用于肿瘤治疗的遗传修饰的仙台病毒.pdf

本发明涉及遗传修饰的副粘病毒、涉及包含该副粘病毒的药物组合物、涉及遗传修饰的副粘病毒用于肿瘤的治疗性和/或预防性治疗的用途、及涉及生产用于肿瘤的治疗性或预防性治疗的药物组合物的方法。

权利要求书一种遗传修饰的副粘病毒，其相对于野生型(wt)在其F基因中包含至少第一遗传修饰和在其P基因中包含至少第二遗传修饰。
权利要求1所述的遗传修饰的副粘病毒，其特征在于所述第一遗传修饰导致向性延伸。
权利要求1或2所述的遗传修饰的副粘病毒，其特征在于所述第二遗传修饰导致向性限制。
前述权利要求中任一项所述的遗传修饰的副粘病毒，其为遗传修饰的仙台病毒(SeV)。
权利要求4所述的遗传修饰的副粘病毒，其特征在于，通过所述第一遗传修饰，编码SeV wt蛋白酶切割位点的核苷酸序列被编码遍在性蛋白酶切割位点的核苷酸序列替换。
权利要求5所述的遗传修饰的副粘病毒，其特征在于，所述遍在性蛋白酶切割位点源自新城疫病毒(NDV)的F基因。
权利要求5或6所述的遗传修饰的副粘病毒，其特征在于，所述SeV wt蛋白酶切割位点包含氨基酸序列VPQSR(SEQ ID No.5)和/或所述遍在性蛋白酶切割位点包含氨基酸序列RRQKR(SEQ ID No.6)。
前述权利要求中任一项所述的遗传修饰的副粘病毒，其特征在于，通过所述第二遗传修饰，编码由P基因编码的辅助性非结构蛋白中至少一种的核苷酸序列被修饰。
权利要求8所述的遗传修饰的副粘病毒，其特征在于，通过所述第二遗传修饰，所述辅助性非结构蛋白中至少一种是不可转录的。
权利要求9所述的遗传修饰的副粘病毒，其特征在于，通过所述第二遗传修饰，所述辅助性非结构蛋白中至少一种的起始密码子被功能性破坏。
权利要求8至10中任一项所述的遗传修饰的副粘病毒，其特征在于，所述辅助性非结构蛋白选自由C’、C、Y1、Y 2、V和W组成的组。
权利要求11所述的遗传修饰的副粘病毒，其特征在于，通过所述第二遗传修饰，至少C(C和/或C’)和Y(Y1和/或Y2)蛋白被修饰，优选被功能性破坏。
权利要求11所述的遗传修饰的副粘病毒，其特征在于，通过所述第二遗传修饰，至少C(C和/或C’)、V和W蛋白被修饰，优选被功能性破坏。
权利要求11所述的遗传修饰的副粘病毒，其特征在于，通过所述第二遗传修饰，至少C(C和/或C’)、V、W和Y(Y1和/或Y2)蛋白被修饰，优选被功能性破坏。
前述权利要求中任一项所述的遗传修饰的副粘病毒，其相对于野生型(wt)包含至少一种转基因。
权利要求15所述的遗传修饰的副粘病毒，其特征在于，所述转基因是自杀基因或诱导细胞死亡的另一种基因或免疫刺激基因。
药物组合物，包含权利要求1至16中任一项所述的遗传修饰的副粘病毒和药学上可接受的载体。
遗传修饰的副粘病毒用于肿瘤疾病，优选实体肿瘤的发生，进一步优选肝细胞癌的发生，的治疗性和/或预防性治疗的用途，其特征在于，所述遗传修饰的副粘病毒是权利要求1至16中任一项所述的遗传修饰的副粘病毒。
生产用于肿瘤疾病，优选实体肿瘤的发生，进一步优选肝细胞癌的发生，的治疗性和/或预防性治疗的药物组合物的方法，所述方法包括下述步骤：
(1)提供权利要求1至16中任一项所述的遗传修饰的副粘病毒，和
(2)将所述遗传修饰的副粘病毒配制到药学上可接受的载体中。

说明书用于肿瘤治疗的遗传修饰的仙台病毒
技术领域
本发明涉及一种遗传修饰的副粘病毒、包含该副粘病毒的药物组合物、遗传修饰的副粘病毒用于肿瘤疾病的治疗性和/或预防性治疗的用途及生产用于肿瘤疾病的治疗性或预防性治疗的药物组合物的方法。
背景技术
统计上，三分之一的欧洲人在其一生中发生癌症。在德国，每年约395,000人发生癌症，其中约195,000人是女性和200,000人是男性。这些病例中的大多数发生于60岁以上的年龄。
实体肿瘤仍是临床肿瘤学的巨大挑战。单种肿瘤疾病预后的显著改善可几乎专门地通过建立被整合到多模式概念中的新疗法原则而实现。
这些新疗法原则之一涉及复制性病毒用于治疗肿瘤的应用。该途径被称为病毒疗法或溶癌作用(oncolysis)。许多病毒具有肿瘤细胞溶解性质，其在不同的肿瘤细胞中具有与健康实质细胞中降低的复制相比的优先复制。目前，多种病毒治疗剂已被用于若干临床试验。
副粘病毒科的病毒是特别令人感兴趣的。该被膜病毒家族的重要成员是属于禽腮腺炎病毒属(Avulavirus)的新城疫病毒(Newcastle disease virus)、属于麻疹病毒属(Morbilliviruses)的麻疹病毒(Measles virus)和属于呼吸道病毒属(Respiroviruses)的仙台病毒(Sendai virus)。
副粘病毒的基因组包含单股负链RNA，即反义模式的编码基因或开放阅读框(ORF)的RNA分子。在仙台病毒中，RNA基因组的3’‑头区域之后是病毒基因N(核衣壳)、P(磷蛋白(Phospho))、M(基质蛋白(Matrix))、F(融合蛋白)、HN(血凝素‑神经氨酸苷酶)和L(大(Large))，之后是5’‑尾区域。
N、P和L蛋白是基因组RNA编码的基因的表达和RNA的自主复制所需的。HN蛋白支持特定细胞类型的感染。所谓的基质蛋白(M)是病毒颗粒中与膜结合的结构蛋白。
