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1、(10)申请公布号 CN 103014022 A (43)申请公布日 2013.04.03 CN 103014022 A *CN103014022A* (21)申请号 201210552305.4 (22)申请日 2012.12.18 C12N 15/29(2006.01) C07K 14/415(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (71)申请人 上海师范大学 地址 200234 上海市徐汇区桂林路 100 号 (72)发明人 马晓静 巩孝帝 林冬枝 董彦君 (74)专利代理机构 上海伯瑞杰知识产权代理有 限公司 31227 代理人。
2、 吴瑾瑜 (54) 发明名称 一个控制早期水稻叶绿体发育的基因及其应 用 (57) 摘要 本发明涉及一个控制早期水稻叶绿体发育的 基因及其检测方法和应用。本发明公开了一个控 制早期水稻叶绿体发育的基因， 具有SEQ ID No.1 所示的核苷酸序列， 该基因编码的蛋白质具有SEQ IDNo.2所示的氨基酸序列。 利用设计的如SEQ ID No.4 和 No.5 特异性 PCR 引物， 通过对水稻中所提 取的DNA进行PCR扩增后经Taq I酶切进行鉴定， 能快速检测到含有该基因水稻植株， 其检测准确 性高， 操作简单， 成本低廉。水稻中该基因被破坏 即可导致早期水稻植株黄化。通过本发明得到的 。
3、控制早期水稻叶绿体发育的基因可应用于杂交水 稻制种， 可提高杂交水稻不育系自身以及它配制 杂交水稻的纯度。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 7 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 7 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 控制早期水稻叶绿体发育的基因， 其特征在于， 具有 SEQ IDNo.1 所示的核苷酸序 列。 2.权利要求1所述控制早期水稻叶绿体发育的基因， 其特征在于， 其核苷酸序列如SEQ ID No.1 所示。 3.权利要求1或2所述的基因序列所编码的蛋白质，。
4、 其特征在于， 具有SEQ ID No.2所 示的氨基酸序列。 4. 权利要求 3 所述的蛋白质， 其特征在于， 氨基酸序列如 SEQID No.2 所示。 5.一对用于检测权利要求1或2所述控制早期水稻叶绿体发育的基因的特异性PCR引 物， 其特征在于， 其核苷酸序列为 ： 上游 ： 5 -AAACCGAAATCGTCGTGGAG-3 下游 ： 5 -ACAAGGGAGCACCTGAACTAAGAC-3。 6. 检测权利要求 1 或 2 所述控制早期水稻叶绿体发育的基因的方法， 其特征在于， 用 权利要求5所述的特异性PCR引物对水稻苗期所提取的DNA进行PCR扩增反应， 得到799bp 核。
5、苷酸片段， 说明含有控制早期水稻叶绿体发育的基因。 7. 权利要求 6 所述的检测方法， 其特征在于， 所述的 799bp 核苷酸片段， 序列如 SEQ ID No.3 所示。 8. 权利要求 6 所述的检测方法， 其特征在于， 将所得到的得到 799bp 片段用 Taq I 酶 切， 出现长度为 536bp 和 263bp 的特异性片段， 说明含有控制早期水稻叶绿体发育的基因。 9. 权利要求 1 或 2 所述控制早期水稻叶绿体发育的基因用于鉴别水稻品种真伪。 权 利 要 求 书 CN 103014022 A 2 1/4 页 3 一个控制早期水稻叶绿体发育的基因及其应用 技术领域 0001 。
6、本发明涉及农业和植物生物技术等领域， 特别是在分子水平上进行植物遗传育种 以及植物生理、 基因功能等基础研究。 背景技术 0002 高等植物叶绿体是进行光合作用的场所， 而叶绿体的发育受一系列核质基因的控 制。研究表明控制叶绿体发育的基因被破坏可导致叶绿体发育受阻， 进而使植物叶色发生 异常， 甚至使光合作用效率急剧下降。 目前， 研究工作者们利用物理、 化学、 生物等诱变创制 水稻叶色突变体， 将其应用于水稻的遗传育种、 生理及其相关基因的克隆和功能研究。 本研 究利用经物理诱变创制的水稻早期苗色突变体并通过图位克隆技术定位到一个控制叶绿 体发育的基因， 至今尚未有与此基因相关的文献报道。 。
7、发明内容 0003 本发明的目的在于提供一个控制早期水稻叶绿体发育的基因、 该基因编码的蛋白 质及这种基因的检测方法和应用。 0004 水稻中该控制早期水稻叶绿体发育的基因若被破坏， 即可导致早期水稻植株黄 化。 0005 这种控制早期水稻叶绿体发育的基因， 具有 SEQ ID No.1 所示的核苷酸序列。优 选的， 其核苷酸序列如 SEQ ID No.1 所示。 0006 所述的基因序列所编码的蛋白质， 具有 SEQ ID No.2 所示的氨基酸序列。优选的， 氨基酸序列如 SEQ ID No.2 所示。 0007 一对用于检测上述基因的特异性引物， 序列为 ： 0008 上游 ： 5 -A。
