用于缓解肠问题的方法和新菌株 发明领域 本 发 明 涉 及 用 于 预 防 和 / 或 治 疗 肠 健 康 问 题 的 与 物 种 Butyricoccus pullicaecorum 相关的丁酸盐 / 酯产生菌株 (butyrate producing bacterial strains)。 因此本发明提供了在人和 / 或动物的肠健康问题的治疗中， 克服了与目前所用丁酸施用方 法相关之问题的方法和组合物。
发明背景
炎症性肠病 (inflammatory bowel disease， IBD) 涉及两种引起肠炎症的慢性疾 病： 溃疡性结肠炎和克罗恩氏病。 溃疡性结肠炎是影响肠粘膜、 使其发炎并发生溃疡的大肠 炎症疾病， 而克罗恩氏病最经常影响小肠的后部 ( 末端回肠 ) 和部分大肠。但是， 克罗恩氏 病不限于这些区域， 它可以发生在消化道的任何部分。 与溃疡性结肠炎相比， 克罗恩氏病所 引起的炎症扩展到更深的肠壁层中。克罗恩氏病通常倾向于影响整个肠壁， 而溃疡性结肠 炎仅影响肠内层。
医学研究尚未确定是什么引起了炎症性肠病。 但认为可涉及许多因素， 例如环境、 饮食并可能涉及遗传。针对 IBD 的药物治疗通常由抗炎药物和免疫抑制剂组成。然而， 目 前控制 IBD 的治疗并非总有效， 而且许多情况仍需要外科手术。目前大约 70％至 80％的克 罗恩氏病患者和 30％至 40％溃疡性结肠炎患者最终需要手术， 这表明目前使用的疗法缺 乏有效性。
对于动物的肠健康问题， 例如菌群失调， 目前使用抗生素进行治疗。而且有多种 饲料添加剂在售， 包括精油、 脂肪酸制剂、 益生元和益生菌和声称促进胃肠道健康的产品组 合。然而它们的使用是经验性的， 它们的功效未被科学证实。
目前用丁酸治疗 IBD， 但是丁酸到胃肠道的实际递送存在问题。已经提出了几种 机制， 包括使用丁酸盐 / 酯包衣片剂 (butyrate coated tablets)、 丁酸盐 / 酯灌肠剂或使 用膳食纤维在胃肠道中的自然发酵。这些目前已知的方法表现出明显的缺点。当使用丁酸 包衣片剂时， 问题在于它们的内含物在目的位置的释放， 并且由于胃肠道内腔 pH 和传输时 间 (transit time) 的个体间差异 (Ibekwe 等， 2006 ； Roda 等， 2007) 而不能优化释放。此 外， 片剂的味道很不好。 另一方面， 直肠丁酸灌肠剂的使用受限于低依从率和结肠粘膜对丁 酸盐 / 酯的短暂及不连续的暴露 (Breuer 等， 1997)。对于使用膳食纤维的发酵来生产丁酸 盐 / 酯， 已将抗性淀粉和低聚果糖的使用与更大的丁酸盐 / 酯产量联系起来 (Morrison 等， 2006)。然而， 丁酸盐 / 酯生产的刺激取决于是否表达丁酰辅酶 A: 乙酰辅酶 A 转移酶的细 菌以及利用乳酸并产生丁酸盐 / 酯的细菌的区域性差异 (Morrison 等， 2006)。因此， 该方 法是不均一的， 而且结果不能预测。目前对于动物菌群失调的治疗使用向饲料中施用粉末 此外还具有动物不喜欢的不利感官性 形式或包衣的丁酸。但这导致了与前述相似的问题， 质。
将丁酸递送进胃肠道的另一方法是施用能原位产生丁酸的丁酸产生菌。对 此， Sokol 等 (Proc Natl Acad Sci USA， 2008 ： 16731) 公开了丁酸盐 / 酯产生菌普拉梭 菌 (Faecalibacterium prausnitzii) 或该细菌的培养物上清液能减少啮齿动物 IBD 模
型中的炎症和坏死。WO 2004/085628 还公开了也产生丁酸的乳酸利用菌 ( 例如菌种 Anaerostipes caccae)， 其可用于治疗与高剂量乳酸相关的疾病 ( 例如 IBD) 的方法中。
最近 Eeckhaut 等， 2008 描述了属于新物种 Butyricicoccus pullicaecorum 的 丁酸盐 / 酯产生菌分离株的分离。所述新物种具有作为模式菌株的分离株 25-3T， 其作为 B.pullicaecorum LMG24109 保藏于 BCCM/LMG 公共细菌保藏中心。
本发明涉及以下意外的发现 ： 与其他丁酸盐 / 酯产生物种 ( 例如普拉梭菌、 Anaerostipes caccae 或 Anaerostipes butyricus) 相比， 与物种 B.pullicaecorum 相关 之丁酸盐 / 酯产生菌株预防或治愈人或动物的肠健康问题的能力更强。因此本发明涉及 B.pullicaecorum 的递送， 其比类似的递送方法有效得多， 并且本发明还进一步克服了上述 所有缺点。
因此本发明解决了这样的问题 ： 寻找治疗人或动物肠健康问题的更高效和更有效 的化合物和方法。本发明提供了用于预防和 / 或治疗人或动物的肠健康问题的新组合物。
发明概述
本发明提供了新的、 创造性方法， 其克服了在人和 / 或动物肠健康问题的治疗中 目前所用丁酸施用方法的相关问题。 已发现本发明的某些丁酸盐 / 酯产生菌株可以用作药物， 并且更特别地， 用于预 防和 / 或治疗发生在人和 / 或动物中的肠健康问题。当施用给人和 / 或动物时， 本发明的 丁酸盐 / 酯产生菌株能够在胃肠道定殖。该定殖使得本发明的丁酸盐 / 酯产生菌株能够在 胃肠道原位产生丁酸， 并且更特别是在结肠定殖并原位产生丁酸。
术语 “肠健康问题” 是指人和 / 或动物的任何肠病， 和 / 但是特别地涉及人的肠道 疾病和动物的菌群失调。
本 发 明 使 用 的 丁 酸 盐 / 酯 产 生 菌 株 特 别 地 涉 及 被 称 为 Butyricicoccus pullicaecorum、 作为 B.pullicaecorum LMG24109 保藏于 BCCM/LMG 公共细菌保藏中心的分 离株。
根据本发明， 所述用于预防和 / 或治疗人和 / 或动物肠健康问题的丁酸产生菌株 是来自梭菌属 (Clostridium) 亚群 IV 的菌株。
在一个优选的实施方案中， 本发明涉及用于预防和 / 或治疗人和 / 或动物肠健 康问题的丁酸产生菌株， 其特征在于所述丁酸产生菌株选自包含以下 Butyricicoccus pullicaecorum 的组 ： 作为 B.pullicaecorum LMG24109 保藏于 BCCM/LMG 公共细菌保藏中 心的 Butyricicoccus pullicaecorum， 以及具有与 SEQ ID No 1 表征的 Butyricicoccus pullicaecorum 16S rRNA 序列表现出至少 93 ％ ( 即 93 ％、 94 ％、 95 ％、 96 ％、 97 ％、 98 ％、 99％或 100％ ) 同源性的 16S rRNA 的菌株。
本发明还涉及益生菌组合物， 其中所述组合物包含治疗有效量的如上定义的分离 菌株和 / 或具有治疗作用的其培养物上清液和 / 或具有治疗作用的其代谢物。
在下文和权利要求中描述了这些和另一些方面和实施方案。
发明详述
根据第一方面， 本发明涉及用作药物、 更特别地用于预防和治疗人和 / 或动物肠 健康病症的某些丁酸盐 / 酯产生菌株。
确实， 本发明公开了与其他丁酸盐 / 酯产生物种 ( 例如普拉梭菌、 Anaerostipes
