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抗 - 淋巴细胞毒素抗体
    相关申请
     本专利申请要求于 2008 年 12 月 31 日提交的题为 “抗 - 淋巴细胞毒素抗体” 的第 61/142,182 号美国临时专利申请的优先权。 上述引用的临时专利申请的全部内容通过引用 并入本文。
     背景技术
     淋巴细胞毒素 (LT) 是涉及 TNF 的细胞因子， 并且其以分泌和膜结合形式发现于人 系统中。分泌形式是单蛋白 LT-α 的三聚体， 而 LT 的表面形式是两种相关分子 LT-α 和 LT-β 的络合物。主要形式是具有组成 α1β2 的异源三聚体， 然而， α2β1 异源三聚体也 存在。 同源三聚体的仅有已知的细胞表面受体是两种 TNF 受体， p55， p75 和 HVEM。相 反， LTα1β2 异源三聚体不结合这些 TNF 受体， 而是结合 LTβ 受体 (LTβR)。LT 与 LTβR 的结合在淋巴管生成和炎症中发挥重要作用。有效和特异性地阻断 LT 与 LTβR 的结合的 抗体的开发在患者中调节 LTβR- 介导的应答方面是非常有益的。
     发明概述
     LTα1β2 是 TNF 配体家族的独特成员， 因为其是两种不同链 LTα 和 LTβ 的异源 三聚体， 而不是其他 LT 家族成员发现的单链的同源三聚体。该家族分子的受体发现结合在 三聚体链之间的裂口中， 如果配体是同源三聚体， 所有三个裂口是相同的， 并且结合在裂口 中的单一抗体预计将同时阻断所有三个结合位点。相反， LTα1β2 异源三聚体展现出三种 不同裂口 ( 其可表示为 β-β， β-α 和 α-β)， 并且直到本发明， 并未清楚单一抗体可结合 异源三聚体并且有效地阻断受体结合的所有位点， 从而完全阻断生物活性。 值得注意的是， 本发明的抗体不结合 LTα3( 或结合 LTα3， 但和阻断 TNFα 受体结合的方式不同 ) 并且和 现有技术的抗 -LTα1β2 抗体相比具有改善的功能。
     例如， 在一个实施方案中， 本发明的抗体和现有技术的抗体 ( 如本文中使用的， 术 语 LT 是指 除非另有说明 ) 相比， 更有效地阻断 LT 与 LTβR 的结合和 / 或通过 诱导的细胞因子产生。 在另外的实施方案中， 这些抗体导致阻 诱导的细 LTβR 更有效地阻断 LT- 信号传导的一种或多种生物效果。例如， 在一个实施方案中， 这些 抗体导致阻断大于 70％的 断大于 80％的 诱导的细胞因子产生。 在一个实施方案中， 这些抗体导致阻断大于 90％的诱导的细胞因子产生。在一个实施方案中， 这些抗体导致阻断大于 95％的胞因子产生。在另外的实施方案中， 这种抗体抑制 LT 结合和 / 或 LT- 诱导的细胞因子产生 的 IC50 小于约 0.05ug/ml。在一个实施方案中， 这种抗体抑制 LT 结合和 / 或 LT- 诱导的细 胞因子产生的 IC50 小于约 100nM。在一个实施方案中， 这种抗体抑制 LT 结合和 / 或 LT- 诱 导的细胞因子产生的 IC50 小于约 30nM。在一个实施方案中， 这种抗体抑制 LT 结合和 / 或 LT- 诱导的细胞因子产生的 IC50 小于约 10nM。在一个实施方案中， 这种抗体抑制 LT 结合 和 / 或 LT- 诱导的细胞因子产生的 IC50 小于约 3nM。一组这种抗体已经被开发并且这些抗 体中的一些结合的抗原表位已经被映射。在优选的实施方案中， 本发明的抗体还结合非人 灵长类例如短尾猴的 LT 的抗原表位。还已经阐述这些抗体的可变区的结构。该组抗体的CDR( 例如 Chothia 或 KabatCDR) 可用于产生结合 LT 并阻断 LT- 诱导的信号传导的结合分 子 ( 例如人源化抗体， 修饰的抗体， 单链结合分子 )。因此， 本发明涉及结合分子， 包含特异 于 LT 的一个或多个结合位点 ( 例如可变重链区和可变轻链区 )， 其阻断 LT 与 LTβR 的结 合， 并且当和现有技术的抗体比较时具有改善的功能性能。
     在一个方面中， 本发明涉及一种分离的结合分子或包含其抗原结合区域的分子， 其在这样的条件下在细胞中结合淋巴细胞毒素 (LT) 并且使 LT- 诱导的生物活性阻断至少 约 70％， 在该条件下参照抗体 B9( 由以登录号 HB11962 保藏在 ATCC 的细胞系 B9.C9.1 产 生 ) 在细胞中使所述 LT- 诱导的生物活性阻断约 50％。
     在另外的方面中， 本发明涉及一种分离的结合分子或包含其抗原结合区域的分 子， 其在细胞中以 IC50 小于 100nM 结合淋巴细胞毒素 (LT) 并且使 LT- 诱导的生物活性阻 断。
     在另外的方面中， 本发明涉及一种分离的结合分子或包含其抗原结合区域的分 子， 其结合淋巴细胞毒素 (LT) 并且使 LTβR-Ig 与细胞的结合阻断至少 85％。
     在另外的方面中， 本发明涉及分离的结合分子或包含其抗原结合区域的分子， 其 中 LT- 诱导的生物活性是 IL-8 释放。 在一个实施方案中， 结合分子包含人氨基酸序列。
     在一个实施方案中， 结合分子包含其抗原结合区域， 包含人氨基酸序列， 所述人氨 基酸序列包含抗体恒定区序列或其片段。
     在一个实施方案中， 本发明涉及结合分子， 其中人恒定区是已经改变以降低与至 少一种 Fc 受体结合的 IgG1 恒定区。
     在一个实施方案中， 本发明涉及结合分子， 其中人恒定区是已经改变以增强与至 少一种 Fc 受体结合的 IgG1 恒定区。
     在一个实施方案中， 本发明涉及结合分子， 其是人源化的。
     在一个实施方案中， LT- 诱导的生物活性被阻断至少约 80％。在一个实施方案中， LT- 诱导的生物活性被阻断至少约 90％。在一个实施方案中， LTBR-Ig- 结合被阻断至少约 90％。
     在一个实施方案中， 结合分子或包含其抗原结合区域的分子在细胞中以 IC50 小 于 30nM 使 LT- 诱导的生物活性阻断。
     在一个实施方案中， 结合分子或包含其抗原结合区域的分子在细胞中以 IC50 小 于 10nM 使 LT- 诱导的生物活性阻断。
     在另外的实施方案中， 本发明的结合分子或包含其抗原结合区域的分子在细胞中 以 IC50 小于 3nM 使 LT- 诱导的生物活性阻断。
     在一个实施方案中， 结合分子结合 LT 上两个位点从而未残留用于 LTβR 结合的位 点。
     在一个实施方案中， 结合分子是全长抗体。在一个实施方案中， 结合分子是 scFv 分子。
     在另外的实施方案中， 本发明涉及特异性结合 LT 的抗原表位的结合分子， 其中所 述抗体与所述 LT 抗原表位的结合以剂量依赖性方式被 102 抗体竞争性阻断。
     在一个实施方案中， LTβ 的氨基酸 193 和 194 对于抗体结合是关键的。
     在另外的实施方案中， 本发明涉及特异性结合 LT 的抗原表位的结合分子， 其中所 述抗体与所述 LT 抗原表位的结合以剂量依赖性方式被 AOD9 抗体竞争性阻断。
     在另外的实施方案中， 本发明涉及特异性结合 LT 的抗原表位的结合分子， 其中所 述抗体与所述 LT 抗原表位的结合以剂量依赖性方式被 101/103 抗体竞争性阻断。
     在另外的实施方案中， 本发明涉及特异性结合 LT 的抗原表位的结合分子， 其中所 述抗体与所述 LT 抗原表位的结合以剂量依赖性方式被 105 抗体竞争性阻断。
     在一个实施方案中， LTβ 的氨基酸 96， 97， 98， 106， 107 和 108 对于抗体结合是关 键的。
     在另外的实施方案中， 本发明涉及特异性结合 LT 的抗原表位的结合分子， 其中所 述抗体与所述 LT 抗原表位的结合以剂量依赖性方式被 9B4 抗体竞争性阻断。
     在一个实施方案中， LTβ 的氨基酸 96， 97 和 98 对于抗体结合是关键的。
     在另外的实施方案中， 本发明涉及特异性结合 LT 的抗原表位的结合分子， 其中所 述抗体与所述 LT 抗原表位的结合以剂量依赖性方式被 A1D5 抗体竞争性阻断。
     在一个实施方案中， LTβ 的氨基酸 172 对于抗体结合是关键的。
     在另外的实施方案中， 本发明涉及特异性结合 LT 的抗原表位的结合分子， 其中所 述抗体与所述 LT 抗原表位的结合以剂量依赖性方式被 107 抗体竞争性阻断。 在另外的实施方案中， 本发明涉及特异性结合 LT 的抗原表位的结合分子， LTβ 的 氨基酸 151 和 153 对于抗体结合是关键的。
     在一个实施方案中， 本发明涉及特异性结合 LT 的抗原表位的分离的抗体， 其中所 述抗体与所述 LT 抗原表位的结合以剂量依赖性方式被 108 抗体竞争性阻断。
     在一个实施方案中， 结合分子包含人氨基酸序列。
     在一个实施方案中， 人氨基酸序列是抗体恒定区序列。
     在一个实施方案中， 抗体是人源化的。
     在另外的方面中， 本发明涉及一种包含重链可变区和轻链可变区的淋巴细胞毒素 结合分子， 所述重链可变区包含重链 CDR CDRH1、 CDRH2 和 CDRH3， 所述轻链可变区包含轻链 CDR CDRL1、 CDRL2 和 CDRL3， 其中所述轻链和重链 CDR 衍生自选自 AOD9， 108， 107， A1D5， 102， 101/103， 9B4 和 105 的抗体。
     在另外的方面中， 本发明涉及包含重链可变区和轻链可变区的淋巴细胞毒素结合 分子， 所述重链可变区包含重链 CDR CDRH1、 CDRH2 和 CDRH3， 所述轻链可变区包含轻链 CDR CDRL1、 CDRL2 和 CDRL3， 其中 CDR 衍生自所述 AOD9 抗体。
     在另外的方面中， 本发明涉及包含重链可变区和轻链可变区的淋巴细胞毒素结合 分子， 所述重链可变区包含重链 CDR CDRH1、 CDRH2 和 CDRH3， 所述轻链可变区包含轻链 CDR CDRL1、 CDRL2 和 CDRL3， 其中 CDR 衍生自 108 抗体。
     在另外的方面中， 本发明涉及包含重链可变区和轻链可变区的淋巴细胞毒素结合 分子， 所述重链可变区包含重链 CDR CDRH1、 CDRH2 和 CDRH3， 所述轻链可变区包含轻链 CDR CDRL1、 CDRL2 和 CDRL3， 其中 CDR 衍生自 107 抗体。
     在另外的方面中， 本发明涉及包含重链可变区和轻链可变区的淋巴细胞毒素结合 分子， 所述重链可变区包含重链 CDR CDRH1、 CDRH2 和 CDRH3， 所述轻链可变区包含轻链 CDR CDRL1、 CDRL2 和 CDRL3， 其中 CDR 衍生自 A1D5 抗体。
     在另外的方面中， 本发明涉及包含重链可变区和轻链可变区的淋巴细胞毒素结合 分子， 所述重链可变区包含重链 CDR CDRH1、 CDRH2 和 CDRH3， 所述轻链可变区包含轻链 CDR CDRL1、 CDRL2 和 CDRL3， 其中 CDR 衍生自 102 抗体。
     在另外的方面中， 本发明涉及包含重链可变区和轻链可变区的淋巴细胞毒素结合 分子， 所述重链可变区包含重链 CDR CDRH1、 CDRH2 和 CDRH3， 所述轻链可变区包含轻链 CDR CDRL1、 CDRL2 和 CDRL3， 其中 CDR 衍生自 101/103 抗体。
     在另外的方面中， 本发明涉及包含重链可变区和轻链可变区的淋巴细胞毒素结合 分子， 所述重链可变区包含重链 CDR CDRH1、 CDRH2 和 CDRH3， 所述轻链可变区包含轻链 CDR CDRL1、 CDRL2 和 CDRL3， 其中 CDR 衍生自 105 抗体。
     在另外的方面中， 本发明涉及包含重链可变区和轻链可变区的淋巴细胞毒素结合 分子， 所述重链可变区包含重链 CDR CDRH1、 CDRH2 和 CDRH3， 所述轻链可变区包含轻链 CDR CDRL1、 CDRL2 和 CDRL3， 其中 CDR 衍生自 9B4 抗体。
     在另外的方面中， 本发明涉及包含重链可变区和轻链可变区的淋巴细胞毒素结合 分子， 所述重链可变区包含重链 CDR CDRH1、 CDRH2 和 CDRH3， 所述轻链可变区包含轻链 CDR CDRL1、 CDRL2 和 CDRL3， 其中 CDRH1 包含序列 GFSLX1X2Y/SGX3H 其中 X 是任意氨基酸。
     在另外的方面中， 本发明涉及包含重链可变区和轻链可变区的淋巴细胞毒素结合 分子， 所述重链可变区包含重链 CDR CDRH1、 CDRH2 和 CDRH3， 所述轻链可变区包含轻链 CDR CDRL1、 CDRL2 和 CDRL3， 其中 CDRH2 包含序列 VIWX1GGX2TX3X4NAX5FX6S 其中 X 是任意氨基酸。
     在另外的方面中， 本发明涉及包含轻链可变区和轻链可变区的淋巴细胞毒素结合 分子， 所述重链可变区包含重链 CDR CDRH1、 CDRH2 和 CDRH3， 所述轻链可变区包含轻链 CDR CDRL1、 CDRL2 和 CDRL3， 其中 CDRL1 包含序列 RASX1SVX2X3X4X5 或 X1ASQDX2X3X4X5LX6 其中 X 是 任意氨基酸。
     在另外的方面中， 本发明涉及包含轻链可变区和轻链可变区的淋巴细胞毒素结合 分子， 所述重链可变区包含重链 CDR CDRH1、 CDRH2 和 CDRH3， 所述轻链可变区包含轻链 CDR CDRL1、 CDRL2 和 CDRL3， 其中 CDRL2 包含序列 RAX1RLX2D 其中 X 是任意氨基酸。
     在另外的方面中， 本发明涉及包含轻链可变区和轻链可变区的淋巴细胞毒素结合 分子， 所述重链可变区包含重链 CDR CDRH1、 CDRH2 和 CDRH3， 所述轻链可变区包含轻链 CDR CDRL1、 CDRL2 和 CDRL3， 其中 CDRL2 包含序列 X1X2SX3X4X5S 其中 X 是任意氨基酸。
     在另外的方面中， 本发明涉及包含轻链可变区和轻链可变区的淋巴细胞毒素结合 分子， 所述重链可变区包含重链 CDR CDRH1、 CDRH2 和 CDRH3， 所述轻链可变区包含轻链 CDR CDRL1、 CDRL2 和 CDRL3， 其中 CDRL3 包含序列 X1QX2X3X4X5PX6T 其中 X 是任意氨基酸。
     在另外的方面中， 本发明涉及包含轻链可变区和轻链可变区的淋巴细胞毒素结合 分子， 所述重链可变区包含重链 CDR CDRH1、 CDRH2 和 CDRH3， 所述轻链可变区包含轻链 CDR CDRL1、 CDRL2 和 CDRL3， 其中 CDRL3 包含序列 LX1X2DX4FPX6T 其中 X 是任意氨基酸。
     在另外的方面中， 本发明涉及包含轻链可变区和轻链可变区的淋巴细胞毒素结合 分子， 所述重链可变区包含 105 抗体变体的重链 CDR CDRH1、 CDRH2 和 CDRH3， 所述轻链可变 区包含 105 变体的轻链 CDR CDRL1、 CDRL2 和 CDRL3。
     在一个实施方案中， 本发明涉及结合分子， 其溶解度大于 100 或 120mg/ml。
     在一个实施方案中， 结合分子包含 105 变体版本 L10 的轻链可变区。在一个实施方案中， 结合分子包含 105 变体版本 H1 的重链可变区。
     在一个实施方案中， 结合分子包含 105 变体版本 H1 的重链可变区或其 CDR 和 105 变体 L10 的轻链可变区或其 CDR。
     在一个实施方案中， 本发明涉及组合物， 包含本发明的结合分子和载体。
     在一个实施方案中， 本发明涉及一种治疗受试者的方法， 所述受试者将受益于使 用抗 -LT 结合分子的治疗， 包括向所述受试者施用所述分子， 使得所得进行所述治疗。
     在一个实施方案中， 所述受试者患有由炎症表征的疾患。
     在一个实施方案中， 炎性疾患选自 ： 风湿性关节炎， 多发性硬化， 克罗恩病， 溃疡性 结肠炎， 移植， 狼疮， 炎症性肝病， 牛皮癣， 干燥综合征， 多发性硬化 ( 例如 SPMS)， 病毒诱导 的肝炎， 自身免疫性肝炎， I 型糖尿病， 动脉硬化症和病毒休克综合征。
     在一个实施方案中， 炎性疾患是风湿性关节炎。
     在一个实施方案中， 受试者患有癌症。 在一个实施方案中， 癌症选自多发性骨髓瘤 和顽性滤泡性淋巴瘤。
     在一个方面中， 本发明涉及编码本发明的结合分子的核酸分子。在一个实施方案 中， 核酸分子在载体中。 在一个实施方案中， 本发明涉及宿主细胞， 包含所述载体。
     在一个实施方案中， 本发明涉及制备抗体或结合分子的方法， 包括 ： (i) 培养权利 要求 66 所述的宿主细胞， 使得所述抗体或结合分子在宿主细胞培养基中分泌 ； (ii) 将所述 抗体或结合分子从所述培养基分离。
     在另外的方面中， 本发明涉及包含本发明的结合分子的组合物在制备药物中的用 途。
     在另外的实施方案中， 所述药物用于治疗和炎症有关的疾患。
     附图简要说明
     图 1A、 1B 和 1C 示出使用用于抗 -LT 抗体的 IL-8 释放测定的抑制曲线。 在组 A 中， 空心菱形表示 102 抗体， 空心方形表示 105 抗体， 实心三角形表示 A0D9 抗体， 空心三角形表 示 B9 抗体， 实心圆形表示 C37 抗体， 以及空心圆形表示 B27 抗体。在组 B 中， 实心圆形表示 105 抗体以及空心三角形表示 107 抗体。组 C 表示 9B4 抗体的抑制曲线。
     图 2A-2G 提供柱状图结果， 其示出注射 MOPC-21( 鼠 IgG1 抗体用作同种型对照 ) 的 嵌 合 (huSCID) 小 鼠 的 MOMA-1+ 巨 噬 细 胞 的 状 态 ： 图 2B)， mLTBR-mIgG1( 图 2C)， 抗体 BBF6(mIgG1)( 图 2D) ； 抗体 B9(mIgG1)( 图 2E) ； 抗体 LT102( 图 2F)， 抗体 LT105( 图 2G)。 野 生型 C57BL/6 切片也示于图 2A。
     图 3A-3G 提供柱状图结果， 其示出人 LTα1β2 的阻断的 HEV 的减少。MOPC-21( 鼠 IgG1 抗体用作同种型对照 ) ： 图 3B)， mLTBR-mIgG1( 图 3C)， 抗体 BBF6(mIgG1)( 图 3D) ； 抗 体 B9(mIgG1)( 图 3E) ； 抗体 LT102( 图 3F)， 抗体 LT105( 图 3G)。野生型 C57BL/6 切片也示 于图 3A。
     图 4 组 A 提供图， 其示出抗体 LT102 和 LT105 在其中测量 LTβRIg( 或 Fc) 与表达 LT 的细胞的阻断的阻断测定中表现出优异的效力。在组 A 中实心方形表示 LTβR-Ig， 空心 圆形表示 102 抗体， 空心方形表示 105 抗体， 空心三角形表示 B9 抗体， 空心菱形表示 C37 抗 体并且实心圆形表示 B27 抗体。组 B 显示出抗体 9B4 的 LTβRIg( 或 Fc) 的阻断的类似的
     优异的效力。
     图 5 提供 LTβRIg 阻断测定 ( 如图 4 中 ) 的数据， 其示出抗体 102( 空心三角形 )， 105( 实心圆形 )， A1D5( 空心菱形 )， 107( 实心三角形 )， A0D9b( 空心圆形 ) 和 103( 实心菱 形 ) 都比 B9( 空心多边形 )B27( 空心反向三角 ) 和 C37( 空心方形 ) 更有效地阻断。LTbR 显示为实心方形。
     图 6 示出 LTα1β2 异源三聚体的图， 包括三个不同裂口 (αβ， βα 和 ββ)， 包 括两个 B 亚基和单一 A 亚基。
     发明详述
     I. 定义
     应当注意术语 “一个” 或 “一种” 实体指一个或多个该种实体 ； 例如， “一种 LT 结合 分子” 应理解为代表一个或多个 LT 结合分子 ( 如本文中使用的， 术语 LT 是指 LTα1β2， 除 非另有说明 )。因此， 术语 “一个” (或 “一种” )， “一个或多个” 以及 “至少一个” 在本文中 可进行互换。
     本文中所用的术语 “多肽” 意欲同时包括了单数和复数的 “多肽” ， 并指由酰胺键 ( 也称作肽键 ) 线性连接的单体 ( 氨基酸 ) 所构成的一种分子。术语 “多肽” 指两个或多 个氨基酸的任何链， 且不指定产物的具体长度。因此， 肽、 二肽、 三肽、 寡肽、 “蛋白” 、 “氨基 酸链” 或任何其他用来指代两个或多个氨基酸链的术语都包含在 “多肽” 的定义之内， 且术 语 “多肽” 可用来取代任何上述术语或与之互换。术语 “多肽” 还意欲指多肽表达后修饰的 产物， 包括但不限于糖基化， 乙酰化， 磷酸化， 酰胺化， 通过已知的保护 / 阻断基团进行衍生 化， 蛋白水解裂解， 或通过非天然存在的氨基酸进行修饰。 多肽可衍生自天然的生物来源或 通过重组技术生产， 但不一定需要转译自指定的核酸序列。 它可通过任何方式生成， 包括化 学合成。 本发明的多肽包含特异于本文更详细描述的 LT 的至少一个结合位点。因此， 本多 肽在本文也称为 “结合分子” 。在一个实施方案中， 本发明的结合分子是抗 -LT 抗体或修饰 的抗体。
     在一个实施方案中， 本发明的多肽是分离的。 “分离的” 多肽或其片段， 变体或衍 生物指一种不存在于其天然环境中的多肽。在一个实施方案中， 不要求达到特定的纯化水 平。例如， 一种分离的多肽可取自其自然的或天然的环境中。在宿主细胞中表达的重组生 产的多肽和蛋白被认为对于本发明的目的而言是分离的， 因为它们是通过任何合适的技术 分离、 分割、 或者部分或充分纯化的天然或重组多肽。
     本文中所用的术语 “衍生自” 指定蛋白是指多肽的来源。在一个实施方案中， 衍生 自特定起始多肽的多肽或氨基酸序列是可变区序列 ( 例如 VH 和 / 或 VL) 或其相关序列 ( 例 如 CDR 或衍生自其的框架区 )。 在一个实施方案中， 衍生自特定起始多肽的氨基酸序列不是 连续的。例如， 在一个实施方案中， 一个、 二个、 三个、 四个、 五个或六个 CDR( 例如 Chothia 或 Kabat CDR) 衍生自本发明的结合分子中使用的起始抗 -LT 抗体。在一个实施方案中， 衍 生自特定起始多肽或氨基酸序列的多肽或氨基酸序列所具有的氨基酸序列和所述起始序 列或其部分基本上一致， 其中所述部分由下列构成 ： 至少 3-5 氨基酸、 5-10 个氨基酸、 至少 10-20 个氨基酸、 至少 20-30 个氨基酸、 或至少 30-50 个氨基酸、 或本领域普通技术人员鉴别 为具有在起始序列中的来源的。
     本发明的多肽还包括前述多肽的片段、 衍生物、 类似物或变体及其任意组合。术 语 “片段” 、 “变体” 、 “衍生物” 和 “类似物” 在涉及本发明的结合分子时包括任何至少保留了 一些相应分子的结合性能的多肽。除在本发明其他地方讨论的特定抗体片段之外， 本发明 的多肽片段包括蛋白水解片段以及缺失片段。 本发明的结合分子的变体包括如上所述的片 段， 还包括具有由氨基酸替换、 缺失或插入所得的变更氨基酸序列的多肽。 变体可以是天然 存在的或是非天然存在的。非天然存在的变体可通过本领域已知的突变技术进行制备。变 体多肽可包含保守或非保守氨基酸替换、 缺失或添加。 因此， 多肽中的氨基酸残基可被来自 相同侧链家族的另外氨基酸残基取代。在另外的实施方案中， 氨基酸链可被侧链家族成员 的顺序和 / 或组成不同的结构上类似的链取代。或者， 在另外的实施方案中， 可对多肽的全 部或部分随机引入突变。
     在一个实施方案中， 本发明的多肽是抗体分子或修饰的抗体分子， 包含含有六种 CDR 的至少一种抗 -LT 抗体结合位点 ( 即， 衍生自结合 LT 的抗体的三种轻链 CDR 和衍生自 结合 LT 的相同或不同抗体的三种重链 CDR)。 在一个实施方案中， 本发明的结合分子包含一 个结合位点， 包含衍生自结合 LT 的抗体的轻链可变区和衍生自结合 LT 的抗体的重链可变 区。在一个实施方案中， 本发明的结合分子包含至少两个结合位点。在一个实施方案中， 结 合分子包含两个结合位点。在一个实施方案中， 结合分子包含多于两个的结合位点。在一 个实施方案中， 本发明涉及这些分离的 LT 结合分子或编码它们的核酸分子。 在一个实施方案中， 本发明的结合分子是单体。 在另外的实施方案中， 本发明的结 合分子是多聚体。例如， 在一个实施方案中， 本发明的结合分子是二聚体。在一个实施方案 中， 本发明的二聚体是同源二聚体， 包含两个相同的单体亚基。在另外的实施方案中， 本发 明的二聚体是异源二聚体， 包含两个不同的单体亚基。二聚体的亚基可包含一种或多种多 肽链。 例如， 在一个实施方案中， 二聚体包含至少两个多肽链。 在一个实施方案中， 二聚体包 含两个多肽链。在另外的实施方案中， 二聚体包含四个多肽链 ( 例如抗体分子中的情况 )。
     在一个实施方案中， 本发明的结合分子是单价的， 即包含一个 LT 靶结合位点 ( 例 如 scFv 分子中的情况 )。 在一个实施方案中， 本发明的结合分子是多价的， 即包含多于一个 的靶结合位点。在另外的实施方案中， 结合分子包含至少两个结合位点。在一个实施方案 中， 结合分子包含两个结合位点 ( 例如抗体的情况中 )。在一个实施方案中， 结合分子包含 三个结合位点。在另外的实施方案中， 结合分子包含四个结合位点。在另外的实施方案中， 结合分子包含多于四个结合位点。
     本文中所用的术语 “化合价” 指结合分子中的潜在结合位点的数量。 结合分子可以 是 “单价的” 并且具有单一结合位点， 或者结合分子可以是 “多价的” ( 例如二价、 三价、 四价 或更多价 )。各结合位点特异性结合一个靶分子或靶分子上的特定位点 ( 例如抗原表位 )。 当结合分子包含多于一个靶结合位点 ( 即多价的结合分子 ) 时， 各靶结合位点可特异性结 合相同或不同分子 ( 例如可结合不同 LT 分子或结合相同分子上的不同抗原表位 )。
     如本文中使用的术语 “结合部分” 、 “结合位点” 或 “结合结构域” 是指特异性结合 LT 的抗体可变区的部分。 在一个实施方案中， 结合位点包含衍生自结合 LT 的抗体的三种轻 链 CDR 和衍生自结合 LT 的抗体的三种重链 CDR。
     术语 “结合特异性” 或 “特异性” 是指结合分子特异性结合给定靶分子或抗原表位 ( 例如免疫反应 ) 的能力。 在某些实施方案中， 本发明的结合分子包含两种或多种结合特异
     性 ( 即， 它们同时结合一种或多种不同抗原上存在的两种或多种不同抗原表位 )。 结合分子 可以是 “单特异性的” 并且具有单一结合特异性， 结合分子可以是 “多特异性的” ( 例如双特 异性或三特异性或更多的多特异性的 ) 并且具有两种或多种结合特异性。在示例性实施方 案中， 本发明的结合分子是 “双特异性” 并且包含两种结合特异性。因此， 无论 LT 结合分子 是 “单特异性的” 还是 “多特异性的” 例如 “双特异性” ， 是指结合分子反应的不同抗原表位 的数量。在示例性实施方案中， 本发明的多特异性结合分子可对于一种或多种 LT 分子上的 不同抗原表位是特异性的。 本发明的给定结合分子就特定结合特异性而言可以是单价或多 价的。
     本文中披露的结合分子可通过抗原的抗原表位或部分 ( 例如可被它们识别或特 异结合的 LT 靶多肽 ) 进行描述或说明。靶多肽中与结合分子的结合位点或部分特异性相 互作用的部分为″抗原表位″或″抗原决定簇″。 根据抗原的大小、 构型和类型， 靶多肽可 能包含单个抗原表位， 但通常包含至少两个抗原表位， 并可能包含任意数量的抗原表位。 另 外， 应当注意靶多肽上的 “抗原表位” 可以是非多肽元件或包括非多肽元件， 例如， “抗原表 位” 可包括碳水化合物侧链。抗体的肽或多肽抗原表位的最小大小约为 4-5 个氨基酸。肽 或多肽抗原表位优选包含至少七个氨基酸， 更优选至少包含九个氨基酸， 最优选包含约 15 至约 30 个氨基酸。由于 CDR 可在其三级形态识别抗原性肽或多肽， 因此包含抗原表位的氨 基酸不需要连续的， 并且在某些情况下， 甚至可能不在同一肽链上。在本发明中， 由本发明 的抗 -LT 抗体识别的肽或多肽抗原表位包含 LT 的至少 4 个、 至少 5 个、 至少 6 个、 至少 7 个、 更优选至少 8 个、 至少 9 个、 至少 10、 至少 15 个、 至少 20 个、 至少 25 个、 或是约 15 至约 30 个连续或非连续的氨基酸的序列。在一个实施方案中， 本发明的结合分子双价结合 LT 异源 三聚体。在一个实施方案中， 本发明的结合分子结合 LT 异源三聚体， 使得 LTβR 配体与异 源三聚体的结合被阻断， 例如使得不保留 LTβR 配体的结合位点。
     “特异性结合” 通常指结合分子通过结合分子的结合位点 ( 例如抗原结合结构域 ) 与抗原表位结合， 且该种结合需要结合位点和抗原表位之间的一些补体。 根据该定义， 当结 合分子通过结合位点与抗原表位的结合比它与任意不相关的抗原表位的结合更为容易时， 则称该结合分子据称 “特异性结合” 该抗原表位。如果结合分子是多特异性的， 结合分子可 通过结合分子的另外结合位点 ( 例如抗原结合结构域 ) 特异性结合第二抗原表位 ( 即和第 一抗原表位不相关 )。
