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1、(10)申请公布号 CN 103014136 A (43)申请公布日 2013.04.03 CN 103014136 A *CN103014136A* (21)申请号 201110282854.X (22)申请日 2011.09.21 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (71)申请人 中国农业科学院生物技术研究所 地址 100081 北京市海淀区中关村南大街 12 号 (72)发明人 金芜军 宛煜嵩 张秀杰 苗朝华 于晓芹 (74)专利代理机构 北京路浩知识产权代理有限 公司 11002 代理人 王朋飞 王加岭 (54) 发明名称 基于外源基因旁侧序。
2、列建立的鉴定纯合型克 螟稻 1 的方法 (57) 摘要 本发明提供了一种基于外源基因旁侧序 列建立的鉴定纯合型克螟稻 1 的方法， 其是 以 5 -TATCTCCTCATTGGCACACCACCTG-3 和 5 -CTCGTCAGCAACTGGGGTGTTCCGC-3为引物， 进行长距离聚合酶链式扩增， 以纯合外源基因 KMD1 基因组 DNA 为模板可以扩增出一条长片段 (8884bp)， 以杂合外源基因 KMD1 基因组 DNA 为模 板扩增出两条片段 (8884bp 和 240bp)， 以非转基 因水稻基因组 DNA 为模板能扩增出一条短片段 (240bp)， 从而可以快速准确地鉴定出纯。
3、合型转基 因抗虫水稻 KMD1， 为后续的转基因作物遗传育种 奠定基础。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 1 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 1 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 一种检测转基因抗虫水稻克螟稻 1 的特异性引物， 其特征在于， 包括 ： 正向引物 ： 5 -TATCTCCTCATTGGCACACCACCTG-3和 反向引物 ： 5 -CTCGTCAGCAACTGGGGTGTTCCGC-3。 2. 一种基于外源基因旁侧序列建立的鉴定纯合型克螟稻 1 。
4、的方法， 其特征在于， 包括 以下步骤 ： 1) 提取植物基因组 ； 2) 以步骤 1) 的基因组为模板， 利用权利要求 1 的特异性引物进行 PCR 检测。 3. 根据权利要求 2 所述的方法， 其特征在于， PCR 反应条件为 ： 94 1min ； 98 10s， 66 10min， 30 个循环 ； 72 10min。 4. 根据权利要求 2 或 3 所述的方法， 其特征在于， PCR 反应体系为 ： 5. 含有权利要求 1 所述特异性引物的检测试剂盒。 6. 权利要求 5 所述的试剂盒在检测纯合型转基因抗虫水稻克螟稻 1 中的应用。 权 利 要 求 书 CN 103014136 A 。
5、2 1/4 页 3 基于外源基因旁侧序列建立的鉴定纯合型克螟稻 1 的方法 技术领域 0001 本发明涉及转基因植物检测领域， 具体地说， 涉及一种基于外源基因旁侧序列建 立的鉴定纯合型克螟稻 1 的方法。 背景技术 0002 标准物质是食品、 农产品中转基因成分检测的 “金标准” ， 是开展转基因生物安全 监管的基准物。 开发转基因成分检测标准物质对原材料的均匀性、 稳定性、 特征量值范围等 方面有严格要求。目前， 国内外转基因成分检测普遍采用基于核酸的定性、 定量检测方法。 其中定量检测通常采用 RealTime-PCR 方法对样品中靶标核酸序列进行绝对定量， 即测定 外源 DNA 插入特。
6、征序列的拷贝数， 并以此为基础计算样品中转基因成分的含量。在转基因 成分检测中， 可以将外源DNA看作一个基因座位， 一个纯合体的2倍体基因组中检测靶标核 酸序列， 即外源 DNA 插入特征序列的拷贝数为 2， 一个杂合体的 2 倍体基因组中外源 DNA 插 入特征序列的拷贝数为 1， 非转基因材料中则为 0。因而， 转基因检测标准物质制备原材料 的均匀性、 稳定性、 特征量值范围， 主要体现在外源 DNA 插入所产生的特征序列的杂合或纯 合状态。 在标准物质的研制过程中， 必需对原材料中靶标核酸序列的遗传特性进行确认， 即 确认外源 DNA 插入所产生的特征序列是纯合还是杂合状态。 0003。
7、 目前， 已报道的转基因成分检测方法， 主要包括针对外源目的基因、 调控元件的筛 选检测和基因特异性检测， 针对遗传转化载体的特征建立特异性检测， 针对外源 DNA 插入 特征序列的品系特异性检测等三类。利用以上方法， 只能确定样品中是否含有转基因成分 或含有何种转基因成分， 但无法直接鉴别样品中外源 DNA 插入的纯合或杂合状态。国内外 目前还没有针对转基因抗虫水稻克螟稻1(KMD1)外源基因纯合/杂合状态检测方法的相关 报道。 发明内容 0004 本发明的目的是提供一种基于外源基因旁侧序列建立的鉴定纯合型克螟稻 1(KMD1) 的方法。 0005 为了实现本发明目的， 本发明的一种检测转基。
