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1、10申请公布号CN102327278A43申请公布日20120125CN102327278ACN102327278A21申请号201110199601622申请日20110718A61K31/69200601A61P31/04200601A61K33/3820060171申请人东南大学地址210096江苏省南京市四牌楼2号72发明人王雪梅李水红燕红74专利代理机构南京经纬专利商标代理有限公司32200代理人李纪昌54发明名称碳硼烷衍生物的应用、纳米复合物制剂及其应用57摘要本发明提供了碳硼烷衍生物及其应用。相关三种新型碳硼烷衍生物的结构式如(1)(2)(3)所示,作为药物活性成分的抗菌药物,不。
2、仅能对临床上常见的病原菌(金黄色葡萄球菌,鲍曼不动杆菌,肺炎克雷伯氏菌,奇异变形杆菌)具有抗菌活性,而且对多药耐药金黄色葡萄球菌菌株具有相同程度的抗菌活性,能够抑制其多药耐药性。其中化合物(2)能够与耐药金黄色葡萄球菌胞外蛋白的发生作用,降低细菌对生物表面的粘附性,抑制耐药菌株生物膜的形成。对降低金黄色葡萄球菌的毒力和侵袭力,增加治疗有效率,避免大剂量使用抗生素造成的不良反应,为寻求新型的抗耐药菌药物提供了一类新的化合物。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书5页附图2页CN102327281A1/1页21碳硼烷衍生物在制备治疗抗菌药物中的应用,其特。
3、征在于所述的碳硼烷衍生物结构式为(1)、(2)或(3)及其药物上可接受的盐类或载体。2根据权利要求书1所述的碳硼烷衍生物在制备治疗纳米抗菌药物中的应用,其特征在于所述的病菌为对抗生素药物有抗性的病原菌。3根据权利要求1所述的碳硼烷衍生物与纳米银颗粒组合的纳米复合物制剂,其特征在于按重量份计,其包括碳硼烷衍生物一份、纳米银颗粒一份。4碳硼烷衍生物与纳米银颗粒组合的纳米复合物制剂在制备治疗抗菌药物中的应用。5根据权利要求书4所述的碳硼烷衍生物与纳米银颗粒组合的纳米复合物制剂在制备治疗抗菌药物中的应用,其特征在于所述的病菌为对抗生素药物有抗性的病原菌。6根据权利要求5所述的所述的碳硼烷衍生物与纳米银。
4、颗粒组合的纳米复合物制剂在制备治疗抗菌药物中的应用,其特征在于所述的对抗生素药物有抗性的病原菌为金黄色葡萄球菌临床耐药菌。权利要求书CN102327278ACN102327281A1/5页3碳硼烷衍生物的应用、纳米复合物制剂及其应用技术领域0001本发明涉及纳米药物领域,具体涉及碳硼烷衍生物及其纳米复合制剂,其为药物活性成分或药物组合物,其抗菌作用,以及在抗菌药物研制中的应用。0002背景技术0003抗菌药物一般是指在一定浓度下对病原体具有杀菌或抑菌活性的药物,包括各种抗生素和化学合成药物。目前国际上用于临床的常用抗菌药物按结构分类主要分为八大类内酰胺类;氨基糖苷类;四环素类;氟喹诺酮类;叶酸。
5、途径抑制剂类;氯霉素;糖肽类;大环内酯类。其主要作用机制有干扰细胞壁的形成抑制核酸的合成抑制蛋白质合成改变细胞膜的通透性作用于能量代谢系统和作为抗代谢物。然而,随着抗生素的广泛应用,越来越多的病原菌对常用抗生素产生一定的耐药性,且耐药程度日趋严重。自从1961年英国首先报道世界上第一株耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌MRSA以来,不同克隆的MRSA菌株急剧增多并遍及全球。MRSA具有传播速度快和广泛耐药性的特点,已居医院感染病原菌的首位。万古霉素被认为是治疗MRSA感染的最后一道防线,但近几年又发现了对万古霉素耐药的MRSA,这给临床MRSA感染的治疗带来巨大难题。细菌产生耐药性的生化机制主要有钝化。