     “优先结合” 指结合分子通过结合位点与抗原表位的特异性结合比它与相关的、 相 似的、 同源的或是类似的抗原表位的结合更为容易。因此， 与给定抗原表位 “优先结合” 的 抗体与该抗原表位的结合比与相关的抗原表位更为容易， 即使该种结合分子可能与该相关 抗原表位交叉反应。
     本文中所用的术语 “交叉反应性” 指对某种抗原特异的结合分子或抗体与第二抗 原反应的能力， 并且是两种不同的抗原性物质之间相关性的衡量。 因此， 当抗体能与未包含 在其构成中的抗原表位结合时该抗体具有交叉反应性。 交叉反应性抗原表位通常含有与诱 导抗原表位相同的多个互补结构特征。
     例如， 某些结合分子具有一定程度的交叉反应性， 因此它们可以结合相关但并不 相同的抗原表位， 例如， 与参考抗原表位具有至少 95％、 至少 90％、 至少 85％、 至少 80％、 至 少 75％、 至少 70％、 至少 65％、 至少 60％、 至少 55％、 和至少 50％的一致性 ( 通过本领域已知的并在此处描述的方法进行计算 ) 的抗原表位。如果抗体不结合与参考抗原表位具有小 于 95％、 小于 90％、 小于 85％、 小于 80％、 小于 75％、 小于 70％、 小于 65％、 小于 60％、 小于 55％和小于 50％的一致性 ( 通过本领域已知的并在此处描述的方法进行计算 ) 的抗原表 位， 则认为该抗体不具有或具有极小的交叉反应性。如果抗体不与某种抗原表位的任何其 他类似物、 直系同源物或同源物相结合， 则可认为该抗体对该抗原表位具有 “高度特异性” 。
     本文中所用的术语 “亲和性” 指个体抗原表位与结合分子的结合位点结合强度的 量度。 例如参见 Harlow et al.， Antibodies ： A Laboratory Manual， (Cold Spring Harbor Laboratory Press， 2nd ed.1988)， 页码 27-28。优选结合亲和性包括解离常数或 Kd 小 于 t 的那些。在一个实施方案中， 本发明的结合分子以亲和性小于下列数值而特异性结合 -2 -2 -3 -3 LT ： 5x10 M， 10 M， 5x10 M， 10 M， 5x10-4M， 10-4M， 5x10-5M， 10-5M， 5x10-6M， 10-6M， 5x10-7M， 10-7M， 5x10 -8M ， 10 -8M ， 5x10 -9M ， 10 -9M ， 5x10 -10M ， 10 -10M ， 5x10 -11M ， 10 -11M ， 5x10 -12M ， 10 -12M ， 5x10 -13M ， 10-13M， 5x10-14M， 10-14M， 5x10-15M 或 10-15M。在一个实施方案中， 本发明的结合分子以亲和性 -9 小于 100x10 结合 LT 异源三聚体上的高亲和性位点。
     本文中所用的术语 “亲和力” 指一组结合分子 ( 例如抗体 ) 和抗原的复合物的整 体稳定性， 即结合分子混合物与抗原的功能性结合强度。例如参见 Harlow， 第 29-34 页。亲 和力既与该组中的个体结合分子与特定抗原表位的亲和性相关， 也与该结合分子和该抗原 的效价相关。例如， 二价单克隆抗体与聚合体等具有高度重复表位结构的抗原的相互作用 将具有较高的亲和力。
     如本文中使用的术语 “效力” 是指结合分子的浓度， 其被发现在特定测定中产生某 些水平的效果。例如， 在一个实施方案中， 本发明的结合分子使 LTβR 的生物活性阻断至少 约 70％， 至少 80％或至少 90％ ； 使 LTbR 结合阻断至少 80％， 至少 90％， 至少 95％， 和/或 以 IC50 小于 500nM， 小于 100nM， 小于 30nM， 小于 10nM， 小于 3nM 在细胞中阻断 LT- 诱导的 生物活性。
     本发明的结合分子的结合位点包含抗体分子的抗原结合位点。 抗原结合位点由从 一种多肽变化至另一种多肽的可变区形成。在一个实施方案中， 本发明的多肽包含至少两 种抗原结合位点。如本文中使用的术语 “抗原结合位点” 包括特异性结合 ( 免疫反应 ) 抗 原 ( 例如抗原的细胞表面或可溶形式 ) 的位点。抗原结合位点包括包括免疫球蛋白重链和 轻链可变区， 并且由这些可变区形成的结合位点决定抗体的特异性。 在一个实施方案中， 本 发明的抗原结合位点包含抗 -LT 抗体分子的至少一种重链或轻链 CDR。在另外的实施方案 中， 本发明的抗原结合位点包含一种或多种抗 -LT 抗体分子的至少两种 CDR。在另外的实 施方案中， 本发明的抗原结合位点包含一种或多种抗 -LT 抗体分子的至少三种 CDR。在另 外的实施方案中， 本发明的抗原结合位点包含一种或多种抗 -LT 抗体分子的至少四种 CDR。 在另外的实施方案中， 本发明的抗原结合位点包含一种或多种抗 -LT 抗体分子的至少五种 CDR。在另外的实施方案中， 本发明的抗原结合位点包含结合 LT 的一种或多种抗体分子的 至少六种 CDR( 三种重链和三种轻链 )。
     本发明的优选结合分子包含衍生自人氨基酸序列的框架和 / 或恒定区氨基酸序 列。然而， 结合多肽可包含衍生自其他哺乳动物物种的框架和 / 或恒定区序列。例如， 包含 鼠序列的结合分子对于某些应用可是合适的。在一个实施方案中， 灵长动物框架区 ( 例如 非人灵长动物 )、 重链部分和 / 或铰链部分可包括在本发明的结合分子中。在一个实施方案中， 一种或多种非人 ( 例如鼠 ) 氨基酸可存在于结合多肽的框架区， 例如人或非人灵长动 物框架氨基酸序列可包含一种或多种氨基酸回复突变， 其中对应鼠氨基酸残基存在和 / 或 可包含在初始鼠抗体中未发现的一种或突变至不同氨基酸残基 ( 例如优化结合或生物物 理性能的其他突变 )。本发明的优选结合分子在人中的免疫原性低于包含相同 CDR 的鼠抗 体。
     术语″抗体″和″免疫球蛋白″在本文中互换使用。抗体或免疫球蛋白至少包 含重链的可变结构域， 并且通常至少包含重链和轻链的可变结构域。脊椎动物系统中的 基本免疫球蛋白结构已得到较为充分的了解。例如参见 Harlow et al.， Antibodies ： A Laboratory Manual， (Cold Spring Harbor Laboratory Press， 2nd ed.1988)。
     如将在下文具体讨论的那样， 术语 “免疫球蛋白”包含可以以生化方式区分的 多种大类的多肽。本领域的技术人员均了解重链被分类为 gamma、 mu、 alpha、 delta 或 epsilon(γ、 μ、 α、 δ、 ε)， 其中还有一些亚类 ( 例如 γ1-γ4)。由该链的性质决定了抗 体的 “类别” 分别为 IgG、 IgM、 IgA、 IgG 或 IgE。免疫球蛋白小类 ( 同种型 ) 如 IgG1、 IgG2、 IgG3、 IgG4、 IgAl 等均得到了很好的区分并赋予了功能定位。熟练的技术人员考虑到本公 开能够轻易辫别这些类别和同型的各修饰型， 且它们均在本发明的范围之内。 轻链被分类为 kappa 或 lambda(κ、 λ)。各重链分类均能与 kappa 或 lambda 轻 链的任意一种相结合。
     轻链和重链均被划分为具有结构和功能同源性的区域。术语 “恒定” 和 “可变” 具 有功能性含义。就此而言， 将意识到轻 (VL) 和重 (VH) 链部分的可变结构域决定了抗原识 别和特异性。相反地， 轻链 (CL) 和重链 (CH1、 CH2 或 CH3) 的恒定结构域则赋予了重要的生 物功能， 例如分泌、 经胎盘活动性、 Fc 受体结合、 补体结合等。根据惯例随恒定区域越为远 离抗体的抗原结合位点或氨基酸末端， 其数量有所上升。 N 末端区为可变区而 C 末端区为恒 定区 ； CH3 和 CL 区实际分别包含了重链和轻链的羧基末端。
     如上文指出， 可变区允许抗体选择性识别特异性结合抗原上的抗原表位。 即， 抗体 ( 例如在一些情况下 CH3 结构域 ) 的 VL 域和 VH 域、 或决定簇互补区 (CDR) 的亚群结合形 成定义三维抗原结合位点的可变区。该四级抗体结构形成了存在于各个 Y 臂末端的抗原结 合位点。在一个实施方案中， 该抗原结合位点可通过各 VH 和 VL 链上的三个 CDR 定义。在 一些情况下， 例如对于源自骆驼类或基于骆驼类免疫球蛋白工程改造的某些免疫球蛋白分 子， 完整的免疫球蛋白分子可能仅由重链组成， 而不含轻链。例如参见 Hamers-Casterman et al.， Nature 363 ： 446-448(1993)。
     如本文中使用的术语 “可变区 CDR 氨基酸残基” 包括 CDR 或互补决定区中的氨基 酸， 如使用序列或结构基方法所鉴定。如本文中使用的， 术语″ CDR″或″互补决定区″是 指在重链和轻链多肽的可变区内发现的非连续的抗原联合位点。这些特定区域由下列文 献描述 ： Kabat et al.， J.Biol.Chem.252， 6609-6616(1977) 和 Kabat et al.， Sequences of protein of immunological interest.(1991) 以及 Chothia et al.， J.Mol.Biol.196 ： 901-917(1987) 和 MacCallum et al.， J.Mol.Biol.262 ： 732-745(1996)， 其中当彼此比较时 所述定义包括氨基酸残基的重叠或亚组， 并且本领域普通技术人员能容易地使用这些定义 中的任一种来鉴别本文所述的抗 -LT 抗体的 CDR。包括通过上述引用的文献中的各种所定 义的 CDR 的氨基酸残基下面阐述用于比较。优选地， 术语 “CDR” 是基于序列比较由 Kabat
     定义的 CDR。
     CDR 定义
     1 2 3残基编号遵循 Kabat et al.， 上文的命名 残基编号遵循 Chothia et al.， 上文的命名残基编号遵循 MacCallum et al.， 上文的命名
     本文中使用的术语 “可变区框架 (FR) 氨基酸残基” 是指 Ig 链或其部分的框架区中 的那些氨基酸。本文中使用的术语 “框架区” 或 “FR 区” 包括为可变区一部分但不是 CDR( 例 如使用 Kabat 定义 CDR) 一部分的氨基酸残基。 因此， 可变区框架长度为约 100-120 氨基酸， 但是仅包括 CDR 外的那些氨基酸。对于重链可变区和由 Kabat et al. 定义的 CDR 的特定 例子， 框架区 1 对应于包括氨基酸 1-30 的可变区结构域 ； 框架区 2 对应于包括氨基酸 36-49 的可变区结构域 ； 框架区 3 对应于包括氨基酸 66-94 的可变区结构域 ； 以及框架区 4 对应于 包括氨基酸 103 至可变区末端的可变区结构域。轻链的框架区由各轻链可变区 CDR 类似地 分隔开。 类似地， 使用由 Chothia et al. 或 McCallum et al. 定义的 CDR， 框架区边界由上 述各自的 CDR 末端分隔开。在优选的实施方案中， CDR 由 Kabat 定义。在另外的实施方案 中， CDR 由 Chothia 定义。
     Kabat et al. 还定义了适用于任何抗体的可变结构域序列的编号系统。本领 域技术人员可明白地分配该″ Kabat 编号″系统至任何可变结构域序列， 而不依赖于超 出序列本身的任何试验数据。如本文中使用的，″ Kabat 编号″是指 Kabat et al.， U.S.Dept.of Health and Human Services， ″ Sequence of Proteins of Immunological Interest″ (1983) 所阐述的编号系统。除非另有说明， 涉及本发明的 LTβR 抗体的可变区 或其抗原结合片段、 变体或衍生物的编号是根据 Kabat 编号系统的。 本文中使用的术语 “Fc 区” 是指从铰链区木瓜蛋白酶切割位点 ( 即 IgG 中的残基 216， 假设重链恒定区的第一残基在 114) 上游开始、 并且在抗体的 C- 末端结束的免疫球蛋 白重链的部分。因此， 完整 Fc 区包含至少铰链区、 CH2 结构域和 CH3 结构域。抗体分子得到 Fc 区是二聚体的。本发明的结合分子可包含完整 Fc 区或一个或多个 Fc 部分。在一个实施 方案中， 结合分子的 Fc 区可以是嵌合的。例如， 多肽的 Fc 结构域可包含衍生自 IgG1 分子 的 CH1 结构域和衍生自 IgG3 分子的铰链区。在另外例子中， Fc 区可包含部分衍生自 IgG1 分子并且部分衍生自 IgG3 分子的铰链区。在另外例子中， Fc 区可包含部分衍生自 IgG1 分
     子并且部分衍生自 IgG4 分子的嵌合铰链。在一个实施方案中， 本发明的二聚体 Fc 区可包 含一个多肽链。在另外的实施方案中， 本发明的二聚体 Fc 区可包含两个多肽链， 例如抗体 分子的情况中。
     在一个实施方案中， 本发明的结合分子包含至少一种恒定区， 例如重链恒定区和 / 或轻链恒定区。在一个实施方案中， 这种恒定区和野生型恒定区相比是修饰的。即， 本文公 开的本发明的多肽可包含对三种重链恒定结构域 (CH1， CH2 或 CH3) 和 / 或轻链恒定区结构 域 (CL) 中的一种或多种的改变或修饰。示例性修饰包括在一种或多种结构域中添加、 缺失 或取代一个或多个氨基酸。可包括这种改变以优化效应子功能、 半衰期等。
     重链恒定区中的氨基酸位置， 包括 CH1， 铰链， CH2 和 CH3 结构域中的氨基酸位 置， 根据 EU 索引编号系统在本文编号 ( 参见 Kabat et al.， “Sequences of Proteins of Immunological Interest” ， U.S.Dept.Health and Human Services， 5th edition， 1991)。 相反， 轻链恒定区 ( 例如 CL 结构域 ) 中的氨基酸位置根据 Kabat 索引编号系统在本文编号 ( 参见 Kabat et al.， ibid)。
     示例性结合分子包括或可包含例如多克隆、 单克隆、 多特异性、 人的、 人源化的、 灵 长动物源化的或嵌合抗体、 单链抗体、 抗原表位结合片段 ( 如 Fab、 Fab′和 F(ab′ )2、 Fd、 Fvs)、 单链 Fvs(scFv)、 单链抗体、 二硫键连接 Fvs(sdFv)、 包含 VL 或 VH 区的片段、 由 Fab 表 达库制备的片段。ScFv 分子已为本领域所知， 其描述参见美国专利 5,892,019。包含 Ig 重 链的本发明的结合分子可以是免疫球蛋白分子的任何形式 ( 例如 IgG、 IgE、 IgM、 IgD、 IgA 和 IgY)、 类别 ( 例如 IgG1、 IgG2、 IgG3、 IgG4、 IgA1 和 IgA2) 或小类。
     结合分子可单独包含可变区或联合包含下列中的全部或一部分 ： 铰链区， CH1， CH2 和 CH3 结构域。本发明还包括抗原结合片段， 包含可变区与铰链区， CH1， CH2 和 CH3 结构域 的组合。
     术语 “片段” 是指多肽 ( 例如抗体或抗体链 ) 的一部分或组成部分， 其包含的氨基 酸残基比完整或整个多肽要少。术语 “抗原结合片段” 是指免疫球蛋白或抗体的多肽片段， 该片段能结合抗原或与完整抗体 ( 即它所来源的完整抗体 ) 竞争结合抗原 ( 即， 特异性结 合 )。本文中使用的术语抗体分子的 “抗原结合片段” 包括抗体的抗原结合片段， 例如抗体 轻链 (VL)， 抗体重链 (VH)， 单链抗体 (scFv)， F(ab’ )2 片段， Fab 片段， Fd 片段， Fv 片段和 单结构域抗体片段 (DAb)。可以将完整抗体或抗体链通过例如化学或酶法处理来获得所述 片段， 或者通过重组手段。
     如上所述， 各种免疫球蛋白类别的恒定区的亚基结构和三种空间构象是熟知的。 如本文中使用的， 术语 “VH 结构域” 包括免疫球蛋白重链的氨基末端可变结构域， 并且术语 “CH1 结构域” 包括免疫球蛋白重链的第一 ( 大部分氨基末端 ) 恒定区结构域。CH1 结构域 邻近 VH 结构域， 并且是免疫球蛋白重链分子的铰链区的氨基末端。
     如本文中使用的， 术语 “CH1 结构域” 包括从例如约 EU 位 118-215 延伸的免疫球蛋 白重链的第一 ( 大部分氨基末端 ) 恒定区结构域。CH1 结构域邻近 VH 结构域并且是免疫球 蛋白重链分子的铰链区的氨基末端， 其并不形成免疫球蛋白重链的 Fc 区的一部分。在一个 实施方案中， 本发明的结合分子包含衍生自免疫球蛋白重链分子 ( 例如人 IgG1 或 IgG4 分 子 ) 的 CH1 结构域。
     如本文中使用的， 术语 “CH2 结构域” 包括从例如约 EU 位 231-340 延伸的重链免疫球蛋白分子的一部分。CH2 结构域是独特的， 因为其不与另外的结构域紧密的配对。相反， 两个 N- 连接的支化的烃链夹置在完整天然 IgG 分子的两个 CH2 结构域之间。在一个实施 方案中， 本发明的结合分子包含衍生自 IgG1 分子 ( 例如人 IgG1 分子 ) 的 CH2 结构域。在 另外的实施方案中， 本发明的改变的多肽包含衍生自 IgG4 分子 ( 例如人 IgG4 分子 ) 的 CH2 结构域。在示例性实施方案中， 本发明的多肽包含 CH2 结构域 (EU 位 231-340) 或其部分。
     如本文中使用的， 术语 “CH3 结构域” 包括从 CH2 结构域的 N- 末端延伸大约 110 残 基例如从约位 341-446b(EU 编号系统 ) 的重链免疫球蛋白分子的一部分。CH3 结构域典型 地形成抗体的 C- 末端部分。然而， 在一些免疫球蛋白中， 另外的结构域可从 CH3 结构域延 伸以形成分子的 C- 末端部分 ( 例如 IgM 的 μ 链和 IgE 的 ε 链的 CH4 结构域 )。在一个 实施方案中， 本发明的结合分子包含衍生自 IgG1 分子 ( 例如人 IgG1 分子 ) 的 CH3 结构域。 在另外的实施方案中， 本发明的结合分子包含衍生自 IgG4 分子 ( 例如人 IgG4 分子 ) 的 CH3 结构域。
     本文中所用的术语 “铰链区” 包含将 CH1 区连接至 CH2 区的重链分子部分。该铰 链区包含了约 25 个残基并且是柔性的， 从而使得两个 N 末端抗原结合区可以独立移动。 铰链区可以被细分为三个不同的区域 ： 上、 中、 下铰链区 (Roux et al.， J.Immunol.161 ： 4083(1998))。
     本文中所用的术语 “嵌合抗体” 是指这样的抗体， 其中结合位点或部分 ( 例如可变 区 ) 得自或衍生自第一物种， 并且恒定区 ( 根据本发明为完整的、 部分的或修饰的 ) 得自第 二物种。 在优选实施方案中， 该靶结合区域或位点来自于非人类来源 ( 例如鼠或灵长动物 ) 而恒定区来自人类。
     如本文中使用的术语 “scFv 分子”包括基本上由下列构成的结合分子 ： 一种轻 链可变结构域 (VL) 或其部分和一种重链可变结构域 (VH) 或其部分， 其中各可变结构域 ( 或其部分 ) 衍生自相同或不同抗体。scFv 分子优选包含夹置在 VH 结构域和 VL 结构域 之间的 scFv 接头。scFv 分子是本领域已知的， 并且描述于例如美国专利 5,892,019， Ho et al.1989.Gene 77 ： 51 ； Bird et al.1988Science 242 ： 423 ； Pantoliano et al.1991. Biochemistry 30 ： 10117 ； Milenic et al.1991.Cancer Research 51 ： 6363 ； Takkinen et al.1991.Protein Engineering4 ： 837。scFv 分子的 VL 和 VH 结构域衍生自一种或多种抗 体分子。本领域技术人员还应该理解本发明的 scFv 分子的可变区可被修饰为使得它们的 抗体分子 ( 它们衍生自该抗体 ) 的氨基酸序列改变。例如， 在一个实施方案中， 可进行核苷 酸或氨基酸取代从而导致氨基酸残基的保守取代或改变 ( 例如在 CDR 和 / 或框架残基中 )。 或者或另外， 可使用本领域已知的技术对 CDR 氨基酸残基进行突变以优化抗原结合。本发 明的结合分子保持结合 LT 抗原的能力。
     如本文中使用的 “scFv 接头” 是指夹置在 scFv 的 VL 和 VH 结构域之间的部分。 scFv 接头优选使 scFv 分子保持为抗原结合构象。在一个实施方案中， scFv 接头包含 scFv 接头肽或由 scFv 接头肽构成。在某些实施方案中， scFv 接头肽包含 gly-ser 连接肽或由 gly-ser 连接肽构成。在其他实施方案中， scFv 接头包含二硫键。
     如本文中使用的术语 “gly-ser 连接肽” 是指由甘氨酸和丝氨酸残基构成的肽。示 例性 gly/ser 连接肽包含氨基酸序列 (Gly4Ser)n。在一个实施方案中， n ＝ 1。在一个实施 方案中， n ＝ 2。在另外的实施方案中， n ＝ 3。在优选的实施方案中， n ＝ 4 即 (Gly4Ser)4。在另外的实施方案中， n ＝ 5。在又一实施方案中， n ＝ 6。另外示例性 gly/ser 连接肽包含 氨基酸序列 Ser(Gly4Ser)n。在一个实施方案中， n ＝ 1。在一个实施方案中， n ＝ 2。在优 选的实施方案中， n ＝ 3。在另外的实施方案中， n ＝ 4。在另外的实施方案中， n ＝ 5。在 又一实施方案中， n ＝ 6。
     在一个实施方案中， 本发明的结合分子是工程抗体分子。 本文中所用的术语 “工程 抗体” 或 “修饰的抗体” 是指结合分子包含抗 -LT 抗体结合位点， 但是不是传统二价四链抗 体分子。
     在一个实施方案中， 这种分子包含可变区， 其中重链或轻链或两者中的可变结构 域通过下列方式改变 ： 用已知特异性的抗体至少部分取代一种或多种 CDR( 例如 Kabat 或 Chothia CDR)， 如果需要， 通过部分框架区取代和序列变化进行。在一个实施方案中， CDR 可衍生自相同类的抗体或者甚至抗体的亚类， 其中框架区从其中衍生。 在一个实施方案中， CDR 衍生自不同类的抗体， 优选衍生自不同物种的抗体。 将一个或多个来自于已知特异性的 非人类抗体的 “供体” CDR 嫁接至人重链或轻链框架区的工程抗体在此称为 “人源化抗体” 。 无需将来自供体可变区的完整 CDR 替换所有的 CDR 以将一个可变区的抗原结合能力转换至 另一个。事实上仅需要转移那些维持该目标结合位点活性所必需的残基。在一个实施方 案中， 这种 “人源化” 抗体可包含另外的改变， 例如框架区氨基酸序列的突变 ( 例如回复突 变至供体氨基酸、 突变至种系氨基酸或其他取代 )。通过本文和现有技术 ( 例如美国专利 Nos.5,585,089， 5,693,761， 5,693,762 和 6,180,370) 所给出的解释， 本领域的技术人员应 当能够通过常规试验或试错法试验获取功能性的工程或人源化抗体。
     术语 “多核苷酸”包括分离的核酸分子或构建体， 例如， 信使 RNA(mRNA) 或质粒 DNA(pDNA)。多核苷酸可包括常规的磷酸二酯键或非常规的键 ( 例如于肽核酸 (PNA) 中发 现的酰胺键 )。术语 “核酸分子” 包括指在多核苷酸中存在的一个或多个核酸片段， 例如 DNA 或 RNA 片段。 “分离的” 核酸或多核苷酸指从其天然环境中分离的核酸分子、 DNA 或 RNA。例 如， 包含在载体中的编码 LT 结合分子的重组多核苷酸被认为对于本发明的目的而言是分 离的。 分离的多核苷酸的进一步例子包括存在于外源宿主细胞中的重组多核苷酸或在溶液 中 ( 部分或完全 ) 纯化的多核苷酸。分离的 RNA 分子包括对本发明多核苷酸的体内或体外 RNA 转录物。 本发明包括的分离的多核苷酸或核酸进一步包括合成制备的该种分子。 此外， 多核苷酸或核酸可以是启动子、 核糖体结合位点或转录终止子等调节元件或是包含该种调 节元件。
     本文中所用的 “编码区” 指由转译氨基酸的密码子组成的一部分核酸。尽管 “终止 密码子” (TAG、 TGA 或 TAA) 不翻译成氨基酸， 它仍可被认为是编码区域的一部分， 但如启动 子、 核糖体结合位点、 转录终止子、 内含子等侧翼序列不是编码区域的一部分。本发明的两 个或多个编码序列可存在于一个单独的多核苷酸构建体 ( 例如单独的载体 ) 中或分离的多 核苷酸构建体 ( 例如分离的 ( 不同 ) 载体 ) 中。此外， 任何载体可包含一个单独的编码区 或包含两个或多个编码区， 例如， 单独载体可分别编码免疫球蛋白的重链可变区和免疫球 蛋白的轻链可变区。此外， 本发明的载体、 多核苷酸或核酸可编码与编码 LT 结合分子或其 片段、 变体或衍生物的核酸融合或未融合的外源编码区域。外源编码区包括但不限于专门 的元件或基序， 例如分泌腺信号肽或外源功能性区域。
     本文中涉及核酸或多肽分子所用的术语 “工程改造的” 是指通过人工方法 ( 例如，通过重组技术、 体外肽合成、 肽的酶催化或化学偶合或这些技术的组合 ) 处理这些分子。
     本文中所用的术语 “连接的” 、 “融合的” 或 “融合” 可相互替换。这些术语指通过化 学连接或重组技术等任何方法连接两个或多个元件或成分。 “框内融合” 指以能够维持原始 开放阅读框架 (ORF) 的正确翻译阅读框的方式连接两个或多个多核苷酸 ORF 以形成更长的 连续 ORF。 因此， 重组融合蛋白是含有两个或更多与原始 ORF 所编码的多肽相应的片段的单 独蛋白 ( 该片段一般在天然状态下不进行该种连接 )。尽管该阅读框架在融合片段中彼此 连续， 但是该片段可被框内接头序列等序列物理或空间分隔。 例如， 编码免疫球蛋白可变区 CDR 的多核苷酸可框内融合， 但只要该 “融合的” CDR 被共转译为连续多肽的一部分， 它可被 编码至少一个免疫球蛋白框架区或附加 CDR 区的多核苷酸所分隔。
     在有关多肽的上下文中， “线性序列” 或 “序列” 指多肽中的由氨基向羧基末端方向 排列的氨基酸， 其中序列内彼此相邻的残基在多肽的一级结构内连续。
     本文中所用的术语 “治疗” 指治疗性或预防性措施， 其目的为预防或延缓 ( 减轻 ) 有害的生理变化或病症， 例如炎症的形成或扩散。有益或目标临床结果包括但不限于可测 或不可测的症状的缓和、 疾病程度的减轻、 疾病状态的稳定 ( 即不恶化 )、 疾病进展的延迟 或减缓、 疾病状态的改善或减轻、 以及 ( 部分或完全 ) 消除。 “治疗” 还可指与未接受治疗的 预计存活相比更长的存活时间。 需要接受治疗的受试者包括已经患有疾病或病症以及容易 患该疾病或病症的受试者或是需要预防该疾病或病症的受试者。
     “受试者” 或 “个体” 或 “动物” 或 “患者” 或 “哺乳动物” 指需要进行诊断、 预后或治 疗的任何受试者， 特别是哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括人、 驯养动物、 畜牧动物以 及动物园、 运动或宠物动物， 例如狗、 猫、 豚鼠、 兔子、 大鼠、 小鼠、 马、 家畜、 牛等。
     本文中所用的短语如 “可由结合分子的施用获益的受试者” 和 “需要治疗的动物” 等包括了可从用于 ( 例如 ) 对结合分子识别的抗原的检测 ( 例如用于诊断过程 ) 和 / 或用 于治疗 ( 即通过特异性结合 LT 的结合分子对炎性疾病或癌症等疾病的减轻或预防 ) 的结 合分子的施用受益的受试者， 包括哺乳动物受试者。 如本文中更具体描述， 该结合分子可在 与药物、 前药或同位素等物质相结合或不相结合的形式下进行使用。
     本文中使用的术语 “由炎症表征的疾患” 是指在受试者中疾患由炎症应答引起或 标准。炎性疾患可以是急性或慢性的。示例性炎性疾患包括风湿性关节炎， 多发性硬化， 克罗恩病， 溃疡性结肠炎， 移植， 狼疮， 炎症性肝病， 牛皮癣， 干燥综合征， 多发性硬化 ( 例如 SPMS)， 病毒诱导的肝炎， 自身免疫性肝炎， I 型糖尿病， 动脉硬化症和病毒休克综合征， 以及 进行移植或已经进行移植的个体。
     II. 抗 -LT 结合分子
     已经开发一组新型抗 -LT 结合分子。本发明的抗 -LT 结合分子和现有技术的抗体 相比展示出改善的功能性能。在另外的实施方案中， 本发明的抗 -LT 结合分子和现有技术 的抗 -LT 抗体相比具有独特的结构性能。
     在一个实施方案中， 本发明涉及本文所述的抗体 AOD9， 108， 107， 105， 9B4， A1D5， 102 或 101/103 抗体 ( 本文中也称为 LT 抗体 ( 例如 LT105) ； 这些抗体的 CDR ； 这些抗体的 可变区序列 ； 这些抗体的变体形式的 CDR 序列 ； 这些抗体的变体形式的可变区序列 ； 以及包 含这些 CDR 和 / 或可变区的结合分子。还提供编码这些结合分子的核酸分子。在某些实施 方案中， 本发明涉及缺少信号序列的成熟形式的分子。下面更详细地阐述本发明的抗体的功能和结构特性以及本发明的其他方面。
     A. 增加 LT- 诱导的信号传导的抑制
     LT- 诱导的信号传导 ( 在结合 LTβR) 时诱导炎性应答， 并且也涉及淋巴组织的正 常发育。本发明的结合分子和 LTβR 竞争结合淋巴细胞毒素， 从而抑制 LT- 介导的信号传 导并且在细胞中降低 LT 介导的生物应答。可使用多种测定来证实本发明的结合分子的阻 断效果。