F蛋白通过诱导细胞膜融合(初始感染和病毒扩展至邻近细胞所必需的)而在感染中具有重要的功能。其在被病毒感染的细胞中作为无活性前体F0合成，并锚定于来源于宿主细胞质膜的病毒脂质被膜中。F0被类胰蛋白酶“Clara”切割成活性亚基F1和F2，类胰蛋白酶“Clara”可被发现于大鼠和小鼠的呼吸道中并从支气管上皮细胞分泌。F1和F2具有融合细胞膜的能力，由此开始病毒对宿主的感染。因此，F0的切割对于仙台病毒的传染性和致病性是决定性因素。蛋白酶限制是仙台病毒在小鼠中的感染被限制于呼吸道并且不能导致全身感染的重要决定因素。
Kinoh等(2004)Generation of a recombinant Sendai virus that is selectively activated and lyses human tumor cells expressing matrix metalloproteinses，Gene Ther.11，p.1137‑1145提出了使用遗传修饰的仙台病毒治疗肿瘤疾病。遗传修饰的原则是将人工切割位点引入病毒F蛋白(其被肿瘤特异性基质金属蛋白酶识别并切割)，并且由此使得修饰病毒的肿瘤特异性复制成为可能。此外，已知的遗传修饰的仙台病毒包含病毒M蛋白的缺失，从而使得以病毒的扩展仅能通过细胞‑细胞接触的方式经由融合而抑制后代病毒的释放。该修饰的仙台病毒还被公开于EP 1 505 154中。
Kinoh等(2009)，Generation of optimized and urokinase‑targeted oncolytic Sendai virus vectors applicable for various human malignancies，Gene Ther.16，p.392‑403描述了一种遗传修饰的仙台病毒，其在病毒F蛋白中具有氨基酸截短，这导致融合活性的提高。此外，病毒F蛋白包含所谓的“尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)敏感序列”(SGRS)，由此通过肿瘤特异性蛋白酶对F0的切割和活化将会扩展病毒的复制能力至许多肿瘤。
Elankumaran等(2010)，Type I Interferone sensitive recombinant Newcastle‑Disease‑Virus for oncolytic virotherapy，Journal of Virology(在线出版)提出了使用重组的新城疫病毒(rNDV)作为抗肿瘤剂，其或者包含V蛋白中的突变并被称为“rBC‑Edit”，或者包含F蛋白中的突变并被称为“rLaSota V.F.”。
US 2009/0175826建议使用重组新城疫病毒(rNDV)作为肿瘤细胞溶解剂，其包含在肿瘤细胞系中诱导细胞凋亡的转基因。
但是，本领域中迄今为止描述的肿瘤细胞溶解病毒并没有证明其价值。具有确定的有效性证明的临床应用仍有待证明。特别地，迄今为止本领域中使用的肿瘤细胞溶解病毒具有下述缺点：其在一定程度上也感染和破坏非肿瘤细胞。基于这些理由，迄今为止使用的肿瘤细胞溶解病毒不能用于临床应用。此外，尚不清楚对于哪些肿瘤疾病单个病毒系统可达到良好效果。出于这一理由，迄今为止使用的肿瘤细胞溶解病毒不能用于临床应用中。
发明内容
针对该背景，本发明的目的在于提供一种改进的肿瘤细胞溶解病毒，通过其可极大地避免迄今为止使用的肿瘤细胞溶解病毒的缺点。特别地，将提供此类肿瘤细胞溶解病毒，其可在肿瘤细胞中复制并且破坏肿瘤细胞，但是其在非肿瘤细胞中仅以强烈受限的方式复制，并且由此充分地满足流行病学安全性方面的要求。
该目的通过提供遗传修饰的副粘病毒、优选地遗传修饰的仙台病毒(Sev)来实现，所述病毒相对于野生型(wt)而言在其F基因中包含至少第一遗传修饰和在其P基因中包含至少第二遗传修饰。
根据本发明，“副粘病毒”指属于副粘病毒科的这样一种病毒以及通过繁殖的方式由其得到的病毒。副粘病毒包括具有呼吸道病毒属、腮腺炎病毒属(Rubulavirus)、禽腮腺炎病毒属和麻疹病毒属的副粘病毒(Paramyxovirinae)亚科以及具有肺病毒属(Pneumovirus)和偏肺病毒属(Metapneumovirus)的肺病毒(Pneumovirinae)亚科。关于副粘病毒分类学的细节可见于例如Kneipe等(2007)，Fields Virology，5th Edition，Lippincot Williams&Wilkins中。
如发明人能发现的，根据这一优选实施方式，仙台病毒的基本上每种病毒株都适合根据本发明所述的修饰。尤其合适的仙台病毒株是“Fushimi”、“Harris”、“Z‑病毒株”、“Ohita”、“Hamamatsu”、“Cantell”和“52”。
发明人已首次认识到，分别对F基因或F蛋白的遗传修饰和蛋白酶限制性的消除提供用于病毒在肿瘤组织中的高效扩展，而使得广谱的不同肿瘤可被感染。
仙台病毒的F基因的核苷酸序列以SEQ ID No.1被示于所附的序列表中，并且其具有GeneID 1489775。仙台病毒的F蛋白的氨基酸序列以SEQ ID No.2被示于所附的序列表中，并且其具有数据库登录号BAA 24390.1或NP_056877。