8、AACCGAAATCGTCGTGGAG-3 0009 下游 ： 5 -ACAAGGGAGCACCTGAACTAAGAC-3 0010 即 SEQ ID No.4 和 SEQ ID No.5 所示的序列。 0011 检测这种控制早期水稻叶绿体发育的基因的方法为， 采用上述特异性 PCR 引物对 水稻苗期所提取的 DNA 进行 PCR 扩增反应， 得到 799bp 核苷酸片段， 说明含有控制早期水稻 叶绿体发育的基因。优选的， 799bp 核苷酸片段序列如 SEQ ID No.3 所示。优选的， 将所得 到的得到 799bp 片段用 Taq I 酶切， 出现长度为 536bp 和 263bp 的特。
9、异性片段， 说明含有控 制早期水稻叶绿体发育的基因。 0012 在本发明研究中， 发明人设计的特异性的 PCR 引物和检测方法， 能对水稻苗期所 提取的 DNA 进行 PCR 扩增， 其产物用 Taq I 进行酶切鉴定， 根据酶切带型能快速检测到含有 此基因的水稻品种， 其检测的准确性高， 操作简单， 成本低廉。若一个水稻品种中含有此基 因， 则用上述引物能够扩增出长度为 799bp 的特异性片段。然后用 Taq I 对该片段进行酶 切， 其酶切带型为出现两个特异性片段， 长度为 536bp 和 263bp。 0013 水稻叶色 （黄化） 突变体材料是由粳稻 “嘉花 1 号” 经 60Co 射。
10、线辐照而来， 经海 说 明 书 CN 103014022 A 3 2/4 页 4 南、 上海两地多年自交加代和选择， 已成为各种农艺性状稳定的品系。 发明人在研究中将此 突变品系与籼稻 “培矮 64S” 配制正反交组合， 构建遗传群体， 利用 SSR 和 InDel 分子标记将 控制叶绿体发育的基因定位在水稻的第 2 号染色体。 0014 本发明控制早期水稻叶绿体发育的基因与其启动子同农杆菌表达载体连接， 并通 过农杆菌介导的转基因技术将该 DNA 序列转入黄化突变体后， 其后代植株叶色变绿， 说明 该基因被破坏即可导致早期水稻叶绿体发育受阻， 使植株黄化。通过本发明得到的控制早 期水稻叶绿体。
11、发育的基因可应用于杂交水稻制种， 可提高杂交水稻不育系自身以及它配制 杂交水稻的纯度。 附图说明 0015 图 1 为本发明的特异性 PCR 引物对该基因进行 PCR 扩增结果 ； 0016 图 2 为本发明对 PCR 扩增产物进行 Taq I 酶切检测结果。图中， M 代表 Marker ； T1 代表扩增的 PCR 产物 ； T2 代表扩增的 PCR 产物 Taq I 酶切后的片段。 具体实施方式 0017 实施例 1 水稻 DNA 提取 0018 1、 根据分子克隆实验手册进行操作， 称取 0.5g 新鲜的苗期水稻叶片 （野生型 “嘉 花1号” ） ， 把叶片剪成0.5cm长的小段， 放。
12、到预冷的研钵中， 加入液氮研磨至粉末状， 之后转 入 1.5ml 离心管中， 加入 1ml 60预热的 2CTAB， 轻轻震荡后 60水浴 45min， 期间震荡 2 次。 0019 2、 取出离心管， 冷却置室温， 12000转/分的条件下离心5min， 吸取上清液， 加入等 体积氯仿 - 异戊醇 (24 ： 1) 混合液， 充分混匀。 0020 3、 将含有溶液的离心管进行平衡， 12000 转 / 分的条件下离心 5min， 吸取上清液， 加入其 2/3 体积异丙醇， 轻轻混匀使核酸析出。 0021 4、 12000 转 / 分的条件下离心 5min， 使核酸沉淀， 弃上清， 用 70%。
13、 乙醇洗涤， 室温干 燥后溶于 10l 的无菌水中。 0022 5、 取 2l 用于后续的 PCR 扩增反应。 0023 实施例 2PCR 扩增和基因检测 0024 （一） 获得控制早期水稻叶绿体发育的基因 0025 1、 25L PCR 反 应 体 系 如 下 ： 100mM Tris-HCl pH9.0 ； 100mMKCl;20mM MgSO4； 80mM(NH4)2SO4； 2.5mM dNTP;10M 引物， 5U/l Taq 酶， 1l 模板 DNA/10l。 0026 引物序列为 ： 0027 上游引物 5-GGGGTACCCACAATGCATCTCGATTCTTA-3（所用内切。
14、酶是 KpnI） 0028 下游引物 5-GCTCTAGAGCAGAATGGGGGGATATCTCA-3（所用内切酶是 XbaI） 0029 3、 PCR 扩增反应在 PCR 扩增仪上进行。 0030 温度和反应条件为 ： 94预变性 4min， 94变性 30sec， 50退火 30sec， 72延伸 60sec， 35 个循环 ； 最后 72延伸 6min。 0031 PCR 扩增产物长度为 3.7kbp， 测序结果如 SEQ ID No.1。 0032 参照 KOME 网站上获得的 ORF 序列， 设计特异性 RT-PCR 引物， 上游端和下游端分别 说 明 书 CN 103014022。