     例如， 在一个实施方案中， 可以测量本发明的结合分子抑制 LT( 例如 LT 异源三聚 体 ) 与 LTβR 结合的能力。在一个实施方案中， 可以使用生理学上单体 LTβ 受体 (LTβR)。 在优选的实施方案中， 使用本领域或此处描述的方法在阻断研究中可以使用二聚体形式的 LTβ 受体， 例如 LTBR-Ig 融合蛋白 ( 例如现有技术中描述的 Fc 融合蛋白 )。例如， 生物素 标记的 LTβR 将结合用佛波脂 (PMA) 处理的 II-23 细胞上的淋巴细胞毒素， 佛波脂 (PMA) 在它们表面上表达 LTα1β2。 佛波脂处理的细胞和结合分子一起孵育以竞争生物素标记的 LTβR-Ig， 细胞被洗涤以除去未结合的 LTβR-Ig， 并且结合的 LTβR-Ig 使用抗生蛋白链菌 素 -PE 检测。因此， 可以使用例如 FACS 分析来测量结合分子阻断生物素标签的 LTβR-Ig 融合蛋白与表面 LT( 相比较于合适对照， 例如不存在结合分子的情况 ) 结合的能力。
     在另外的实施方案中， 测量结合分子抑制细胞因子 ( 例如 IL-8) 由 LTβR 表达细 胞 ( 例如 A375 细胞 ) 产生的能力。 在该测定中 LTβR 表达细胞接触 LTα1β2 和结合分子， 并且例如使用 ELISA 测定来测量结合分子抑制 IL-8 释放由细胞 ( 相比较于合适对照， 例如 不存在结合分子的情况 ) 产生的能力
     在一个实施方案中， 本发明的结合分子实现使 LTβR-Ig 结合的抑制和 / 或使一 种或多种 LT 生物活性例如细胞因子 ( 例如 IL-8) 产生的抑制大于 70％。在一个实施方案 中， 本发明的结合分子实现使 LTβR-Ig 结合的抑制和 / 或使一种或多种 LT 生物活性的抑 制大于 80％。 在一个实施方案中， 本发明的结合分子实现使 LTβR-Ig 结合的抑制和 / 或使 一种或多种 LT 生物活性的抑制大于 90％。在一个实施方案中， 本发明的结合分子实现使 LTβR-Ig 结合的抑制和 / 或使一种或多种 LT 生物活性的抑制大于 95％。在一个实施方案 中， 本发明的结合分子实现使 LTβR-Ig 结合的完全抑制 ( 即， 100％ ) 和 / 或使一种或多种 LT 生物活性的完全抑制 ( 即， 100％ )。
     在一个实施方案中， 本发明涉及分离的结合分子或包含其抗原结合区域的分子， 其在这样的条件下在细胞中结合淋巴细胞毒素 α1β2 并且使 LTα1β2- 诱导的生物活性 抑制至少约 70％， 例如在该条件下参照抗体 B9( 由以登录号 HB11962 保藏在 ATCC 的细胞系 B9.C9.1 产生 ) 在细胞中使 LTα1β2- 诱导的生物活性抑制约 50％。 在另外的实施方案中， 本发明的分离的结合分子或包含其抗原结合区域的分子在细胞中使 LTα1β2- 诱导的生 物活性阻断至少约 80％， 例如在该条件下参照抗体 B9( 由以登录号 HB11962 保藏在 ATCC 的 细胞系 B9.C9.1 产生 ) 在细胞中使 LTα1β2- 诱导的生物活性抑制约 50％。在另外的实施 方案中， 本发明的分离的结合分子或包含其抗原结合区域的分子在细胞中使 LTα1β2- 诱 导的生物活性阻断至少约 85 ％， 例如在该条件下参照抗体 B9( 由以登录号 HB11962 保藏 在 ATCC 的细胞系 B9.C9.1 产生 ) 在细胞中使 LTα1β2- 诱导的生物活性抑制约 50％。在 另外的实施方案中， 本发明的分离的结合分子或包含其抗原结合区域的分子在细胞中使 LTα1β2- 诱导的生物活性阻断至少约 90 ％， 例如在该条件下参照抗体 B9( 由以登录号HB11962 保藏在 ATCC 的细胞系 B9.C9.1 产生 ) 在细胞中使 LTα1β2- 诱导的生物活性抑制 约 50％。在另外的实施方案中， 本发明的分离的结合分子或包含其抗原结合区域的分子在 细胞中使 LTα1β2- 诱导的生物活性阻断至少约 95％， 例如在该条件下参照抗体 B9( 由以 登录号 HB11962 保藏在 ATCC 的细胞系 B9.C9.1 产生 ) 在细胞中使 LTα1β2- 诱导的生物 活性抑制约 50％。在另外的实施方案中， 本发明的分离的结合分子或包含其抗原结合区域 的分子在细胞中使 LTα1β2- 诱导的生物活性阻断至少约 98％， 例如在该条件下参照抗体 B9( 由以登录号 HB11962 保藏在 ATCC 的细胞系 B9.C9.1 产生 ) 在细胞中使 LTα1β2- 诱 导的生物活性抑制约 50％。在另外的实施方案中， 本发明的分离的结合分子或包含其抗 原结合区域的分子在细胞中使 LTα1β2- 诱导的生物活性阻断至少约 100％， 例如在该条 件下参照抗体 B9( 由以登录号 HB11962 保藏在 ATCC 的细胞系 B9.C9.1 产生 ) 在细胞中使 LTα1β2- 诱导的生物活性抑制约 50％。在一个实施方案中， 生物活性是 IL-8 释放。
     在一个实施方案中， 本发明涉及分离的结合分子， 其结合淋巴细胞毒素 β 并且使 LTβR 与细胞的结合 ( 或如上所述与二聚体 LTBR-Ig 结合 ) 抑制至少约 70％。在另外的实 施方案中， 本发明涉及分离的结合分子， 其结合淋巴细胞毒素 β 并且使 LTβR( 或 LTBR-Ig) 与细胞的结合抑制至少 80％。 在另外的实施方案中， 本发明涉及分离的结合分子， 其结合淋 巴细胞毒素 β 并且使 LTβR( 或 LTBR-Ig) 与细胞的结合抑制至少约 90％。在另外的实施 方案中， 本发明涉及分离的结合分子， 其结合淋巴细胞毒素 β 并且使 LTβR( 或 LTBR-Ig) 与细胞的结合抑制至少约 95％。在另外的实施方案中， 本发明涉及分离的结合分子， 其结 合淋巴细胞毒素 β 并且使 LTβR( 或 LTBR-Ig) 与细胞的结合抑制至少约 98 ％。在另外 的实施方案中， 本发明涉及分离的结合分子， 分离的结合分子结合淋巴细胞毒素 β 并且使 LTβR( 或 LTBR-Ig) 与细胞的结合抑制至少约 100％。
     B. 增强的效力和 / 或亲和性
     在一个实施方案中， 本发明的结合分子以比现有技术抗体更低的浓度抑制 LT 与 LTβR 的结合和 / 或抑制 LT- 诱导的生物活性。 当包含本发明的 LT 结合位点的抗体使 LT- 诱 导的生物活性 ( 例如 IL-8 释放 ) 抑制 50％的浓度 (IC50) 和包含现有技术 LT 结合位点的 抗体比较时， 这可容易地观察到。现有技术抗体需要 3 个级数量级的更多抗体来实现使 LT 与 LTβR 的结合抑制 50％ ( 参见图 1， 4 和 5)， 并且一些根本未实现 50％抑制。对于这些抗 体， 可以使用理论 “理论 IC50” 来进行比较。在计算 IC50 值时， 使用在使用抗原 (LT) 预孵 育步骤的过程中存在的抗体浓度 ( 而不是在加入细胞和缓冲液后的最终抗体浓度 )。
     在一个实施方案中， 本发明的结合分子抑制 LTβR 或 LTβR-Ig 结合的 IC50 或抑 制一种或多种 LT 生物活性的 IC50 小于约 500nM。 在另外的实施方案中， 本发明的结合分子 抑制 LTβR 或 LTβR-Ig 结合的 IC50 或抑制一种或多种 LT 生物活性的 IC50 小于约 100nM。 在另外的实施方案中， 本发明的结合分子抑制 LTβR 或 LTβR-Ig 结合的 IC50 或抑制一种 或多种 LT 生物活性的 IC50 小于约 30nM。在另外的实施方案中， 本发明的结合分子抑制 LTβR 或 LTβR-Ig 结合的 IC50 或抑制一种或多种 LT 生物活性的 IC50 小于约 10nM。在另 外的实施方案中， 本发明的结合分子抑制 LTβR 或 LTβR-Ig 结合的 IC50 或抑制一种或多 种 LT 生物活性的 IC50 小于约 3nM。
     在一个实施方案中， 本发明的结合分子具有下列这些改善性能中的多于一种 ： 即， 实现使 LTβR 或 LTβR-Ig 结合的抑制或一种或多种 LT 生物活性的抑制大于 70％， 80％，90％， 95％或 98％， 并且抑制的 IC50 小于约 500nM， 100nM， 30nM， 10nM 或 3nM。
     在一个实施方案中， 本发明的结合分子以 EC50 小于约 0.3nM 结合 LTα1β2。 在另 外的实施方案中， 本发明的结合分子以 EC50 小于约 0.1nM 结合 LTα1β2。 在另外的实施方 案中， 本发明的结合分子以 EC50 小于约 0.03nM 结合 LTα1β2。
     在一个实施方案中， 本发明的结合分子以 IC50 为 100nM 或更低使一种或多种 LT 生物活性 ( 例如 IL-8 释放 ) 抑制至少 90％。 在一个实施方案中， 本发明的结合分子以 IC50 为 30nM 或更低使一种或多种 LT 生物活性 ( 例如 IL-8 释放 ) 抑制至少 90％。在一个实施 方案中， 本发明的结合分子以 IC50 为 10nM 或更低使一种或多种 LT 生物活性 ( 例如 IL-8 释放 ) 抑制至少 90％。在一个实施方案中， 本发明的结合分子以 IC50 为 3nM 或更低使一种 或多种 LT 生物活性 ( 例如 IL-8 释放 ) 抑制至少 90％。在一个实施方案中， 本发明的结合 分子或包含其抗原结合区域的分子还使 LTβR 或 LTβR-Ig 结合抑制至少 70％， 例如在该条 件下参照抗体 B9( 由以登录号 HB11962 保藏在 ATCC 的细胞系 B9.C9.1 产生 ) 在细胞中使 LTα1β2- 诱导的生物活性抑制约 50％。在一个实施方案中， 本发明的结合分子或包含其 抗原结合区域的分子还使 LTβR 或 LTβR-Ig 结合抑制至少 80％， 例如在该条件下参照抗体 B9( 由以登录号 HB11962 保藏在 ATCC 的细胞系 B9.C9.1 产生 ) 在细胞中使 LTα1β2- 诱导 的生物活性抑制约 50％。在一个实施方案中， 本发明的结合分子或包含其抗原结合区域的 分子还使 LTβR 或 LTβR-Ig 结合抑制至少 90％， 例如在该条件下参照抗体 B9( 由以登录号 HB11962 保藏在 ATCC 的细胞系 B9.C9.1 产生 ) 在细胞中使 LTα1β2- 诱导的生物活性抑制 约 50％。在一个实施方案中， 本发明的结合分子或包含其抗原结合区域的分子还使 LTβR 或 LTβR-Ig 结合抑制至少 95％， 例如在该条件下参照抗体 B9( 由以登录号 HB11962 保藏 在 ATCC 的细胞系 B9.C9.1 产生 ) 在细胞中使 LTα1β2- 诱导的生物活性抑制约 50％。在 一个实施方案中， 本发明的结合分子或包含其抗原结合区域的分子还使 LTβR 或 LTβR-Ig 结合抑制至少 100％， 例如在该条件下参照抗体 B9( 由以登录号 HB11962 保藏在 ATCC 的细 胞系 B9.C9.1 产生 ) 在细胞中使 LTα1β2- 诱导的生物活性抑制约 50％。
     C. 与 LT 的新区域的结合
     本发明的结合分子不结合 LTα3( 或在 103 的情况中 )， 如果它们结合 LTα3 的话， 并不以这样的方式来结合， 该方式为阻断 LTα3 与 TNFR 的结合。另外， 本发明的结合分子 全都阻断 LT 与 LTβR 或 LTβR-Ig 的结合。在一个实施方案中， 本发明的抗 -LT 结合分子 和本发明的抗 -LT 抗体竞争结合 LT。 因此， 在某些实施方案中， 本发明的组合物中使用的结 合部分可以和竞争测定中参照抗体结合相同的抗原表位， 例如本文所述的 AOD9， 108， 107， 105， 9B4， A1D5， 102 或 101/103 抗体。例如， 结合部分可以衍生自交叉阻断 ( 即竞争结合 ) 本发明的抗 -LT 抗体或以其他方式干扰抗体结合的抗体。
     结合分子据说″竞争抑制” 或 “竞争阻断” 配体的结合， 如果其在一定程度上特异 性或优选结合抗原表位， 该程度为配体 ( 例如 LT) 与 LTβR 或 LTβR-Ig 的结合以依赖于配 体浓度的方式抑制或阻断 ( 例如空间阻断 )。例如， 当生物化学上测量时， 给定浓度的结合 分子的竞争抑制可通过增加配体浓度来克服， 在该情况下配体将在与结合分子的结合靶分 子 ( 例如 LTβR) 的竞争中胜出。不希望束缚于任何特定理论， 当结合分子结合的抗原表位 位于或接近配体的结合位点从而抑制配体的结合时， 认为竞争发生。竞争抑制可通过本领 域熟知的方法和 / 或实施例中所述的方法来测定， 包括例如竞争 ELISA 测定法。在一个实施方案中， 本发明的结合分子使选自 AOD9， 108， 107， 105， 9B4， A1D5， 102 或 101/103 的抗 -LT 抗体与 LT( 或竞争抗体能力中的一种以降低 LT 与 LTβR 的结合或下调 LT- 介导的信号传 导 ) 的结合竞争抑制至少 90％、 至少 80％或至少 70％。
     在一个实施方案中， 本发明的结合分子竞争抑制 AOD9 抗体与 LT 的结合。在一个 实施方案中， 本发明的结合分子竞争抑制 108 抗体与 LT 的结合。在一个实施方案中， 本发 明的结合分子竞争抑制 107 抗体与 LT 的结合。在一个实施方案中， 本发明的结合分子竞争 抑制 105 或 9B4 抗体与 LT 的结合。在一个实施方案中， 本发明的结合分子竞争抑制 A1D5 抗体与 LT 的结合。在一个实施方案中， 本发明的结合分子竞争抑制 102 抗体与 LT 的结合。 在一个实施方案中， 本发明的结合分子竞争抑制 101/103 抗体与 LT 的结合。
     结合 LT 的竞争性抗原表位的其他抗体可使用现有技术已知的技术和它们的表征 的可变区来鉴别。这些抗体可用作结合分子或它们的可变区可用作结合位点， 并且引入本 发明的结合分子。例如这种抗体的 CDR 可引入本发明的结合分子。例如， 已经在各种片段 或全长 LT 但没有信号序列的抗体产生后， 可以使用本领域已知的抗原表位映射方案来确 定 LT 的哪个氨基酸或抗原表位结合抗体或抗原结合片段 ( 例如双抗体 - 夹心 ELISA， 描述 于″ Chapter11-Immunology， ″ Current Protocols in Molecular Biology， Ed.Ausubel et al.， v.2， John Wiley&Sons， Inc.(1996))。另外的抗原表位映射方案可发现于 Morris， G.Epitope Mapping Protocols， New Jersey ： Humana Press(1996)， 其通过引用全部并入本 文。抗原表位映射也可通过市售装置 ( 即 ProtoPROBE， Inc.(Milwaukee， Wisconsin)) 来进 行。
     在又一实施方案中， 本发明的结合分子可包含结合 LT 的某些氨基酸残基的结合 位点或者 LT 的某些氨基酸可对于其结合是关键的。下面公开的 LT 中的氨基酸位置是指成 熟形式的蛋白中的氨基酸位置。对于成熟 LTβ 蛋白的序列， 参见 Genbank 登陆 GI ： 292277 和 4505035 以及 Browning J.et al.， Cell72 ： 847-856(1993)， 其通过引用全部并入本文。
     在一个实施方案中， 本发明涉及特异性结合 LT 的抗原表位的分离的结合分子， 其 中 LT 抗原表位与结合分子的结合以剂量依赖性方式被 102 抗体竞争性阻断。在另外的实 施方案中， LTβ 的氨基酸 193(R) 和 194(R)( 如下面 SEQ ID NO ： 中所阐述 ) 对于结合分子 的结合是关键的。LTβ 的序列如下 ：
     1 MGALGLEGRG GRLQGRGSLL LAVAGATSLV TLLLAVPITV LAVLALVPQD
     51 QGGLVTETAD PGAQAQQGLG FQKLPEEEPE TDLSPGLPAA HLIGAPLKGQ
     101 GLGWETTKEQ AFLTSGTQFS DAEGLALPQD GLYYLYCLVG YRGRAPPGGG
     151 DPQGRSVTLR SSLYRAGGAY GPGTPELLLE GAETVTPVLD PARRQGYGPL
     201 WYTSVGFGGL VQLRRGERVY VNISHPDMVD FARGKTFFGA VMVG
     在一个实施方案中， 本发明涉及特异性结合 LT 的抗原表位的分离的结合分子， 其 中 LT 抗原表位与结合分子的结合以剂量依赖性方式被 AOD9 抗体竞争性阻断。在另外的实 施方案中， LTβ 的氨基酸 151(D) 和 153(Q)( 如 SEQID NO ： 中所阐述 ) 对于结合分子的结合 是关键的。
     在一个实施方案中， 本发明涉及特异性结合 LT 的抗原表位的分离的结合分子， 其 中 LT 抗原表位与结合分子的结合以剂量依赖性方式被 101/103 抗体竞争性阻断。
     在一个实施方案中， 本发明涉及特异性结合 LT 的抗原表位的分离的结合分子， 其中 LT 抗原表位与结合分子的结合以剂量依赖性方式被 105 或 9B4 抗体竞争性阻断。在一 个实施方案中， LTβ 的氨基酸 96(P)， 97(L)， 98(K) 对于结合分子的结合是关键的。
     在一个实施方案中， 本发明涉及特异性结合 LT 的抗原表位的分离的结合分子， 其 中 LT 抗原表位与结合分子的结合以剂量依赖性方式被 105 抗体竞争性阻断。在一个实施 方案中， LTβ 的氨基酸 96(P)， 97(L)， 98(K)， 106(T)， 107(T) 和 108(K)( 如 SEQ ID NO ： 中所 阐述 ) 对于结合分子的结合是关键的。
     在一个实施方案中， 本发明涉及特异性结合 LT 的抗原表位的分离的结合分子， 其 中 LT 抗原表位与结合分子的结合以剂量依赖性方式被 A1D5 抗体竞争性阻断。在一个实施 方案中， LTβ 的氨基酸 172(P)( 如 SEQ ID NO ： 中所阐述 ) 对于结合分子的结合是关键的。
     在一个实施方案中， 本发明涉及特异性结合 LT 的抗原表位的分离的结合分子， 其 中 LT 抗原表位与结合分子的结合以剂量依赖性方式被 107 抗体竞争性阻断。在一个实施 方案中， LTβ 的氨基酸 151(D) 和 153(Q)( 如 SEQ IDNO ： 中所阐述 ) 对于结合分子的结合是 关键的。
     在一个实施方案中， 本发明涉及特异性结合 LT 的抗原表位的分离的结合分子， 其 中 LT 抗原表位与结合分子的结合以剂量依赖性方式被 108 抗体竞争性阻断。
     D. 新型结构
     在又一实施方案中， 本发明的抗 -LT 结合分子包含和本文所述的抗 -LT 结合位点 享有某些结构特征例如氨基酸序列同一性的抗 -LT 结合位点。
     具有所要求的功能活性的一组抗体的 CDR 序列在下表 1 和 2 中有所阐述。
     在一个实施方案中， 本发明涉及包含重链可变区和轻链可变区的淋巴细胞毒素 (LT) 结合分子， 所述重链可变区包含重链 CDR CDRH1、 CDRH2 和 CDRH3， 所述轻链可变区包 含轻链 CDR CDRL1、 CDRL2 和 CDRL3， 其中所述轻链和重链 CDR 衍生自选自 AOD9， 108， 107， A1D5， 102， 101/103， 9B4 和 105 的抗体。
     在一个实施方案中， 本发明涉及包含重链可变区和轻链可变区的 LT 结合分子， 所 述重链可变区包含重链 CDR CDRH1、 CDRH2 和 CDRH3， 所述轻链可变区包含轻链 CDR CDRL1、 CDRL2 和 CDRL3， 其中 CDR 衍生自 AOD9 抗体。
     在一个实施方案中， 本发明涉及包含重链可变区和轻链可变区的 LT 结合分子， 所 述重链可变区包含重链 CDR CDRH1、 CDRH2 和 CDRH3， 所述轻链可变区包含轻链 CDR CDRL1、 CDRL2 和 CDRL3， 其中 CDR 衍生自 108 抗体。
     在一个实施方案中， 本发明涉及包含重链可变区和轻链可变区的 LT 结合分子， 所 述重链可变区包含重链 CDR CDRH1、 CDRH2 和 CDRH3， 所述轻链可变区包含轻链 CDR CDRL1、 CDRL2 和 CDRL3， 其中 CDR 衍生自 107 抗体。
     在一个实施方案中， 本发明涉及包含重链可变区和轻链可变区的 LT 结合分子， 所 述重链可变区包含重链 CDR CDRH1、 CDRH2 和 CDRH3， 所述轻链可变区包含轻链 CDR CDRL1、 CDRL2 和 CDRL3， 其中 CDR 衍生自 A1D5 抗体。
     在一个实施方案中， 本发明涉及包含重链可变区和轻链可变区的 LT 结合分子， 所 述重链可变区包含重链 CDR CDRH1、 CDRH2 和 CDRH3， 所述轻链可变区包含轻链 CDR CDRL1、 CDRL2 和 CDRL3， 其中 CDR 衍生自 102 抗体。
     在一个实施方案中， 本发明涉及包含重链可变区和轻链可变区的 LT 结合分子， 所述重链可变区包含重链 CDR CDRH1、 CDRH2 和 CDRH3， 所述轻链可变区包含轻链 CDR CDRL1、 CDRL2 和 CDRL3， 其中 CDR 衍生自 101/103 抗体。
     在一个实施方案中， 本发明涉及包含重链可变区和轻链可变区的 LT 结合分子， 所 述重链可变区包含重链 CDR CDRH1、 CDRH2 和 CDRH3， 所述轻链可变区包含轻链 CDR CDRL1、 CDRL2 和 CDRL3， 其中 CDR 衍生自 105 抗体。
     在一个实施方案中， 本发明涉及包含重链可变区和轻链可变区的 LT 结合分子， 所 述重链可变区包含重链 CDR CDRH1、 CDRH2 和 CDRH3， 所述轻链可变区包含轻链 CDR CDRL1、 CDRL2 和 CDRL3， 其中 CDR 衍生自 9B4 抗体。
     根据本发明的例子的分离的抗体的 CDR 的分析促进开发共有 CDR 氨基酸序列。在 一个实施方案中， 本发明的结合分子包含本文所述的一种或多种共有 CDR 序列 ( 参见例如 表 1 和 2)。例如， 本发明的实施方案涉及包含重链可变区和轻链可变区的 LT 结合分子， 所 述重链可变区包含重链 CDRCDRH1、 CDRH2 和 CDRH3， 所述轻链可变区包含轻链 CDR CDRL1、 CDRL2 和 CDRL3， 其中 CDRH1 包含序列 GFSLX1X2Y/SGX3H/GX4X5 其中 X 是任意氨基酸。在另外 的实施方案中， X1 选自 S 或 T ； X2 选自 T， D 或 N。在另外的实施方案中， X3 选自 V， M 或 I， X4 不存在或 V， 并且 X5 不存在或 S。在一个实施方案中， CDRH1 的氨基酸序列的 7/10 或 7/12 等同于共有序列中的那些。在一个实施方案中， 残留 5 种 CDR 衍生自 A0D9 抗体、 108 抗体、 9B4 抗体或 107 抗体、 或其组合。
     在另外的实施方案中， 本发明涉及包含重链可变区和轻链可变区的 LT 结合分 子， 所述重链可变区包含重链 CDR CDRH1、 CDRH2 和 CDRH3， 所述轻链可变区包含轻链 CDR CDRL1、 CDRL2 和 CDRL3， 其中 CDRH1 包含序列 GX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10 其中 X1 选自 Y 或 F ； X2 选 自 S， T或V； X3 选自 F 或 I ； X4 选自 T 或 S ； X5 选自 G， D或S； X6 选自 Y， S或G； X7 选自 F， Y 或W； X8 选自 M 或 Y ； X9 选自 N， Y或W； 并且 X10 选自不存在或 N。在一个实施方案中， 残留 5 个 CDR 衍生自 A1D5， A105， 102 或 101/103 抗体。
     在另外的实施方案中， 本发明涉及包含重链可变区和轻链可变区的 LT 结合分 子， 所述重链可变区包含重链 CDR CDRH1、 CDRH2 和 CDRH3， 所述轻链可变区包含轻链 CDR CDRL1、 CDRL2 和 CDRL3， 其中 CDRH2 包含序列 VIWX1GGX2TX3X4NAX5FX6S。在一个实施方案中， X 是任意氨基酸。在另外的实施方案中， X1 选自 R 或 S ； X2 选自 N 或 S ； X3 选自 N 或 D ； X4 选 自Y或H； X5 选自 A 或 V ； 并且 X6 选自 M， T 或 I。在一个实施方案中， 结合分子的残留 5 个 CDR 衍生自 A0D9 抗体、 108 抗体或 107 抗体。
     在另外的实施方案中， 本发明涉及包含重链可变区和轻链可变区的 LT 结合分 子， 所述重链可变区包含重链 CDR CDRH1、 CDRH2 和 CDRH3， 所述轻链可变区包含轻链 CDR CDRL1、 CDRL2 和 CDRL3， 其中 CDRH2 包含序列 X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10YX11X12X13X14X15X16 其中 X1 选 自 R， T， G 或不存在 ； X2 选自 I， H或Y； X3 选自 N， G， Y或I； X4 选自 P， D， Y或S； X5 选自 Y， W 或G； X6 选自 N， T或D； X7 选自 G， D或S； X8 选自 D， Y或S； X9 选自 S， T， K或N； X10 选自 F， H， D， R或N； X11 选自 N， P或T； X12 选自 Q， D， G或P； X13 选自 K 或 S ； X14 选自 F， V或L； X15 选 自K或Q； 并且 X16 选自 D， G 或 N。在一个实施方案中， 残留 5 个 CDR 衍生自 A1D5， 102， 9B4， 105 或 101/103 抗体或其组合。
     在一个实施方案中， 本发明涉及包含重链可变区和轻链可变区的 LT 结合分子， 所 述重链可变区包含重链 CDR CDRH1、 CDRH2 和 CDRH3， 所述轻链可变区包含轻链 CDR CDRL1、CDRL2 和 CDRL3， 其中 CDRH3 包含序列 G/AYYG/A。在一个实施方案中， 残留 5 个 CDR 衍生自 A0D9， 107， 108， 9B4 抗体或其组合。
     在一个实施方案中， 本发明涉及包含重链可变区和轻链可变区的 LT 结合分子， 所 述重链可变区包含重链 CDR CDRH1、 CDRH2 和 CDRH3， 所述轻链可变区包含轻链 CDR CDRL1、 CDRL2 和 CDRL3， 其中 CDRL1 包含序列或 X1ASQDX2X3X4X5LX6 其中 X 是任意氨基酸。在一个实 施方案中， X1 选自 K 或 R ； X2 选自 I 或 M ； X3 选自 N 或 S ； X4 选自 T 或 N ； X5 选自 Y 或 F ； X6 选 自 N， T 或 R。在一个实施方案中， 残留 5 个 CDR 衍生自 A0D9 抗体， 108 抗体， 107 抗体， A1D5 抗体或 101/103 抗体。
     在一个实施方案中， 本发明涉及包含重链可变区和轻链可变区的 LT 结合分子， 所 述重链可变区包含重链 CDR CDRH1、 CDRH2 和 CDRH3， 所述轻链可变区包含轻链 CDR CDRL1、 CDRL2 和 CDRL3， 其中 CDRL1 包含序列或 RASX1SV X2X3X4X5 其中 X 是任意氨基酸。在一个实 施方案中， X1 选自 E 或 S ； X2 选自 D 或 S ； X3 选自 N 或 Y ； X4 选自 Y 或 M ； X5 选自 G 或 I。在一 个实施方案中， 残留 5 个 CDR 衍生自 105 抗体或 9B4 抗体或其组合。
     在一个实施方案中， 本发明涉及包含重链可变区和轻链可变区的 LT 结合分子， 所 述重链可变区包含重链 CDR CDRH1、 CDRH2 和 CDRH3， 所述轻链可变区包含轻链 CDR CDRL1、 CDRL2 和 CDRL3， 其中 CDRL2 包含序列 RAX1RLX2D 其中 X 是任意氨基酸。在一个实施方案中， X1 选自 N 或 D ； X2 选自 V 或 L。在一个实施方案中， 残留 5 个 CDR 衍生自 A0D9 抗体， 108 抗 体， 107 抗体， 或 101/103 抗体或其组合。
     在另外的实施方案中， CDRL2 包含序列 X1X2SX3X4X5S 其中 X1 选自 Y， R， A或K； X2 选 自 T， A或V； X3 选自 K， S或N； X4 选自 L 或 R ； X5 选自 H， E， A 或 F。在一个实施方案中， 残留 5 个 CDR 衍生自 A1D5 抗体， 102 抗体， 105 抗体， 105A 抗体， 105B 抗体， 105C 抗体或 9B4 抗体。
     在另外的实施方案中， 本发明涉及包含重链可变区和轻链可变区的 LT 结合分 子， 所述重链可变区包含重链 CDR CDRH1、 CDRH2 和 CDRH3， 所述轻链可变区包含轻链 CDR CDRL1、 CDRL2 和 CDRL3， 其中 CDRL3 包含序列 X1QX2X3X4X5PX6T 其中 X1 选自 Q 或 F ； X2 选自 Y， V， G， W或S； X3 选自 D， S或N； X4 ＝ D， H， Y或K； X5 选自 F， N或D； 并且 X6 ＝ W， L 或 Y。在 一个实施方案中， 残留 5 个 CDR 衍生自 108， 107， A1D5， 102， 9B4 或 105 抗体或其组合。