本发明的发明人还认识到，分别在P基因或P蛋白中的第二遗传修饰导致病毒的减毒。因为P基因中的遗传修饰或突变，分别地，基因或蛋白C’、C、Y1、Y2的阅读框移位。但是，P蛋白保持完全完整。
仙台病毒的P基因的核苷酸序列以SEQ ID No.3被示于所附的序列表中。P蛋白的氨基酸序列以SEQ ID No.4被示于所附的序列表中，并且其具有数据库登录号BAA 24386.1和AAB 06279。
P基因编码被称为C’、C、Y1、Y2、V和W的几种辅助性非结构蛋白质。这些蛋白质通过重叠阅读框和“RNA编辑”产生。辅助性非结构蛋白质的确切功能尚未完全详细阐明，虽然假设它们可与被感染的细胞的非特异性防御系统(例如干扰素系统)相互作用。
根据本发明修饰的副粘病毒与野生型病毒相反在肿瘤组织中有能力独立复制并且破坏肿瘤组织，尽管不能观察到对于特定肿瘤细胞类型的限制。令人吃惊地，根据本发明的病毒在非肿瘤细胞(例如，原代人肝细胞或成纤维细胞)中仅可以非常有限的程度复制。因此，根据本发明的病毒可以以相对非肿瘤细胞而言的非常高的优先性感染肿瘤细胞。对正常组织的损害可显著降低，而病毒的治疗范围增加。
根据本发明，“遗传修饰”指本发明的副粘病毒相对于野生型的优选靶向的基因组、遗传信息或编码蛋白质的改变，其例如可通过靶向诱变被引入。
根据一种优选的进一步的发展，第一遗传修饰以导致向性(tropism)延伸的方式来设计。
该措施具有下述优点：根据本发明的病毒变为独立于例如仅被少量组织或肿瘤细胞表达的特定蛋白酶。关于这一点，例如，野生型仙台病毒依赖于仅由支气管内皮细胞表达的类胰蛋白酶，并且因此其仅能感染这些细胞。Kinoh等(2009；1.c.)描述的病毒依赖于基质金属蛋白酶(NMP)，并且因此仅能感染表达NMP的此类肿瘤细胞。相反，根据本发明进一步开发的病毒因为在F基因中的第一遗传修饰而有能力感染并裂解所有肿瘤细胞。
根据进一步优选的实施方式，第二遗传修饰被配置为导致向性限制。
该方式具有下述优点：病毒安全性增加，并且副作用显著降低。根据本发明的病毒选择性地裂解肿瘤细胞，但是健康细胞不被裂解或仅以非常有限的程度裂解。发明人已经意识到，通过P基因(即非结构蛋白质)的靶向遗传修饰，可以以使得病毒以靶向方式在肿瘤细胞中复制的方式来影响待裂解的细胞的反应模式。该途径与Kinoh等(2009；1.c.)描述的其中编码结构蛋白的M基因的缺失导致合成不完整的病毒颗粒的那些途径不同。那也导致裂解活性的降低。令人吃惊地，根据本发明的病毒的裂解活性限于在肿瘤细胞且活性非常高。
优选地，如果通过F基因中的第一遗传修饰，编码SeV WT蛋白酶切割位点(其包含氨基酸序列VPQSR(SEQ ID No.5))的核苷酸序列被编码遍在性蛋白酶切割位点(优选来自新城疫病毒(NDV)的F基因)(其包含氨基酸序列RRQKR(SEQ ID No.6)的核苷酸序列替代。
根据本发明对F蛋白中蛋白水解性的SeV‑WT蛋白酶切割位点的修饰消除了野生型的蛋白酶限制。因而F蛋白可被遍在性蛋白酶切割，由此可实现相对于可能仅存在于小鼠呼吸道中的特定蛋白酶的独立性，或还可实现相对于肿瘤降低的蛋白酶的独立性。结果，遗传修饰的病毒可用于更广谱的肿瘤，然而发生抗性的风险被被显著降低。
根据本发明优选的进一步发展，P基因中的第二遗传修饰导致对P基因编码的辅助性非结构蛋白质的修饰，优选地，以辅助性非结构蛋白质中的至少一个不可转录、更优选地因为起始密码子的功能性破坏而不可转录的方式进行修饰。
这些方式具有下述优点：根据本发明修饰的病毒被减毒，其方式是使得在非恶性细胞中的复制和健康组织的感染受到显著地限制。由此，根据本发明的病毒以更为靶向的方式感染肿瘤细胞，并且能裂解它们。
优选地是，辅助性非结构蛋白质选自由C’、C、Y1、Y2、V和W组成的组，其中优选地是通过在P基因中的第二遗传修饰，至少C’/C和Y1/Y2蛋白，进一步优选至少C’/C、V和W蛋白，进一步优选至少C’/C、V、W和Y1/Y2蛋白分别被修饰或被功能性破坏。
如发明人已能在模型系统中发现的，经此种方式修饰的病毒包含特别高的对肿瘤细胞的选择性和在非肿瘤细胞中特别低的复制能力。
仙台病毒C’基因的核苷酸序列以SEQ ID No.7被示于所附的序列表中，并且其具有GeneID AB005796.1。仙台病毒的C’蛋白的氨基酸序列以SEQ ID No.8被示于所附的序列表中，并且其具有数据库登录号BAA 24394。
仙台病毒C基因的核苷酸序列以SEQ ID No.9被示于所附的序列表中。仙台病毒的C蛋白的氨基酸序列以SEQ ID No.10被示于所附的序列表中，并且其具有数据库登录号BAA 24396。
仙台病毒V基因的核苷酸序列以SEQ ID No.11被示于所附的序列表中。仙台病毒的V蛋白的氨基酸序列以SEQ ID No.12被示于所附的序列表中，并且其具有数据库登录号BAA 20021。
仙台病毒W基因的核苷酸序列以SEQ ID No.13被示于所附的序列表中。仙台病毒的W蛋白的氨基酸序列以SEQ ID No.14被示于所附的序列表中，并且其具有数据库登录号AAX07444。