caccae 或 Anaerostipes butyricus) 相比， 与物种 B.pullicaecorum 相关之丁酸盐 / 酯产 生菌株预防或治愈人或动物肠健康问题的能力更强。 例如， 本发明证明， 与用阳性对照或其 他三个菌种治疗相比， 用 B.pullicaecorum 治疗时结肠重量、 结肠指数以及溃疡程度 ( 均反 映疾病炎症的严重性 ) 和 / 或其他疾病严重性的公知参数显著降低。
本发明的另一方面涉及与物种 B.pullicaecorum 相关的丁酸盐 / 酯产生菌株， 其 在预防或治愈人或动物肠健康问题的能力上， 至少与普拉梭菌相似， 优选比普拉梭菌更佳。
术语 “药物” 也称为药用物质、 药或治疗用药， 可将其定义为旨在用于疾病的医学 诊断、 治愈、 治疗或预防的任何化学物质或化学物质的组合物。 所述药物包含至少一种生物 活性成分， 以及可能的至少一种赋形剂或载体， 其是片剂或药物剂型之基质， 或者是活性成 分混悬于其中的液体， 并且还可能包含其他药学惰性物质。 技术人员已知合适的载体、 赋形 剂或其他物质。所述 “药物” 可通过技术人员所知的任何合适方法施用。优选的施用途径 是经口施用。但是施用的剂量和形式取决于个体 / 动物。
本文所用术语 “丁酸盐 / 酯” (butyrate， “丁酸盐 / 酯” 是 “丁酸 (butyric acid)” 的盐或酯 ) 和 “丁酸” 作为同义词使用， 其表示具有结构式 (I) 的羧酸 (CH3-CH2-CH2-COOH)。
更优选地， 本发明的丁酸盐 / 酯产生菌株涉及将丁酸盐 / 酯作为主要代谢物产生的菌株。 更优选地， 本发明所用的丁酸盐 / 酯产生菌株是 Butyricicoccus pullicaecorum 和 / 或与由 SEQ ID No 1 表征的 B.pullicaecorum 的 16S rRNA 序列显示至少 93％ ( 即 94％、 95％、 96％、 97％、 98％、 99％或 100％ ) 同源性的菌株。更优选地， 本发明的菌株对 SEQ ID No 1 表征之 B.pullicaecorum 16S rRNA 序列显示至少 94％、 95％、 96％、 97％、 98％、 99％ 或 100％的同源性。甚至更优选地， 本发明的菌株对 SEQ ID No 1 表征之 B.pullicaecorum 16S rRNA 序列显示至少 95％、 96％或 98％的同源性。优选地， 所述丁酸盐 / 酯产生菌株能 在基本厌氧条件下产生丁酸。
所 述 丁 酸 盐 / 酯 产 生 菌 株 Butyricicoccus pullicaecorum 属 于 柔 嫩 梭 菌 (Clostridium leptum) 进化群 ( ＝梭菌亚群 IV)。
所述梭菌亚群 IV 包含混合的多个属 ( 包括梭菌属、 真杆菌属 (Eubacterium) 和瘤 胃球菌属 (Ruminococcus)) 的分离株。许多物种是嗜常温菌和纤维素分解菌， 包括白色瘤 胃球菌 (Ruminococcus albus)、 黄色瘤胃球菌 (Ruminococcus flavefaciens) 和纤维素羧 菌 (C.cellulosi)。还有不分解纤维素的菌株， 尽管其中许多降解其他多糖。亚群 IV 的成 员表型不一致， 而且显示出宽的染色体 DNA G+C 含量范围。
在一个优选的实施方案中， 本发明提供的丁酸盐 / 酯产生菌株是指已经于 2007 年 4 月 26 日 作 为 B.pullicaecorum LMG24109 保 藏 于 BCCM/LMG 公 共 细 菌 保 藏 中 心 的 Butyricicoccus pullicaecorum 菌 株。 该 保 藏 的 Butyricicoccus pullicaecorum 菌
株的特征为具有 SEQ ID No 1 的 16S rRNA 序列。所述丁酸产生菌株 Butyricicoccus pullicaecorum 也 作 为 B.pullicaecorum CCUG 55265 保 藏 于 哥 德 堡 大 学 的 培 养 物 保 藏 中 心 (CCUG)。Eeckhaut 等 2008 已 经 对 B.pullicaecorum 的 不 同 分 离 株 和 模 式 菌 株 25-3T 进行了很好地表征 (International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology ： 2799)， 其通过引用并入本文。
表 1 提供了 B.pullicaecorum 的 16S rRNA 序列 (SEQ ID No 1)。
B.pullicaecorum 的 GC 含量约为 54％。此外 B.pullicaecorum 的细胞为类球形。 表 2 提供了 B.pullicaecorum 的生物化学性质。
已发现本发明的丁酸盐 / 酯产生菌株可以用于预防和 / 或治疗发生在人和 / 或动 物中的肠健康问题。当施用给人和 / 或动物时， 本发明的新丁酸盐 / 酯产生菌株能够在胃 肠道中定殖。该定殖使得本发明的丁酸盐 / 酯产生菌株能够在胃肠道原位产生丁酸， 并且 更特别是在结肠定殖并原位产生丁酸。通过提供这些丁酸盐 / 酯产生菌株， 克服了现有技 术中已知的缺点。
相比于已知方法， 此类递送方法要简单得多， 在持续的长时间中在目的位置释放 丁酸。因此， 本发明方法不依赖于胃肠道中特定微生物的存在。而且， 发明人已经发现， 本 发明丁酸产生菌的定殖在原位实现了显著量的丁酸盐 / 酯生产。 因此本发明提供了一种方法， 其克服了在人和 / 或动物肠健康问题的治疗中与目 前所用丁酸施用方法相关的问题。
表1
表2如上所述， 本发明所用的丁酸盐 / 酯产生菌株还指与 SEQ ID No 1 所示 16S rRNA 序列具有大于 93 ％、 94 ％、 95 ％、 96 ％、 97 ％、 98 ％、 99 ％或 100 ％同源性的 “Butyricoccus pullicaecorum 相关菌株” 。优选地， 具有与 Butyricicoccus pullicaecorum 16S rRNA 序 列具有大于 93％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％、 99％或 100％同源性的 16S rRNA 序列的菌 株从人中分离。
在本申请中， 术语 “基本厌氧” 具有其普通含义， 是指有极少或没有游离氧的条件。 对于天然环境， 它是指有极少或没有游离氧的环境。例如， 认为动物和 / 或人的消化道中的 条件是基本厌氧的。还已知一些人工发酵方法是在厌氧环境下进行的。
本发明还涉及丁酸产生菌株制造用于预防和 / 或治疗肠健康问题的制剂的用 途， 其特征在于所述丁酸产生菌株选自作为 B.pullicaecorum LMG 24109 保藏于 BCCM/ LMG 公共细菌保藏中心的 Butyricicoccus pullicaecorum， 和对以 SEQ ID No 1 表征之 Butyricicoccus pullicaecorum 16S rRNA 序列显示至少 93 ％、 94 ％、 95 ％、 96 ％、 97 ％、 98％、 99％或 100％同源性的菌株。