     在另外的实施方案中， CDRL3 包含序列 LX1X2DX3FPX4T 其中 X1 选自 H 或 Q ； X2 选自 H 或Y ； X3 选自 A 或 K ； X4 选自 W 或 P。 在一个实施方案中， 残留 5 个 CDR 衍生自 A0D9 或 101/103 抗体或其组合。
     在另外的实施方案中， 本发明提供分离的多肽， 包含、 基本上由下列构成或由下列 构成 ： 免疫球蛋白重链可变区 (VH)， 其中 VH-CDR1， VH-CDR2 和 VH-CDR3 区具有的多肽序列 等同于本文所述抗体的 VH-CDR1， VH-CDR2 和 VH-CDR3 序列 ( 例如 Kabat CDR 或 Chothia CDR( 示例性取代位点示于表 1)， 不同之处在于在任意一种 VH-CDR 中有一个、 两个、 三个、 四 个、 五个或六个氨基酸取代。在更大 CDR 例如 VH-CDR-3 中， 在 CDR 中可进行另外的取代， 只 要包含 VH-CDR 的 VH 特异性或优选结合 LT。在某些实施方案中氨基酸取代是保守的。
     在另外的实施方案中， 本发明提供分离的多肽， 包含、 基本上由下列构成或由下列 构成 ： 免疫球蛋白轻链可变区 (VL)， 其中 VL-CDR1， VL-CDR2 和 VL-CDR3 区具有的多肽序列 等同于本文所述抗体的 VL-CDR1， VL-CDR2 和 VL-CDR3 序列 ( 例如 Kabat CDR 或 Chothia CDR( 示例性取代位点示于表 2)， 不同之处在于在任意一种 VL-CDR 中有一个、 两个、 三个、 四个、 五个或六个氨基酸取代。在某些实施方案中氨基酸取代是保守的。
     在一个实施方案中， 可使结合分子的 CDR 改变以获得具有改善的性能的结合分 子， 例如结合性能或物理化学性能例如溶解度。例如， 在一个实施方案中， 可使重链或轻链 的一个或多个 CDR 改变， 这影响自缔合以改善分子的溶解度。在一个实施方案中， 这些改 变导致氨基酸被表 1 和 2 中阐述的基序提供的取代氨基酸所取代。在一个实施方案中， 使 CDRL2( 例如 105 抗体 ) 进行至少一种改变。在另外的实施方案中， 使 CDRL2( 例如 105 抗 体 ) 进行两种改变。
     例如， 在一个实施方案中， 可以制备 ： 在 Kabat 位 54 至 K 在 R 的 CDRL2 具有突变的 105 抗体的轻链版本 ( 版本 A) ； 在 Kabat 位 57 位 S 在 N 的 CDRL2 具有突变的第二版本 ( 版 本 B) ； 以及在 CDRL2 都具有突变的第三版本 ( 比较于 Kabat 位 54 的 K 和 Kabat 位 57 的 S ； 版本 C)。 如本发明的例子中所示， 包含 CDRL2 的这些修饰的版本的抗体证实改善的溶解度。
     本发明的 LT 结合分子可包含抗原识别位点、 完整可变区或衍生自本发明的一种 或多种初始或亲本抗 -LT 抗体的一种或多种 CDR。
     在一个实施方案中， 考虑到 A0D9， 108， 9B4 和 107 重链 CDR 之间的同源性， 可进行 多种组合。例如， 在一个实施方案中， A0D9 重链 CDRH1 可取代 108， 9B4 或 107 CDRH1， 并且 联合来自这些抗体可变区中的任一种的 CDRH2 和 CDRH3。
     在另外的实施方案中， 考虑到 A0D9， 108， 9B4， 101/103 和 107 轻链 CDR 之间的同源 性， 可进行多种组合。例如， 在一个实施方案中， A0D9 轻链 CDRL11 可取代 108， 9B4， 101/103 或 107 CDRL1， 并且联合来自这些抗体可变区中的任一种的 CDRL2 和 CDRL3。
     在另外的实施方案中， 本发明的第一抗 -LT 抗体的重链可联合本发明的第二 抗 -LT 抗体的轻链。例如， 考虑到 A0D9， 108 和 107 重链 CDR 之间的同源性， A0D9 重链可联 合 108 或 107 轻链以产生抗 -LT 结合位点。在另外的实施方案中， 108 重链可联合 A0D9 或 107 轻链以产生抗 -LT 结合位点。在又一实施方案中， 108 重链可联合 A0D9 或 107 轻链以 产生抗 -LT 结合位点。
     在又一实施方案中， 各种版本的抗 -LT 抗体轻链和重链可联合。例如， 在一个实施 方案中， 本文所述的各种版本的 105 抗体轻链和重链可联合。如本文所阐述， 这些版本中的 一些证实和初始 105 抗体相比改善的溶解度。 105 轻链和重链的示例性组合包括 ： H1/L0( 重 链版本 1 和轻链版本 0) ； H1/L 版本 A ； H1/L 版本 B ； H1/L10 ； H1/L12 ； H1/L13 ； H11/L10 ； H11/ L12 ； H11/L13 ； H14/L10 和 H14/L12。
     本发明还涉及编码本发明的结合分子的多核苷酸序列。
     在某些实施方案中， 多核苷酸或核酸分子是 DNA 或 RNA 分子。在 DNA 的情况下， 包 含编码多肽的核酸的多核苷酸通常可包括启动子和 / 或可操作地和一个或多个编码区缔 合的其他转录或翻译控制元件。在可操作的缔合基因产物例如多肽的编码区中， 其和一个 或多个调节序列以这样的方式进行缔合， 该方式为在调节序列的影响或控制下进行基因产 物的表达。
     编码抗 -LT 结合位点的核酸分子可操作地连接编码一个或多个恒定区部分的核 苷酸序列、 或可以或不可以衍生自抗体的其他期望核苷酸序列。如果启动子功能的诱导使 mRNA 的转录编码期望基因产物， 并且如果两个 DNA 片段之间的接头的性质不干扰表达调节 序列引导基因产物表达的能力或干扰 DNA 模板被转录的能力， 则两个 DNA 片段 ( 例如多肽编码区域和与之连接的启动子 ) 被 “可操作地连接” 。因此， 如果启动子能够影响核酸的转 录， 则该启动子区域将被可操作地连接至编码多肽的核酸。该启动子可以是仅能在预定细 胞中引导 DNA 的充分转录的细胞特异性启动子。除启动子外的其他转录控制元件， 如增强 子、 操作子、 阻遏子以及转录终止信号可与多核苷酸进行可操作连接以引导细胞特异性转 录。本文中披露了合适的启动子和其他转录控制区。
     各种转录控制区域已为本领域技术人员所熟知。 其包括但不限于在脊椎动物细胞 中起作用的转录控制区域， 例如但不限于来自细胞巨化病毒的启动子和增强子片段 ( 立即 早期启动子， 与内含子 -A 相连接 )、 猿病毒 40( 早期启动子 ) 以及逆转录酶病毒 ( 例如禽 劳斯肉瘤病毒 )。其他的转录控制区域包括衍生自肌动蛋白、 热休克蛋白、 牛生长激素和兔 β- 球蛋白的脊椎动物基因的区域以及其他能够在真核细胞中控制基因表达的序列。其他 合适的转录控制区域包括组织特异性启动子和增强子以及淋巴因子 - 诱导型启动子 ( 例如 受干扰素或白介素诱导的启动子 )。
     类似地， 各种转译控制元件已为本领域普通技术人员所熟知。其包括但不限于核 糖体结合位点、 转译启动和终止密码子以及衍生自小核糖核酸病毒的元件 ( 特别是内部核 糖体进入位点或是 IRES， 也被称为 CITE 序列 )。
     在其他的实施方案中， 本发明的核苷酸为 RNA 分子， 例如以信使 RNA(mRNA) 的形式 存在。
     本发明的多核苷酸和核酸编码区可与编码分泌腺或信号肽的附加编码区 ( 引导 本发明的多核苷酸编码的多肽的分泌 ) 相连接。根据信号假设， 由哺乳动物细胞分泌的蛋 白具有信号肽或分泌型前导序列， 后者在生长蛋白链向粗面内质网的输出被启动时从成熟 蛋白上被裂解。 本领域普通技术人员均了解由脊椎动物细胞分泌的多肽通常具有融合到多 肽 N 末端的信号肽， 它从完整或 “全长” 多肽序列裂解以生产分泌或 “成熟” 型多肽。在某 些实施方案中采用了如免疫球蛋白重链或轻链信号肽等天然信号肽， 或保留了引导与之可 操作连接的多肽分泌能力的该序列的功能性衍生物。可选择地， 还可以使用外源哺乳动物 信号肽或其功能性衍生物。例如， 野生型前导序列可被人组织型纤溶酶原激活剂 (TPA) 或 鼠 β- 葡萄糖醛酸酶的前导序列替换。在一个实施方案中， 本发明的结合分子是缺少信号 肽的成熟形式的分子。
     此外， 如本文中别处详细描述的， 本发明包括组合物， 包含上述一种或多种多核苷 酸。
     III. 结合分子的示例性形式
     A. 抗 -LT 抗体
     在某些实施方案中， 本发明的 LT 结合分子是抗体。考虑到本申请中公开的数据， 明显的是可以制备结合 LT 并且优于之前产生的那些抗体的抗体。在一个实施方案中， 本 发明涉及和本文披露的那些功能上相关的抗体。在一个实施方案中， 本发明涉及和本文披 露的那些结构上相关的抗体。在另外的实施方案中， 本发明涉及和本文披露的那些功能上 和结构上相关的抗体。本发明的抗体可通过本领域已知的用于合成抗体的方法来制备， 特 别是通过化学合成或优选通过本文所述的重组技术来制备。例如， 本领域技术人员可使用 熟知技术来筛选抗体 - 产生细胞系并培养。这些技术描述于多种多本试验手册和初级出 版物中。就此而言， 上述适用于本发明的技术描述于 Current Protocols in Immunology，Coligan et al.， Eds.， Green Publishing Associates and Wiley-Interscience， John Wiley and Sons， New York(1991)， 其通过引用的方式全文 ( 包括附录 ) 并入本文中。
     本发明的另一实施方案包含在不能生成内源免疫球蛋白的转基因动物 ( 例如， 鼠 ) 体内生成人或实质人抗体 ( 例如， 参见美国专利 No.6,075,181， 5,939,598， 5,591,669 和 5,589,369， 均通过引用的方式并入本文中 )。例如， 据描述在嵌合和胚系突变小鼠中的 抗体重链结合区的纯合子缺失可导致内源抗体生产的完全抑制。 人免疫球蛋白基因阵列向 该胚系突变小鼠的转移可导致在抗原攻击下的人抗体生产。另一使用 SCID 鼠生成人抗体 的优选方法可参见美国专利 No.5,811,524， 该文献通过引用的方式并入本文中。应当可以 理解与这些人抗体相关的遗传材料也可以依照此处所述进行分离和操作。
     在另一个实施方案中， 可通过显微操作选择淋巴细胞并分离可变基因。 例如， 可从 免疫哺乳动物分离外周血单核细胞并在体外培养大约 7 天。筛选该培养物以获得达到筛选 标准的特异性 IgG。可对阳性孔的细胞进行分离。可通过 FACS 或补体介导的溶血空斑检测 的鉴定分离得到生产 Ig 的单独 B 细胞。可通过显微操作将生成 Ig 的 B 细胞转移至试管， 并可采用 RT-PCR 等方法扩增 VH 和 VL 基因。将 VH 和 VL 基因克隆至抗体表达载体并转染 进入细胞 ( 例如， 真核或原核细胞 ) 以进行表达。
     在某些实施方案中， LT 抗体的可变区和恒定区、 或其抗原结合片段、 变体或衍生物 均为完全人源。完全人源抗体可通过本领域已知的以及本文中描述的技术进行制备。例 如， 针对特异性抗原的完全人源抗体可通过向经修饰在应答抗原性攻击时生产该种抗体同 时其内源性基因座被灭活的转基因动物施用抗原进行制备。 可用于制备该种抗体的示例性 技术参见美国专利 6,150,584、 6,458,592、 6,420,140。其他的技术已为本领域所知。如本 文其他部分将作更具体讨论， 完全人源抗体还可通过各种展示技术进行制备， 例如噬菌体 展示或其他病毒展示系统。
     目标抗原抗原的多克隆抗体可通过各种本领域公知的方法生产。例如， 包含目标 抗原抗原的抗原可施用至各种宿主动物， 包括但不限于兔子、 小鼠、 大鼠、 鸡、 仓鼠、 山羊、 驴 等， 以诱导包含了对该抗原特异的多克隆抗体的血浆的生产。依据宿主种类不同， 各种佐 剂可用于提高免疫应答， 其包括但不限于弗氏试剂 ( 完全或不完全 )， 矿物凝胶 ( 如氢氧化 铝 )， 表面活性物质如溶血卵磷脂， pluronic 多元醇， 聚阴离子， 肽， 油乳剂， 匙孔血蓝蛋白， 二硝基酚以及潜在有用的人佐剂如 BCG( 卡介苗 ) 和短小棒状杆菌。该类佐剂也是本领域 熟知的。
     单克隆 抗体可通过本领域已知的多种技术进行制备， 包括杂交瘤， 重组和噬 菌体展示技术的应用及其组合。例如， 单克隆抗体可通过本领域已知的杂交瘤技术进行 生产， 该技术还在许多文献中得到描述， 例如 Harlow et al.， Antibodies ： A Laboratory Manual， Cold Spring Harbor Laboratory Press， 2nd ed.(1988) ； Hammerling et al.， in ： Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas Elsevier， N.Y.， 563-681(1981)( 所述 参考文献以引用的方式全部并入 )。本文中所用的术语 “单克隆抗体” 不限于通过杂交瘤 技术生产的抗体。术语 “单克隆抗体” 指由单个克隆 ( 包括真核、 原核或噬菌体克隆 ) 得到 的抗体， 而非它的生产方法。因此， 术语 “单克隆抗体” 不限于通过杂交瘤技术生产的抗体。 单克隆抗体可采用 LT 敲除小鼠生产以增加抗原表位识别的区域。单克隆抗体可通过本领 域已知的多种技术进行制备， 包括本文其他部分所述的杂交瘤和重组和噬菌体展示技术的应用。 在一个实施例中， 采用本领域认可的方案， 通过多次皮下或腹腔注射相关抗原 ( 例如， 纯化的 LTα1β2 或包含 LTα1β2 的细胞表达或细胞萃取物 ) 和佐剂在哺乳动物体 内产生抗体。 该免疫作用通常可引发包含了从激活的脾细胞或淋巴细胞产生抗原反应抗体 的免疫应答。 尽管可从动物血浆获取所得的抗体以进行多克隆制备， 通常期望可从脾脏、 淋 巴结或外周血分离单独的淋巴细胞以进行单克隆抗体 (MAb) 的均一制备。优选地， 该淋巴 细胞从脾脏中获取。在该种众所周知的方法中 (Kohler et al.， Nature 256 ： 495(1975))， 该取自注射了抗原的哺乳动物的相对短命或终会死亡的淋巴细胞与一个永生肿瘤细胞系 ( 例如， 骨髓瘤细胞系 ) 相融合， 从而得到了永生的并能生产 B 细胞的转基因编码抗体的杂 交细胞或 “杂交瘤” 。 所得的杂交物通过对包含了能够形成单独抗体的特定基因的单独株系 进行挑选， 稀释和再生而分离得到单独遗传株系。 它们可生产针对目标抗原的相似抗体， 并 由于其单纯的遗传亲缘而被称为 “单克隆” 。
     将由此制备的杂交瘤细胞接种和培养至适当的培养基中， 该培养基优选包含一种 或多种抑制未融合的， 亲代骨髓瘤细胞生长或存活的物质。本领域的技术人员均了解用于 杂交瘤形成， 挑选和培养的试剂， 细胞系和培养基可从多个来源购买， 且已充分建立了标准 化的方案。通常对杂交瘤细胞生长的培养基进行分析以测定针对目标抗原的单克隆抗体 的生产。优选地， 由杂交瘤细胞生产的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀， 放射性免 疫测定 (RIA) 或酶联免疫吸收分析 (ELISA) 等体外分析进行测定。当杂交瘤经鉴定能够生 产具有所需特异性， 亲和性和 / 或活性的抗体后， 该克隆可通过有限稀释法进行亚克隆并 以标准方法培养 (Goding， Monoclonal Antibodies ： Principles and Practice， Academic Press， pp 59-103(1986))。进一步会了解， 由亚克隆分泌的单克隆抗体可通过蛋白 -A、 羟 基磷灰石层析、 凝胶电泳、 透析或亲和层析等传统方法进行纯化， 从培养基、 腹水或血清中 分离。
     本领域技术人员还可理解编码抗体或抗体片段 ( 例如， 抗原结合位点 ) 的 DNA 还 可以从抗体库 ( 例如噬菌体展示库 ) 获得。 特别地， 该种噬菌体可特别用于展示由抗体库或 组合抗体库 ( 例如， 人或鼠 ) 表达的抗原结合结构域。 表达结合目标抗原的抗原结合结构域 的噬菌体可通过抗原 ( 例如， 采用标记抗原或者固体表面或珠子结合或捕获的抗原 ) 进行 选择或鉴别。在这些方法中使用的噬菌体通常为丝状噬菌体， 包括 fd 和 M13 结合区， 该结 合区可由 Fab， Fv OE DAB( 单独轻或重链 Fv 区 ) 或二硫键稳定的 Fv 抗体结构域融合至噬 菌体基因 III 或基因 VIII 蛋白的噬菌体进行表达。示例性方法可参见例如 EP 368684B1 ； 美 国 专 利 5,969,108， Hoogenboom， H.R. 和 Chames， Immunol.Today21 ： 371(2000) ； Nagy et al.Nat.Med.8 ： 801(2002) ； Huie et al.， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98 ： 2682(2001) ； Lui et al.， J.Mol.Biol.315 ： 1063(2002)， 其均通过引用的方式并入本文中。许多文献 ( 例如 Marks et al.， Bio/Technology10 ： 779-783(1992)) 均已描述了通过链替换， 以及 作为构建大型噬菌体库的策略的组合感染和体内重组对高亲和性人抗体的生产。在另一 实施方案中， 可采用核糖体展示替代噬菌体作为展示平台 ( 例如参见 Hanes et al.， Nat. Biotechnol.18 ： 1287(2000) ； Wilson et al.， Proc.Natl.Acad.Sci.USA98 ： 3750(2001) ； 或 Irving et al.， J.Immunol.Methods 248 ： 31(2001))。在又一实施方案中， 可通过细胞 表面库筛选抗体 (Boder et al.， Proc.Natl.Acad.Sci.USA97 ： 10701(2000) ； Daugherty et
     al.， J.Immunol.Methods 243 ： 211(2000))。在又一示例性实施方案中， 高亲和性人 Fab 库 有下列表示 ： 联合衍生自人供体的免疫球蛋白序列和选择的互补决定区例如 CDR H1 和 CDR H2 中的合成多样性 ( 参见例如 Hoet et al.， Nature Biotechnol.， 23 ： 344-348(2005)， 其 均通过引用的方式并入本文中 )。该类方法可为用于单克隆抗体的分离和后续克隆的传统 杂交瘤技术提供替代方法。
     在噬菌体展示方法中， 功能性抗体区被展示在携带了对其编码的多聚核苷酸序列 的噬菌体颗粒的表面上。例如， 可从动物 cDNA 库 ( 例如， 人或鼠淋巴组织 cDNA 库 ) 或合成 cDNA 库扩增或以其他方式分离编码 VH 和 VL 区的 DNA 序列。在某些实施方案中， 该编码 VH 和 VL 区的 DNA 在 PCR 中通过 scFv 接头相连接并被克隆进入噬菌粒载体 ( 例如， p CANTAB 6 或 pComb 3 HSS)。将该载体导入 E.coli 并以辅助噬菌体感染该 E.coli。这些方法中所 用的噬菌体通常为丝状噬菌体， 包括 fd 和 M13， 通常将 VH 或 VL 区重组融合至噬菌体基因 III 或基因 VIII。表达能够结合目标抗原 ( 即， LT 多肽或其片段 ) 的抗原结合结构域的噬 菌体可通过抗原 ( 例如， 采用标记抗原或者固体表面或珠子结合或捕获的抗原 ) 进行选择 或鉴别。
     可用于制备该抗体的噬菌体展示方法的附加例子包括下列中披露的那些 ： Brinkman et al.， J.Immunol.Methods 182 ： 41-50(1995) ； Ames et al.， J.Immunol. Methods 184 ： 177-186(1995) ； Kettleborough et al. ，Eur.J.Immunol.24 ： 952-958(1994) ； Persic et al.， Gene 187 ： 9-18(1997) ； Burton et al.， Advances in Immunology 57 ： 191-280(1994) ； PCT 申 请 No.PCT/GB91/01134 ； PCT 公 开 WO90/02809 ； WO 91/10737 ； WO 92/01047 ； WO 92/18619 ； WO 93/11236 ； WO95/15982 ； WO 95/20401 ；和 美 国 专 利 No.5,698,426 ； 5,223,409 ； 5,403,484 ； 5,580,717 ； 5,427,908 ； 5,750,753 ； 5,821,047 ； 5,571,698 ； 5,427,908 ； 5,516,637 ； 5,780,225 ； 5,658,727 ； 5,733,743 和 5,969,108 ； 其均以引用的方式全部并入本文中。
     如上述参考文献所述， 在噬菌体筛选后， 可从该噬菌体分离该抗体编码区并用于 生成包括人抗体或任何其他目标抗原结合片段的完整抗体， 并在包括哺乳动物细胞， 昆虫 细胞， 植物细胞， 酵母和细菌的目标宿主中表达。 例如， 用于重组生产 Fab、 Fab′和 F(ab′ )2 片段的技术也可采用本领域已知的技术， 例如参见 PCT 公开 WO 92/22324 ； Mullinax et al.， BioTechniques12(6) ： 864-869(1992) ； 和 Sawai et al.， AJRI 34 ： 26-34(1995) ； 和 Better et al.， Science 240 ： 1041-1043(1988)( 所述参考文献以引用的方式全部并入 )。
     可 用 于 生 产 单 链 Fvs 和 抗 体 的 技 术 例 子 可 参 见 美 国 专 利 No.4,946,778 和 5,258,498 ； Huston et al.， Methods in Enzymology 203 ： 46-88(1991) ； Shu et al.， PNAS 90 ： 7995-7999(1993) ； 和 Skerra et al.， Science 240 ： 1038-1040(1988)。 对于某些用途， 包括抗体在人体的体内应用和体外检测分析， 可优选使用嵌合， 人源化或人源抗体。
     完整人类抗体可特别用于人类患者的治疗。人类抗体可通过本领域已知的多 种方法制备， 包括上述采用来自人免疫球蛋白序列的抗体库进行的噬菌体展示方法。还 可参见美国专利 No.4,444,887 和 4,716,111 ； 和 PCT 公开 WO98/46645， WO 98/50433， WO 98/24893， WO 98/16654， WO 96/34096， WO96/33735， 和 WO 91/10741 ； 其均以引用的方式全 部并入本文中。
     人类抗体还可采用不能表达功能性内源免疫球蛋白， 但能表达人免疫球蛋白基因的转基因鼠进行生产。例如， 人重链和轻链免疫球蛋白基因复合物可随机导入或通过同源 重组进入鼠胚胎干细胞。可选择地， 除人重链和轻链基因外， 还可将人可变区， 恒定区和多 样区导入鼠胚胎干细胞。 鼠重链和轻链免疫球蛋白基因可通过同源重组导入的人免疫球蛋 白基因座进行单独或同时的非功能性修饰。特别地， JH 区纯合子的删除防止了内源抗体的 生产。扩增该修饰后的胚胎干细胞并注射进入胚泡以生产嵌合鼠。然后饲养该嵌合鼠以生 产表达人抗体的纯合子型后代。该转基因鼠以选择抗原 ( 例如所需靶多肽的全部或部分 ) 通过常规方式进行免疫。 针对该抗原的单克隆抗体可采用常规杂交瘤技术从免疫后的转基 因鼠获取。转基因鼠包含的人免疫球蛋白转基因在 B- 细胞分化时重排， 随后进行类型转 换和体细胞突变。因此， 通过该种技术可生产治疗有效的 IgG、 IgA、 IgM 和 IgE 抗体。该技 术生产人类抗体的综述可参见 Lonberg and Huszar Int.Rev.Immunol.13 ： 65-93(1995)。 对技术用于生产人类抗体和人类单克隆抗体以及生产该类抗体的方案的具体讨论可参见 PCT 公开 WO 98/24893 ； WO 96/34096 ； WO 96/33735 ； 美国专利 No.5,413,923 ； 5,625,126 ； 5,633,425 ； 5,569,825 ； 5,661,016 ； 5,545,806 ； 5,814,318 ； 和 5,939,598， 其以引用的方 式 全 部 并 入 本 文 中。 此 外， 可 委 托 Abgenix， Inc.(Freemont， Calif.) 和 GenPharm(San Jose， Calif.) 等公司通过与上述类似的技术提供针对选定抗原的人类抗体。 识别选定抗原表位的完整人类抗体可通过称为 “定向选择” 的技术进行生产。在 该方法中采用一种选定的非人类单克隆抗体 ( 例如， 鼠抗体 ) 引导识别相同表位的完整人 类抗体的筛选。(Jespers et al.， Bio/Technology12 ： 899-903(1988)。还可参见美国专利 No.5,565,332)。
     ″亲和性 - 成熟的″抗体是和未具有这些改变的父代抗体相比， 在其一个或多种 CDR 中具有一个或多个改变从而导致抗体和抗原的亲和性改善的抗体。优选亲和性 - 成熟 的抗体对于靶抗原具有纳摩尔或甚至皮摩尔的亲和性。亲和性 - 成熟的抗体通过本领域已 知的方法来制备。Marks et al Bio/Technology 10 ： 779-783(1992) 描述了通过 VH 和 VL 结构域的缓慢移动而引起亲和性成熟。CDR 和 / 或框架残基的随机突变由下列文献描述 ： Barbas et al， ProcNat.Acad.Sci， USA 91 ： 3809-3813(1994) ； Schier et al.， Gene169 ： 147-155(1995) ； Yelton et al， J.Immunol.155 ： 1994-2004(1995) ； Jackson et al， J.Immunol.154.7) ： 3310-9(1995) ； 和 Hawkins et al， J.MoI Biol.226 ： 889-896(1992)。
     B. 单链结合分子
     在其他实施方案中， 本发明的结合分子可以是单链结合分子 ( 例如单链可变区 或 scFv)。描述用于制备单链抗体的技术 ( 美国专利 No.4,694,778 ； Bird， Science 242 ： 423-442(1988) ； Huston et al.， Proc.Natl.Acad.Sci.USA85 ： 5879-5883(1988) ； 和 Ward et al.， Nature 334 ： 544-554(1989)) 可适于制备单链结合分子。可通过氨基酸桥连接 Fv 区的重链和轻链片段从而生成单链抗体来制备单链抗体。 也可采用在大肠杆菌内组装功能 Science 242 ： 1038-1041(1988))。 性 Fv 片段的技术 (Skerra et al.，
     在某些实施方案中， 本发明的结合分子是 scFv 分子 ( 例如连接 scFv 接头的来自 本发明的抗 -LT 抗体的 VH 和 VL 结构域 ) 或包含这些分子。scFv 分子可以是常规 scFv 分 子或稳定的 scFv 分子。稳定的 scFv 包含稳定突变、 二硫键或赋予 scFv 或包含 scFv 的结 合分子改善的稳定性 ( 例如改善的热稳定性 ) 的优化的接头， 其详细描述于美国专利申请 No.11/725,970， 其以引用的方式全部并入本文中。
     在其他实施方案中， 本发明的结合分子是包含 scFv 分子的多肽。在某些实施方 案中， 多特异性结合分子可通过下列方式产生 ： 使 scFv 分子 ( 例如稳定的 scFv 分子 ) 连 接上文所述的抗 -LT 抗体、 或包含一种抗 -LT 抗体的结合位点的单特异性结合分子， 其中 scFv 分子和父代结合分子具有相同的结合特异性。在一个实施方案中， 本发明的结合分子 是 scFv 分子已经融合的天然存在的抗 -LT 抗体。
     稳定的 scFv 分子具有改善的热稳定性 ( 例如熔融温度 (Tm) 值大于 54℃ ( 例如 55， 56， 57， 58， 59， 60℃或更高 ) 或者 T50 值大于 39℃ ( 例如 40， 41， 42， 43， 44， 45， 46， 47， 48， 50， 51， 52， 53， 54， 55， 56， 57， 58 或 59℃ )。本发明的 scFv 分子或者包含它们的融合蛋白的 稳定性可参照常规 ( 非稳定的 )scFv 分子或包含常规 scFv 分子的结合分子的生物物理学 性能 ( 例如热稳定性 ) 来评价。在一个实施方案中， 本发明的结合分子的热稳定性为 ： 比 对照结合分子 ( 例如常规 scFv 分子 ) 高约 0.1， 约 0.25， 约 0.5， 约 0.75， 约 1， 约 1.25， 约 1.5， 约 1.75， 约 2， 约 3， 约 4， 约 5， 约 6， 约 7， 约 8， 约 9 或约 10 摄氏度。