仙台病毒Y1基因的核苷酸序列以SEQ ID No.15被示于所附的序列表中。仙台病毒的Y1蛋白的氨基酸序列以SEQ ID No.16被示于所附的序列表中，并且其具有数据库登录号BAA 24388。
仙台病毒Y2基因的核苷酸序列以SEQ ID No.17被示于所附的序列表中。仙台病毒的Y2蛋白的氨基酸序列以SEQ ID No.18被示于所附的序列表中，并且其具有数据库检索号AAX07449。
根据优选的进一步的实施方式，根据本发明的病毒包含相对于野生型(wt)而言至少一种转基因，优选自杀基因或其它细胞死亡诱导基因或免疫刺激基因。
该方式具有下述优点：根据本发明的病毒的细胞毒性再次被提高，因为转基因的产物另外有助于增强被感染的肿瘤细胞的破坏。具有抗肿瘤作用的转基因也被包括在内。
针对该背景，本发明的进一步的主题涉及包含根据本发明的遗传修饰的副粘病毒和药学上可接受的载体的药物组合物。
药学上可接受的载体被全面描述于本领域的现有技术中，例如，Bauer等(1999)，Lehrbuch der Pharmazeutischen Technologie，Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH Stuttgart，Kibbe等(2000)，Handbook of Pharmaceutical Excipients，American Pharmaceutical Association and Pharmaceutical Press中。上述公开文献的内容也是本文公开的主题。不言而喻，药物组合物可包含其它辅助剂和活性剂，例如细胞抑制剂。
本发明的进一步的主题涉及根据本发明的遗传修饰的副粘病毒用于肿瘤疾病，优选实体肿瘤的发生，进一步优选肝细胞癌的发生的治疗性和/或预防性治疗的用途。
肝细胞癌具有每年一百万的发生率，且因此是世界范围内最频发的恶性肿瘤之一。仅在少数情况下，通过手术切除和肝移植的治愈性疗法是可能的。迄今为止仍缺乏令人信服的替代疗法概念，因为针对迄今为止测试的所有化疗剂都可观察到明显的抗性。本发明有效地满足了这些需求。
本发明的进一步的主题涉及生产用于肿瘤疾病的治疗性和/或预防性治疗的药物组合物的方法，所述肿瘤疾病优选是实体肿瘤的发生，进一步优选是肝细胞癌的发生，所述方法包括下述步骤：(1)提供根据本发明的遗传修饰的副粘病毒，以及(2)将所述遗传修饰的副粘病毒配制进药学上可接受的载体中。
应当理解，前文提到的和下文中将要解释的特征不仅可以以特别指出的组合使用，还可以以其它组合或者以独立的方式使用而不偏离本发明的范围。
附图简要说明
下面将通过产生本发明进一步的特征、优点和特点的实施方式来解释本发明。将参照所附的显示了下述内容的附图：
图1显示了仙台病毒的基因组结构；
图2显示了具有仙台病毒的cDNA的pSVV10质粒的结构；
图3显示了P基因中非结构性辅助基因的开放阅读框(ORF)；
图4显示了亚克隆到克隆载体pSL1180中；
图5显示了诱变PCR的原理；
图6显示了用于经诱变PCR验证突变的引物示意图；
图7显示了再克隆的步骤1，其中突变的SphI‑EcoRI片段被从pLS1180Sph1‑Eco pSVV10克隆载体上切下，并被克隆到仙台病毒载体pVV13中；
图8显示了再克隆的步骤2；进入缺乏M、F、HN的ORF的pSVV13载体中；该区域已通过EcoRI克隆有来自pRS Id‑E Fm的改变的F切割位点；所得到的载体含有突变的P/C区域以及来自NDV的遍在性F切割位点；
图9显示了根据本发明的病毒在vero生产细胞和肝细胞瘤细胞(Hep3B、HuH7、PLC/PRF/5)上的复制；
图10显示了根据本发明的病毒在非肿瘤细胞(MRC‑5、人成纤维细胞、PHH，原代人肝细胞)上的复制；
图11显示了根据本发明的病毒的体内扩增。
具体实施方式
1.仙台病毒的基因组组织
仙台病毒是具有大约15kb的基因组的负链RNA病毒。基因组组织示于图1中。六个结构蛋白的基因排列于病毒基因组RNA上，它们具有3′‑N‑P‑M‑F‑HN‑L‑5′的顺序。在第一个基因的前端定位有包含54个核苷酸的前导区域(ld)，且最后一个基因之后是具有57个核苷酸的长度的尾随区域(tr)。各个基因下方的数字对应于以bp表示的基因长度。对于单个基因的转录而言，病毒转录酶在被称为基因起始基序(GS)的3’末端保守序列处开始mRNA的合成，接着是非翻译区域(UTR)、病毒基因的开放阅读框(ORF)以及最后是基因末端基序(GE)(mRNA合成在此处终止)。在两个表达单元之间可找到3bp的保守基因间基序(I)，其不被引入该mRNA中。
本发明的基础以所谓pSVV10质粒的形式提供，更精确地，编码病毒株Fushimi，ATCC VR‑105的仙台病毒cDNA的pSVV10IdGFPMFHN质粒(其具有19.774bp的尺寸)，该质粒被描绘于图2中。
2.P基因编码的辅助性蛋白的详细阐述
仙台病毒的辅助性蛋白C’、C、Y1、Y2、V和W由P基因编码。C和Y蛋白的ORF移位+1个碱基。V和W蛋白根据在所谓的编辑位点(ES)处插入的G蛋白的数目产生。具有辅助性基因的P‑ORF序列区域示于图3中，其中的数字指在PSVV10载体中的具体信息。
3.亚克隆到诱变质粒中