本发明还涉及丁酸产生菌株用于肠健康问题的预防和 / 或治疗的用途， 其特征在 于所述丁酸产生菌株选自作为 B.pullicaecorum LMG 24109 保藏于 BCCM/LMG 公共细菌保 藏中心的 Butyricicoccus pullicaecorum， 和对以 SEQ ID No 1 表征之 Butyricicoccus pullicaecorum 16S rRNA 序列显示至少 93％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％、 99％或 100％ 的同源性的菌株。例如， Eeckhaut 等 2008(International Journal of Systematic and
Evolutionary Microbiology ： 2799) 描述了确定后者的 “同源性” 的一个实例。
本文所用术语 “16S rRNA” 是约 1542 个核苷酸的核酸序列， 它是原核核糖体小亚 基 (30S) 的组分。已知 16S rRNA 作为支架来决定核糖体蛋白质的位置。由于已知它是高 度保守序列， 通常将 16S rRNA 序列用于进化研究。对来自数千种生物的 16S rRNA 序列的 比较性分析证明存在寡核苷酸标志序列 (oligonucleotide signature sequence)。
本文所用术语 “同源性” 是指核酸序列的相似性。例如， 一般来说， 如果两个核酸 有相同的序列， 则它们显示 100％的同源性。 其中一个核酸的核苷酸序列的改变降低同源性 百分比。通常， 同源性百分比量化了两个核酸序列之间的一致性程度。
在又一个实施方案中， 本发明设定肠健康问题发生在人和 / 或动物中， 其中所述 肠健康问题是炎症性肠道疾病， 例如优选的炎症性肠道病， 例如溃疡性结肠炎或克罗恩氏 病。在另一实施方案中， 肠健康问题与病原微生物在人和 / 或动物胃肠道的定殖有关。 优选地， 肠健康问题由产气荚膜梭菌 (Clostridium perfringens) 或艰难梭状芽孢杆菌 (Clostridium difficile) 引起。
在又一实施方案中， 本发明设定动物的肠健康问题是菌群失调。
菌群失调是指引起小肠炎症和 / 或胃肠道正常菌群破坏的非特异性细菌性肠炎。 这种病症尤其出现在食物摄取良好的 ( 优选快速成长的 ) 肉鸡中。然而到目前为止， 没有 发现造成菌群失调的单种细菌。 在另一实施方案中， 本发明设定本发明所用的丁酸产生菌株存在于包含有效量的 所述丁酸产生菌株的组合物中。术语 “有效量” 是指对有效地预防、 治疗或缓解人或动物的 肠健康问题而言足够大的细菌量。
在一个优选的实施方案中， 本发明涉及一种组合物， 并且优选为益生菌组合物， 其 中所述组合物包含本发明以上定义的治疗有效量的分离株和 / 或其培养物上清液和 / 或 其代谢物。所述 “其培养物上清液” 是指所述细菌分泌的代谢物， 并且其可以如细菌本身那 样用作药物。换言之， 所述培养物上清液可以用作药物， 优选地为了预防、 治疗或缓解人或 动物的肠健康问题， 例如 IBD 或菌群失调。术语 “其代谢物” 是指细菌代谢作用的任何中间 或终产物 ( 即初级和次级代谢物两者， 如蛋白质、 肽、 脂肪酸、 色素、 抗生素等 )， 而且因此不 仅限于分泌的代谢物， 对于上述术语 “培养物上清液” 也一样。本发明的所有代谢物是能够 用作药物的代谢物， 优选为了预防、 治疗或缓解人或动物的肠健康问题， 例如 IBD 或菌群失 调。
本文所用术语 “益生菌组合物” 是指包含益生菌的组合物。益生菌是膳食补充剂， 是包含有益细菌或酵母的活微生物。更特别地， 益生菌是指施用充足数量时有益于宿主健 康的活微生物。乳酸菌是最常用的微生物类型。乳杆菌属 (Lactobacillus) 和双歧杆菌属 (Bifidobacterium) 的菌株是应用最广泛的益生菌。益生菌培养物帮助机体天然存在的胃 肠道菌群自我重建。
在 本 发 明 的 一 个 优 选 实 施 方 案 中， 在益生菌组合物中优选使用本发明的 B.pullicaecorum 和 / 或对以 SEQ ID No 1 表征之 B.pullicaecorum 16S rRNA 序列显示至 少 93％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％、 99％或 100％同源性的菌株。
在又一实施方案中， 本发明的益生菌组合物包含如上定义有待根据本发明应用的 丁酸产生菌株以及可食用载体或药用基质。本发明还涉及一种益生菌组合物， 其包含以上
所述菌株培养物上清液和 / 或所述菌株的代谢物以及可食用载体或药用基质。更特别地， 该益生菌组合物中的所述丁酸产生菌株选自 Butyricicoccus pullicaecorum 和对以 SEQ ID No 1 表征之 Butyricicoccus pullicaecorum 16S rRNA 序列显示至少 93％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％、 99％或 100％同源性的菌株。
根据本发明， 将待使用的丁酸产生菌株并入载体中， 所述载体可以是食物或药物 产品， 例如乳、 酸乳、 凝乳、 乳酪、 发酵乳、 基于乳的发酵产品、 冰淇淋、 基于发酵谷物的产品、 奶粉或婴儿配方产品。 所述载体可为片剂、 液体菌悬液、 干口服补剂、 湿口服补剂、 干管饲剂 或湿管饲剂等的形式。所述载体还可包含其他已知对胃肠道受损状况有益的化合物， 例如 抗氧化剂， 例如维生素 C、 维生素 E、 硒或锌。根据对应的预防性治疗， 本领域技术人员会选 择合适的草药形式和 / 或补剂来帮助改善个体健康。
在又一实施方案中， 本发明的益生菌组合物还包含至少一种乳酸菌， 优选选自干 酪 乳 杆 菌 (Lactobacillus casei)、 瑞 士 乳 杆 菌 (Lactobacillus helveticus)、 德氏乳 杆菌保加利亚亚种 (Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus)、 副干酪乳 杆菌 (Lactobacillus paracasei)、 嗜酸乳杆菌 (Lactobacillus acidophilus)、 乳酸乳 球菌 (Lactococcus lactis)、 嗜热链球菌 (Streptococcus thermophilus)、 长双歧杆菌 (Bifidobacterium longum) 和 / 或短双岐杆菌 (Bifidobacterium breve)。
本文所述乳酸菌通常包含革兰氏阳性、 低 GC 含量、 耐酸、 通常不形成孢子、 基 本厌氧的杆菌或球菌， 它们通过其常见的代谢和生理特征相关联。这些细菌生产乳酸 作为碳水化合物发酵的主要代谢终产物。包含乳酸菌的属优选选自乳杆菌属、 明串 珠 菌 属 (Leuconostoc)、 小 球 菌 属 (Pediococcus)、 乳 球 菌 属 (Lactococcus)、 链球菌 属 (Streptococcus)、 气 球 菌 属 (Aerococcus)、 肉 食 杆 菌 属 (Carnobacterium)、 肠球菌 属 (Enterococcus)、 酒 球 菌 属 (Oenococcus)、 芽 胞 乳 杆 菌 属 (Sporolactobacillus)、 Teragenococcus、 浸游球菌属 (VagococcuS)、 Weisella 和乳杆菌目 (Lactobacillales)。
在又一实施方案中， 本发明的组合物额外地包含糖类， 优选寡糖和 / 或多糖， 更优 选菊粉和 / 或低聚果糖。