     在一个实施方案中， scFv 接头由氨基酸序列 (Gly4Ser)4 构成或包含 (Gly4Ser)4 序 列。其他示例性接头包含或由 (Gly4Ser)3 与 (Gly4Ser)5 序列构成。本发明的 scFv 接头的 长度可改变。在一个实施方案中， 本发明的 scFv 接头的长度为约 5 至约 50 个氨基酸。在 另外的实施方案中， 本发明的 scFv 接头的长度为约 10 至约 40 个氨基酸。在另外的实施方 案中， 本发明的 scFv 接头的长度为约 15 至约 30 个氨基酸。在另外的实施方案中， 本发明 的 scFv 接头的长度为约 17 至约 28 个氨基酸。在另外的实施方案中， 本发明的 scFv 接头 的长度为约 19 至约 26 个氨基酸。在另外的实施方案中， 本发明的 scFv 接头的长度为约 21 至约 24 个氨基酸。
     在某些实施方案中， 本发明的稳定的 scFv 分子包含至少一种二硫键， 其使 VL 结构 域中的氨基酸连接 VH 结构域中的氨基酸。半胱氨酸残基对于提供二硫键是必须的。二硫 键可引入本发明的 scFv 分子， 例如以连接 VL 的 FR4 和 VH 的 FR2 或连接 VL 的 FR2 和 VH 的 FR4。 二硫键结合的示例性位置包括 ： VH 的 43， 44， 45， 46， 47， 103， 104， 105 和 106 以及 VL 的 42， 43， 44， 45， 46， 98， 99， 100 和 101， Kabat 编号。半胱氨酸残基突变的氨基酸位置的示例 性组合包括 ： VH44-VL100， VH105-VL43， VH105-VL42， VH44-VL101， VH106-VL43， VH104-VL43， VH44-VL99， VH45-VL98， VH46-VL98， VH103-VL43， VH103-VL44 和 VH103-VL45。在一个实施 方案中， 二硫键连接 VH 氨基酸 44 和 VL 氨基酸 100。
     在一个实施方案中， 本发明的稳定的 scFv 分子包含具有夹置在 VH 结构域和 VL 结 构域之间的氨基酸序列 (Gly4Ser)4 的 scFv 接头， 其中 VH 和 VL 结构域通过氨基酸位 44 的 VH 中的氨基酸和氨基酸位 100 的 VL 中的氨基酸之间的二硫键连接。
     在其他实施方案中， 本发明的稳定的 scFv 分子包含 scFv 的可变结构域 (VH 或 VL) 内的一个或多个 ( 例如 2， 3， 4， 5 或更多 ) 稳定突变。在一个实施方案中， 稳定突变选自 ： a) 在 VL 的 Kabat 位 3 氨基酸 ( 例如谷氨酰胺 ) 被例如丙氨酸， 丝氨酸， 缬氨酸， 天冬氨酸 或甘氨酸取代 ； (b) 在 VL 的 Kabat 位 46 氨基酸 ( 例如丝氨酸 ) 被例如亮氨酸取代 ； (c) 在 VL 的 Kabat 位 49 氨基酸 ( 例如丝氨酸 ) 被例如酪氨酸或丝氨酸取代 ； (d) 在 VL 的 Kabat 位 50 氨基酸 ( 例如丝氨酸或缬氨酸 ) 被例如丝氨酸， 苏氨酸和精氨酸， 天冬氨酸， 甘氨酸或 赖氨酸取代 ； (e) 在 VL 的 Kabat 位 49 氨基酸 ( 例如丝氨酸 ) 和 Kabat 位 50( 例如丝氨酸 ) 分别被例如酪氨酸和丝氨酸 ； 酪氨酸和苏氨酸 ； 酪氨酸和精氨酸 ； 酪氨酸和甘氨酸 ； 丝氨酸和精氨酸 ； 或丝氨酸和赖氨酸取代 ； (f) 在 VL 的 Kabat 位 75 氨基酸 ( 例如缬氨酸 ) 被例如 异亮氨酸取代 ； (g) 在 VL 的 Kabat 位 80 氨基酸 ( 例如脯氨酸 ) 被例如丝氨酸或甘氨酸取 代； (h) 在 VL 的 Kabat 位 83 氨基酸 ( 例如苯丙氨酸 ) 被例如丝氨酸， 丙氨酸， 甘氨酸或苏氨 酸取代 ； (i) 在 VH 的 Kabat 位 6 氨基酸 ( 例如谷氨酸 ) 被例如谷氨酰胺取代 ； (j) 在 VH 的 Kabat 位 13 氨基酸 ( 例如赖氨酸 ) 被例如谷氨酸盐取代 ； (k) 在 VH 的 Kabat 位 16 氨基酸 ( 例如丝氨酸 ) 被例如谷氨酸盐或谷氨酰胺取代 ； (l) 在 VH 的 Kabat 位 20 氨基酸 ( 例如缬 氨酸 ) 被例如异亮氨酸取代 ； (m) 在 VH 的 Kabat 位 32 氨基酸 ( 例如天冬酰胺 ) 被例如丝 氨酸取代 ； (n) 在 VH 的 Kabat 位 43 氨基酸 ( 例如谷氨酰胺 ) 被例如赖氨酸或精氨酸取代 ； (o) 在 VH 的 Kabat 位 48 氨基酸 ( 例如蛋氨酸 ) 被例如异亮氨酸或甘氨酸取代 ； (p) 在 VH 的 Kabat 位 49 氨基酸 ( 例如丝氨酸 ) 被例如甘氨酸或丙氨酸取代 ； (q) 在 VH 的 Kabat 位 55 氨基酸 ( 例如缬氨酸 ) 被例如甘氨酸取代 ； (r) 在 VH 的 Kabat 位 67 氨基酸 ( 例如缬氨 酸 ) 被例如异亮氨酸或亮氨酸取代 ； (s) 在 VH 的 Kabat 位 72 氨基酸 ( 例如谷氨酸 ) 被被 例如天冬氨酸或天冬酰胺取代 ； (t) 在 VH 的 Kabat 位 79 氨基酸 ( 例如苯丙氨酸 ) 被被例 丝氨酸， 缬氨酸或酪氨酸取代 ； 以及 (u) 在 VH 的 Kabat 位 101 氨基酸 ( 例如脯氨酸 ) 被例 如天冬氨酸取代。
     C. 单结构域结合分子
     在某些实施方案中， 结合分子是或包含单结构域结合分子 ( 例如单结构域抗体 )， 也称为纳米抗体。示例性单结构域分子包括抗体的分离的重链可变结构域 (VH)， 即重链 可变结构域并且没有轻链可变结构域 ； 和抗体的分离的轻链可变结构域 (VL)， 即轻链可变 结构域没有重链可变结构域。本发明的结合分子中使用的示例性单结构域抗体包括例如 Camelid 重链可变结构域 ( 约 118 至 136 个氨基酸残基 )， 如 Hamers-Casterman， et al.， Nature363 ： 446-448(1993) 和 Dumoulin， et al.， Protein Science 11 ： 500-515(2002) 中 所述。单结构域抗体的多聚体也在本发明的范围内。其他单结构域抗体包括 shark 抗体 ( 例如 shark Ig-NAR)。Shark Ig-NAR 包含一个可变结构域 (V-NAR) 和五个 C- 样恒定结 构域 (C-NAR) 的同源二聚体， 其中多样性集中在长度从 5 至 23 个残基变化的延长的 CDR3 区域中。在 camelid 物种 ( 例如骆驼 ) 中， 重链可变区， 称为 VHH， 形成完整抗原结合结构 域。camelid VHH 可变区和衍生自常规抗体 (VH) 的那些之间的主要差异包括 ： (a) 和 VHH 中的对应区域相比， VH 的轻链接触表面中的氨基酸更具疏水性 ； (b)VHH 中更长的 CDR3 ； 以 及 (c)VHH 中 CDR1 和 CDR3 之间的二硫键频繁出现。制备单结构域结合分子的方法描述于 美国专利 Nos 6.005,079 和 6,765,087， 其均以引用的方式全部并入本文中。
     D. 微抗体
     在某些实施方案中， 本发明的结合分子是微抗体或包含微抗体。微抗体可使用本 领域所述的方法来制备 ( 例如参见美国专利 5,837,821 或 WO94/09817A1)。 在某些实施方案 中， 微抗体是仅包含天然或天然 ( 例如诱变 ) 存在的重链可变结构域或轻链可变结构域、 或 其组合的 2 个互补决定区 (CDR) 的结合分子。这种微抗体的例子由 Pessi et al.， Nature 362 ： 367-369(1993) 所述。另外示例性微抗体包含连接或融合 CH3 结构域或完整 Fc 区的 scFv 分子。微抗体的多聚体也在本发明的范围内。
     E. 结合分子片段
     除非明确说明， 本文中涉及结合分子使用的″片段″是指抗原结合片段， 即特异性结合抗原的结合的一部分。在一个实施方案中， 本发明的结合分子是抗体片段或包含这 种片段。识别特异性抗原表位的抗体片段可通过已知的技术来产生。例如， 可采用木瓜蛋 白酶 ( 生产 Fab 片段 ) 或胃蛋白酶 ( 生产 F(ab′ )2 片段 ) 等酶通过蛋白水解裂解免疫球 蛋白分子或重组生产 Fab 和 F(ab′ )2 片段。F(ab′ )2 片段包含了可变区， 轻链恒定区和 重链 CH1 区。
     F. 多价微抗体
     在一个实施方案中， 本发明的多特异性结合分子是具有至少一种 scFv 片段 ( 第一 结合位点 ) 和具有第二结合位点的至少一种 scFv 的多价微抗体。两种 scFv 分子的结合位 点可以相同或不同。在优选的实施方案中， 至少一种 scFv 分子稳定化。示例性双特异性二 价微抗体构建体包含 CH3 结构域， 其在其 N- 末端融合连接肽， 所述连接肽在其 N- 末端融合 VH 结构域， 所述 VH 结构域在其 N- 末端融合 (Gly4Ser)n 柔性接头， 所述接头在其 N- 末端融 合 VL 结构域。在某些实施方案中， 多价微抗体可以是二价、 三价 ( 例如三价抗体 )， 双特异 性 ( 例如二价抗体 ) 或四价的 ( 例如四价抗体 )。
     在另外的实施方案中， 本发明的结合分子是 scFv 四价微抗体， scFv 四价微抗体的 各重链部分含有具有不同结合特异性的第一和第二 scFv 片段。在优选的实施方案中， 至少 一种 scFv 分子稳定化。所述第二 scFv 片段可连接第一 scFv 片段的 N- 末端 ( 例如双特异 性 NH scFv 四价微抗体或双特异性 NL scFv 四价微抗体 )。或者， 第二 scFv 片段可连接含 有所述第一 scFv 片段的所述重链部分的 C- 末端 ( 例如双特异性 C-scFv 四价微抗体 )。尽 管双特异性四价微抗体的第一重链部分的第一和第二 scFv 片段结合相同靶 LT 分子， 双特 异性四价微抗体的第二重链部分的第一和第二 scFv 片段中的至少一种可结合相同或不同 的 LT 靶分子。
     G. 多特异性抗体
     本发明的多特异性结合分子可包含至少两个结合位点， 其中至少一种结合位点衍 生自或包含上述单特异性结合分子中的一种的结合位点。在某些实施方案中， 本发明的多 特异性结合分子的至少一种结合位点是抗体的抗原结合区域或其抗原结合片段 ( 例如上 述抗体或抗原结合片段 )。
     在某些实施方案中， 本发明的多特异性结合分子是双特异性的。双特异性结 合分子可是双价的或更高价的 ( 例如三价、 四价、 六价等 )。双特异性二价抗体、 它们的 制备方法例如描述于美国专利 No.5,731,168 ； 5,807,706 ； 5,821,333 ； 和美国申请公开 No.2003/020734 和 2002/0155537， 公开内容均以引用的方式全部并入本文中。双特异性四 价抗体、 它们的制备方法例如描述于例如 WO 02/096948 和 WO 00/44788， 公开内容均以引 用的方式全部并入本文中。通常参见 PCT 公开 WO 93/17715 ； WO 92/08802 ； WO 91/00360 ； WO 92/05793 ； Tutt et al.， J.Immunol.147 ： 60-69(1991) ；美 国 专 利 No.4,474,893 ； 4,714,681 ； 4,925,648 ； 5,573,920 ； 5,601 ， 819 ； Kostelny et al. ， J.Immunol.148 ： 1547-1553(1992)。
     H. 含 scFv 的多特异性结合分子
     在一个实施方案中， 本发明的多特异性结合分子是多特异性结合分子， 包含至少 一种 scFv 分子， 例如上述 scFv 分子。在其他实施方案中， 本发明的多特异性结合分子包含 两种 scFv 分子， 例如双特异性 scFv(Bis-scFv)。 在某些实施方案中， scFv 分子是常规 scFv分子。在其他实施方案中， scFv 分子是上述稳定的 scFv 分子。在某些实施方案中， 多特异 性结合分子可通过下列方式来产生 ： 连接 scFv 分子 ( 例如稳定的 scFv 分子 ) 和上述抗 -LT 抗体， 或单特异性结合分子， 包含一种抗 -LT 抗体的结合位点， 其中 scFv 分子和父代结合分 子结合 LT 的不同区域 / 具有不同关键的 LT 接触残基。在一个实施方案中， 本发明的结合 分子是天然存在的抗 -LT 抗体， 其已经融合 scFv 分子。在一个实施方案中， 这种 scFv 分子 是稳定的。
     当稳定的 scFv 连接父代结合分子时， 稳定的 scFv 分子的连接优选使结合分子的 热稳定性改善至少约 2℃或 3℃。在一个实施方案中， 本发明的含 scFv 的结合分子和常规 结合分子相比具有改善 1℃的热稳定性。 在另外的实施方案中， 本发明的结合分子和常规结 合分子相比具有改善 2℃的热稳定性。 在另外的实施方案中， 本发明的结合分子和常规结合 分子相比具有改善 4， 5， 6℃的热稳定性。
     在一个实施方案中， 本发明的结合分子是稳定的 “抗体” 或 “免疫球蛋白” 分子， 例 如天然存在的抗体或免疫球蛋白分子 ( 或其抗原结合片段 ) 或基因工程改造的抗体分子， 其以和抗体分子类似的方式结合抗原并且包含本发明的 scFv 分子。如本文中使用的， 术 语″免疫球蛋白″包括具有两个重链和两个轻链的组合的多肽， 无论是否具有任何相关的 特异性免疫反应性。
     在一个实施方案中， 本发明的多特异性结合分子包含连接抗体重链的 C- 末端的 至少一种 scFv( 例如 2， 3 或 4scFvs， 例如稳定的 scFvs)， 其中 scFv 和抗体具有不同的结合 特异性。在另外的实施方案中， 本发明的多特异性结合分子包含连接抗体重链的 N- 末端的 至少一种 scFv( 例如 2， 3 或 4scFvs， 例如稳定的 scFvs)， 其中 scFv 和抗体具有不同的结合 特异性。在另外的实施方案中， 本发明的多特异性结合分子包含连接抗体轻链的 N- 末端的 至少一种 scFv( 例如 2， 3 或 4scFvs 或稳定的 scFvs)， 其中 scFv 和抗体具有不同的结合特 异性。在另外的实施方案中， 本发明的多特异性结合分子包含连接抗体重链或轻链的 N- 末 端的至少一种 scFv( 例如 2， 3 或 4scFvs 或稳定的 scFvs) 和连接重链的 C- 末端的至少一 种 scFv( 例如 2， 3 或 4scFvs 或稳定的 scFvs)， 其中 scFvs 具有不同的结合特异性。
     I. 多特异性二价抗体
     在其他实施方案中， 本发明的结合分子是多特异性二价抗体。 在一个实施方案中， 本发明的多特异性结合分子是双特异性二价抗体， 双特异抗体的各臂包含汇接 scFv 片段。 在优选的实施方案中， 至少一种 scFv 片段是稳定的。在一个实施方案中， 双特异性双特异 抗体可包含具有第一结合特异性的第一臂和具有第二结合特异性的第二臂。 在另外的实施 方案中， 双特异抗体的各臂可包含具有第一结合特异性的第一 scFv 片段和具有第二结合 特异性的第二 scFv 片段。在某些实施方案中， 多特异性双特异抗体可直接融合完整 Fc 区 或 Fc 部分 ( 例如 CH3 结构域 )。
     J. 多特异性结合分子片段
     在某些实施方案中， 本发明的结合分子片段可制成多特异性的。本发明的多特异 性结合分子包括双特异性 Fab2 或多特异性 ( 例如三特异性 )Fab3 分子。例如， 多特异性结 合分子片段可包含具有不同特异性的 Fab 或 scFv 分子的化学缀合的多聚体 ( 例如二聚体、 三聚体或四聚体 )。
     K.scFv2 四价抗体在其他实施方案中， 本发明的多特异性结合分子是 scFv2 四价抗体， scFv2 四价抗 体的各重链部分含有 scFv 分子。 在优选的实施方案中， 至少一种 scFv 分子是稳定的。 scFv 片段可以连接重链部分的可变区的 N- 末端 ( 例如 NH scFv2 四价抗体或 NL scFv2 四价抗 体 )。或者， scFv 片段可连接 scFv2 四价抗体的重链部分的 C- 末端。scFv2 四价抗体的各 重链部分可具有结合相同或不同靶 LT 分子或抗原表位可变区和 scFv 片段。在多特异性分 子的情况下， 如果 scFc2 四价抗体的第一重链部分的 scFv 片段和可变区结合相同靶分子或 抗原表位， 双特异性四价微抗体的第二重链部分的第一和第二 scFv 片段中的至少一种结 合不同靶分子或抗原表位。
     L. 汇接可变结构域结合分子
     在其他实施方案中， 本发明的多特异性结合分子可包含含有汇接抗原结合位点的 结合分子。例如， 可变结构域可包含 ： 抗体重链， 其工程化以包括直接串联融合或连接的至 少两个 ( 例如两个、 三个、 四个或更多 ) 可变重链结构域 (VH 结构域 ) ； 以及抗体轻链， 其工 程化以包括直接串联融合或连接的至少两个 ( 例如两个、 三个、 四个或更多 ) 可变轻链结构 域 (VL 结构域 )。VH 结构域和对应的 VL 结构域相互作用以形成一系列抗原结合位点， 其中 至少两个结合位点结合 LT 的相同或不同抗原表位。汇接可变结构域结合分子可包含两个 或多个重链或轻链， 并且具有高级价数 ( 例如二价或四价 )。 汇接可变结构域结合分子的制 备方法是本领域已知的， 例如参见 WO 2007/024715。 M. 多特异性融合蛋白
     在另外的实施方案中， 本发明的多特异性结合分子是多特异性融合蛋白。如本文 中使用的措词″多特异性融合蛋白″表示具有上述至少两种结合特异性的融合蛋白 ( 如 上面定义 )。多特异性融合蛋白可装配为例如异源二聚体， 异源三聚体或异源四聚体， 其基 本上公开于 WO 89/02922( 公开于 Apr.6， 1989)， EP 314,317( 公开于 May 3， 1989) 和美国 专利 No.5,116,964 公布于 May 2， 1992。优选多特异性融合蛋白是双特异性的。在某些实 施方案中， 多特异性融合蛋白的至少结合特异性包含 scFv 例如稳定的 scFv。
     本 领 域 技 术 人 员 使 用 常 规 重 组 DNA 技 术 来 开 发 多 种 其 他 多 价 抗 体 构 建 体， 如 公 开 于 PCT 国 际 申 请 No.PCT/US86/02269 ； 欧 洲 专 利 申 请 No.184,187 ； 欧洲专利申 请 No.171,496 ； 欧 洲 专 利 申 请 No.173,494 ； PCT 国 际 申 请 No.WO 86/01533 ； 美国专 利 No.4,816,567 ；欧 洲 专 利 申 请 No.125,023 ； Better et al.(1988)Science 240 ： 1041-1043 ； Liu et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84 ： 3439-3443 ； Liu et al.(1987) J.Immunol.139 ： 3521-3526 ； Sun et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84 ： 214-218 ； Nishimura et al.(1987)Cancer Res.47 ： 999-1005 ； Wood et al.(1985)Nature 314 ： 446-449 ； Shaw et al.(1988)J.Natl.Cancer Inst.80 ： 1553-1559) ； Morrison(1985) Science 229 ： 1202-1207 ； Oi et al.(1986)BioTechniques 4 ： 214 ； 美 国 专 利 No.5,225,539 ； Jones et al.(1986)Nature 321 ： 552-525 ； Verhoeyan et al.(1988) 1534 ； Beidleret al.(1988)J.Immunol.141 ： 4053-4060 ； 以 及 Winter and Science 239 ： Milstein， Nature， 349， pp.293-99(1991))。 优选非人抗体是连接非人抗原结合结构域和人 恒定结构域而 “人源化” 的 ( 例如 Cabilly et al.， 美国专利 No.4,816,567 ； Morrison et al.， Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.， 81， pp.6851-55(1984))。
     可用于制备多价抗体构建体的其他方法描述于下列公开文献 ： Ghetie，Maria-Ana et al.(2001)Blood 97 ： 1392-1398 ； Wolff， Edith A.et al.(1993)Cancer Research 53 ： 2560-2565 ； Ghetie， Maria-Ana et al.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.94 ： 7509-7514 ； Kim ，J.C.et al.(2002)Int.J.Cancer 97(4) ： 542-547 ； Todorovska ， Aneta et al.(2001)Journal of Immunological Methods 248 ： 47-66 ； Coloma M.J.et al.(1997)Nature Biotechnology 15 ： 159-163 ； Zuo ， Zhuang et al.(2000)Protein Engineering(Suppl.)13(5) ： 361-367 ； Santos A.D.， et al.(1999)Clinical Cancer Research 5 ： 3118s-3123s ； Presta ，Leonard G.(2002)Current Pharmaceutical Biotechnology 3 ： 237-256 ； van Spriel， Annemiek et al.， (2000)Review Immunology Today 21(8)391-397。
     IV. 修饰的结合分子
     在某些实施方案中， 本发明的结合分子的至少一种可包含一种或多种修饰。修饰 形式的本发明的 LT 结合分子可使用本领域已知的技术从全前体或父代抗体来制备。
     在某些实施方案中， 本发明的修饰的 LT 结合分子是多肽， 其已经被改变以显示出 天然多肽未发现的特征 ( 例如修饰导致功能的降低或功能的增强， 例如效应功能 )。 在一个 实施方案中， 结合分子的一个或多个残基可通过官能性侧基的反应而化学上衍生化。在一 个实施方案中， 结合分子可修饰以包括二十个标准氨基酸的一种或多种天然存在的氨基酸 衍生物。例如， 4- 羟基脯氨酸可替换脯氨酸 ； 5- 羟基赖氨酸可替换赖氨酸 ； 3- 甲基组氨酸 可替换组氨酸 ； 高丝氨酸可替换丝氨酸 ； 以及鸟氨酸可替换赖氨酸。
     在一个实施方案中， 本发明的 LT 结合分子包含了其中一个或多个结构域被部分 或全部删除的合成恒定区 (“结构域删除结合分子” )。在某些实施方案中的相容性修饰结 合分子包含了整个 CH2 结构域被去除的结构域删除构建体或变体 (ΔCH2 构建体 )。在其 他实施方案中可采用短连接肽替换缺失区域以提供可变区的灵活性和自由移动性。本领 域的技术人员将可以理解由于 CH2 结构域对抗体分解率的调节性能， 因而特别优选该构建 体。结构域删除构建体可由编码 IgG1 人恒定区的载体获得 ( 例如参见 WO 02/060955A2 和 WO02/096948A2)。该载体经工程改造缺失了 CH2 结构域并提供了表达区域缺失 IgG1 恒定 区的合成载体。
     在一个实施方案中， 本发明的 LT 结合分子包含数个或者甚至单个氨基酸缺失或 替换的免疫球蛋白重链， 只要其允许单体亚基间结合。例如， 在某些情况下， 在 CH2 区选定 部位的单个氨基酸突变可足以基本上降低 Fc 结合。类似地， 可能仅需要删除控制带调节效 应功能 ( 例如， 补体结合 ) 的一个或多个恒定区。该恒定区的部分缺失可能提高该抗体的 选定特性 ( 血清半衰期 )， 同时保留其他与对象恒定区相关的所需功能的完整性。此外， 如 上文指出， 结合分子的恒定区可通过对增强所得构建体性能的一个或多个氨基酸的突变或 替换进行改变。就此而言， 可以在破坏保守结合位点 ( 例如， Fc 结合 ) 的活性的同时充分 保留修饰抗体的构型和免疫原性作用。 另一实施方案包含了向恒定区添加一个或多个氨基 酸以增强所需的特性 ( 例如效应功能 ) 或者提供更多细胞毒素或糖附着。在该实施方案中 可能需要插入或复制来自选定恒定区结构域的特定序列。
     本发明还提供包含、 主要包含、 或由此处所述的结合部分 ( 例如， 抗体分子的 VH 区 和或 VL 区 ) 的变体 ( 包括衍生物 ) 组成的结合分子， 该结合部分免疫特异性结 LT 多肽。 本 领域技术人员已知的标准技术可用于在编码 LT 结合分子的核苷酸序列引入突变， 包括但不限于可导致氨基酸替换的定点突变和 PCR- 介导的突变。优选地， 该变体 ( 包括衍生物 ) 相对参考 VH 区、 VH-CDR1、 VH-CDR2、 VH-CDR3、 VL 区、 VL-CDR1、 VL-CDR2 或 VL-CDR3 编码少于 50 个氨基酸替换， 少于 40 个氨基酸替换， 少于 30 个氨基酸替换， 少于 25 个氨基酸替换， 少 于 20 个氨基酸替换， 少于 15 个氨基酸替换， 少于 10 个氨基酸替换， 少于 5 个氨基酸替换， 少于 4 个氨基酸替换， 少于 3 个氨基酸替换， 或少于 2 个氨基酸替换。 “保守氨基酸替换” 是 以具有类似电荷侧链的氨基酸残基替换其中一个氨基酸残基。本领域内已经定义了有类 似电荷侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链 ( 例如， 赖氨酸， 精氨酸， 组氨 酸 )， 酸性侧链 ( 例如， 天冬氨酸， 谷氨酸 )， 未带电极性侧链 ( 例如， 甘氨酸， 天冬酰胺， 谷氨 酰胺， 丝氨酸， 苏氨酸， 酪氨酸， 半胱氨酸 )， 无极性侧链 ( 例如， 丙氨酸， 缬氨酸， 亮氨酸， 异 亮氨酸， 脯氨酸， 苯丙氨酸， 蛋氨酸， 色氨酸 )， β- 分支侧链 ( 例如， 苏氨酸， 缬氨酸， 异亮氨 酸 ) 和芳香侧链 ( 例如， 酪氨酸， 苯丙氨酸， 色氨酸， 组氨酸 ) 的氨基酸。可选择地， 该突变 可沿全部或部分编码序列进行 ( 例如饱和突变 )， 对所得的突变进行生物活性筛选以鉴定 保留活性 ( 例如， 结合 LT 多肽的能力 ) 的突变体。
     例如， 可以仅在本发明的结合分子 ( 例如抗体分子 ) 的框架区或 CDR 区引入突变。 所引入的突变可以是同义或中性错义突变， 即对抗体结合抗原的能力没有或具有很少的影 响， 事实上该种突变有些不改变任何氨基酸序列。这些类型的突变可能对优化密码子用途 或提高杂交瘤的抗体生产非常有用。可选择地， 非中性错义突变可改变结合分子结合抗原 的能力。 例如， 多数同义或中性错义突变的位点可能在框架区中， 而多数非中性错义突变的 位点可能在 CDR 中， 尽管这并非绝对要求。本领域的技术人员均能设计和测试具有所需性 能 ( 例如未改变抗原结合活性或改变了结合活性 ( 例如， 提高了抗原结合活性或改变了抗 体特异性 ) 的突变分子。突变后可对编码蛋白进行常规表达， 编码蛋白的功能性和 / 或生 物活性 ( 例如， 免疫特异性结合 LT 多肽的至少一个抗原表位的能力 ) 可通过此处所述的技 术或本领域已知的常规修饰技术进行测定。
     A. 共价连接
     本发明的 LT 结合分子可是修饰的， 即， 将分子共价连接至该结合分子， 并使该共 价连接不阻碍结合分子特异性结合其同源抗原表位。例如但非限制， 本发明的结合分子可 通过糖基化， 乙酰化， 聚乙二醇化， 磷酰化， 酰胺化 ( 包括或除去 )、 经过已知的保护 / 阻断基 团进行衍生化， 蛋白水解裂解， 与细胞配体或其他蛋白连接等方法修饰。 各种化学修饰中的 任意一种均可通过已知技术实现， 包括但不限于特异性化学裂解， 乙酰化， 甲酰化， 衣霉素 代谢合成等。此外， 该衍生物可能包含一个或多个非传统氨基酸。
     如本文别处更为具体的描述， 本发明的结合分子还可在 N 或 C 末端重组融合至外 源多肽或者化学结合 ( 包括共价和非共价结合 ) 至多肽或其他组合物。例如， LT- 特异性 结合分子可重组融合或结合至可用于检测测定标记的分子或外源多肽， 药物， 放射性核， 或 毒素等效应分子。例如， 参见 PCT 公开 WO 92/08495、 WO 91/14438、 WO 89/12624、 美国专利 No.5,314,995 和 EP 396,3870。