为将点突变插入辅助性蛋白基因中，进行诱变PCR。但是，对该方法而言，仅可使用最大尺寸为8kb的质粒。通过限制性酶EcoRI和SphI将仙台病毒基因组的P/V/C区域从仙台病毒载体pSVV10(19774bp)克隆到克隆载体pSL1180(3422bp)中。为此，用酶EcoRI和SphI消化pSVV10(图2)和pSL1180载体二者，且将待突变的pSVV10区域(2254bp)连接至sPL1180的载体主链(3303bp)中。得到的克隆质粒pSL1180SphI‑Eco pSVV10大小为5557bp；参见图4。
4.诱变
通过靶向突变，防止辅助性基因C’、C、Y1和Y2的转录。编辑位点中的突变也具有可不再发生编辑的效应。下面的概述显示了具有所有基因起始点和编辑位点的pSL1180的相关克隆区(SEQ IDNo.19)：
GCTTCGGCTACACTTACGAGGCGCCAGGAGGAAGAGAGTCGCTCTCGGTTATCGGATTCCTCGCTGTCCTGTCGAGTGAACCAACTGACATCGGAGGGGACAGAAGCTGGCTCCACAACACCATCAACACTCCCCAAGGACCAGGCTCTGCCCATAGAGCCAAAAGTGAGGGCGAAGGAGAAGTCTCAACACCGTCGACCCAAGATAATCGATCAGGTGAGGAGAGTAGAGTCTCTGGGAGAACAAGCAAGCCAGAGGCAGAAGCACATGCTGGAAACCTTGATAAACAAAATATACACCGGGCCTTTGGGGGAAGAACTGGTACAAACTCTGTATCTCAGGATCTGGGCGATGGAGGAGACTCCGGAATCCTTGAAAATCCTCCAAATGAGAGAGGATATCCGAGATCAGGTATTGAAGATGAAAACAGAGAGATGGCTGCGCACCCTGATAAGAGGGGAGAAGACCAAGCTGAAGGACTTCCAGAAGAGGTACGAGGAGGTACATCCCTACCTGATGAAGGAGAAGGTGGAGCAAGTAATAATGGAAGAAGCATGGAGCCTGGCAGCTCACATAGTGCAAGAGCTGGGGTCCTGGTGATTCCTAGCCCCGAACTCGAAGAGGCTGTGCTACGGAGGAACAAAAGAAGACCTACCAACAGTGGGTCCAAACCTCTTACTCCAGCAACCGTGCCTGGCACCCGGTCCCCACCGCTGAATCGTTACAACAGCACAGGGTCACCACCAGGAAAACCCCCATCTACACAGGATGAGCACATCAACTCTGGGGACACCCCCGCCGTCAGGGTCAAAGACCGGAAACCACCAATAGGGACCCGCTCTGTCTCAGATTGTCCAGCCAACGGCCGCCCAATCCACCCGGGTCTAGAGACCGACTAAAGAGATGGCTACATTGTTGACGAGTCTTGGTGTAATCCAGTCTGCTCAAGAATTCGAGTCATCCCGAGACGCGAGTTATGTGTTTGCAAGACGTGCCCTAAAGTCTGCAAACTATGCAGAGATGACATTCAATGTATGCGGCCTGATCCTTTCTGCCGAGAAATCTTCCGCTCGTAAGGTAGATGAGAACAAACAACTGCTCAAACAGATCCAAGAGAGCGTGGAATCATTCCGGGATATTTACAAGAGATTCTCTGAGTATCAGAAAGAACAGAACTCATTGCTGATGTCCAACCTATCTACACTTCATATCATCACAGATAGAGGTGGCAAGACTGACAACACAGACTCCCTTACAAGGTCCCCCTCCGTTTTTGCAAAATCAAAAGAGAACAAGACTAAGGCTACCAGGTTTGACCCATCTATGGAGACCCTAGAAGATATGAAGTACAAACCGGACCTAATCCGAGAGGATGAATTTAGAGATGAGATCCGCAACCCGGTGTACCAAGAGAGGGACACAGAACCCAGGGCCTCAAACGCATCACGCCTCCTCCCCTCCAAAGAGAAGCCCACAATGCACTCTCTCAGGCTCGTCATAGAGAGCAGTCCCCTAAGCAGAGCTGAGAAAGCAGCATATGTGAAATCATTATCCAAGTGCAAGACAGACCAAGAGGTTAAGGCAGTCATGGAACTCGTAGAAGAGGACATAGAGTCACTGACCAACTAG

产生了三种特异性引物，其一方面功能性地破坏辅助性蛋白基因的起始序列，另一方面不导致P阅读框中氨基酸的改变。
引物1(SeV Cko)：
5′CGCATGGATCAAGACGCCTTCATTCTAAAAGAAGATTCTGAAGTAGAGAGG 3′
(SEQ ID No.20)
未修饰的P‑氨基酸：
                            Asp       Leu       Val