在组合物中加入糖类底物和 / 或乳酸菌克服了当丁酸产生菌株在胃肠道中定殖 时丁酸盐 / 酯产量低的相关问题。糖类底物 ( 例如菊粉和 / 或低聚果糖 ) 的添加和 / 或其 他乳酸菌的添加为本发明的丁酸产生菌株提供了底物。
在另一优选的实施方案中， 本发明涉及用于预防和 / 或治疗人和 / 或动物肠健康 问题的本发明组合物 ( 优选益生菌组合物 )。
本发明要用的丁酸产生菌株可以通过包括以下步骤的方法制备 ：
- 在培养容器中引入营养溶液，
- 制造厌氧条件，
- 将所述容器高压灭菌，
- 引入电子受体，
- 引入以上定义的丁酸盐 / 酯产生菌株的细菌培养物，
- 保持适合所述细菌生长和增殖的条件， 和
- 将所述容器和内含物冷却至阻止细菌进一步生长并适于培养物保存的温度。
以下非限制实施例进一步支持了以上方面和实施方案。本实施例说明如何将丁酸产生菌株分离， 以及这些菌株可如何用于预防和 / 或治 疗肠健康问题。 实施例实施例 1 ： Butyricicoccus pullicaecorum 的分离
用以下策略分离 Butyricicoccus pullicaecorum 菌株 ：
从四周龄肉鸡的盲肠内含物中分离菌株。将鸡处以安乐死， 如 Barcenilla 等 (2000) 所述在厌氧的 M2GSC 培养基中将盲肠内含物样品匀浆。 将该悬液进行十倍的系列稀 释， 从每个稀释度取 0.3ml 涂布于含有 1.5％琼脂和 M2GSC 培养基的琼脂板上。将平板在 接近家禽体温的 42℃孵育 48 小时， 将单菌落转移到 10ml M2GSC 培养液的管中。所有操作 在厌氧工作站 (Ruskinn Technology， South Wales， UK) 中进行。通过气液相色谱 (GC14， Shimadzu， ′ s Hertogenbosch， The Netherlands) 分析过夜培养物中的短链脂肪酸浓度。 获得了几个产生丁酸盐 / 酯的培养物。这些细菌培养物的上清液中包含大量的丁酸。
通 过 碱 裂 解 法 提 取 DNA 后， 如 前 所 述 进 行 了 重 复 元 件 引 发 的 (repetitive element primed， Rep)-PCR( 用 (GTG)5 作为引物 ) 和随机扩增多态 DNA(RAPD) 分型 ( 使用 5′ -AGCGGGCCAA-3′作为引物 )。两种分析中分离株产生了相同或几乎相同的 DNA 指纹， 这提示分离株源自在取样鸡肠道中定殖的单个菌株。
为了明确该分离株的进化地位， 使用 “通用” 真细菌引物 fD1 和 rD1(Weisburg 等， 1991) 测定了每个分离株的将近整个 16S rRNA 序列 ( 对应于大肠杆菌编号系统中的 8-1541 位 )。表 1 提供了 16S rRNA 序列。纯化的扩增子用引物 pD， Gamma*， 3 和 O* 在 ABI PRISM 310 遗传分析仪上测序。用 FASTA 程序找到与推断序列的最接近匹配序列。用 CLUSTAL_W 程序将核苷酸序列与参照 16S rRNA 序列比对， 通过 PHYLIP 软件包用 DNADIST 进行距离分 析来使用邻接法 (neighbour-joining method) 建立进化树。
表 3 列出了分离自肉鸡盲肠内含物的不同菌株在 42℃下在 M2GSC 培养液中培养过 夜而产生的发酵产品。( 浓度 (mM) 是三次重复的平均数 ± 标准差 )。
表3
分离株 11-3 25-3 44-3 49-3 54-3
醋酸盐 -10.6±4.3 -14.3±1.7 -14.6±3.5 -12.4±0.70 -11.8±5.9 丙酸盐 -0.6±1.1 -1.4±1.2 -1.1±0.3 -0.7±0.4 -0.2±0.9 丁酸盐 13.2±1.0 18.6±1.2 15.5±4.3 18.6±5.1 13.6±0.2它们最接近的遗传亲缘菌包括 Eubacterium desmolans 的成员。所有分离株具有 几乎一致 (98％ -99％ ) 的 16S rRNA 序列。表 1 提供了 16S rRNA 序列。实施例 2 ： 丁酸产生菌株对结肠炎的作用
本实施例证明了包含丁酸盐 / 酯产生菌株 ( 例如 Butyricicoccus pullicaecorum 菌株 ) 的组合物的有益作用。
所有菌株在厌氧条件中在 41℃下， 于 pH6 的 M2GSC 培养基中培养。将培养 17 小时 的培养物在 41℃下 4000rpm 离心 15 分钟。沉淀重悬于补充有 1mg/ml L- 半胱氨酸盐酸盐 的 pH6 的 HBSS 中。通过将十倍稀释的细菌悬液在 M2GSC 培养基上铺板来测定两种培养物 的 cfu/ml 数。
首先被研究的两个细菌分离株是本发明的 Butyricicoccus pullicaecorum 以及 Anaerostipes butyraticus， 其分别属于梭菌亚群 IV 和 XIVa。 Anaerostipes butyraticus 菌株已作为 A.butyricus LMG24724 于 2008 年 9 月 3 日保藏于 BCCM/LMG 公共细菌保藏中 心。这两种菌株与普拉梭菌和 Anaerostipes caccae 一起自人粪便中分离， 它们属于梭菌 亚群 IV 和 XIVa， 在 TNBS 诱导的大鼠结肠炎模型中测试了它们降低炎症及溃疡的能力。直 肠内施用溶于 400μl 50％乙醇中的 10mg TNBS， 施用第 7 天诱导出结肠炎。组 1 至组 4(n ＝ 10) 的大鼠每天 ( 第 1 天直至第 8 天 ) 通过胃内管饲分别被给予 109cfu 的普拉梭菌、 B.pullicaecorum、 A.caccae 和 A.butyraticus。组 5 为阴性对照组， 组 6 为未接种的经 TNBS 处理的阳性对照组。滴注 TNBS 48 小时后， 对大鼠进行尸体解剖。取出结肠， 纵向切 开并仔细冲洗以除去粪便残留。测定结肠的重量和长度以及损伤程度。用这些数据计算结 肠指数 ( 结肠重量与体重之比， mg/g)、 结肠重量 ( 结肠重量与结肠长度之比， mg/cm) 以及 溃疡度 ( 损伤程度与结肠长度之比，％ )， 这些是反映结肠炎症严重性的参数。用 GLM 程 序 (Statistical Analysis Systems Institute， 1990) 来分析参数， 采用以接种菌株作为 主要解释性变量的完全随机设计。用 Fisher’ s 受保护的 t 检验来比较平均值， P ＜ 0.05 时认为差异显著 ( 表 4 ： 反映结肠炎症的严重性的参数， 用平均值表示。没有共同上标的行 中平均数之间差异显著 (P ＜ 0.05))。对损伤进行了肉眼和显微评分。取发炎组织样本以 定量 TNFα 和 IL-12 水平。与结肠炎对照组相比， 接受 B.pullicaecorum 菌株的组的 TNFα 和 IL-12 分泌显著降低。从表中也明显看出， 与阳性对照组相比， 接受 B.pullicaecorum 菌 株的组的所有参数差异显著。
因此显然， 与本发明 B.pullicaecorum 相关的丁酸盐 / 酯产生菌株对见于溃疡性 结肠炎的粘膜炎症有有利作用。应认为该丁酸盐 / 酯产生菌株是下一代益生菌剂， 其作用 模式与丁酸产生相关。
表4
实施例 3 ： 丁酸产生菌株对 DSS 诱导结肠炎的作用