15、 A 4 3/4 页 5 为 : 0033 5 -GAAGATCTATGAGCTACTTCACTTGC-3 0034 5 -GGGGTACCCCAGACTCCTGCGCATGC-3 0035 对所提取的正常植株总cDNA进行扩增， 其目的片段长度为750bp， 并进行测序。 将 测序得到的 DNA 序列即 ORF 利用 Bioxm 软件翻译成氨基酸序列如 SEQ ID No.2 所示。将测 序得到的 DNA 序列即 ORF 利用 Bioxm 软件翻译成氨基酸序列如 SEQ ID No.2 所示。 0036 （二） 检测控制早期水稻叶绿体发育的基因 0037 1、 25L PCR 反应体系如下 。
16、： 100mM Tris-HCl pH9.0;100mMKCl;20mM MgSO4;80mM(NH4)2SO4;2.5mM dNTP;10M 引物， 5U/l Taq 酶， 1l 模板 DNA/10l。 0038 引物的核苷酸序列如 SEQ ID No.4 和 SEQ ID No.5 所示 ： 0039 上游 ： 5 -AAACCGAAATCGTCGTGGAG-3 0040 下游 ： 5 -ACAAGGGAGCACCTGAACTAAGAC-3 0041 2、 PCR 扩增反应在 PCR 扩增仪上进行。 0042 温度和反应条件为 ： 94预变性 4min， 94变性 30sec， 50退火 。
17、30sec， 72延伸 60sec， 35 个循环 ； 最后 72延伸 6min。 0043 得到的扩增产物， 上样于 1% 琼脂糖凝胶上并电泳， 经溴化乙锭染色后在 UVP 凝胶 成像仪上成像， 结果如图 1， 出现 799bp 条带， 序列如 SEQ ID NO.3 所示， 是 SEQ ID No.1 中 的一段。 0044 3、 酶切反应体系 0045 1l 无菌水， 1l 10Taq Ibuffer， 1l 0.1%BSA， 0.5l 10U/l TaqI 和 6.5l PCR 扩增产物 （总体积 10l） 。 0046 4、 酶切处理 0047 将酶切反应体系混匀后， 放入 37恒温。
18、水浴中， 温浴 1 小时， 每管加入 1l 10Loading buffer 终止酶切反应。将扩增产物， 上样于 1% 琼脂糖凝胶上并电泳， 经溴化 乙锭染色后在 UVP 凝胶成像仪上成像。结果如图 2。其酶切带型为出现两个特异性片段， 长 度为 536bp 和 263bp。 0048 实施例 3 基因功能验证 0049 采用 射线或者其他物理方法诱变， 破坏水稻中 SEQ ID No.1 的基因序列。经测 序该基因中的碱基缺失， RNA 水平降低， 则水稻早期植株黄化。该基因的功能互补实验结果 表明含有该正常基因的突变体后代植株叶色呈绿色。 0050 水稻叶色突变体材料是由粳稻 “嘉花 1 。
19、号” 经 60Co 射线辐照而来， 是一种黄化突 变体， 经海南、 上海两地多年自交加代和选择， 已成为各种农艺性状稳定的品系。 0051 1、 利用 SSR 和 InDel 分子标记进行突变基因的定位， 通过测序和半定量 RT-PCR 技 术， 表明该基因序列发生突变及其 RNA 水平的表达量下降。 0052 2、 将SEQ ID NO.1的核苷酸序列连接到含有外源启动子CaMV35S的农杆菌表达载 体 pCAMBIA1301S 上， 并经过酶切、 测序验证为该目的基因序列。 0053 3、 利用农杆菌介导的转基因技术， 将上述重组载体转化受体， 受体是黄化突变体 的愈伤组织， 通过鉴定获得。
20、阳性第一代转基因植株， 其叶色呈绿色。 0054 4、 将第一代转基因植株的种子播种， 其叶色出现分离， 呈绿色和黄化表型， 并符合 说 明 书 CN 103014022 A 5 4/4 页 6 孟德尔遗传分离比即 3 ： 1。 0055 5、 该基因正常表达是水稻植株叶色呈绿色， 而其表达下调的突变植株苗期叶色呈 黄化表型， 因此可以通过此表型变化来鉴别水稻品种真伪， 提高纯度。 说 明 书 CN 103014022 A 6 1/7 页 7 0001 0002 序 列 表 CN 103014022 A 7 2/7 页 8 0003 序 列 表 CN 103014022 A 8 3/7 页 9 0004 序 列 表 CN 103014022 A 9 4/7 页 10 0005 序 列 表 CN 103014022 A 10 5/7 页 11 0006 序 列 表 CN 103014022 A 11 6/7 页 12 0007 序 列 表 CN 103014022 A 12 7/7 页 13 序 列 表 CN 103014022 A 13 1/1 页 14 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103014022 A 14 。