8、因抗虫水稻 KMD1 的特异 性 引 物， 其 包 括 ： 正 向 引 物 5 -TATCTCCTCATTGGCACACCA CCTG-3 和 反 向 引 物 5-CTCGTCAGCAACTGGGGTGTTCCGC-3。 该引物对是基于KMD1外源基因的旁侧序列而设计 的引物， 利用该对引物进行长距离聚合酶链式扩增 (long distance PCR， LD-PCR)， 以纯合 KMD1 基因组 DNA 为模板可以扩增出一条长片段 (8884bp)， 以杂合 KMD1 基因组 DNA 为模板 扩增出两条片段 (8884bp 和 240bp)， 以非转基因水稻基因组 DNA 为模板只能扩增出一。
9、条短 片段 (240bp)。 0006 本发明提供基于外源基因旁侧序列建立的鉴定纯合型 KMD1 的方法， 包括步骤 ： 1) 提取植物基因组 ； 2) 以步骤 1) 的基因组为模板， 利用上述特异性引物进行 PCR 检测。 0007 PCR反应条件优选为 ： 94 1min ； 98 10s， 66 10min， 30个循环 ； 72 10min。 说 明 书 CN 103014136 A 3 2/4 页 4 0008 PCR 反应体系优选为 ： 0009 0010 本发明进一步提供含有上述特异性引物的检测试剂盒及其在检测纯合型转基因 抗虫水稻 KMD1 中的应用。 0011 本发明首次基于。
10、外源基因旁侧序列建立转基因抗虫水稻克螟稻 1(KMD1) 的外源 基因纯合的鉴定方法， 可用于转基因检测用标准物质候选物的筛选鉴定。 此外， 在转基因作 物遗传育种过程中， 需要将转基因材料与其它材料进行杂交、 转育以获得适合的栽培品种， 利用分子生物学手段快速、 简便鉴定纯合体 / 杂合体育种材料， 有利于缩短育种进程。 附图说明 0012 图 1 为本发明通过 LD-PCR 在水稻中的扩增结果 ； 其中， M ： 1kbplus DNA ladder ； 1 ： 空白对照 ； 2 ： 非转基因水稻明恢 63 ； 3 ： 外源基因纯合的 KMD1 ； 4 ： 外源基因杂合的 KMD1。 具体。
11、实施方式 0013 以下实施例用于说明本发明， 但不用来限制本发明的范围。 0014 以下实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条件， 例如 Sambrook 等 的 分子克隆 ： 实验室手册 (New York ： Cold Spring Harbor Laboratory Press， 2001) 中 所述的条件， 或按照仪器或试剂制造厂商所建议的条件。 所用试剂和材料均为市售商品， 转 基因抗虫水稻 KMD1 和非转基因水稻明恢 63 可市售获得。 0015 实施例 0016 利用引物， 其中正向引物为 LA-KMD1F ： 5 -TATCTCCTCATTGGCACACCACC。
12、TG-3， 反 向引物为 LA-KMD1R ： 5 -CTCGTCAGCAACTGGGGTGTTCCGC-3进行 LD-PCR 扩增鉴定 KMD1 的 外源基因纯合状态。 0017 1. 实验材料 0018 1.1 植物材料 0019 转基因抗虫水稻 KMD1， 非转基因水稻明恢 63。 0020 1.2 酶与试剂 0021 分 子 生 物 学 试 剂， Takara LA Taq， 10LA PCR Buffer II(Mg2+Plus)， dNTP Mixture(2.5mM) 购 自 Takara Biotechnology， 1kb Plus DNA Marker 购 自 TransG。
13、en Biothech。 0022 其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。 引物由北京生工生物技术有限公司合 成。 说 明 书 CN 103014136 A 4 3/4 页 5 0023 1.3 实验仪器 0024 DNA 处理仪器 ： 低温混合球磨仪 MM400(Retsch) ； 0025 PCR 扩增仪 ： AB Applied Biosystems veriti 96 well Thermal Cycler(AB) ； 0026 核酸电泳仪 ： DYY-11 型核酸电泳仪 ( 北京六一仪器厂 ) ； 0027 DNA 电泳分析系统 ： GeneSnap 凝胶成像分析系统 ； 0028 。