从 CER Janvier(France) 处获得 35 只 4 周龄的雄性 Wistar 大鼠， 并且用 14 天的 时间适应研究条件。将动物随机分成 4 个实验组， 并且每笼至多饲养 5 只大鼠。它们都可 以随意获取大鼠颗粒状饲料和水。在组 1 和组 2 中， 大鼠每天 ( 共 14 天 ) 通过胃内管饲接 8 9 受 0.5ml 的 10 -10 cfu/ml 普拉梭菌或 Butyricicoccus pullicaecorum。这些菌株在厌氧
环境下， 38℃， pH6.8 的 M2GSC 培养基中培养。将培养 20 小时的培养物在 38℃， 4000rpm 离 心 15 分钟。沉淀在补充有 1mg/ml L- 半胱氨酸盐酸盐的 pH6.8 的 HBSS 中重悬。通过将十 倍稀释的细菌悬液在 M2GSC 培养基上铺板来测定两种培养物的 cfu/ml 数。组 3 和组 4 是 对照组， 每天接受补充有 1mg/ml L- 半胱氨酸盐酸盐的 pH6.8 的 HBSS。
实验开始一周后， 将正常饮用水换成含有 4％ DSS 的水。组 4( 非结肠炎组 ) 用无 DSS 的水。
每天记录动物的体重、 粪便中总血的存在和大便稠度。用这些数据计算每只动物 的每日平均疾病活动指数 (disease acticity index， DAI)。所有大鼠在开始 DSS 处理后 第 7 天处死。取出从肛门到盲肠结肠交界处的结肠， 纵向切开并用水轻微冲洗以除去粪便 残留。之后将结肠称重并测量其长度。取结肠样本进行髓过氧化物酶定量和组织学染色。 将腔内含物和粘膜刮取物冻存于 -20℃以进行菌群分析。
型中的炎症和坏死。WO 2004/085628 还公开了也产生丁酸的乳酸利用菌 ( 例如菌种 Anaerostipes caccae)， 其可用于治疗与高剂量乳酸相关的疾病 ( 例如 IBD) 的方法中。
最近 Eeckhaut 等， 2008 描述了属于新物种 Butyricicoccus pullicaecorum 的 丁酸盐 / 酯产生菌分离株的分离。所述新物种具有作为模式菌株的分离株 25-3T， 其作为 B.pullicaecorum LMG24109 保藏于 BCCM/LMG 公共细菌保藏中心。
本发明涉及以下意外的发现 ： 与其他丁酸盐 / 酯产生物种 ( 例如普拉梭菌、 Anaerostipes caccae 或 Anaerostipes butyricus) 相比， 与物种 B.pullicaecorum 相关 之丁酸盐 / 酯产生菌株预防或治愈人或动物的肠健康问题的能力更强。因此本发明涉及 B.pullicaecorum 的递送， 其比类似的递送方法有效得多， 并且本发明还进一步克服了上述 所有缺点。
因此本发明解决了这样的问题 ： 寻找治疗人或动物肠健康问题的更高效和更有效 的化合物和方法。本发明提供了用于预防和 / 或治疗人或动物的肠健康问题的新组合物。
发明概述
本发明提供了新的、 创造性方法， 其克服了在人和 / 或动物肠健康问题的治疗中 目前所用丁酸施用方法的相关问题。 已发现本发明的某些丁酸盐 / 酯产生菌株可以用作药物， 并且更特别地， 用于预 防和 / 或治疗发生在人和 / 或动物中的肠健康问题。当施用给人和 / 或动物时， 本发明的 丁酸盐 / 酯产生菌株能够在胃肠道定殖。该定殖使得本发明的丁酸盐 / 酯产生菌株能够在 胃肠道原位产生丁酸， 并且更特别是在结肠定殖并原位产生丁酸。
术语 “肠健康问题” 是指人和 / 或动物的任何肠病， 和 / 但是特别地涉及人的肠道 疾病和动物的菌群失调。
本 发 明 使 用 的 丁 酸 盐 / 酯 产 生 菌 株 特 别 地 涉 及 被 称 为 Butyricicoccus pullicaecorum、 作为 B.pullicaecorum LMG24109 保藏于 BCCM/LMG 公共细菌保藏中心的分 离株。
根据本发明， 所述用于预防和 / 或治疗人和 / 或动物肠健康问题的丁酸产生菌株 是来自梭菌属 (Clostridium) 亚群 IV 的菌株。
在一个优选的实施方案中， 本发明涉及用于预防和 / 或治疗人和 / 或动物肠健 康问题的丁酸产生菌株， 其特征在于所述丁酸产生菌株选自包含以下 Butyricicoccus pullicaecorum 的组 ： 作为 B.pullicaecorum LMG24109 保藏于 BCCM/LMG 公共细菌保藏中 心的 Butyricicoccus pullicaecorum， 以及具有与 SEQ ID No 1 表征的 Butyricicoccus pullicaecorum 16S rRNA 序列表现出至少 93 ％ ( 即 93 ％、 94 ％、 95 ％、 96 ％、 97 ％、 98 ％、 99％或 100％ ) 同源性的 16S rRNA 的菌株。
本发明还涉及益生菌组合物， 其中所述组合物包含治疗有效量的如上定义的分离 菌株和 / 或具有治疗作用的其培养物上清液和 / 或具有治疗作用的其代谢物。
在下文和权利要求中描述了这些和另一些方面和实施方案。
发明详述
根据第一方面， 本发明涉及用作药物、 更特别地用于预防和治疗人和 / 或动物肠 健康病症的某些丁酸盐 / 酯产生菌株。
确实， 本发明公开了与其他丁酸盐 / 酯产生物种 ( 例如普拉梭菌、 Anaerostipes
caccae 或 Anaerostipes butyricus) 相比， 与物种 B.pullicaecorum 相关之丁酸盐 / 酯产 生菌株预防或治愈人或动物肠健康问题的能力更强。 例如， 本发明证明， 与用阳性对照或其 他三个菌种治疗相比， 用 B.pullicaecorum 治疗时结肠重量、 结肠指数以及溃疡程度 ( 均反 映疾病炎症的严重性 ) 和 / 或其他疾病严重性的公知参数显著降低。
本发明的另一方面涉及与物种 B.pullicaecorum 相关的丁酸盐 / 酯产生菌株， 其 在预防或治愈人或动物肠健康问题的能力上， 至少与普拉梭菌相似， 优选比普拉梭菌更佳。
术语 “药物” 也称为药用物质、 药或治疗用药， 可将其定义为旨在用于疾病的医学 诊断、 治愈、 治疗或预防的任何化学物质或化学物质的组合物。 所述药物包含至少一种生物 活性成分， 以及可能的至少一种赋形剂或载体， 其是片剂或药物剂型之基质， 或者是活性成 分混悬于其中的液体， 并且还可能包含其他药学惰性物质。 技术人员已知合适的载体、 赋形 剂或其他物质。所述 “药物” 可通过技术人员所知的任何合适方法施用。优选的施用途径 是经口施用。但是施用的剂量和形式取决于个体 / 动物。
本文所用术语 “丁酸盐 / 酯” (butyrate， “丁酸盐 / 酯” 是 “丁酸 (butyric acid)” 的盐或酯 ) 和 “丁酸” 作为同义词使用， 其表示具有结构式 (I) 的羧酸 (CH3-CH2-CH2-COOH)。
更优选地， 本发明的丁酸盐 / 酯产生菌株涉及将丁酸盐 / 酯作为主要代谢物产生的菌株。 更优选地， 本发明所用的丁酸盐 / 酯产生菌株是 Butyricicoccus pullicaecorum 和 / 或与由 SEQ ID No 1 表征的 B.pullicaecorum 的 16S rRNA 序列显示至少 93％ ( 即 94％、 95％、 96％、 97％、 98％、 99％或 100％ ) 同源性的菌株。更优选地， 本发明的菌株对 SEQ ID No 1 表征之 B.pullicaecorum 16S rRNA 序列显示至少 94％、 95％、 96％、 97％、 98％、 99％ 或 100％的同源性。甚至更优选地， 本发明的菌株对 SEQ ID No 1 表征之 B.pullicaecorum 16S rRNA 序列显示至少 95％、 96％或 98％的同源性。优选地， 所述丁酸盐 / 酯产生菌株能 在基本厌氧条件下产生丁酸。