Orig.P‑seq.：CGC ATG GAT CAAGCCTTCATTAAAGAAGATTCTGAAGAGAGG(SEQ ID No.21)
Prim.seq.：CGC ATG GAT CAAGCC TTC ATTAAA GAA GAT TCT GAAGAG AGG(SEQ ID No.22)
                           Asp        Leu       Val
突变的C‑氨基酸：
                           起始       Leu       Leu
经修饰的C‑序列：CCT TCA TTCAAG AAG ATT CTG AAGAGA GG(SEQ ID No.23)
                                    终止      终止
引物2(SeV Yko)：
5′CTCTCGGACGTTATCGGATTCCTCGACGCTGTCCTG 3′(SEQ ID No.24)
未修饰的P‑氨基酸：
                           Asp         Asp
P‑序列              CTCTCGGTT ATC GGA TTC CTCG CT GTC CTG(SEQ ID No.25)
                           Asp         Asp
突变的Y‑氨基酸：
                          起始          起始
原始序列        C TCT CGGTTA TCG GAT TCC TCGCTG TCC TG(SEQ ID No.26)
引物Y1(C)‑序列  C TCT CGGTTA TCG GA TTC CTCGCTG TCC TG(SEQ ID No.27)
                          
引物3(SeV Vko)：
5′GACTCAACAAAGAAAGGCATAGGTGAGAACACATCATCTATG 3′(SEQ ID No.28)
未修饰的P‑氨基酸：
                           Lys       Lys       Gly
Orig.P‑seq.：GAC TCA ACAGGC ATAGAG AAC ACA TCA TCTA TG(SEQ ID No.29)
Prim seq.：GAC TCA ACAGGC ATAGAG AAC ACA TCA TCT ATG(SEQ ID No.30)
                          Lys      Lys      Gly
V和W的突变的Y‑氨基酸：
Lys Lys  G  H  R  R  E
修饰的V‑序列：GAC TCA ACAGGCAT AGGGAA CAC ATC ATC TAT G(SEQ ID NR.31)
(+1G)Lys Lys G H R终止
     Lys Lys G A终止
未修饰的W‑序列：GAC TCA ACAGGG GCA TAGAGA ACA CAT CAT CTA TG(SEQ ID NR.32)
(+2G)
使用所述引物，在诱变PCR中产生了下述突变：想要的突变：

公司的“QuickChange多位点指导试剂盒(Multi Site directed Kit)”使得能以三个连续步骤对大小高达8kb的质粒靶向插入点突变。在第一个步骤中，包含单个的点突变的错配引物在被提供给反应时与变性的模板单链退火。应当注意，所有引物都与相同的模板链结合。PfuTurbo聚合酶从引物处开始延伸互补序列，而不移置引物。新产生的DNA链现包括该突变和单悬端的末端(所谓的“缺口”)，它们被酶混合物的组分适当地转移。
在第二个步骤中，用DpnI进行消化而导致对特异性甲基化和半甲基化的DNA的消化。因为已经在大肠杆菌中扩增的质粒是dam甲基化的，因此仅母本模板被消化，而PCR中产生的含有该突变的拷贝不被消化。
在最后步骤中，ssRNA在XL10金超感受态细胞中转化且就此在体内转化为dsDNA。现在可从细菌分离质粒，并通过测序针对插入的突变进行分析。诱变PCR的原理描绘于图5中。
诱变分析按照下文所述来进行(表1)：
表1：用于产生在辅助性蛋白中具有部分缺失的重组仙台病毒的SeV诱变PCR分析

诱变PCR类似于常规PCR，仅延伸时间非常长，因为必须要补足完整的载体，并且因此延伸时间对于各种载体不同：每kb两分钟；在此处：pSL1180+Eco‑SphI片段(来自pSVV10)约5.5kb，对应于11分钟的延伸；参见表2：
表2：诱变PCR程序

扩增之后，将1μl DpnI限制性酶(10U/μl)直接供给PCR分析，用移液器重悬，短暂离心，并在37℃消化1小时。将得到的ssDNA转化到XL10金超感受态细胞中，并通过Miniprep作为dsDNA突变的质粒从细菌分离；参见表3：
表3：通过诱变修饰的序列；*Kurutani等Genes to Cells，1998和Gotoh等FEBS letters，1999

5.测序