     本发明的 LT 结合分子可由通过肽键或修饰肽键 ( 即， 肽异构体 ) 彼此连接的氨 基酸所组成， 并可包含 20 个基因编码氨基酸以外的氨基酸。LT- 特异性结合分子可通过 转译后作用等自然作用， 或通过本领域公知的化学修饰技术进行修饰。该修饰在基本文 本和更具体的专著， 以及大量的研究文献中得到了具体的描述。LT- 特异性结合分子的任何部位均可进行修饰， 包括肽骨架， 氨基酸侧链以及氨基或羧基末端， 或在碳水化合物 等部分上。应当可以理解在给定 LT- 特异性结合分子的多个位点可出现相同或不同程度 的相同类型的修饰。此外， 给定 LT- 特异性结合分子可包含多种类型的修饰。LT- 特异 性结合分子可因为泛素化等原因而带有分支， 它们也可呈带或不带分支的环状。环状， 分 支和带分支的环状 LT- 特异性结合分子可通过转译后自然作用或合成方法形成。修饰包 括乙酰化， 酰化， ADP- 核糖基化， 酰胺化， 黄素的共价结合， 亚铁血红素部分的共价结合， 核苷酸或核苷酸衍生物的共价结合， 脂质或脂质衍生物的共价结合， 磷脂酰肌醇的共价 结合， 交联， 环化， 形成二硫键， 脱甲基， 共价交联的形成， 半胱氨酸的形成， 焦谷氨酸的形 成， 甲酰化， γ- 羧化， 糖基化， GPI 锚形成， 羟基化， 碘处理， 甲基化， 豆蔻酰化， 氧化， 聚乙 二醇化， 蛋白水解作用， 磷酸化， 异戊烯化， 外消旋， 硒化， 硫酸盐化， 如精胺酰化等经转移 RNA 介导向蛋白添加氨基酸， 泛素化。( 例如参见 Proteins-Structure And Molecular Properties， T.E.Creighton， W.H.Freeman and Company， New York 2nd Ed.， (1993) ； Posttranslational Covalent Modification Of Proteins， B.C.Johnson， Ed.， Academic Press， New York， pgs.1-12(1983) ； Seifter et al.， Meth Enzymol 182 ： 626-646(1990) ； Rattan et al.， Ann NY Acad Sci 663 ： 48-62(1992))。
     本发明还包括包含 LT 结合分子以及外源多肽的融合蛋白。该抗体融合的外源多 肽可具有功能性或可用于靶向 LT 多肽表达细胞。在一个实施方案中， 本发明的融合蛋白 包括具有本发明的结合分子的结合位点中的任意一种或多种的氨基酸序列、 以及外源多肽 序列的多肽， 主要由其组成、 或由其组成的。在另一个实施方案中， 用于此处披露的诊断和 治疗方法的融合蛋白包括具有 LT- 特异性结合分子的任意一个， 两个， 三个 VH-CDR 氨基酸 序列， 或一种 LT- 特异性结合分子的任意一个， 两个， 三个 VL-CDR 氨基酸序列， 以及外源多 肽序列的多肽， 主要由其组成、 或由其组成。在一个实施方案中， 该融合蛋白包含了本发明 LT- 特异性结合分子的 VH-CDR3 氨基酸序列， 以及外源多肽序列的多肽， 该融合蛋白特异性 结合 LT 的至少一种抗原表位。在另一实施方案中， 融合蛋白包含具有本发明 LT- 特异性结 合分子的至少一个 VH 区氨基酸序列和本发明 LT- 特异性结合分子的至少一个 VL 区氨基酸 序列， 以及外源多肽序列的多肽。在一个实施方案中， 该融合蛋白的 VH 和 VL 区对应特异性 结合 LT 的至少一种抗原表位的的单独来源抗体。在另一实施方案中， 用于此处披露的诊 断和治疗方法的融合蛋白包括具有 LT- 特异性结合分子的任意一个， 两个， 三个或更多 VH CDR 氨基酸序列以及 LT- 特异性结合分子的任意一个， 两个， 三个或更多 VL CDR 氨基酸序 列， 以及外源多肽序列的多肽， 主要由其组成、 或由其组成。优选对应本发明单独来源结合 分子的两个， 三个， 四个， 五个， 六个， 或更多 VH-CDR 或 VL-CDR。 本发明还包括编码这些融合 蛋白的核酸分子。
     文献报导的示例性融合蛋白包括与 T 细胞受体 (Gascoigne et al.， Proc.Natl. Acad.Sci.USA 84 ： 2936-2940(1987)) ； CD4(Capon et al.， Nature337 ： 525-531(1989) ； Traunecker et al.， Nature 339 ： 68-70(1989) ； Zettmeissl et al.， DNA Cell Biol. USA 9 ： 347-353(1990) ； 和 Byrn et al.， Nature344 ： 667-670(1990)) ； L- 选 择 素 ( 归 巢 受 体 )(Watson et al.， J.Cell.Biol.110 ： 2221-2229(1990) ；和 Watson et al.， Nature 349 ： 164-167(1991)) ； CD44(Aruffo et al.， Cell 61 ： 1303-1313(1990)) ； CD28 和 B7(Linsley et al.， J.Exp.Med.173 ： 721-730(1991)) ； CTLA-4(Lisley et al.， J.Exp.Med.174 ： 561-569(1991)) ； CD22(Stamenkovic et al.， Cell 66 ： 1133-1144(1991)) ； TNF 受体 (Ashkenazi et al.， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88 ： 10535-10539(1991) ； Lesslauer et al.， Eur.J.Immunol.27 ： 2883-2886(1991) ； 和 Peppel et al.， J.Exp.Med.174 ： 1483-1489(1991)) ； 和 IgE 受体 a(Ridgway and Gorman， J.Cell.Biol.Vol.115， Abstract No.1448(1991)) 相融合。
     如本文别处讨论， 本发明的 LT 抗体、 或其抗原结合片段、 变体、 或衍生物可通过本 领域已知方法融合至外源多肽以提高该多肽的体内半衰期或用于免疫测定。例如， 在一个 实施方案中， 可将 PEG 连接至本发明的 LT 结合分子以提高其体内半衰期。Leong， S.R.， et al.， Cytokine 16 ： 106(2001) ； Adv.in Drug Deliv.Rev.54 ： 531(2002) ； 或 Weir et al.， Biochem.Soc.Transactions30 ： 512(2002)。
     此 外， 本 发 明 的 LT 结 合 分 子 可 融 合 至 标 记 序 列 ( 如 肽 ) 以 促 进 其 纯 化 或 检 测。在优选实施方案中， 该标记氨基酸序列为六组氨酸肽， 例如 pQE 载体中所提供的标签 (QIAGEN， Inc.， 9259 Eton Avenue， Chatsworth， Calif.， 91311)， 其中多数已上市销售。如 Gentz et al.， Proc.Natl.Acad.Sci.USA86 ： 821-824(1989) 所述， 例如， 用于融合蛋白快速 纯化的六组氨酸。 其他可用于纯化的肽标签包括但不限于对应来自流感血凝集素蛋白的抗 原表位的 “HA” 标签 (Wilson et al.， Cell 37 ： 767(1984)) 以及 “flag” 标签。
     融合蛋白可通过本领域公知的方法进行制备 ( 例如， 参见美国专利 No.5,116,964 和 5,225,538)。可根据经验选择进行融合的精确位点以优化该融合蛋白的分泌或结合特 性。然后将编码该融合蛋白的 DNA 转染进入表达宿主细胞。
     本发明的 LT 结合分子可以非结合形式使用或与多种分子中的至少一种相结合， 例如， 可提高该分子的治疗性能， 促进靶标检测， 或患者的显像或治疗。本发明的 LT 结合分 子可在纯化前或纯化后、 纯化进行时进行标记或连接。
     特别地， 本发明的 LT 结合分子可连接至治疗剂， 前药， 肽， 蛋白， 酶， 病毒， 脂质， 生 物应答调节剂， 药剂或 PEG。
     本领域的技术人员应能理解根据待连接的选定试剂的不同， 可通过多种技术实现 该连接。例如， 与生物素的连接物可通过结合多肽与生物素的活化酯 N- 羟基琥珀酰亚胺 酯 ) 反应得到。类似地， 与荧光标记的结合物可在偶合剂 ( 例如， 此处所列举的偶合剂 ) 的 存在下， 或通过与异硫氰酸 ( 优选荧光素 - 硫氰酸 ) 的反应进行制备。本发明的 LT 结合分 子的结合物可以类似方式进行制备。
     本发明还包括与诊断或治疗剂相结合的本发明的 LT 结合分子。该 LT 结合分子可 例如在作为检测特定治疗和 / 或预防方案的有效性的临床测试步骤中， 用于检测神经疾病 的发展或进展。可通过将该 LT 结合分子与可测物质偶合以促进检测。可测物质的例子包 括各种酶， 辅基， 荧光材料， 发光材料， 生物发光材料， 放射性材料， 使用各种正电子发射断 层的正电子发射金属， 以及非放射性顺磁性金属离子。例如， 可连接至抗体并用于本发明 所述诊断的金属离子可参见美国专利 No.4,741,900。适用酶的例子包括辣根过氧化酶， 碱 性磷酸酶， β- 半乳糖苷酶， 或是乙酰胆碱酯酶 ； 适用辅基的例子包括抗生蛋白链菌素 - 生 物素和亲和素 - 生物素 ； 适用荧光材料的例子包括伞形酮， 荧光素， 异硫氰酸萤光素， 丹磺 酰， 二氯三嗪野芝麻碱荧光素， 丹磺酰氯或藻红素 ； 发光材料的例子包括发光氨 ； 生物发光 材料的例子包括荧光素酶， 虫荧光素和发光蛋白质 ； 以及适用放射性物质的例子包括 125I、42102341411 A CN 102341425131说明书38/92 页111 I、 In 或 99Tc。
     LT 结合分子还可通过与化学发光化合物偶合进行可测标记。 然后可通过检测化学 反应过程中产生的发光以测定化学发光标记 LT 结合分子的存在。特别有用的化学发光标 记化合物的例子为发光氨， 异鲁米诺， theromatic 吖啶酯， 咪唑， 吖啶盐和草酸酯。
     对 LT 结 合 分 子 进 行 可 测 标 记 的 方 法 之 一 为 将 其 连 接 至 酶 并 将 连 接 产 物 用 于 酶 免 疫 测 定 (EIA)(Voller， A.， ″ The Enzyme Linked Immunosorbent Assay(ELISA)″ Microbiological Associates Quarterly Publication， Walkersville， Md. ， Diagnostic Horizons 2 ： 1-7(1978)) ； Voller et al. ，J.Clin.Pathol.31 ： 507-520(1978) ； Butler ， J.E. ， Meth.Enzymol.73 ： 482-523(1981) ； Maggio ， E.(ed.) ， Enzyme Immunoassay， CRC Press， Boca Raton， Fla.， (1980) ； Ishikawa， E.et al.， (eds.)， Enzyme Immunoassay， Kgaku Shoin， Tokyo(1981)。该种与 LT 结合分子连接的酶将以特定 方式适当的底物 ( 优选发色底物 ) 反应从而生成可通过例如分光光度计， 荧光计或视觉方 法检测的化学部分。可用于可测标记该抗体的酶包括但不限于， 苹果酸脱氢酶， 葡萄球菌 核酸酶， delta-5- 类固醇异构酶， 酵母乙醇脱氢酶， alpha- 甘油磷酸脱氢酶， 丙糖磷酸盐异 构酶， 辣根过氧化酶， 碱性磷酸酶， 天冬酰胺酶， 葡萄糖氧化酶， beta- 半乳糖苷酶， 核糖核酸 酶， 脲酶， 过氧化氢酶， 葡萄糖 -6- 磷酸脱氢酶， 葡萄糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。此外， 可通过采用针对该酶的发色底物的比色法实现该检测。 还可通过对底物的酶反应程度与类似建 立的标准的视觉比较实现该检测。
     还可通过多种其他免疫测定方法实现该检测。例如， 在放射性标记该 LT 结合分子 后， 可采用放射性免疫测定 (RIA) 检测该抗体 ( 例如参见 Weintraub， B.， Principles of Radioimmunoassays， Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques， The Endocrine Society， (March， 1986)， 其通过引用的方式并入本文中 )。该放射性同位素的 检测手段包括但不限于伽马计数器， 闪烁计数器或自动射线摄影。
     LT 结合分子还可采用 152Eu 或其他镧系元素等荧光发射金属进行可测标记。 这些 金属可通过二乙烯三胺五乙酸 ((DTPA) 或乙二胺四乙酸 (EDTA) 等金属鳌合基团连接该结 合分子。
     将 各 种 部 分 连 接 至 结 合 分 子 的 技 术 已 熟 知，例 如 参 见 Arnon et al.， ″ Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy″， in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy， Reisfeld et al.(eds.)， pp.243-56(Alan R.Liss， Inc.(1985) ； Hellstrom et al.， ″ Antibodies For Drug Delivery ″， in Controlled Drug Delivery(2nd Ed.)， Robinson et al.(eds.)， Marcel Dekker， Inc.， pp.623-53(1987) ； Thorpe， ″ Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy ： A Review ″， in Monoclonal Antibodies ′ 84 ： Biological And Clinical Applications， Pinchera et al.(eds.)， pp.475-506(1985) ； ″ Analysis， Results， And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy″， in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy， Baldwin et al.(eds.)， Academic Press pp.303-16(1985) 和 Thorpe et al.，″ The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates 119-58(1982)。43″， Immunol.Rev.62 ：102341411 A CN 102341425
     说明书39/92 页特别地， 用于此处披露的诊断和治疗方法的结合分子可结合至细胞毒性 ( 例如放 射性同位素， 细胞毒性药物， 或毒素 ) 治疗剂， 细胞抑制剂， 生物毒素， 前药， 肽， 蛋白， 酶， 病 毒， 脂质， 生物应答调节剂， 药剂， 免疫活性配体 ( 例如， 淋巴因子或其他抗体， 其中所得的 分子同时结合肿瘤细胞和效应细胞 ( 如 T 细胞 ))， 或 PEG。在另一实施方案中， 用于此处披 露的诊断和治疗方法的结合分子可结合至降低肿瘤血管形成的分子。在其他实施方案中， 所披露的组合物可包含偶联药物或前药的结合分子。 本发明的其他实施方案包含了结合分 子的用途， 例如， 与特异性生物毒素或其细胞毒性片段 ( 例如， 蓖麻毒素， 白树毒素， 假单胞 菌外毒素或白喉毒素 ) 结合的结合分子的用途。结合或未结合的结合分子的使用选择将依 赖于癌症的类型和阶段， 辅助治疗的使用 ( 例如， 化疗或外部辐射 ) 以及患者的状态。可以 理解本领域的技术人员将能够根据此处的教导容易地作出选择。
     可以理解， 在过去的研究中， 带有同位素标记的抗肿瘤抗体曾成功地被用于破坏 动物模型、 部分情况下在人体内的实体肿瘤和淋巴瘤 / 白血病中的细胞。示例性放射性同 90 125 131 123 111 105 153 67 67 166 177 186 位素包括 ： Y、 I、 I、 I、 In、 Rh、 Sm、 Cu、 Ga、 Ho、 Lu、 Re。188Re。该放射性核 通过生成致电离辐射， 在核 DNA 中引起多条链的断裂， 从而导致细胞死亡。用于生成治疗性 结合物的同位素通常可产生具有短光程长的高能量 α- 或 β- 粒子。该种放射性核可以杀 死它们极为接近的细胞， 例如该结合物吸附或进入的肿瘤细胞。它们对于非定域细胞作用 很小或没有作用。放射性核基本上为非免疫原性。
     对于在本发明中使用放射标记结合物， 结合分子可直接标记 ( 例如通过碘化 ) 或 可以通过使用鳌合剂间接标记。本文中所用的短语 “间接标记” 和 “间接标记方法” 均指鳌 合剂被共价连接至结合分子， 且至少一个放射核与该鳌合剂结合。该种鳌合剂通常指双功 能鳌合剂， 因为它们同时结合多肽和放射性同位素。特别优选的鳌合剂包括 1- 异硫氰酸苯 甲基 -3- 甲基二乙烯三胺五乙酸 ( “MX-DTPA” ) 和环己基二乙烯三胺五乙酸 ( “CHX-DTPA” ) 衍生物。其他的鳌合剂包括 P-DOTA 和 EDTA 衍生物。特别优选的用于间接标记的放射性核 包括 111In 和 90Y。
     本文中所用的短语 “直接标记” 和 “间接标记方法” 同时指放射性核被共价直接吸 附至多肽 ( 通常通过氨基酸残基 )。更具体地， 这些连接技术包括随机标记和定点标记。对 于后者， 该标记发生在多肽上的特定位点， 例如仅在该结合物的 Fc 部分存在的 N- 连接的 糖残基。此外， 各种直接标记技术和方案在本发明适用。例如， 碍 -99 标记的多肽可通过 配体交换过程制备， 其中通过锡粒子溶液还原高得酸 (TcO4 )， 将还原的得鳌合至 Sephadex 柱， 并向该柱应用结合多肽， 或者也可采用批量标记技术， 例如， 孵育高锝酸， 还原剂 ( 例如 SnCl2)， 缓冲溶液 ( 例如邻苯二甲酸钠 - 钾溶液 ) 以及结合分子。在任何情况下， 优选用于 直接标记多肽的放射性核已为本领域公知， 并特别优选的用于直接标记的放射性核为通过 131 酪氨酸残基共价吸附的 I。用于此处披露的方法的结合分子可例如通过过放射活性碘化 钠或钾以及化学氧化剂 ( 例如， 次氯酸钠， 氯胺 T 等 )， 或是酶氧化剂 ( 例如乳过氧化酶， 葡 萄糖氧化酶和葡萄糖 ) 进行衍生。
     有关鳌合剂和鳌合剂结合物的专利已为本领域所知。例如， Gansow 的美国专 利 No.4,831,175 涉及多取代二乙烯三胺五乙酸鳌合剂以及包含它的蛋白结合物， 以及它 们 的 制 备 方 法。Gansow 的 美 国 专 利 No.5,099,069、 5,246,692、 5,286,850、 5,434,287 和 5,124,471 同样涉及多取代 DTPA 鳌合剂。这些专利均通过引用的方式并入本文中。适用金属鳌合剂的其他例子为乙二胺四乙酸 (EDTA)、 二乙烯三胺五乙酸 (DPTA)、 1， 4， 8， 11- 四氮 杂十四烷、 1， 4， 8， 11- 四氮杂十四烷 -1， 4， 8， 11- 四乙酸， 或特别优选并在下文多次体现的 类似物环己基 -DTPA 或 CHX-DTPA。其他的适用鳌合剂包括尚待发现的鳌合剂， 这些鳌合剂 可由技术人员简单地辨别， 且明确包含在本发明的范围之内。
     其他优选的针对结合分子 ( 例如结合多肽 ) 的结合制剂为细胞毒性药物， 特别是 用于癌症治疗的细胞毒性药物。本文中所用的 “细胞毒素或细胞毒性剂” 指对细胞的生长 和增殖不利且能减少， 抑制或破坏细胞或恶性肿瘤的任意制剂。示例性细胞毒素包括但不 限于， 放射性核， 生物毒素， 酶活毒素， 细胞抑制或细胞毒性治疗剂， 前药， 免疫活性配体和 生物应答调节剂如细胞因子。 延迟或减缓免疫活性细胞或恶性细胞生长的任何细胞毒素均 在本发明的范围之内。
     将 各 种 部 分 连 接 至 结 合 分 子 的 技 术 已 熟 知，例 如 参 见 Arnon et al.， ″ Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy″， in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy， Reisfeld et al.(eds.)， pp.243-56(Alan R.Liss， Inc.(1985) ； Hellstrom et al.， ″ Antibodies For Drug Delivery ″， in Controlled Drug Delivery(2nd Ed.)， Robinson et al.(eds.)， Marcel Dekker， Inc.， pp.623-53(1987) ； Thorpe， ″ Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy ： A Review ″， in Monoclonal Antibodies ′ 84 ： Biological And Clinical Applications， Pinchera et al.(eds.)， pp.475-506(1985) ； ″ Analysis， Results， And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy″， in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy， Baldwin et al.(eds.)， Academic Press pp.303-16(1985)， and Thorpe et al.，″ The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates ″， Immunol.Rev.62 ： 119-58(1982)。
     B. 降低免疫原性
     在某些实施方案中， 本发明的 LT 结合分子或其部分可通过本领域认可的技术进 行修饰以降低其免疫原性。例如， 结合分子或其部分可进行人源化， 灵长源化或去免疫化。 在一个实施方案中， 可制备嵌合结合分子或结合分子可包含至少一部分的嵌合抗体分子。 在这样的情况下， 非人 LT 结合分子、 通常鼠或灵长动物结合分子保留或充分保留了父代结 合分子的抗原结合功能， 但在人体内具有更低免疫原性。这可通过多种方法实现， 包括 (a) 将完整非人类可变区嫁接至人恒定区以生成嵌合结合分子 ； (b) 将一个或多个非人类决定 簇互补区 (CDR) 的至少一部分嫁接至保留或未保留关键框架残基的人框架和恒定区 ； 或 (c) 移植整个非人类可变结构域， 但通过替换表面残基以类人切片将其 “包覆” 。 该类方法参 见 Morrison et al.， Proc.Natl.Acad.Sci.81 ： 6851-6855(1984) ； Morrison et al.， Adv. Immunol.44 ： 65-92(1988) ； Verhoeyen et al.， Science 239 ： 1534-1536(1988) ； Padlan， Molec.Immun.28 ： 489-498(1991) ； Padlan， Molec.Immun.31 ： 169-217(1994)， 和美国专利 No.5,585,089， 5,693,761， 5,693,762 和 6,190,370， 所有文献都通过引用的方式全部并入 本文中。
     在一个实施方案中， 本发明的结合分子 ( 例如抗体 ) 或其部分可以是嵌合的。嵌 合结合分子是结合分子， 其中结合分子的不同部分衍生自不同动物物种， 例如抗体具有衍生自鼠单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区。嵌合结合分子的制备方法是本 领域已知的。参见例如 Morrison， Science229 ： 1202(1985) ； Oi et al.， BioTechniques 4： 214(1986) ； Gillies et al.， J.Immunol.Methods 125 ： 191-202(1989) ；美 国 专 利 No.5,807,715 ； 4,816,567 ； 和 4,816397， 其均以引用的方式全部并入本文中。开发″嵌 合 抗 体 ″ 的 制 备 的 技 术 (Morrison et al.， Proc.Natl.Acad.Sci.81 ： 851-855(1984) ； Neuberger et al. ，Nature312 ： 604-608(1984) ； Takeda et al. ，Nature 314 ： 452-454(1985)) 可用于合成所述分子。 例如， 编码鼠 LT 抗体分子的结合特异性的基因序列 可和具有合适生物活性的人抗体分子的序列融合在一起。如本文中使用的， 嵌合结合分子 是分子， 其中不同部分衍生自不同动物物种， 例如具有衍生自鼠单克隆抗体的可变区和人 免疫球蛋白恒定区的那些， 例如人源化抗体。
     在另外的实施方案中， 本发明的结合分子或其部分是灵长动物源化。灵长动物源 化抗体的方法由 Newman， Biotechnology 10 ： 1455-1460(1992) 披露。具体而言， 该技术导 致产生包含了猴可变结构域和人恒定区的抗体。 该文献通过引用的方式并入本文中。 此外， 该技术还可参见共同受让的美国专利 No.5,658,570， 5,693,780 和 5,756,096， 该文献通过 引用的方式并入本文中。
     在另外的实施方案中， 本发明的结合分子 ( 例如抗体 ) 或其部分是人源化的。人 源化结合分子是结合分子， 其具有来自非人类的结合特异性， 即具有一个或多个来自非人 类抗体的互补决定区 (CDR)， 以及来自人免疫球蛋白分子的框架区。人框架区的框架残 基通常可被 CDR 供体抗体的相应残基所替代以突变而改变， 优选提高抗原结合。这些框 架替换可通过本领域公知的方法进行鉴定， 例如， 可通过对 CDR 和框架残基的相互作用 建模以鉴定对抗原结合重要的框架残基， 可通过序列比较鉴定在特定位点的反常框架残 基。( 例如参见 Queen et al.， 美国专利 No.5,585,089 ； Riechmann et al.， Nature332 ： 323(1988)， 其以引用的方式全部并入本文中。抗体可通过多种本领域已知的技术进行 人源化， 例如， CDR- 嫁接 (EP 239,400 ； PCT 公开 WO 91/09967 ； 美国专利 No.5,225,539 ； 5,530,101 ； 和 5,585,089)，镶 饰 或 重 塑 (EP 592,106 ； EP519,596 ； Padlan， Molecular Immunology 28(4/5) ： 489-498(1991) ； Studnicka et al.， Protein Engineering 7(6) ： 805-814(1994) ； Roguska.et al.， PNAS91 ： 969-973(1994))，以 及 链 替 换 ( 美 国 专 利 No.5,565,332)。抗体人源化的其他参考文献包括 ： Kabat， E.A.， Wu， T.T.， Perry， H.M.， Gottesman， K.S.and Foeller， C.(1991)Sequences of Proteins of Immunological th Interest.5 Edition， U.S.Dept.Health and Human Services.U.S.Govt.Printing Office.Chothia， C.， Lesk， A.M.， Tramontano， A.， Levitt， M.， Smith-Gill， S.J.， Air， G.， Sheriff， S.， Padlan， E.A.， Davies， D.， Tulip， W.R.， Colman， P.M.， Spinelli， S.， Alzari， P.M.and Poljak， R.J.(1989)Nature 342 ： 877-883.Chothia， C.， Novotny， J.， Bruccoleri， R.and Karplus， M.(1985)J.Mol.Biol.186 ： 651Brensing-Kuppers J， ZocherI， Thiebe R， Zachau HG.(1997).Gene.191(2) ： 173-81.Matsuda F， Ishii K， Bourvagnet P， KumaK， Hayashida H， Miyata T， Honjo T.(1998)J Exp Med.188(11) ： 2151-62.CarterP.J.and Presta L.J.(2000)“Humanized antibodies and methods for making them” US Patent 6,407,213 Johnson ， T.A. ， Rassenti ， LZ. ， and Kipps ， T.J.(1997)J.Immunol.158 ： 235-246， 其以引用的方式全部并入本文中。 本申请包括的示例性人源化可变区在实施例中阐述。 去免疫化还可用于降低结合分子的免疫原性。 本文中所用的术语 “去免疫化” 包括 对结合分子进行改造以修饰 T 细胞抗原表位 ( 例如， 参见 WO9852976A1， WO0034317A2)。例 如， 可对来自起始抗体的 VH 和 VL 序列进行分析， 由各 V 区 “定位” 的人 T 细胞抗原表位显 示了与序列内的决定簇互补区 (CDR) 和其他关键残基相关的抗原表位的定位。对来自于 T 细胞表位图谱的单独 T 细胞表位进行分析， 以在不轻易改变终抗体活性的情况下鉴定选择 性的氨基酸替代物。经设计得到了一系列包括氨基酸替代物组合物的替代 VH 和 VL 序列， 随后这些序列被整合进入一系列的结合多肽 ( 例如， LT- 特异性抗体或其免疫特异性片段 ) 以用于本文中所述的诊断和治疗方法， 并对功能进行测验。通常可生成和测验 12-24 个变 体抗体。 然后将包含修饰后的 V 区和人 C 区的完整重链和轻链基因克隆进入表达载体， 将该 后续质粒导入细胞系进行全抗体生产。对该类抗体通过适当的生化和生物侧定进行比较， 鉴定得到最佳变体。