14、其它仪器包括 ： 恒温水浴锅、 电子天平、 离心机、 涡旋仪、 纯水仪、 恒温培养箱等。 0029 2. 实验方法 0030 2.1 水稻基因组 DNA 的提取 0031 水稻单粒种植， 取幼嫩叶片作为 DNA 提取材料， 依照 TianGen Plant Genomic DNA Kit( 购自天根生化科技 ( 北京 ) 有限公司， 目录号 ： DP320 ； 包括缓冲液 LP1、 LP2、 LP3、 洗脱 缓冲液 TE 及吸附柱 CB3) 的操作手册， 进行水稻总 DNA 的提取。 0032 a. 称取水稻新鲜叶片 100mg， 单株分别标记， 剪刀剪碎装入 2ml 离心管中， 放入液 氮中。
15、预冷， 用低温混合球磨仪充分破碎。加入 400l 缓冲液 LP1 和 6l RNase A(10mg/ ml)， 涡旋振荡 1min， 室温放置 10min。 0033 b. 加入 130l 缓冲液 LP2， 充分混匀， 涡旋振荡 1min。12,000rpm 离心 5min， 将上 清移至新的离心管中。 0034 c.加入1.5倍体积的缓冲液LP3， 充分振荡混匀15s， 此时可能会出现絮状沉淀。 将 所得的溶液或者絮状沉淀加入一个吸附柱 CB3 中， 12,000rpm 离心 30s， 弃废液， 吸附柱 CB3 放回收集管中。 0035 d. 向吸附柱 CB3 中加入 700l 漂洗液 P。
16、W， 12,000 离心 30s， 弃废液， 吸附柱 CB3 放回收集管中。 重复此步骤如下 ： 向吸附柱CB3中加入500l漂洗液PW， 12,000离心30s， 弃废液， 吸附柱 CB3 放回收集管中。14,000rpm 离心 2min， 弃废液。将吸附柱 CB3 置于室温 放置数分钟， 以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。 0036 e. 将吸附柱 CB3 转入一个干净的离心管中， 向吸附膜的中间部位悬空滴加 50l 去离子双蒸水 (pH7.0-8.5)， 室温放置 2-5min， 12,000 离心 2min， 将溶液收集到离心管中。 0037 2.2DNA 浓度和纯度测定 0038 使。
17、用 NaNoDrop 1000 分光光度计 (Thermo Scientific) 测定 DNA 的纯度和浓度， 并用去离子双蒸水调节 DNA 浓度至 100ng/l。 0039 2.3 长距离聚合酶链式扩增 (long distance PCR， LD-PCR) 0040 根据获得的 3 侧翼序列和 5 侧翼序列， 从两端设计引物用于扩增出全长。其中 正向引物 LA-KMD1F 在 5 插入区的水稻序列， 反向引物 LA-KMD1R 在 3 插入区的水稻序列， 引物序列见表 1。 0041 表 1 0042 引物 序列 LA-KMD1F 5 -TATCTCCTCATTGGCACACCACCT。
18、G-3 LA-KMD1R 5 -CTCGTCAGCAACTGGGGTGTTCCGC-3 说 明 书 CN 103014136 A 5 4/4 页 6 0043 LD-PCR 扩增体系为 ： 总体系 25l， Takara LA Taq 1.25U， 10LAPCR Buffer II(Mg2+Plus)2.5l， dNTP Mixture(2.5mM)4l， 引 物 各 1l(10M)， 水 稻 DNA 2l(100ng/l)， 剩余用 ddH2O 补足。 0044 LD-PCR 扩增程序 ： 94 1min ； 98 10s， 66 10min， 30 个循环 ； 72 10min。 004。
19、5 3. 实验结果 0046 根据转基因水稻 KMD1 5 和 3 两端侧翼序列设计的正向引物和反向引物， 通过 LD-PCR在非转基因水稻明恢63、 纯合转基因水稻KMD1、 杂合转基因水稻KMD1 DNA中进行扩 增， 能够快速准确地鉴定出 KMD1 中纯合体和杂合体。其中在纯合转基因水稻 KMD1 中仅能 扩增出一条 8884bp 的片段 ； 杂合转基因水稻 KMD1 扩增出两条片段， 一条为 8884bp， 一条为 240bp ； 而非转基因水稻中只能扩增出一条 240bp 片段。扩增结果如图 1 所示， 其中琼脂糖 凝胶浓度为 1， EB 中染色 20min。 0047 虽然， 上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述， 但在 本发明基础上， 可以对之作一些修改或改进， 这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此， 在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进， 均属于本发明要求保护的范围。 说 明 书 CN 103014136 A 6 1/1 页 7 0001 序 列 表 CN 103014136 A 7 1/1 页 8 图 1 说 明 书 附 图 CN 103014136 A 8 。