗肿瘤药物，其特征在于，所述的肿。

5、瘤是胃癌或者胰腺癌。权利要求书 CN 103127062 A 2 1/4 页 3 13 - 乙酰基银线草醇 C 在制备抗肿瘤药物中的应用技术领域 0001 本发明属于化工领域及医药领域，涉及13 -乙酰基银线草醇C在制备抗肿瘤药物中的应用。背景技术 0002 银线草为金粟兰科植物银线草 (Chloranthus Japonicus Sieb) 的全草或根及根茎。倍半萜类化合物是金粟兰科植物中比较重要的一类化合物，在整个金粟兰科植物中均有分布，具有消炎解痉、抑制微生物等生物活性。银线草中得到半萜类化合物结构复杂其骨架可分为桉叶烷型、环桉烷型、吉马烷型、菖蒲烷。

6、型等数种类型，同时它们具有内酯、酮、醇、多聚体等多种形式。 0003 2008 年， Yang 等从全缘金粟兰 ( 也有称为毛脉金粟兰 ) 的植物中提取获得了 13 - 乙酰基银线草醇 C，并认为其可能是钾离子通道的封阻剂 ( 即文中的化合物 2， Chlorahololides C-F ： a new class of potent and selective potassium channel blockers from Chloranthus holostegius.， Tetrahedron， 64(9)， 2027-2034.， 2008)。 2009 年， Lee 等从。

7、宽叶金粟兰中提取了 13 - 乙酰基银线草醇 C，分析了该化合物的结构，并通过实验证明其有抗真菌作用 ( 即文中的 CHE-23C， Antifungal Activity of CHE-23C， a Dimeric Sesquiterpene from Chloranthus henryi.， Journal of Agricultural and Food Chemistry， 57(13)， 5750-5755.， 2009)。但是，关于 13 - 乙酰基银线草醇 C 的功能报道仍属少数，需要进一步探索。 0004 13 - 乙酰基银线草醇 C 是天然产物，生物利用度较高、。

8、性质较稳定，具有临床使用价值。随着人们对此类化合物的化学和生物学研究的深入，其分子作用机制将逐步明确，这将进一步推动此类化合物的化学结构修饰和构效关系研究，并有助于提高此类化合物的药用价值。发明内容 0005 本发明的目的是提供 13 - 乙酰基银线草醇 C 的新的药物用途。 0006 本发明提供了 13 - 乙酰基银线草醇 C 在制备抗肿瘤药物中的应用。所述的抗肿瘤药物可以是抗肝癌、白血病、胰腺癌或者胃癌药物。该抗肿瘤药物可以是针剂或者片剂。 0007 本发明提供了一种抑制体外肿瘤细胞增殖的方法，将 13 - 乙酰基银线草醇 C 加入肿瘤细胞的培养液中。所述的肿。

9、瘤细胞可以是肝癌细胞、血癌细胞、宫颈癌细胞、乳腺癌细胞或者胰腺癌细胞。本发明的一个实施例中采用的肝癌细胞是 HepG2。一般而言，加入 13 - 乙酰基银线草醇 C 的终浓度为 1-100M。例如， 1-2M， 1-10M， 1-5M， 5-20M， 2-30M， 5-60M， 5-90M， 10-80M， 10-50M， 10-60M， 10-20M， 10-30M， 1-60M， 5-10M，等等。 0008 本发明还提供了一种抗肿瘤药物，所述的抗肿瘤药物的活性成分是 13 - 乙酰基银线草醇 C。所述的肿瘤可以是肝癌、胃癌、胰腺癌或者血癌。说明书 CN 1031。

10、27062 A 3 2/4 页 4 0009 本发明的小分子化合物可以采用各种常规的制备方法制备。例如，采用人工化学合成的方法。 0010 利用本发明小分子化合物，通过各种常规筛选方法，可筛选出与 13 - 乙酰基银线草醇 C 发生相互作用的物质，如受体、抑制剂或拮抗剂等。 0011 本发明及其抑制剂、拮抗剂等，在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中 pH 通常约为 5-8，较佳地 pH 约为 6-8， pH 值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可。

11、以通过常规途径进行给药，其中包括 ( 但并不限于 ) ：肌内、腹膜内、皮下、皮内、或局部给药。 0012 以本发明的13 -乙酰基银线草醇C为例，可以将其与合适的药学上可接受的载体联用。这类药物组合物含有治疗有效量的化合物和药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括 ( 但并不限于 ) ：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的 13 - 乙酰基银线草醇 C 可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合。

12、物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约 1 微克 / 千克体重 - 约 5 毫克 / 千克体重。此外，本发明的 13 - 乙酰基银线草醇 C 还可与其他治疗剂一起使用。 0013 当本发明的 13 - 乙酰基银线草醇 C 被用作药物时，可将治疗有效剂量的 13 - 乙酰基银线草醇 C 施用于哺乳动物，其中该治疗有效剂量通常至少约 10 微克 / 千克体重，而且在大多数情况下不超过约 8 毫克 / 千克体重，较佳地该剂量是约 10 微克 / 千克体重 - 约 1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状。

13、况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。 0014 本发明提供了 13 - 乙酰基银线草醇 C 在制备抗肿瘤药物中的应用。13 - 乙酰基银线草醇 C 是天然产物，副作用较小，能够明显抑制肿瘤细胞的增殖。本发明的小分子化合物作为新的抗肿瘤药物或者其辅助成分进行开发，抑瘤效果明显，绿色环保，将为治疗和治愈肿瘤提供了一种新的途径和手段。具体实施方式 0015 实验方法： 0016 1. 细胞复苏 0017 1) 从液氮罐中取出冻存管，直接投入 37温水中，并不时摇动令其尽快融化。 0018 2)从37水浴中取出冻存管，用吸管吸出细胞悬液，注入离心管并加入10倍以上。