所 述 丁 酸 盐 / 酯 产 生 菌 株 Butyricicoccus pullicaecorum 属 于 柔 嫩 梭 菌 (Clostridium leptum) 进化群 ( ＝梭菌亚群 IV)。
所述梭菌亚群 IV 包含混合的多个属 ( 包括梭菌属、 真杆菌属 (Eubacterium) 和瘤 胃球菌属 (Ruminococcus)) 的分离株。许多物种是嗜常温菌和纤维素分解菌， 包括白色瘤 胃球菌 (Ruminococcus albus)、 黄色瘤胃球菌 (Ruminococcus flavefaciens) 和纤维素羧 菌 (C.cellulosi)。还有不分解纤维素的菌株， 尽管其中许多降解其他多糖。亚群 IV 的成 员表型不一致， 而且显示出宽的染色体 DNA G+C 含量范围。
在一个优选的实施方案中， 本发明提供的丁酸盐 / 酯产生菌株是指已经于 2007 年 4 月 26 日 作 为 B.pullicaecorum LMG24109 保 藏 于 BCCM/LMG 公 共 细 菌 保 藏 中 心 的 Butyricicoccus pullicaecorum 菌 株。 该 保 藏 的 Butyricicoccus pullicaecorum 菌
株的特征为具有 SEQ ID No 1 的 16S rRNA 序列。所述丁酸产生菌株 Butyricicoccus pullicaecorum 也 作 为 B.pullicaecorum CCUG 55265 保 藏 于 哥 德 堡 大 学 的 培 养 物 保 藏 中 心 (CCUG)。Eeckhaut 等 2008 已 经 对 B.pullicaecorum 的 不 同 分 离 株 和 模 式 菌 株 25-3T 进行了很好地表征 (International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology ： 2799)， 其通过引用并入本文。
表 1 提供了 B.pullicaecorum 的 16S rRNA 序列 (SEQ ID No 1)。
B.pullicaecorum 的 GC 含量约为 54％。此外 B.pullicaecorum 的细胞为类球形。 表 2 提供了 B.pullicaecorum 的生物化学性质。
已发现本发明的丁酸盐 / 酯产生菌株可以用于预防和 / 或治疗发生在人和 / 或动 物中的肠健康问题。当施用给人和 / 或动物时， 本发明的新丁酸盐 / 酯产生菌株能够在胃 肠道中定殖。该定殖使得本发明的丁酸盐 / 酯产生菌株能够在胃肠道原位产生丁酸， 并且 更特别是在结肠定殖并原位产生丁酸。通过提供这些丁酸盐 / 酯产生菌株， 克服了现有技 术中已知的缺点。
相比于已知方法， 此类递送方法要简单得多， 在持续的长时间中在目的位置释放 丁酸。因此， 本发明方法不依赖于胃肠道中特定微生物的存在。而且， 发明人已经发现， 本 发明丁酸产生菌的定殖在原位实现了显著量的丁酸盐 / 酯生产。 因此本发明提供了一种方法， 其克服了在人和 / 或动物肠健康问题的治疗中与目 前所用丁酸施用方法相关的问题。
表1
表2如上所述， 本发明所用的丁酸盐 / 酯产生菌株还指与 SEQ ID No 1 所示 16S rRNA 序列具有大于 93 ％、 94 ％、 95 ％、 96 ％、 97 ％、 98 ％、 99 ％或 100 ％同源性的 “Butyricoccus pullicaecorum 相关菌株” 。优选地， 具有与 Butyricicoccus pullicaecorum 16S rRNA 序 列具有大于 93％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％、 99％或 100％同源性的 16S rRNA 序列的菌 株从人中分离。
在本申请中， 术语 “基本厌氧” 具有其普通含义， 是指有极少或没有游离氧的条件。 对于天然环境， 它是指有极少或没有游离氧的环境。例如， 认为动物和 / 或人的消化道中的 条件是基本厌氧的。还已知一些人工发酵方法是在厌氧环境下进行的。
本发明还涉及丁酸产生菌株制造用于预防和 / 或治疗肠健康问题的制剂的用 途， 其特征在于所述丁酸产生菌株选自作为 B.pullicaecorum LMG 24109 保藏于 BCCM/ LMG 公共细菌保藏中心的 Butyricicoccus pullicaecorum， 和对以 SEQ ID No 1 表征之 Butyricicoccus pullicaecorum 16S rRNA 序列显示至少 93 ％、 94 ％、 95 ％、 96 ％、 97 ％、 98％、 99％或 100％同源性的菌株。
本发明还涉及丁酸产生菌株用于肠健康问题的预防和 / 或治疗的用途， 其特征在 于所述丁酸产生菌株选自作为 B.pullicaecorum LMG 24109 保藏于 BCCM/LMG 公共细菌保 藏中心的 Butyricicoccus pullicaecorum， 和对以 SEQ ID No 1 表征之 Butyricicoccus pullicaecorum 16S rRNA 序列显示至少 93％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％、 99％或 100％ 的同源性的菌株。例如， Eeckhaut 等 2008(International Journal of Systematic and
Evolutionary Microbiology ： 2799) 描述了确定后者的 “同源性” 的一个实例。
本文所用术语 “16S rRNA” 是约 1542 个核苷酸的核酸序列， 它是原核核糖体小亚 基 (30S) 的组分。已知 16S rRNA 作为支架来决定核糖体蛋白质的位置。由于已知它是高 度保守序列， 通常将 16S rRNA 序列用于进化研究。对来自数千种生物的 16S rRNA 序列的 比较性分析证明存在寡核苷酸标志序列 (oligonucleotide signature sequence)。
本文所用术语 “同源性” 是指核酸序列的相似性。例如， 一般来说， 如果两个核酸 有相同的序列， 则它们显示 100％的同源性。 其中一个核酸的核苷酸序列的改变降低同源性 百分比。通常， 同源性百分比量化了两个核酸序列之间的一致性程度。
在又一个实施方案中， 本发明设定肠健康问题发生在人和 / 或动物中， 其中所述 肠健康问题是炎症性肠道疾病， 例如优选的炎症性肠道病， 例如溃疡性结肠炎或克罗恩氏 病。在另一实施方案中， 肠健康问题与病原微生物在人和 / 或动物胃肠道的定殖有关。 优选地， 肠健康问题由产气荚膜梭菌 (Clostridium perfringens) 或艰难梭状芽孢杆菌 (Clostridium difficile) 引起。
在又一实施方案中， 本发明设定动物的肠健康问题是菌群失调。