     在一个实施方案中， 本发明的结合分子是人源化抗体或包含具有受体人框架或基 本上人受体框架的人源化抗体可变区。为了本文的目的， ″受体人框架″是包含衍生自人 免疫球蛋白框架或人共有框架的 VL 或 VH 框架的氨基酸序列的框架。″衍生自″人免疫球 蛋白框架或人共有框架的受体人框架可包含其相同氨基酸序列， 或可含有某些氨基酸序列 改变。在一个实施方案中， VL 受体人框架和 VL 人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列 的序列相同。
     ″人共有框架″是表示在人免疫球蛋白 VL 或 VH 框架序列的选择中最通常存在的 氨基酸残基的框架。通常， 人免疫球蛋白 VL 或 VH 序列的选择来自可变结构域序列的亚基。 也可考虑人种系序列或具有一些共有序列的种系序列 ( 例如 FR4)。
     在一个实施方案中， 轻链和重链的受体框架序列是相同的， 在规范、 界面和镶饰区 残基具有和鼠初始抗体序列的高度类似性。当测定类似于种系序列时排除 CDR 序列。在一 个实施方案中， 受体序列具有相同长度的 CDR 如果 ( 除了 CDR-H3) 的话 ； 并且要求最少数量 的回复突变。
     在一个实施方案中， 和稳定共有种类最为不同的受体框架被选择以改善人源化设 计的物理化学性能。
     在 一 个 实 施 方 案 中， 对 于 105 抗 体， 人 种 系 huL6( 具 有 共 有 人 KV3FR4) 和 人 gi|3004688 可分别用作轻链和重链的受体框架。
     在一个实施方案中， 人源化 105 轻链被制成在氨基酸位 1 包含回复突变 (E → D ； 即 E 至 D)。在一个实施方案中， 制成在氨基酸位 21 包含回复突变 (L → I)。在另外的实施方 案中， 制成在氨基酸位 68 包含回复突变 (G → R)。在又一实施方案中， 制成在氨基酸位 86 包含回复突变 (Y → F)。
     在一个实施方案中， 制成人源化轻链的第一版本， 包含在位 1 的回复突变。在另外 的实施方案中， 制成 105 轻链的第二版本， 包含在位 1、 21 和 86 的回复突变。在另外的实施 方案中， 制成 105 轻链的第三版本， 包含在位 1、 21、 68 和 86 的回复突变。
     人源化 LT105 轻链的三种不同版本如下所示。 LT105 的人源化轻链包括 ： 种系 huL6 框架 // 共有人 KV4 FR4//LT105 L CDR。下面在 L1、 L2 和 L3 所述的回复突变为小写字体、 粗字体。包括 Chothia 定义的 CDR 有下划线。
     ＞ L0 ＝嫁接 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVDNYGISFMHWYQQKPGQAPRLLIYRASNLESGIPARFSGS LTISSLEPEDFAVYYCQQSNKDPYTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO ： ) ＞ L1 IVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVDNYGISFMHWYQQKPGQAPRLLIYRASNLESGIPARFSGSGSGTDFT
     GSGTDFT LTISSLEPEDFAVYYCQQSNKDPYTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO ： )
     ＞ L2
     IVLTQSPATLSLSPGERAT SCRASESVDNYGISFMHWYQQKPGQAPRLLIYRASNLESGIPARFSG SGSGTDFT
     LTISSLEPEDFAV YCQQSNKDPYTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO ： )
     ＞ L3
     IVLTQSPATLSLSPGERAT SCRASESVDNYGISFMHWYQQKPGQAPRLLIYRASNLESGIPARFSG SGS TDFT
     LTISSLEPEDFAV YCQQSNKDPYTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO ： )
     在一个实施方案中， 制成人源化 105 重链， 包含在氨基酸位 1 的回复突变 (E → D)。 在一个实施方案中， 制成包含在氨基酸位 2r 的回复突变 (A → V)。 在另外的实施方案中， 制 成包含在氨基酸位 25 的回复突变 (S → T)。在又一实施方案中， 制成包含在氨基酸位 37 的 回复突变 (V → I)。在又一实施方案中， 制成包含在氨基酸位 47 的回复突变 (W → G)。在 又一实施方案中， 制成包含在氨基酸位 48 的回复突变 (I → M)。 在又一实施方案中， 制成包 含在氨基酸位 49 的回复突变 (S → G)。在又一实施方案中， 制成包含在氨基酸位 67 的回复 突变 (F → I)。在又一实施方案中， 制成包含在氨基酸位 78 的回复突变 (L → F)。在又一 实施方案中， 制成包含在氨基酸位 82 的回复突变 (M → L)。
     在一个实施方案中， 制成人源化 105 重链的第一版本， 包含在位 24 和 47 的回复突 变。在另外的实施方案中， 制成 105 重链的第二版本， 包含在位 24， 37， 49， 67 和 78 的回复 突变。在另外的实施方案中， 制成 105 重链的第三版本， 包含在位 1， 24， 25， 37， 47， 49， 67 和 78 的回复突变。 在另外的实施方案中， 制成 105 重链的第四版本， 包含在位 1， 24， 25， 37， 47， 48， 49， 67， 78 和 82 的回复突变。
     下 面 示 出 人 源 化 LT105 重 链 的 四 种 不 同 版 本。LT105 的 人 源 化 重 链 包 括 gi|3004688 框架 //LT105 H CDR。下面在 H1， H2， H3 和 H4 所述的回复突变为小写字体、 粗 字体。包括 Chothia 定义的 CDR 有下划线。
     ＞ H0 ＝嫁接
     EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSITSGYYWNWVRQAPGKGLEWISYISYDGSNNYNPSLKNRFT ISRDSAK
     NSLYLHMHSLRAEDTAVYYCARDAYSYGMDYWGQGTTVTVSS
     (SEQ ID NO ： )
     ＞ H1
     EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCA SGYSITSGYYWNWVRQAPGKGLE
     ISYISYDGSNNYNPSLKNRFTISRDSAK
     NS YLHMHSLRAEDTAVYYCARDAYSYGMDYWGQGTTVTVSS
     (SEQ ID NO ： )
     ＞ H2
     EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCA SGYSITSGYYWNW RQAPGKGLE I YISYDGSNNYNPSLKNR TISRDSAK
     NS YLHMHSLRAEDTAVYYCARDAYSYGMDYWGQGTTVTVSS
     (SEQ ID NO ： )
     ＞ H3
     VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCA GYSITSGYYWNW RQAPGKGLE I YISYDGSNNYNPSLKNR TISRDSAK
     NS YLHMHSLRAEDTAVYYCARDAYSYGMDYWGQGTTVTVSS
     (SEQ ID NO ： )
     ＞ H4
     VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCA GYSITSGYYWNW RQAPGKGLE YISYDGSNNYNPSLKNR TISRDSAK
     NS YLH HSLRAEDTAVYYCARDAYSYGMDYWGQGTTVTVSS
     (SEQ ID NO ： )
     如所阐述的可进行上面另外的改变以阐述 105 抗体的可替换的版本， 并且可制成 多种轻链和重链组合。例如， 在一个实施方案中， 本发明的结合分子包含 105 抗体版本 0 的 轻链或其 CDR。在另外的实施方案中， 本发明的结合分子包含 105 抗体版本 1 的重链或其 CDR。在另外的实施方案中， 本发明的结合分子包含 105 抗体版本 0 的轻链或其 CDR 并且联 合 105 抗体版本 1 的重链或其 CDR
     L0
     1 EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGISFMHWY QQKPGQAPRL
     51 LIYRASNLES GIPARFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY YCQQSNKDPY
     101 TFGQGTKVEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV
     151 QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV
     201 THQGLSSPVT KSFNRGEC
     (SEQ ID NO ： )
     H1
     1 EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAVSGYSIT SGYYWNWVRQ APGKGLEGIS
     51 YISYDGSNNY NPSLKNRFTI SRDSAKNSFY LHMHSLRAED TAVYYCARDA
     101 YSYGMDYWGQ GTTVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY
     151 FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI
     201 CNVNHKPSNT KVDKKVEPKS CDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD
     251 TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST
     301 YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY
     351 TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD401 SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPG
     (SEQ ID NO ： )
     在另外的实施方案中， 本发明的结合分子包含 105 抗体的版本 A 的轻链或其 CDR。 在另外的实施方案中， 本发明的结合分子包含 105 抗体的版本 B 的轻链或其 CDR。 在另外的 实施方案中， 本发明的结合分子包含 105 抗体的版本 C 的轻链或其 CDR。例如， 在一个实施 方案中， 这种轻链可以和 105 抗体的重链版本配对。
     1 EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGISFMHWY QQKPGQAPRL
     51 LIYKASNLES GIPARFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY YCQQSNKDPY
     101 TFGQGTKVEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV
     151 QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV
     201 THQGLSSPVT KSFNRGEC
     版本 B
     1 EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGISFMHWY QQKPGQAPRL
     51 LIYRASSLES GIPARFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY YCQQSNKDPY
     101 TFGQGTKVEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV
     151 QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV
     201 THQGLSSPVT KSFNRGEC
     版本 C
     1 EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGISFMHWY QQKPGQAPRL
     51 LIYKASSLES GIPARFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY YCQQSNKDPY
     101 TFGQGTKVEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV
     151 QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV
     201 THQGLSSPVT KSFNRGEC
     在另外的实施方案中， 本发明的结合分子包含 105 抗体版本 10 的轻链或其 CDR。 在另外的实施方案中， 本发明的结合分子包含 105 抗体版本 1 的重链或其 CDR。 在另外的实 施方案中， 本发明的结合分子包含 105 抗体版本 10 的轻链或其 CDR 并且联合 105 抗体版本 1 的重链或其 CDR ：
     L10
     1 AIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASESVD NYGISFMHWY QQKPGKAPKL
     51 LIYKASSLES GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLQPEDFATY YCQQSNKDPY
     101 TFGQGTKVEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV
     151 QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV
     201 THQGLSSPVT KSFNRGEC
     在另外的实施方案中， 本发明的结合分子包含 105 抗体版本 12 或 13 的轻链或其 CDR。在另外的实施方案中， 本发明的结合分子包含 105 抗体版本 1 的重链或其 CDR。在另 外的实施方案中， 本发明的结合分子包含 105 抗体版本 12 或 13 的轻链或其 CDR 并且联合 105 抗体版本 1 的重链或其
     CDR ：
     L121 DIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASESVD NYGISFMHWY RQKPGKAPKL
     51 LIYKASSLES GVPSRFSGRG SGTDFTLTIS SLQPEDFATY YCQQSNKDPY
     101 TFGQGTKVEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV
     151 QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV
     201 THQGLSSPVT KSFNRGEC
     L13
     1 DIRLTQSPSS LSASVGQRVT ISCRASESVD NYGISFMHWY RQKPGKAPKL
     51 LIYKASSLES GVPSRFSGRG SGTDFTLTIS SLQPEDFATY YCQQSNKDPY
     101 TFGQGTKVEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV
     151 QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV
     201 THQGLSSPVT KSFNRGEC
     在另外的实施方案中， 本发明的结合分子包含 105 抗体的版本 11 或 14 的重链或 其 CDR( 例如 ) 联合 105 抗体的轻链版本。
     H11
     1 EVQLVESGGG LVQPRGSLRL SCAVSGYSIT SGYYWNWIRQ APGKGLEWVS
     51 YISYDGSNNY NPSLKNRFTI SRDNSKNTFY LQMNNLRAED TAAYYCARDA
     101 YSYGMDYWGQ GTTVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY
     151 FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI
     201 CNVNHKPSNT KVDKKVEPKS CDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD
     251 TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST
     301 YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY
     351 TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD
     401 SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPG
     H14
     1 EVQLQESGGG LVKPRGSLRL SCAVSGYSIT SGYYWNWIRQ APGKGLEWVS
     51 YISYDGSNNY NPSLKNRFSI SRDNSKNTFY LKMNRLRAED SAAYYCARDA
     101 YSYGMDYWGQ GTTVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY
     151 FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI
     201 CNVNHKPSNT KVDKKVEPKS CDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD
     251 TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST
     301 YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY
     351 TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD
     401 SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPG
     在一个实施方案中， 对于 102 抗体， 使用人种系序列 huA3( 具有共有 HUMKV2 FR4) 和人种系序列 huVH3-11( 具有共有 HUMHV3 FR4)。
     设计一种版本的可变重链的整形链， 并且设计四种版本的可变重链的整形链， 除 了轻链和重链 CDR 嫁接序列。对于重链， 第一版本含有最少的回复突变并且随后版本含有 更多的回复突变 ( 即它们是至少″人源化″ )。鼠 A113 被所有版本的重链中的 S113( 存在 于人 HV FR4) 取代， 并且不作为回复突变进行分析。根据 Kabat 路线进行编号。在一个实施方案中， 人源化 LT102(huLT102) 的整形的轻链包括种系 huA3 框架、 共 有人 KV2 FR4 和 LT102 L CDR。hu102 的轻链中的回复突变包括 I2V。V2 是支持 CDR-L1 的 规范残基。
     下面示出示例性人源化 LT102 轻链序列 ( 关于回复突变的细节参见上面所述 )。 LT102 的人源化轻链包括 ： 种系 huA3 框架 // 共有人 KV2 FR4//LT102 L CDR。回复突变为 小写字体、 粗字体。包括 Chothia 定义的 CDR 有下划线。
     ＞ L0 ＝嫁接
     DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQNIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSG SGSGTDF
     TLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHFPWTFGQGTKVEIK
     ＞ L1
     D VMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQNIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFS GSGSGTDF
     TLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHFPWTFGQGTKVEIK
     下面描述四种不同版本的人源化 LT102 重链。LT102 的人源化重链包括 ： 种系 huVH3-11 框架 // 共有人 HV3 FR4//LT102 H CDR。下面在 H1， H2， H3 和 H4 所述的回复突变 为小写字体、 粗字体。包括 Chothia 定义的 CDR 有下划线。
     ＞ H0 ＝嫁接
     QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMYWIRQAPGKGLEWVSTIGDGTSYTHYPDSVQGRFT ISRDNAK
     NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLGTGPFAYWGQGTLVTVSS
     ＞ H1
     QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCA SGFTFSDYYMYWIRQAPGKGLEWVSTIGDGTSYTHYPDSVQGRF TISRDNAK
     NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLGTGPFAYWGQGTLVTVSS
     ＞ H2
     VQLVESGGGLVKPGGSLRLSCA SGFTFSDYYMYWIRQAPGKGLEWVSTIGDGTSYTHYPDSVQGRF TISRD AK
     NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLGTGPFAYWGQGTLVTVSS
     ＞ H3
     V LVESGGGLVKPGGSLRLSCA SGFTFSDYYMYWIRQAPGKGLEWVSTIGDGTSYTHYPDSVQGR FTISRD AK
     NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLGTGPFAYWGQGTLVTVSS
     ＞ H4
     V LVESGGGLVKPGGSLRLSCA SGFTFSDYYMYWIRQAPGKGLEWVSTIGDGTSYTHYPDSVQGR FTISRD A
     N LYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLGTGPFAYWGQGTLVTVSS
     在一个实施方案中， 制成人源化 102 轻链， 包含在氨基酸位 2 的回复突变 (I → V)。
     在 一 个 实 施 方 案 中， 制 成 人 源 化 102 重 链， 包 含 在 氨 基 酸 位 24 的 回 复 突 变(A → V)。 在一个实施方案中， 制成人源化 102 重链， 包含在氨基酸位 73 的回复突变 (N → Y)。 在一个实施方案中， 制成人源化 102 重链， 包含在氨基酸位 3 的回复突变 (Q → K)。在一个 实施方案中， 制成人源化 102 重链， 包含在氨基酸位 K → T) 的回复突变。在一个实施方案 中， 制成人源化 102 重链， 包含在氨基酸位 77 的回复突变 (S → N)。
     在一个实施方案中， 制成人源化 102 重链的第一版本， 包含在位 24 的回复突变。 在 另外的实施方案中， 制成 102 重链的第二版本， 包含在位 24， 1 和 73 的回复突变。在另外的 实施方案中， 制成 102 重链的第三版本， 包含在位 24， 1， 73 和 3 的回复突变。在另外的实施 方案中， 制成 102 重链的第四版本， 包含在位 24， 1， 73， 3， 75 和 77 的回复突变。
     C. 效应功能和 Fc 修饰
     本发明的 LT 结合分子可包含介导一种或多种效应功能的恒定区。 例如， 补体的 Cl 成分与抗体恒定区的结合可激活补体系统， 从而引起靶细胞的补体依赖性细胞毒性。补体 的激活对于细胞病原体的调理和溶解非常重要。补体的激活还刺激炎症应答， 并且还可参 与自身免疫超敏性。此外， 抗体通过 Fc 区结合各种细胞上的受体， 其中抗体 Fc 区上的 Fc 受体结合位点结合细胞上的 Fc 受体 (FcR)。 有多种 Fc 受体对不同类别的抗体具有特异性， 包括 IgG(gamma 受体 )、 IgE(epsilon 受体 )、 IgA(alpha 受体 ) 和 IgM(mu 受体 )。抗体与 细胞表面上 Fc 受体的结合可引发一系列重要的和多样的生物应答， 包括抗体包裹粒子吞 没和破坏， 免疫复合物的清除， 杀伤细胞对抗体包裹的目标细胞的溶解 ( 称为抗体依赖性 细胞介导的细胞毒， 或 ADCC)， 炎症介质的释放， 胎盘转移和免疫球蛋白生产的控制。
     本发明的某些实施方案包括 LT 结合分子， 其中一个或多个恒定区域的至少一种 氨基酸被删除或以其他方式改造从而提供所需的生化性质， 例如下降的效应功能， 增加的 效应功能， 非共价二聚化的改善的能力， 提高的肿瘤位点定位能力， 下降的血清半衰期， 或 是与具有大致相同免疫原性的完整、 未改造的抗体相比具有提高的血清半衰期。 例如， 本文 中所述的诊断和治疗方法中采用的某些结合分子为包含了与免疫球蛋白重链类似的多肽 链， 但缺失了一个或多个重链区的至少一部分的区域缺失抗体。例如， 在某些抗体中， 修饰 抗体的恒定区中的一个完整区域将被删除， 例如， CH2 区的全部或部分将被删除。
     在某些 LT 结合分子中， 抗 -LT 结合位点可融合 Fc 部分。在一个实施方案中 Fc 部 分可以是衍生自抗体分子的野生型 Fc 部分。在另外的实施方案中， Fc 部分可以使用本领 域已知的技术来突变以改变 ( 例如增加或降低 ) 效应功能。例如， ( 通过点突变或其他方 法 ) 对恒定区域的删除或灭活可降低循环修饰结合分子的 Fc 受体结合从而提高肿瘤定位。 在其他情况下恒定区修饰与本发明的适度互补结合相一致从而减少了血清半衰期以及与 结合细胞毒素的非特异性结合。 恒定区的另一种修饰可用于修饰二硫键或寡糖部分从而通 过提高抗原特异性或抗体灵活性来增强定位。通过修饰得到的生理功能， 生物相容性以及 其他生化作用 ( 例如肿瘤定位、 生物分布以及血清半衰期 ) 可通过公知的免疫技术在不采 取附加试验的情况下轻易地进行检测和定量。