针对突变的正确插入验证得到的突变质粒。图6显示了包括完整突变区的引物示意图。上面的数字是指原始载体psVV10(～19kb)中的位置的信息，下面的数字指pSL1180+pSVV10克隆载体(～5.5kb)中的位置的信息。
6.将突变的序列再克隆进编码完整仙台病毒的载体中
突变的序列区域必须被再克隆回具有仙台病毒完整cDNA序列的载体中。鉴于将产生应具有遍在性F切割位点而不是仅对啮齿动物呼吸道中类胰蛋白酶“Clara”有活性的切割位点的病毒，已使用载体pRS Id‑EGFP Fmut(19958bp，Sascha Bossow，MPI Munich)的eco‑eco区。代替具有核苷酸序列(GTTCCACAGTCGAGA；SEQ IDNo.33)的仙台病毒F蛋白中的切割位点，其引入具有序列(CGTCGTCAGAAGAGA；SEQ ID No.34)的来自新城疫病毒的F蛋白的遍在性切割位点。
首先，从pSL1180 Sph1‑Eco pSVV10克隆载体切下不同的突变SphI‑EcoRI片段，并将其克隆到与载体pSVV10类似但缺乏F基因和HN基因的区域的仙台病毒载体pSVV13中。然后经由EcoRI，将F基因和HN基因的缺乏区域克隆进这样的载体中，其具有来自pRSId‑EGFP Fut的经修饰的F基因中的切割位点。得到的载体被称为pSeVmut。经由BSR‑T7细胞的转染，通过“补救(rescue)”方法产生功能性仙台病毒。再克隆的步骤1示于图7中，和再克隆的步骤2示于图8中。
7.重组仙台病毒的产生
通过用于副粘病毒的“补救”方法，有可能产生遗传修饰的病毒。为此，通过脂质转染，组成型表达T7RNA聚合酶的BST‑T7细胞使用辅助质粒和编码仙台病毒cDNA的质粒共转染。由T7启动子控制的质粒于细胞中转录，这以几个步骤产生病毒蛋白质和病毒负链RNA基因组以及导致产生功能性病毒。
接种BSR‑T7细胞(具有6个孔的板，每个孔3x105)，并于37℃培养过夜。为进行转染，将200μl具有FuGENE 6的DMEM置于小瓶中(Fugene 6的量对应于每μg DNA 2μl的比例)，并孵育5分钟。在添加列于表4中的DNA组分后，再在室温下进行25分钟的另一孵育步骤。
表4“补救”分析的DNA组分

用DMEM对BSR‑T7细胞洗两次；接下来提供1.8ml DMEM培养基+2％FCS。在搅拌下逐滴加入孵育的转染混合物，在33℃下将细胞孵育三天。之后，对转染的BSR‑T7细胞洗涤三次，每次用1ml DMEM进行，以除去质粒残余。向各次分析中添加1mL新鲜的DMEM培养基+2％FCS，一天后收获新产生的病毒。
在转移到用于扩增的Vero细胞之前，将含有病毒的上清液于室温下以300rpm离心4分钟。用DMEM将四天前制备(接种：2x 105细胞每3.5cm皿；设定：在感染时大约106细胞每3.5cm皿)的Vero细胞洗涤两次，用100至500μl BSR‑T7上清液(用培养基添加至500μl的吸附体积)于33℃搅拌(每15分钟)下感染1小时。除去接种物，用DMEM洗涤细胞两次，并于33℃下在1ml培养基中孵育2至5天，每天更换培养基。一在荧光显微镜中可检测到作为病毒编码的标志物蛋白的eGPF，就移除培养物上清液。采用该初始病毒代，以更大的规模产生进一步的传代(第二代和第三代)。通过TCID50方法定量病毒后代的滴度。
产生了根据本发明的下述遗传修饰的或重组的仙台病毒：
a)SeV Fmut：具有NDV切割位点的仙台病毒株Fushimi
b)SeV Fmut dV：与a同样，还具有V和W基因中的突变
c)SeV Fmut dC：与a同样，还具有C和C’基因中的突变
d)SeV Fmut dCdY：与a同样，还具有C和C’基因以及Y1和Y2基因中的突变
e)SeV Fmut dCdV：与a同样，还具有C和C’基因以及V和W基因中的突变
f)SeV Fmut dCdYdV：与a同样，还具有C和C’基因、V、W及Y1和Y2基因中的突变
8.重组仙台病毒的表征
在若干种水平上广泛地表征产生的重组仙台病毒。在未转化的Vero生产细胞上和肿瘤细胞上，特别是在肝细胞瘤细胞(Hep3B、HuH7、PLC/PRF/5)上以及在几种非肿瘤细胞(例如各个不同供体的人成纤维细胞系MRC5和原代人肝细胞(PHH))上分析病毒复制。
生长曲线
1.提供500μl中的每12个孔1x105个细胞(供应Vero、肝细胞瘤细胞、MRC5、PHH，也从1x105个细胞开始)
2.使其生长
3.移除培养基，用PBS洗涤1次
4.+250μl Optimem
5.在Optimem中稀释病毒(MOI 0.05)
6.将稀释的病毒加入细胞
7.用全部6个SeV变体进行感染(冷冻过量稀释液，并且滴定作为起始值)
8.于37℃感染1小时
9.洗涤细胞2次(PBS)
10.+1ml新鲜的培养基(DMEM 5％FCS)
11.24、48、72、96小时后(每种情况下，感染开始后)，移除SN中的病毒，并储存于‑80℃下(各200μl)
a.用培养基小心洗涤2次
b.+1000ml培养基(DMEM 5％FCS)，刮除细胞
12.于‑80℃下冷冻裂解物
13.解冻用于滴定
a.37℃水浴2分钟
b.10‑15秒涡旋
c.3000xg下微离心2分钟
13.离心
14.在Vero上滴定(TCID50)