菌群失调是指引起小肠炎症和 / 或胃肠道正常菌群破坏的非特异性细菌性肠炎。 这种病症尤其出现在食物摄取良好的 ( 优选快速成长的 ) 肉鸡中。然而到目前为止， 没有 发现造成菌群失调的单种细菌。 在另一实施方案中， 本发明设定本发明所用的丁酸产生菌株存在于包含有效量的 所述丁酸产生菌株的组合物中。术语 “有效量” 是指对有效地预防、 治疗或缓解人或动物的 肠健康问题而言足够大的细菌量。
在一个优选的实施方案中， 本发明涉及一种组合物， 并且优选为益生菌组合物， 其 中所述组合物包含本发明以上定义的治疗有效量的分离株和 / 或其培养物上清液和 / 或 其代谢物。所述 “其培养物上清液” 是指所述细菌分泌的代谢物， 并且其可以如细菌本身那 样用作药物。换言之， 所述培养物上清液可以用作药物， 优选地为了预防、 治疗或缓解人或 动物的肠健康问题， 例如 IBD 或菌群失调。术语 “其代谢物” 是指细菌代谢作用的任何中间 或终产物 ( 即初级和次级代谢物两者， 如蛋白质、 肽、 脂肪酸、 色素、 抗生素等 )， 而且因此不 仅限于分泌的代谢物， 对于上述术语 “培养物上清液” 也一样。本发明的所有代谢物是能够 用作药物的代谢物， 优选为了预防、 治疗或缓解人或动物的肠健康问题， 例如 IBD 或菌群失 调。
本文所用术语 “益生菌组合物” 是指包含益生菌的组合物。益生菌是膳食补充剂， 是包含有益细菌或酵母的活微生物。更特别地， 益生菌是指施用充足数量时有益于宿主健 康的活微生物。乳酸菌是最常用的微生物类型。乳杆菌属 (Lactobacillus) 和双歧杆菌属 (Bifidobacterium) 的菌株是应用最广泛的益生菌。益生菌培养物帮助机体天然存在的胃 肠道菌群自我重建。
在 本 发 明 的 一 个 优 选 实 施 方 案 中， 在益生菌组合物中优选使用本发明的 B.pullicaecorum 和 / 或对以 SEQ ID No 1 表征之 B.pullicaecorum 16S rRNA 序列显示至 少 93％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％、 99％或 100％同源性的菌株。
在又一实施方案中， 本发明的益生菌组合物包含如上定义有待根据本发明应用的 丁酸产生菌株以及可食用载体或药用基质。本发明还涉及一种益生菌组合物， 其包含以上
所述菌株培养物上清液和 / 或所述菌株的代谢物以及可食用载体或药用基质。更特别地， 该益生菌组合物中的所述丁酸产生菌株选自 Butyricicoccus pullicaecorum 和对以 SEQ ID No 1 表征之 Butyricicoccus pullicaecorum 16S rRNA 序列显示至少 93％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％、 99％或 100％同源性的菌株。
根据本发明， 将待使用的丁酸产生菌株并入载体中， 所述载体可以是食物或药物 产品， 例如乳、 酸乳、 凝乳、 乳酪、 发酵乳、 基于乳的发酵产品、 冰淇淋、 基于发酵谷物的产品、 奶粉或婴儿配方产品。 所述载体可为片剂、 液体菌悬液、 干口服补剂、 湿口服补剂、 干管饲剂 或湿管饲剂等的形式。所述载体还可包含其他已知对胃肠道受损状况有益的化合物， 例如 抗氧化剂， 例如维生素 C、 维生素 E、 硒或锌。根据对应的预防性治疗， 本领域技术人员会选 择合适的草药形式和 / 或补剂来帮助改善个体健康。
在又一实施方案中， 本发明的益生菌组合物还包含至少一种乳酸菌， 优选选自干 酪 乳 杆 菌 (Lactobacillus casei)、 瑞 士 乳 杆 菌 (Lactobacillus helveticus)、 德氏乳 杆菌保加利亚亚种 (Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus)、 副干酪乳 杆菌 (Lactobacillus paracasei)、 嗜酸乳杆菌 (Lactobacillus acidophilus)、 乳酸乳 球菌 (Lactococcus lactis)、 嗜热链球菌 (Streptococcus thermophilus)、 长双歧杆菌 (Bifidobacterium longum) 和 / 或短双岐杆菌 (Bifidobacterium breve)。
本文所述乳酸菌通常包含革兰氏阳性、 低 GC 含量、 耐酸、 通常不形成孢子、 基 本厌氧的杆菌或球菌， 它们通过其常见的代谢和生理特征相关联。这些细菌生产乳酸 作为碳水化合物发酵的主要代谢终产物。包含乳酸菌的属优选选自乳杆菌属、 明串 珠 菌 属 (Leuconostoc)、 小 球 菌 属 (Pediococcus)、 乳 球 菌 属 (Lactococcus)、 链球菌 属 (Streptococcus)、 气 球 菌 属 (Aerococcus)、 肉 食 杆 菌 属 (Carnobacterium)、 肠球菌 属 (Enterococcus)、 酒 球 菌 属 (Oenococcus)、 芽 胞 乳 杆 菌 属 (Sporolactobacillus)、 Teragenococcus、 浸游球菌属 (VagococcuS)、 Weisella 和乳杆菌目 (Lactobacillales)。
在又一实施方案中， 本发明的组合物额外地包含糖类， 优选寡糖和 / 或多糖， 更优 选菊粉和 / 或低聚果糖。
在组合物中加入糖类底物和 / 或乳酸菌克服了当丁酸产生菌株在胃肠道中定殖 时丁酸盐 / 酯产量低的相关问题。糖类底物 ( 例如菊粉和 / 或低聚果糖 ) 的添加和 / 或其 他乳酸菌的添加为本发明的丁酸产生菌株提供了底物。
在另一优选的实施方案中， 本发明涉及用于预防和 / 或治疗人和 / 或动物肠健康 问题的本发明组合物 ( 优选益生菌组合物 )。
本发明要用的丁酸产生菌株可以通过包括以下步骤的方法制备 ：
- 在培养容器中引入营养溶液，
- 制造厌氧条件，
- 将所述容器高压灭菌，
- 引入电子受体，
- 引入以上定义的丁酸盐 / 酯产生菌株的细菌培养物，
- 保持适合所述细菌生长和增殖的条件， 和
- 将所述容器和内含物冷却至阻止细菌进一步生长并适于培养物保存的温度。
以下非限制实施例进一步支持了以上方面和实施方案。本实施例说明如何将丁酸产生菌株分离， 以及这些菌株可如何用于预防和 / 或治 疗肠健康问题。 实施例实施例 1 ： Butyricicoccus pullicaecorum 的分离
用以下策略分离 Butyricicoccus pullicaecorum 菌株 ：
从四周龄肉鸡的盲肠内含物中分离菌株。将鸡处以安乐死， 如 Barcenilla 等 (2000) 所述在厌氧的 M2GSC 培养基中将盲肠内含物样品匀浆。 将该悬液进行十倍的系列稀 释， 从每个稀释度取 0.3ml 涂布于含有 1.5％琼脂和 M2GSC 培养基的琼脂板上。将平板在 接近家禽体温的 42℃孵育 48 小时， 将单菌落转移到 10ml M2GSC 培养液的管中。所有操作 在厌氧工作站 (Ruskinn Technology， South Wales， UK) 中进行。通过气液相色谱 (GC14， Shimadzu， ′ s Hertogenbosch， The Netherlands) 分析过夜培养物中的短链脂肪酸浓度。 获得了几个产生丁酸盐 / 酯的培养物。这些细菌培养物的上清液中包含大量的丁酸。