14、培养液，混合后低速离心，弃上清，再重复用培养液洗一次。 0019 3) 用培养液适当稀释后，接种培养瓶，放在 37培养箱静置培养，次日更换培养液，继续培养。培养至一定浓度时进行传代。PANC-1 细胞培养在含 10 Gibico 胎牛血清的 DMEM 高糖培养基中， A549 和 HepG2 细胞培养在含 10胎牛血清的 DMEM 高糖培养基中，培养基中含 100U/ml 青霉素和 100g/ml 链霉素。 0020 2. 细胞传代培养 0021 每天观察细胞生长的情况，当细胞在培养瓶中长至约 90汇合时传代，约每隔说明书 CN 103127062 A 4 3/。

15、4 页 5 2-4 天传代一次。一瓶传代成三瓶，或一个 25cm2 传代于一个 75cm2 的培养瓶中。方法： 0022 1) 用 1 磷酸缓冲液洗涤细胞一次。 0023 2)加入2-3ml胰酶消化液消化，置于37培养箱中数分钟。用手拍打细胞培养瓶，使细胞分离。 0024 3) 用含 10-15的 Gibico 胎牛血清的合适培养基终止胰酶消化。将细胞分装于新的培养瓶中，继续培养。 0025 3. 细胞冻存 0026 1) 取培养至对数生长期的细胞胰蛋白酶消化，收集于离心管中并计数，离心。 0027 2) 弃除胰蛋白酶及旧的培养液，加入配置好的冻存培养液 ( 含 10 DM。

16、SO， 40 DMEM 和 50 Gibico 胎牛血清 )，冻存液中细胞的最终浓度为 0.5-1107/ml。用吸管轻轻吹打使细胞均匀，然后分装入无菌冻存管中，每管加 1-1.5ml。 0028 3) 将冻存管放入冻存盒置 -80速冻， 5 小时后移入液氮罐中保存。 0029 4. 药物准备： 0030 13 - 乙酰基银线草醇 C 溶于 DMSO( 二甲基亚砜 )，配制成 100mM 或 50mM 的母液备用。 0031 实施例 1MTS 法测定 13 - 乙酰基银线草醇 C 对肝癌细胞的生长抑制作用 0032 HepG2(购自ATCC)3103/孔接种至96孔板，培养24。

17、小时使之贴壁后加入13 -乙酰基银线草醇 C( 购自中国科学院上海药物研究所 )，设 6 个浓度梯度，每个浓度设 3 个复孔。细胞在 37， 5 CO2 条件下培养 72 小时后，倒掉培养液，用 MTS 试剂盒 (Promega 公司 ) 测定细胞存活率。 0033 测试方法为：将细胞用无血清培养基洗一遍，按照 100l/well 的量加入预先配制好的 MTS 显色溶液 (10ml 无血清培养基中加入 2ml 溶液 1 和 100l 溶液 2，充分混匀 )。将一个没有细胞的孔设为本底孔，用以校正溶液的背景光吸收。把细胞放入细胞培养箱中继续培养24小时，然后用酶标。

18、仪读取光吸收值(参考波长630-700nm，测定波长490nm)，计算细胞存活率，以测定孔光吸收值 / 对照孔光吸收值作为细胞存活率的数值。根据细胞存活率，计算 13 - 乙酰基银线草醇 C 对 HepG2 细胞的 IC50 值。 0034 IC50 是指被抑制一半时抑制剂的浓度。这里即为 HepG2 细胞数量为对照的一半时 13 - 乙酰基银线草醇 C 的浓度。IC50 的计算一般需要测定 5 个以上的剂量效应，再通过曲线拟合得到函数计算而得。 0035 结果： 13 - 乙酰基银线草醇 C 对 HepG2 细胞的 IC50 值为 103M。 0036 实施例 213 - 。

19、乙酰基银线草醇 C 对人胰腺癌细胞的生长抑制作用 0037 利用 cck-8 试剂盒 ( 日本同仁化学研究所 ) 检测。 0038 步骤： 0039 1) 将 PANC-1 细胞 ( 购自中国科学院细胞库 ) 均匀的种在 96 孔板里，每孔细胞数为 3103 个。 0040 2) 待贴壁，过夜后加药，加药 (13 - 乙酰基银线草醇 C 浓度分别为 50、 16.67、 5.56、 1.85、 0.62M)，每个浓度有 3 个复孔。 0041 3) 培养 48 小时，将完全培养基替换成无血清培养基与 CCK8 的混合物 (10 1)，于 37培养箱孵育 2 小时。说明书。

20、CN 103127062 A 5 4/4 页 6 0042 4) 以 450nm 为测量波长，以 650nm 为对照波长，于酶标仪上测出读数。 0043 结果： 13 - 乙酰基银线草醇 C 对 PANC-1 细胞的 IC50 值为 5.38M。 0044 实施例 313 - 乙酰基银线草醇 C 对人白血病细胞的生长抑制作用 0045 按照实施例 2 的方法检测 13 - 乙酰基银线草醇 C 对 K562 的作用，结果显示 13 - 乙酰基银线草醇 C 对 K562 细胞的 IC50 值为 1.75M。 0046 实施例 413 - 乙酰基银线草醇 C 对人胃癌细胞的生长抑制作用 0047 按照实施例2的方法检测13 -乙酰基银线草醇C对HGC的作用，结果显示13 -乙酰基银线草醇 C 对 HGC 细胞的 IC50 值为 9.68M。说明书 CN 103127062 A 6 。

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