6、酶的产生药物作用靶位的改变外膜通透性的改变和主动外排机制。其中细菌生物膜的形成与细菌的群体耐药有着密切的联系,据统计临床上约有65的细菌感染与细菌生物膜感染有关。细菌生物膜引起的感染多表现为复发性、难治性和慢性持续性特征。其关键在于1即使宿主的细胞和体液免疫防御反应很强也难以完全清除生物膜感染。2抗生素可以杀死膜内游出的细菌而减轻感染症状却不能杀死生物膜内菌而治愈感染。3生物膜有规律的释放浮游态的细菌到周围组织,如果宿主免疫防御体系不能及时清除这些细菌,临床即表现为急性感染,生物膜便成为内源性感染原。0004因此对细菌生物耐药机理进行深入研究,以指导对现有药物进行结构改造或开发新型抗菌药物是十。
7、分有必要的。我们研究发现这三种新型碳硼烷衍生物及其纳米复合物制剂均具有较好的抗菌活性,特别是其通过特异性与蛋白疏水微区结合,以及诱导耐药金黄色葡萄球菌胞外蛋白表达量的减少,从而降低对生物组织或细胞的粘附性,降低细菌生物膜的形成,从而抑制因细菌形成生物膜而使药物无法杀死膜内菌而使治疗失败或易复发这一机理造成的多药耐药性。由于这三种新型碳硼烷衍生物及其纳米复合物制剂为本研究组首次合成,因此国内外专利及其他文献没有涉及新型碳硼烷衍生物及其纳米复合物制剂抗菌活性的有关报道。发明内容0005技术问题本发明提供了三种新型碳硼烷衍生物及其纳米复合物制剂作为抗菌药物的应用,以及在治疗耐药细菌生物膜感染中的应用。
8、。0006技术方案说明书CN102327278ACN102327281A2/5页4碳硼烷衍生物在制备治疗抗菌药物中的应用,其特征在于所述的碳硼烷衍生物结构式为(1)、(2)或(3)及其药物上可接受的盐类或载体。0007所述的碳硼烷衍生物在制备治疗纳米抗菌药物中的应用,其特征在于所述的病菌为对抗生素药物有抗性的病原菌。0008所述的碳硼烷衍生物与纳米银颗粒组合的纳米复合物制剂,其特征在于按重量份计,其包括碳硼烷衍生物一份、纳米银颗粒一份。0009碳硼烷衍生物与纳米银颗粒组合的纳米复合物制剂的制备方法为将三种碳硼烷衍生物(1),(2),(3)与纳米银按照质量比为11的比例混合后,加入二甲基亚砜水1。
9、99体积比作为溶剂,用超声振荡器(100W,40KHZ)振荡30分钟即得。得到的复合物制剂为黑色混悬液,粒径范围为2040NM。0010碳硼烷衍生物与纳米银颗粒组合的纳米复合物制剂在制备治疗抗菌药物中的应用。0011所述的碳硼烷衍生物与纳米银颗粒组合的纳米复合物制剂在制备治疗抗菌药物中的应用,其特征在于所述的病菌为对抗生素药物有抗性的病原菌。0012所述的所述的碳硼烷衍生物与纳米银颗粒组合的纳米复合物制剂在制备治疗抗菌药物中的应用,其特征在于所述的对抗生素药物有抗性的病原菌为金黄色葡萄球菌临床耐药菌。0013所述的碳硼烷衍生物,其特征在于该纳米药物组合上可接受的载体选自以下的至少一种赋性剂,粘。
10、合剂,润滑剂,崩解剂,包衣剂,乳化剂,悬浮剂,溶剂,稳定剂,吸收剂,注射用水和等渗剂。0014所述的碳硼烷衍生物,其特征在于该纳米复合物制剂组合制成于绷带或注射给药形式。0015在实际应用中可将三种碳硼烷衍生物(结构式123所示)作为抗菌药物单独使用或与其他药物联合使用,利用其能抑制临床耐药菌生物膜的形成这一特点,不但可预防或治疗由金黄色葡萄球菌,鲍曼不动杆菌,肺炎克雷伯氏菌,鲍曼不动杆菌耐药菌所引起的浅层或深部的微生物感染,而且可联合其他药物对大肠杆菌,绿脓杆菌,霍乱弧菌,结核杆菌等其他病原微生物的感染。0016有益效果1三种碳硼烷衍生物及其纳米复合物制剂均具有广谱抗菌活性,对供试菌株金黄色。