通 过 碱 裂 解 法 提 取 DNA 后， 如 前 所 述 进 行 了 重 复 元 件 引 发 的 (repetitive element primed， Rep)-PCR( 用 (GTG)5 作为引物 ) 和随机扩增多态 DNA(RAPD) 分型 ( 使用 5′ -AGCGGGCCAA-3′作为引物 )。两种分析中分离株产生了相同或几乎相同的 DNA 指纹， 这提示分离株源自在取样鸡肠道中定殖的单个菌株。
为了明确该分离株的进化地位， 使用 “通用” 真细菌引物 fD1 和 rD1(Weisburg 等， 1991) 测定了每个分离株的将近整个 16S rRNA 序列 ( 对应于大肠杆菌编号系统中的 8-1541 位 )。表 1 提供了 16S rRNA 序列。纯化的扩增子用引物 pD， Gamma*， 3 和 O* 在 ABI PRISM 310 遗传分析仪上测序。用 FASTA 程序找到与推断序列的最接近匹配序列。用 CLUSTAL_W 程序将核苷酸序列与参照 16S rRNA 序列比对， 通过 PHYLIP 软件包用 DNADIST 进行距离分 析来使用邻接法 (neighbour-joining method) 建立进化树。
表 3 列出了分离自肉鸡盲肠内含物的不同菌株在 42℃下在 M2GSC 培养液中培养过 夜而产生的发酵产品。( 浓度 (mM) 是三次重复的平均数 ± 标准差 )。
表3
分离株 11-3 25-3 44-3 49-3 54-3
醋酸盐 -10.6±4.3 -14.3±1.7 -14.6±3.5 -12.4±0.70 -11.8±5.9 丙酸盐 -0.6±1.1 -1.4±1.2 -1.1±0.3 -0.7±0.4 -0.2±0.9 丁酸盐 13.2±1.0 18.6±1.2 15.5±4.3 18.6±5.1 13.6±0.2它们最接近的遗传亲缘菌包括 Eubacterium desmolans 的成员。所有分离株具有 几乎一致 (98％ -99％ ) 的 16S rRNA 序列。表 1 提供了 16S rRNA 序列。实施例 2 ： 丁酸产生菌株对结肠炎的作用
本实施例证明了包含丁酸盐 / 酯产生菌株 ( 例如 Butyricicoccus pullicaecorum 菌株 ) 的组合物的有益作用。
所有菌株在厌氧条件中在 41℃下， 于 pH6 的 M2GSC 培养基中培养。将培养 17 小时 的培养物在 41℃下 4000rpm 离心 15 分钟。沉淀重悬于补充有 1mg/ml L- 半胱氨酸盐酸盐 的 pH6 的 HBSS 中。通过将十倍稀释的细菌悬液在 M2GSC 培养基上铺板来测定两种培养物 的 cfu/ml 数。
首先被研究的两个细菌分离株是本发明的 Butyricicoccus pullicaecorum 以及 Anaerostipes butyraticus， 其分别属于梭菌亚群 IV 和 XIVa。 Anaerostipes butyraticus 菌株已作为 A.butyricus LMG24724 于 2008 年 9 月 3 日保藏于 BCCM/LMG 公共细菌保藏中 心。这两种菌株与普拉梭菌和 Anaerostipes caccae 一起自人粪便中分离， 它们属于梭菌 亚群 IV 和 XIVa， 在 TNBS 诱导的大鼠结肠炎模型中测试了它们降低炎症及溃疡的能力。直 肠内施用溶于 400μl 50％乙醇中的 10mg TNBS， 施用第 7 天诱导出结肠炎。组 1 至组 4(n ＝ 10) 的大鼠每天 ( 第 1 天直至第 8 天 ) 通过胃内管饲分别被给予 109cfu 的普拉梭菌、 B.pullicaecorum、 A.caccae 和 A.butyraticus。组 5 为阴性对照组， 组 6 为未接种的经 TNBS 处理的阳性对照组。滴注 TNBS 48 小时后， 对大鼠进行尸体解剖。取出结肠， 纵向切 开并仔细冲洗以除去粪便残留。测定结肠的重量和长度以及损伤程度。用这些数据计算结 肠指数 ( 结肠重量与体重之比， mg/g)、 结肠重量 ( 结肠重量与结肠长度之比， mg/cm) 以及 溃疡度 ( 损伤程度与结肠长度之比，％ )， 这些是反映结肠炎症严重性的参数。用 GLM 程 序 (Statistical Analysis Systems Institute， 1990) 来分析参数， 采用以接种菌株作为 主要解释性变量的完全随机设计。用 Fisher’ s 受保护的 t 检验来比较平均值， P ＜ 0.05 时认为差异显著 ( 表 4 ： 反映结肠炎症的严重性的参数， 用平均值表示。没有共同上标的行 中平均数之间差异显著 (P ＜ 0.05))。对损伤进行了肉眼和显微评分。取发炎组织样本以 定量 TNFα 和 IL-12 水平。与结肠炎对照组相比， 接受 B.pullicaecorum 菌株的组的 TNFα 和 IL-12 分泌显著降低。从表中也明显看出， 与阳性对照组相比， 接受 B.pullicaecorum 菌 株的组的所有参数差异显著。
因此显然， 与本发明 B.pullicaecorum 相关的丁酸盐 / 酯产生菌株对见于溃疡性 结肠炎的粘膜炎症有有利作用。应认为该丁酸盐 / 酯产生菌株是下一代益生菌剂， 其作用 模式与丁酸产生相关。
表4
实施例 3 ： 丁酸产生菌株对 DSS 诱导结肠炎的作用
从 CER Janvier(France) 处获得 35 只 4 周龄的雄性 Wistar 大鼠， 并且用 14 天的 时间适应研究条件。将动物随机分成 4 个实验组， 并且每笼至多饲养 5 只大鼠。它们都可 以随意获取大鼠颗粒状饲料和水。在组 1 和组 2 中， 大鼠每天 ( 共 14 天 ) 通过胃内管饲接 8 9 受 0.5ml 的 10 -10 cfu/ml 普拉梭菌或 Butyricicoccus pullicaecorum。这些菌株在厌氧
环境下， 38℃， pH6.8 的 M2GSC 培养基中培养。将培养 20 小时的培养物在 38℃， 4000rpm 离 心 15 分钟。沉淀在补充有 1mg/ml L- 半胱氨酸盐酸盐的 pH6.8 的 HBSS 中重悬。通过将十 倍稀释的细菌悬液在 M2GSC 培养基上铺板来测定两种培养物的 cfu/ml 数。组 3 和组 4 是 对照组， 每天接受补充有 1mg/ml L- 半胱氨酸盐酸盐的 pH6.8 的 HBSS。
实验开始一周后， 将正常饮用水换成含有 4％ DSS 的水。组 4( 非结肠炎组 ) 用无 DSS 的水。
每天记录动物的体重、 粪便中总血的存在和大便稠度。用这些数据计算每只动物 的每日平均疾病活动指数 (disease acticity index， DAI)。所有大鼠在开始 DSS 处理后 第 7 天处死。取出从肛门到盲肠结肠交界处的结肠， 纵向切开并用水轻微冲洗以除去粪便 残留。之后将结肠称重并测量其长度。取结肠样本进行髓过氧化物酶定量和组织学染色。 将腔内含物和粘膜刮取物冻存于 -20℃以进行菌群分析。
该实验的结果证明， 本发明的与 B.pullicaecorum 相关的丁酸盐 / 酯产生菌株对 粘膜炎症有有益作用。12102325464 A CN 102325477
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