d.制备病毒稀释液(第一总是未稀释的)
e.加入至96孔板(总是调节至4℃的新鲜板)
f.对细胞进行胰蛋白酶处理
g.计数并添加2x104个细胞/96孔
h.3天后评估滴度
图9显示了在Vero生产细胞和肝细胞瘤细胞上的病毒复制。据发现，所有产生的重组病毒在Vero生产细胞中显示出非常好的复制，其具有相当的滴度和107至108TCID50/ml的病毒产率。
以三次独立分析重复病毒颗粒的滴度，显示了平均值和标准差(IO＝接种体)。
在用于肝细胞癌的三种人标准细胞系HuH7、PLC/PRF/5和Hep3B中，已证明所有重组病毒显示出在肿瘤细胞中非常好的复制。因此，根据本发明的重组病毒的相关肿瘤细胞溶解活性的一种决定性前提已经得到满足。
几个不同供体的人成纤维细胞系MRC‑5和原代人肝细胞(PHH)作为非肿瘤细胞被示例性地分析。结果示于图10中。被分析的变体的肿瘤细胞溶解强度与辅助性蛋白中的缺失无关。具有单缺失(SeVV F、mut dC、SeV V Fmut dV)的病毒仅适度地丧失了其在正常细胞中复制的能力，而具有两个或更多个缺失的病毒(SeV Fmut dCdY、SeV Fmut dCdV、SeV Fmut dCdYdV)在肝细胞瘤细胞(即肿瘤细胞)中有效复制并且破坏它们，但在正常细胞中几乎不能观察到感染。
以三次独立分析(对于PHH，具有三个不同的供体)重复病毒颗粒的滴定。显示了平均值和标准差(IO＝接种体)。
在进一步的实验中，分析了病毒体内扩增。
1.在右腹侧，将5x106个HuH7肿瘤细胞皮下植入Balb c nu/nu小鼠中。
2.一旦肿瘤体积达到至少100mm3，向肿瘤中施用100μl PBS中的仙台病毒。
3.病毒注射后2天，处死动物并移出肿瘤。
4.将肿瘤的一部分包埋进组织钉(tissue tack)中，冷冻并通过冷冻切片机进行切割。在荧光显微镜中直接检测病毒表达的GFP。
5.肿瘤的另一部分包埋到石蜡中，且通过特异性抗GFP抗体检测GFP。
结果显示于图11中。可能已经在体内证明，肿瘤细胞被重组病毒SeV Fmut感染，并且病毒能够在其中扩增。该结果证实了：如所希望地，在肺之外的在肿瘤组织中的体内复制是可能的。SeV Fmut病毒能在人肝细胞瘤异种移植物组织(HuH7)中增殖，D52病毒(“Fushimi”野生型变体)在将病毒应用于肿瘤之后保持高度的局部化限制。
9.结论
使用相对野生型而言在其F基因和其P基因中经过遗传修饰的不同重组仙台病毒，发明人能够证明它们可在抗肿瘤疗法中用作肿瘤细胞溶解病毒。
列出了下述序列：
SEQ ID No.1：SeV(病毒株“Ohita”)的F基因的核苷酸序列
SEQ ID No.2：SeV(病毒株“Ohita”)的F蛋白的氨基酸序列
SEQ ID No.3：SeV(病毒株“Ohita”)的P基因的核苷酸序列
SEQ ID No.4：SeV(病毒株“Ohita”)的P蛋白的氨基酸序列
SEQ ID No.5：SeV‑WT蛋白酶切割位点的氨基酸序列
SEQ ID No.6：NDV的F蛋白的蛋白酶切割位点的氨基酸序列
SEQ ID No.7：SeV(病毒株“Ohita”)的C’基因的核苷酸序列
SEQ ID No.8：SeV(病毒株“Ohita”)的C’蛋白的氨基酸序列
SEQ ID No.9：SeV(病毒株“Ohita”)的C基因的核苷酸序列
SEQ ID No.10：SeV(病毒株“Ohita”)的C蛋白的氨基酸序列)
SEQ ID No.11：SeV(病毒株“Hamamatsu”)的V基因的核苷酸序列
SEQ ID No.12：SeV(病毒株“Hamamatsu”)的V蛋白的氨基酸序列
SEQ ID No.13：SeV(病毒株“Cantell”)的W基因的核苷酸序列
SEQ ID No.14：SeV(病毒株“Cantell”)的W蛋白的氨基酸序列
SEQ ID No.15：SeV(病毒株“Ohita”)的Y1基因的核苷酸序列
SEQ ID No.16：SeV(病毒株“Ohita”)的Y1蛋白的氨基酸序列
SEQ ID No.17：SeV(病毒株“52”)的Y2基因的核苷酸序列
SEQ ID No.18：SeV(病毒株“52”)的Y2蛋白的氨基酸序列
SEQ ID No.19：pSL1180的克隆区域的核苷酸序列
SEQ ID No.20：PCR引物1的核苷酸序列
SEQ ID No.21：P基因核苷酸序列
SEQ ID No.22：P基因mut.核苷酸序列
SEQ ID No.23：C基因mut.核苷酸序列
SEQ ID No.24：PCR引物2核苷酸序列
SEQ ID No.25：P基因核苷酸序列
SEQ ID No.26：Y1基因核苷酸序列
SEQ ID No.27：Y1基因mut.核苷酸序列
SEQ ID No.28：PCR引物3核苷酸序列
SEQ ID No.29：P基因核苷酸序列
SEQ ID No.30：P基因mut.核苷酸序列
SEQ ID No.31：V基因mut.核苷酸序列
SEQ ID No.32：W基因mut.核苷酸序列
SEQ ID No.33：SeV的F基因中的切割位点的核苷酸序列
SEQ ID No.34：NDV的F基因中的切割位点的核苷酸序列