11、葡萄球菌,鲍曼不动杆菌,肺炎克雷伯氏菌,奇异变形杆菌都有很好的抗菌活性。2相关硼烷衍生物及其纳米复合物制剂对金黄色葡萄球菌临床耐药菌株具有很好的抗菌活性,能够通过抑制其生物膜的形成而抑制其多药耐药性,用以治疗生物膜相说明书CN102327278ACN102327281A3/5页5关的细菌感染。附图说明0017下面结合附图说明本发明的实施例。本发明保护范围不以实施例为限。0018图1是化合物(1)的抗金黄色葡萄球菌时间杀菌曲线。0019图2是化合物(2)的抗金黄色葡萄球菌时间杀菌曲线。0020图3是化合物(3)的抗金黄色葡萄球菌时间杀菌曲线。0021图4是激光共聚焦显微镜观察化合物(2)不同浓度。
12、下对临床耐药金黄色葡萄球菌生物膜形成的影响。具体实施方式0022实施例1三种碳硼烷衍生物的最低抑菌浓度试验11受试药物的配制如结构式(1)、(2)、(3)所示的三种碳硼烷衍生物分别用二甲基亚砜配制成高浓度母液,再用双蒸水分别稀释成浓度为1600,800,400,200,100,50,25,125,625G/ML。受试药物于4保存。实验前,将药物取出37水浴融合后,摇匀,进行药效学实验。实验中需严格控制DMSO终浓度在05V/V以下,以确保对生物体无任何细胞毒性。002312实验菌株及培养方法标准菌株金黄色葡萄球菌(CGMCC189),肺炎克雷伯氏菌ATCC700600,鲍曼不动杆菌ATCC19。
13、606,奇异变形杆菌ATCC12453。临床耐药菌株金黄色葡萄球菌(SA321),肺炎克雷伯氏菌KP450,鲍曼不动杆菌AB135,奇异变形杆菌PM102。LB液体培养基1W/V胰蛋白胨,05W/V酵母抽提物,1W/V氯化钠,高压蒸汽灭菌30MIN后,用2MOL/ML的NAOH调整PH至7274。LB琼脂板为LB液体培养基中加入05W/V琼脂粉,高压蒸汽灭菌后,冷却至50倒板,冷凝即得。培养方法用接种环从4保存的固体斜面培养基上挑取少量菌落,接种于固体LB培养基平面上,37恒温箱中培养24H后,用接种环挑取35个菌落转移至无菌试管中,用09无菌生理盐水稀释并混匀,显微镜下用血细胞计算板计数,并。
14、用培养基调整菌液浓度至1010550105CFU/ML作MIC测定用菌悬液。002413最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)的测定根据美国临床试验室标准化委员会(CLSI)2006年制订的稀释法抗菌药物敏感性试验方案(M7A7)。取三组分别加有不同终浓度1000,800,400,200,100,50,25,125,625G/ML的化合物1,化合物2,化合物3的菌悬液(2105CFU/ML),加入到无菌96孔板中,每孔加入200L,未加药物的细菌悬液作为阳性对照组,200LLB培养液作为阴性对照组,8种菌株分别进行测定。经恒温培养24H后,在阴性对照溶液清澈,阳性对照组菌落生长良好的前。
15、提下,肉眼观察到各加药组微孔中溶液澄清的最低加药浓度即为MIC。取大于MIC浓度的其他几个浓度的培养物分别吸取01ML,移种在不含药物的琼脂培养平板上孵育1824H,分别菌落计数,其菌落数少于5个的药物浓度即为MBC。MIC被定义为微生物没有增长的最低抗菌剂浓度。MBC被定义为完全杀死某种菌株的药物最低浓度。对金黄色葡萄球菌,肺炎克雷伯氏菌,鲍曼不动杆菌,奇异变形杆菌的标准菌株和临床耐药菌株均有抑菌活性,MIC范围为25800G/ML。试验结果表明化合说明书CN102327278ACN102327281A4/5页6物1,化合物2,化合物3对金黄色葡萄球菌,肺炎克雷伯氏菌,鲍曼不动杆菌以及奇异变。
16、形杆菌的敏感标准菌株和临床多药耐药菌株均有一定的生长抑制作用,且这四种细菌对化合物1,化合物2,化合物3的敏感程度基本无显著差别,因此表明了该三种化合物能克服临床多药耐药性菌株对药物的耐药性。0025实施例2三种碳硼烷衍生物纳米复合物制剂抗金黄色葡萄球菌时间杀菌曲线,如图1、2、3。0026三种碳硼烷衍生物(1),(2),(3)纳米复合物制剂的抗金黄色葡萄球菌临床耐药株SA321的抗菌特点通过时间杀菌曲线评估。在不同浓度125,25,50,100,200G/ML下被测试。细菌悬液分别加入上述终浓度的药物,设置未加药的细菌悬液作为对照组,然后将它们放入到恒温培养箱中37培养,分别取不同时间间隔0。
17、,4,8,12,16,24H的培养液进行平板菌落计算,杀菌活性被定义为与对照组相比大于3倍LOG10CFU/ML的下降量。试验结果表明相关抗菌活性均呈浓度依赖型。0027实施例3三种碳硼烷衍生物及其纳米复合物制剂抑菌百分率比较试验细胞密度为2105CFU/ML的标准菌株GCMCC189和临床耐药菌株SA321的细菌悬液分别加入不同终浓度(8,16,32G/ML)的化合物(1),(2),(3)制剂,未加药的细菌悬液设为对照组,然后放入恒温培养箱中37培养24H,用紫外分光光度计测定600NM处的吸光度值。抑菌百分率1ODTESTEDODBLANK/ODCONTROLODBLANK100试验结果表。
18、明三种碳硼烷衍生物及其纳米复合物制剂对金黄色葡萄球菌敏感和耐药菌株的抑菌百分率没有明显差异(P005)。三种化合物对金黄色葡萄球菌的敏感菌株和耐药菌株的敏感程度无显著性差异这表明了这三种化合物具有抗耐药性。0028实施例4碳硼烷衍生物化合物2及其纳米复合物制剂诱导金黄色葡萄球菌临床耐药菌株SA321粘附性降低。0029人类上皮细胞系人子宫颈癌细胞HELACELLS常被应用于衡量细菌对细胞或组织侵袭力能力的一个尺度。通过对HELA细胞粘附性的大小来判断其侵袭力的大小。试验过程简述如下亚抑菌浓度下(SUBMIC)的SA321菌株与HELA细胞共培养2H后,通过瑞氏吉姆萨染色后于显微镜下观察。粘附有。
19、细菌的HELA细胞数与细胞总数的比例作为观察结果。试验中在显微镜下视野中数80个HELA细胞,其中粘附有细菌的HELA细胞数除以80后的百分率作为粘附率结果。由此可见经亚抑菌浓度的化合物(2)诱导后,金黄色葡萄球菌临床耐药菌株SA321的粘附性发生显著降低(P005)。0030实施例5碳硼烷衍生物化合物2及其纳米复合物制剂与细菌胞外蛋白的相互作用。0031试验过程简述如下首先提取出金黄色葡萄球菌临床耐药菌株SA321的胞外蛋白,然后加入不同浓度的化合物(2)与胞外蛋白作用2H后进行考马斯亮蓝R250染色,测定595NM处的吸光度值OD595NM。试验结果表明加入相关制剂的蛋白质样品OD595N。
20、M值与未加药的对照组比较,发生显著降低。0032实施例6碳硼烷衍生物化合物2及其纳米复合物制剂抑制临床耐药金黄色葡萄球菌菌株生物膜的形成。0033试验过程简述如下取SA321菌株菌悬液1ML加入到6孔板中,然后每孔放入一个盖玻片,分别向5个孔中加入5个不同浓度的碳硼烷衍生物制剂,未加药的孔作为对照说明书CN102327278ACN102327281A5/5页7组,37条件下静态培养18小时后,用PBS洗掉未粘连细菌,然后用吖啶橙染色,于激光共聚焦显微镜下观察生物膜的形成情况。研究结果表明亚抑菌浓度下的新型碳硼烷衍生物制剂能够抑制细菌生物膜的形成。说明书CN102327278ACN102327281A1/2页8图1图2说明书附图CN102327278ACN102327281A2/2页9图3图4说明书附图CN102327278A。