     在某些实施方案中， 本发明的结合多肽中使用的 Fc 结构域是 Fc 变体。如本文中 使用的， 术语 “Fc 变体” 是指相对于所述 Fc 结构域衍生的野生型 Fc 结构域， 具有至少一种 氨基酸取代的 Fc 结构域。例如， 其中 Fc 结构域衍生自人 IgG1 抗体， 所述人 IgG1 Fc 结构 域的 Fc 变体包含相对于野生型 Fc 结构域 ( 例如设计以改变的结合分子的效应功能或半衰 期 ) 的至少一种氨基酸取代。Fc 变体的氨基酸取代可定位在 Fc 结构域内的任何位置 ( 即任何 EU 常规氨基酸位 置 )。在一个实施方案中， Fc 变体包含定位在铰链结构域或其部分中的氨基酸位置处的取 代。在另外的实施方案中， Fc 变体包含定位在 CH2 结构域或其部分中的氨基酸位置处的取 代。在另外的实施方案中， Fc 变体包含定位在 CH3 结构域或其部分中的氨基酸位置处的取 代。在另外的实施方案中， Fc 变体定位在 CH4 结构域或其部分中的氨基酸位置处的取代。
     本发明的结合多肽可使用任何本领域识别的 Fc 变体， 其已知赋予效应功能和 / 或 FcR 结合的改善 ( 例如降低或增强 )。所述 Fc 变体可包括例如下列国际 PCT 公开披露 的氨基酸取代中的任一种 ： WO88/07089A1， WO96/14339A1， WO98/05787A1， WO98/23289A1， WO99/51642A1 ，WO99/58572A1 ，WO00/09560A2 ，WO00/32767A1 ，WO00/42072A2 ， WO02/44215A2 ， WO02/060919A2 ， WO03/074569A2 ， WO04/016750A2 ， WO04/029207A2 ， WO04/035752A2 ， WO04/063351A2 ， WO04/074455A2 ， WO04/099249A2 ， WO05/040217A2 ， WO05/070963A1 ， WO05/077981A2 ， WO05/092925A2 ， WO05/123780A2 ， WO06/019447A1 ， WO06/047350A2，和 WO06/085967A2 或 美 国 专 利 5,648,260 ； 5,739,277 ； 5,834,250 ； 5,869,046 ； 6,096,871 ； 6,121,022 ； 6,194,551 ； 6,242,195 ； 6,277,375 ； 6,528,624 ； 6,538,124 ； 6,737,056 ； 6,821,505 ； 6,998,253 ； 和 7,083,784， 其均通过引用的方式并入本 文中。
     在某些实施方案中， 本发明的结合多肽包含 Fc 变体多肽， 所述 Fc 变体多肽包含改 变抗体的抗原非依赖性效应功能、 特别是抗体的循环半衰期的氨基酸取代。和缺少这些取 代的结合多肽相比， 这些结合多肽显示出与 FcRn 结合的增强或降低， 因此分别在血清中具 有增加或降低的半衰期。 对 FcRn 具有改善的亲和性的 Fc 变体预期具有更长的血清半衰期， 并且这些分子在治疗哺乳动物的方法中具有有用的应用， 其中期望施用的多肽具有延长的 半衰期， 例如以治疗慢性疾病或疾患。相反， 和 FcRn 具有降低的结合亲和性的 Fc 变体预 期具有更短的半衰期， 并且这些分子也有用于例如施用至哺乳动物， 其中缩短的循环时间 可是有利的， 例如对于体内诊断成像或在这样的情况其中当存在于延长期间的循环中时初 始多肽具有毒性副作用。和 FcRn 具有降低的结合亲和性的 Fc 变体也较少可能穿过胎盘， 因此也有用于治疗孕妇中的疾病或疾患。另外， FcRn 结合亲和性降低的其他应用可以是期 望的， 包括期望脑、 肾脏和 / 或肝脏定位的那些应用。在一个示例性实施方案中， 本发明的 改变的多肽表现出穿过脉管系统的肾脏的肾小球的上皮细胞的降低的运输。在另外的实 施方案中， 本发明的改变的多肽表现出穿过脑的血脑屏障 (BBB) 至血管空间中的降低的运 输。在一个实施方案中， FcRn 结合改变的结合多肽包含在 Fc 结构域的 “FcRn 结合环” 内具 有一个或多个氨基酸取代的 Fc 结构域。FcRn 结合环包含氨基酸残基 280-299( 根据 EU 编 号 )。在其他实施方案中， FcRn 结合亲和性改变的本发明的结合多肽包含在 15 触区域” 内具有一个或多个氨基酸取代的 Fc 结构域。如本文中使用的， 术语 15 FcRn “接 FcRn “接触区域” 包括下列位置处的残基 ： 243-261， 275-280， 282-293， 302-319， 336-348， 367， 369， 372-389， 391， 393， 408， 424， 425-440(EU 编号 )。在优选的实施方案中， FcRn 结合亲和性 改变的本发明的结合多肽包含在下列位置中的任一种处具有一个或多个氨基酸取代的 Fc 结构域 ： 256， 277-281， 283-288， 303-309， 313， 338， 342， 376， 381， 384， 385， 387， 434 和 438。 FcRn 结合活性改变的示例性氨基酸取代披露于国际 PCT 公开 No.WO05/047327， 其通过引用 的方式并入本文中。在其他实施方案中， 本文所述的诊断和治疗方法中使用的某些结合分子具有恒定 区例如 IgG4 重链恒定区， 其被改变以减少或消除糖基化。例如， 本发明的结合多肽还可包 含 Fc 变体， 所述 Fc 变体包含改变结合多肽的糖基化的氨基酸取代。例如， 所述 Fc 变体可 具有减少的糖基化 ( 例如 N- 或 O- 连接的糖基化 ) 或可包含野生型 Fc 结构域的改变的糖 形 ( 例如低岩藻糖或无岩藻糖聚糖 )。分子的这些低岩藻糖或非岩藻糖形式可使用本领域 已知的可替换的细胞系来准备以产生这些改变的形式。在一个实施方案中， Fc 变体是非岩 藻糖化的。
     在示例性实施方案中， Fc 变体包含通常在氨基酸位 297(EU 编号 ) 发现的 N- 连接 的聚糖的减少的糖基化。在另外的实施方案中， 结合多肽具有糖基化基序附近或之内的氨 基酸取代， 例如， 含有氨基酸序列 NXT 或 NXS 的 N- 连接糖基化基序。在特定实施方案中， 结 合多肽包含在氨基酸位 228 或 299(EU 编号 ) 具有氨基酸取代的 Fc 变体。在更特定的实施 方案中， 结合分子包含含有 S228P 和 T299A 突变 (EU 编号 ) 的 IgG4 恒定区。
     赋予减少或改变的糖基化的示例性氨基酸取代公开于 PCT 公开 No.WO05/018572， 其通过引用并入本文。在优选的实施方案中， 本发明的结合分子被修饰以消除糖基化。这 些结合分子可称为″ agly″结合分子 ( 例如 “agly” 抗体 )。尽管未受到理论的束缚， 但是 据信″ agly″结合分子在体内可具有改善的安全性和稳定性特性。示例性 agly 结合分子 包含 IgG4 抗体的无糖基化 Fc 区 (“IgG4.P” )， 其没有 Fc- 效应功能从而消除对于表达 LT 的正常重要器官的潜在的 Fc 介导的毒性。在特定实施方案中， 本发明的 agly 结合分子可 包含本领域已知的 IgG4.P 或 IgG4PE 恒定区。
     V. 结合分子的制备方法
     众所周知， RNA 可通过标准技术 ( 例如在异硫氰酸胍萃取和沉淀后进行离心或层 析 ) 从原始杂交瘤细胞或其他转化细胞分离。在需要时可通过 oligodT 纤维素层析等标准 技术从总 RNA 分离 mRNA。适用的技术已为本领域熟知。
     在一个实施方案中， 编码本发明的结合分子的单独链 ( 例如该抗体轻链和重链 ) 的 cDNA 可参照公知的方法采用逆转录酶和 DNA 聚合酶同时或单独制备。例如， 可通过共有 恒定区引物或基于公开的重链和轻链 DNA 和氨基酸序列的更具特异性的引物启动 PCR。如 上文讨论， PCR 还可用于分离编码该结合分子的单独链的 DNA 克隆。 在该情况下可用共有引 物或更具同源性探针如鼠恒定区探针来筛选该库。 DNA， 通常是质粒 DNA， 可采用本领域已知 技术从细胞分离， 并参考标准的， 公知技术 ( 例如， 其具体内容可参见前述有关重组 DNA 技 术的参考文献 ) 获得限制性酶图谱和测序。当然， 该 DNA 可在分离过程或后续分析中参照 本发明在任意点进行合成。在对分离的遗传物质进行操作以提供本发明的结合分子后， 编 码该 LT 结合分子的多核苷酸通常被插入表达载体并引导进入可用于生产所需数量 LT 结合 分子的宿主细胞。
     结合分子， 例如结合此处所述的目标分子 ( 例如 LT) 的抗体的重链或轻链的重组 表达需要构建包含了编码该结合分子的多核苷酸的表达载体。 在获得编码本发明结合分子 ( 或其链或部分 ) 的多核苷酸后， 可通过本领域公知的重组 DNA 技术制备生产该结合分子的 载体。因此， 此处描述了通过表达包含结合分子编码核苷酸序列的多核苷酸制备蛋白的方 法。 可采用本领域技术人员公知的方法构建包含结合分子编码序列和适当的转录和转译控 制信号的表达载体。这些方法包括例如体内重组 DNA 技术， 合成技术， 以及体内遗传重组。因此， 本发明提供了包含可操作地连接至启动子的编码本发明结合分子或其链或结构域的 核苷酸序列的可复制载体。该类载体可包含编码该抗体分子恒定区的核苷酸序列 ( 例如， 参见 PCT 公开 WO 86/05807 ； PCT 公开 WO 89/01036 以及美国专利 No.5,122,464)， 且编码 结合分子 ( 或其链或结构域 ) 的核苷酸可被克隆进入该种载体以表达完整的结合分子。
     如果本发明的结合分子是二聚体， 宿主细胞可以共转染本发明的表达载体、 编码 第一多肽单体的第一载体和编码第二多肽单体的第二载体。 两种载体可含有相同的可选择 的标记， 其能够使单体进行平等的表达。或者， 可以使用编码两种载体的单一载体。在单 体是抗体轻链和重链的实施方案中， 轻链有利地置于重链之前以避免过多毒性游离的重链 (Proudfoot， Nature322 ： 52(1986) ； Kohler， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77 ： 2197(1980))。 结合分子的单体的编码序列可包含 cDNA 或基因组 DNA。本文使用的术语 “载体” 或 “表达 载体” 是指根据本发明所用的作为导入和在宿主细胞表达目标基因的工具的载体。如本领 域技术人员所知， 该种载体可简单选自质粒， 噬菌体， 病毒和逆转录病毒。 一般而言， 适用本 发明的载体将包含选择性标记， 帮助目标基因进行克隆的适当限制性酶切位点以及进入真 核或原核细胞和 / 或在其中复制的能力。
     可采用多种表达载体系统实现本发明目的。例如， 一类利用来自动物病毒 ( 例如 牛乳头瘤病毒， 多瘤病毒， 腺病毒， 痘苗病毒， 杆状病毒， 逆转录病毒 (RSV、 MMTV 或 MOMLV) 或 SV40 病毒 ) 的 DNA 元件的载体。其他包括了具有内部核糖体结合位点的多顺反子系统的 应用。此外， 将该 DNA 整合至其染色体的细胞可通过导入一个或多个支持转染宿主细胞选 择的标记进行选择。该标记可向营养缺陷型宿主提供原营养， 耐受抗微生物剂 ( 例如， 抗生 素 ) 或耐受铜等重金属。该选择性标记基因既可直接连接至待表达的 DNA 序列， 也可通过 共转化导入相同的细胞。为优化 mRNA 的合成可能还需要附加的元件。这些元件可包括信 号序列， 剪接信号， 以及转录启动子， 增强子， 以及终止信号。
     在特别优选的实施方案中， 该克隆可变区基因与上述方法合成的 ( 优选人 ) 重和 轻链恒定区一起插入表达载体。在一个实施方案中， 这可通过称为 NEOSPLA( 披露于美国专 利 6,159,730) 的 Biogen IDEC， Inc. 的专有表达载体作用。该载体包含了细胞巨化病毒启 动子 / 增强子， 小鼠 β 球蛋白主启动子， SV40 复制起始区， 牛生长激素多聚腺苷酸化序列， 新霉素磷酸转移酶外显子 1 和外显子 2， 二氢叶酸还原酶基因和前导序列。 据发现通过结合 可变和恒定区基因， 在 CHO 细胞内转染， 在含 G418 培养基筛选并通过氨甲喋呤扩增时， 该载 体可导致极高水平的抗体表达。当然， 任何能在真核细胞引发表达的表达载体均可用于本 发明。适用载体的范例包括但不限于质粒 pcDNA3， pHCMV/Zeo， pCR3.1， pEF1/His， pIND/GS， pRc/HCMV2， pSV40/Zeo2， pTRACER-HCMV， pUB6/V5-His， pVAX1 和 pZeoSV2( 可从 Invitrogen， San Diego， CA 购买 )， 以及质粒 pCI( 可从 Promega， Madison， WI 购买 )。一般而言， 对大 量的转染细胞进行筛选以确定其是否表达了适当高水平免疫球蛋白重链和轻链是常规实 验， 其可通过机器人系统等形式开展。载体系统的描述还可参见美国专利 No.5,736,137 和 5,658,570， 其通过引用的方式全文并入本文中。该系统提供了很高的表达水平， 例如， ＞ 30pg/ 细胞 / 天。其他示例性载体系统披露于美国专利 6,413,777。
     在其他优选实施方案中， 本发明的结合分子可采用多顺反子构建体进行表达， 例 如可参见 2002 年 11 月 18 日提交的美国专利申请公开 No.2003-0157641A1， 其通过引用的 方式全文并入本文中。在这些新型表达系统中， 多个目的基因产物例如抗体的重和轻链可通过单个多顺反子构建体生产。这些系统有利地利用了内部核糖体进入位点 (IRES) 以在 真核宿主细胞内提供相对高水平的 LT 结合分子。适用 IRES 序列可参见在此引用的美国专 利 No.6,193,980。 本领域技术人员应当可以理解该种表达系统可被用于有效生产本发明披 露的全系列的 LT 结合分子。
     更普遍而言， 一旦制备得到编码 LT 结合分子的单体亚基的载体或 DNA 序列， 该 表达载体可被导入合适的宿主细胞。质粒相宿主细胞的导入可采用本领域技术人员公知 的多种技术实现。这些技术包括但不限于， 转染 ( 包括电泳和电穿孔 )， 原生质体融合， 磷酸钙沉淀， 带有套膜 DNA 的细胞融合， 显微注射以及用完整病毒感染。参见 Ridgway， A.A.G. ″ Mammalian Expression Vectors ″ Vectors， Rodriguez and Denhardt， Eds.， Butterworths， Boston， Mass.， Chapter 24.2， pp.470-472(1988)。典型地， 质粒通常通过 电穿孔导入宿主细胞。在适于结合分子生产的条件下培养带有表达构建体的宿主细胞， 并 对结合分子合成进行测定。 示例性检测技术包括酶联免疫吸附分析 (ELISA)， 放射性免疫测 定 (RIA)， 或荧光激活细胞分类分析 (FACS)， 免疫组化等。
     该表达载体通过常规技术转入宿主细胞， 然后以常规技术培养该转染细胞以生产 用于此处所述方法的抗体。因此， 本发明包括了包含可操作地连接至外源启动子的编码本 发明结合分子或其单体或链的多核苷酸的宿主细胞。 在针对表达双链抗体或二聚体结合分 子的优选实施例中， 如下文详述， 单独编码结合分子链的载体可在宿主细胞中共表达以表 达完整结合分子。
     此处所述的 “宿主细胞” 指能够接受使用重组 DNA 技术构建并至少编码一种外源 基因的载体的细胞。在对从重组宿主分离结合分子的方法的描述中所用的术语 “细胞” 和 “细胞培养物” 可相互替换地说明结合分子的来源 ( 除非另行清楚指明 )。换言之， 可回收 多肽的 “细胞” 即可指离心得到的全细胞， 也可指包含了培养基和悬浮细胞的细胞培养。
     可采用多种宿主表达载体系统来表达用于此处所述方法的结合分子。 该种宿主表 达系统代表了可生产和后续纯化目标编码序列的载体， 还代表了在以适当核苷酸编码序列 进行转化或转染后原位表达本发明抗体分子的细胞。其包括但不限于微生物， 如以包含了 抗体编码序列的重组噬菌体 DNA， 质粒 DNA 或粘粒 DNA 表达载体转染的细菌 ( 例如， 大肠杆 菌， 枯草芽袍杆菌 ) ； 以包含抗体编码序列的重组酵母表达载体转染的酵母 ( 例如， 毕赤酵 母)； 以包含抗体编码序列的重组病毒表达载体 ( 杆状病毒 ) 感染的昆虫细胞系统 ； 以包含 抗体编码序列的重组病毒表达载体 ( 例如， 花椰菜花叶病毒， CaMV ； 烟草花叶病毒， TMV) 感 染或重组质粒表达载体 ( 例如， Ti 质粒 ) 转染的植物细胞系统 ； 或包含了带有哺乳动物细 胞基因组启动子 ( 例如， 金属硫蛋白启动子 ) 或哺乳动物病毒启动子 ( 例如， 腺病毒晚期 启动子 ； 牛痘病毒 7.5k 启动子 ) 的重组表达构建体的哺乳动物细胞系统 ( 例如， COS， CHO， BLK， 293， 3T3 细胞 )。优选地， 可使用细菌细胞如大肠杆菌， 更优选使用真核细胞表达重组 结合分子， 特别是完整重组结合分子。 例如， 结合来自人细胞巨化病毒的中间早期基因启动 子元件等载体的哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢细胞 (CHO) 是一种有效的抗体和其他结合 分子的表达系统 (Foecking et al.， Gene45 ： 101(1986) ； Cockett et al.， Bio/Technology 8： 2(1990))。
     该用于蛋白表达的宿主细胞系通常来源于哺乳动物 ； 本领域技术人员应当具有优 选适用于表达目标基因产物的特定宿主细胞系的能力。示例性宿主细胞系包括但不限于，CHO( 中国仓鼠卵巢细胞 )， DG44 和 DUXB11( 中国仓鼠卵巢细胞系， DHFR 缺陷型 )， HELA( 人 子宫颈癌 )， CVI 猴肾细胞系 )， COS( 带有 SV40T 抗原的 CVI 衍生物 )， VERY， BHK( 幼仓鼠 肾 )， MDCK， 293， WI38， 81610( 中国仓鼠纤维原细胞 )， BALBC/3T3( 鼠成纤维 )， HAK( 仓鼠肾 细胞系 )， SP2/O( 小鼠骨髓瘤 )， P3x63-Ag3.653( 小鼠骨髓瘤 )， BFA-1c1BPT( 牛内皮细胞 )， RAJI( 人淋巴细胞 ) 以及 293( 人肾 )。特别优选 CHO 细胞。通常可从商业服务机构， 美国 组织培养物保藏中心或公开文献获取。
     此外， 还可选择以特定形式调节插入序列表达， 或修饰和处理基因产物的宿主细 胞株。对该蛋白产物的该种修饰 ( 例如， 糖基化 ) 和处理 ( 例如， 裂解 ) 可对该蛋白的功能 非常重要。 不同的宿主细胞可对蛋白和基因产物的转译后处理和修饰均有不同的特性和特 殊的机制。可选择适当的细胞系或宿主系统以确保表达的外源蛋白的正确修饰和处理。为 此， 可使用具有正确处理基因产物的初级转录， 糖基化和磷酸化的细胞机制的真核宿主细 胞。
     优选稳定表达以进行重组蛋白的长期高产量生产。例如， 可通过工程改造得到稳 定表达该结合分子的细胞系。宿主细胞可通过由适当表达控制元件 ( 例如， 启动子， 增强 子， 序列， 转录终止子， 聚腺苷酸化位点等 ) 和选择性标记控制的进行转化， 而非使用包含 病毒复制起始区的表达载体。在导入外源 DNA 后， 将工程细胞在富集培养基中培养 1-2 天， 然后转入选择性培养基。 重组质粒中的选择性标记可带来对选择因素的耐受并使细胞将该 质粒稳定整合进入其染色体， 然后生长得到可进行后续克隆并扩展入细胞系的病灶。该方 法可用于工程改造可稳定表达结合分子的细胞系。
     多种选择系统可供使用， 包括但不限于可分别应用于 tk-、 hgprt- 或 aprt- 细 胞的单纯疱疹病毒胸苷激酶 (Wigler et al.， Cell 11 ： 223(1977))， 次黄嘌呤 - 鸟嘌 呤 磷 酸 核 糖 转 移 酶 (Szybalska&Szybalski， Proc.Natl.Acad.Sci.USA48 ： 202(1992))， 以 及 腺 喋 呤 磷 酸 核 糖 转 移 酶 (Lowy et al.， Cell 22 ： 8171980) 基 因。 此 外， 抗代谢 物抗性可用作下列基因选择的基础 ： 具有对氨甲喋呤的抗性的 dhfr(Wigler et al.， Natl.Acad.Sci.USA 77 ： 357(1980) ； O ′ Hare et al.， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78 ： 1527(1981)) ； 具有对麦考酚酸的抗性的 gpt(Mulligan&Berg， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78 ： 2072(1981)) ； 具有对氨基糖苷 G-418 的抗性的 neo(Clinical Pharmacy 12 ： 488-505 ； Wu and Wu， Biotherapy 3 ： 87-95(1991) ； Tolstoshev， Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32 ： 573-596(1993) ； Mulligan， Science260 ： 926-932(1993) ； 和 Morgan and Anderson， Ann. Rev.Biochem.62 ： 191-217(1993) ； TIB TECH 11(5) ： 155-215(1993 年 5 月 ) ； 具有对潮霉素 的抗性的 hygro(Santerre et al.， Gene 30 ： 147(1984))。本领域公知的可供使用的重组 DNA 技术可参见 Ausubel et al.(eds.)， Current Protocols in Molecular Biology， John Wiley&Sons， NY(1993) ； Kriegler， Gene Transfer and Expression， A Laboratory Manual， Stockton Press， NY(1990) ； 以及 Chapters 12 和 13， Dracopoli et al.(eds)， Current Protocols in Human Genetics， John Wiley&Sons， NY(1994) ； Colberre-Garapin et al.， J.Mol.Biol.150 ： 1(1981)， 其通过引用的方式全文并入本文中。
     结合分子的表达水平可通过载体扩增得到提高 ( 其综述参见 Bebbington and Hentschel， The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning， Academic Press， New York，Vol.3.(1987))。 当表达结合分子的载体系统中的标记可进行扩增时， 宿主细胞培养中抑制 剂水平的提升可提高标记基因拷贝数。由于扩增区与结合分子关联， 因而结合分子的产量 也会得到提高 (Crouse et al.， Mol.Cell.Biol.3 ： 257(1983))。
     体外生产可以放大， 以获得大量的所需多肽。在组织培养条件下培养哺乳动物细 胞的技术已为本领域所知并包括均匀悬浮培养 ( 例如， 在气升式反应器或连续搅拌反应器 中 )， 或是固定化或包埋细胞培养 ( 例如， 在中空纤维， 微胶囊中， 在琼脂糖微珠或陶瓷芯 上 )。在必须和 / 或需要时， 例如， 在合成铰链区多肽的生物合成后， 或在此处所述的 HIC 层析步骤前后， 该多肽溶液可通过常规层析方法进行纯化， 例如凝胶过滤， 离子交换层析， DEAE- 纤维素层析或 ( 免疫 -) 亲和层析。
     编码本发明 LT 结合分子的基因还可通过非哺乳动物细胞 ( 例如细菌或昆虫或酵 母或植物细胞 ) 进行表达。较容易接受核酸的细菌包括肠杆菌成员， 例如大肠杆菌或沙门 氏菌菌株 ； 芽孢杆菌， 例如枯草芽孢杆菌 ； 肺炎球菌 ； 链球菌， 以及流感嗜血杆菌。应当进一 步指出， 在细菌中表达时该外源多肽通常作为包含体的一部分。 该外源多肽可进行分离， 纯 化然后组装入功能性分子。在需要结合分子的四价形式时， 该亚基将自动装配进入四价结 合分子 ( 例如四价抗体 (WO02/096948A2))。
     在细菌系统中， 根据被表达的结合分子的目标用途， 可选择使用多种表达载体。 例 如， 当需要生产大量该种蛋白， 以得到结合分子的药物组合物时， 可采用能够引导高水平表 达易纯化融合蛋白产物的载体。 该类载体包括但不限于， 大肠杆菌表达载体 pUR278(Ruther et al.， EMBO J.2 ： 1791(1983))， 其中该抗体克隆序列可在与 lacZ 编码区同框的情况下 单独连接至该载体从而生产融合蛋白 ； pIN 载体 (Inouye&Inouye， Nucleic Acids Res.13 ： 3101-3109(1985) ； Van Heeke&Schuster， J.Biol.Chem.24 ： 5503-5509(1989)) 等。pGEX 载 体也可用于将外源多肽以谷胱甘肽 S 转移酶 (GST) 融合蛋白的形式进行表达。一般而言， 该种融合蛋白具有可溶性， 并能通过吸附， 结合至基质谷胱甘肽 - 琼脂糖珠， 然后在自由谷 胱甘肽存在下洗脱进行简单的纯化。通过设计该 pGEX 载体包括了凝血酶或 Xa 因子蛋白酶 裂解位点， 从而使该克隆的目标基因产物可以从 GST 部分释放。
     除了原核生物外， 还可采用真核微生物。尽管许多其他的菌株 ( 例如， 毕赤酵母 ) 已上市销售， 酿酒酵母， 或普通面包酵母在真和微生物中最为常用。
     通常可使用质粒 YRp7(Stinchcomb et al.， Nature 282 ： 39(1979) ； Kingsman et al.， Gene 7 ： 141(1979) ； Tschemper et al.， Gene 10 ： 157(1980)) 等在酵母中进行表达。 该质粒已包含了可为缺乏在色氨酸中生长能力的酵母突变菌株 ( 例如 ATCC No.44076 或 PEP4-1(Jones， Genetics 85 ： 12(1977)) 提供选择性标记的 TRP1 基因。然后作为酵母宿主 细胞基因组特征的 Trp1 病斑的存在为色氨酸缺失生长下转化的检测提供了有效的环境。
     在昆虫系统中， 通常使用蓿苜尺蠖核多角体病毒 (AcNP V) 作为表达外源基因的载 体。该病毒生长于草地夜蛾细胞。该抗体编码序列可单独克隆进入该病毒的非必须区 ( 例 如多角体蛋白基因 ) 并位于 AcNPV 启动子 ( 例如该多角体蛋白启动子 ) 的控制下。
     当本发明的结合分子被重组表达后， 可通过本领域已知的任意免疫球蛋白分子纯 化方法对其进行纯化， 例如， 层析 ( 例如， 离子交换层析， 亲和层析， 特别是对蛋白 A 特异性 抗原的亲和层析， 筛分柱层析 )， 离心， 微分溶出， 或通过任何其他蛋白纯化标准技术。可选 择地， 提高本发明结合分子 ( 例如抗体 ) 亲和性的优选方法参见 US 20020123057A1。VI. 使用包含结合 LT 的结合分子的组合物的治疗方法
     本发明的一种实施方案提供受益于施用抗 -LT 结合分子的受试者的治疗方法， 该 方法包括、 主要包括、 或由向该动物施用有效量的本文所述的本发明的结合分子或组合物。
     在一个实施方案中， 本发明的结合分子施用至患有和炎症或自身免疫应答有关的 疾患的受试者。在一个实施方案中， 本发明的结合分子施用至患有癌症的受试者。
     示例性炎症或自身免疫疾患包括器官特异性疾病 ( 即， 免疫应答特异性针对于器 官系统例如内分泌系统， 造血系统， 皮肤， 心肺系统， 肠胃及肝脏系统， 肾脏系统， 甲状腺， 耳， 神经肌系统， 中枢神经系统等 ) 或可影响多种器官系统的系统性疾病 ( 例如， 全身性红 斑狼疮 (SLE)， 风湿性关节炎， 多肌炎等 )。在一个实施方案中， 使用本发明的结合分子治疗 的自身免疫或炎性疾患是具有异位淋巴表现的疾患。
     示例性自身免疫或炎性疾病包括例如 ： 风湿性关节炎， 干燥综合征， 硬皮病， 狼疮 例如 SLE 和狼疮肾炎， 多肌炎 / 皮肌炎， 冷球蛋白血症， 抗 - 磷脂抗体综合征和牛皮癣关节 炎 )， 自身免疫肠胃及肝脏疾患 ( 如例如炎性肠疾病 ( 例如溃疡性结肠炎和克罗恩病 )， 自 身免疫胃炎和恶性贫血， 自身免疫性肝炎， 原发性胆汁性肝硬化， 原性性硬化性胆管炎和腹 腔疾病 )， 血管炎 ( 如例如 ANCA- 阴性血管炎和 ANCA- 相关血管炎， 包括丘 - 施二氏血管 炎， 韦格内氏肉芽肿症和显微镜下多血管炎 )， 自身免疫神经系统疾患 ( 如例如多发性硬化 (MS)， RRMS， SPMS， 眼肌阵挛性肌阵挛综合征， 重症肌无力， 视神经脊髓炎， 帕金森氏症， 阿耳 茨海默氏病和自身免疫多发性神经病 )， 肾脏喜欢 ( 如例如， 血管球性肾炎， 古德帕斯彻氏 综合征和贝格尔氏病 )， 自身免疫皮肤病 ( 如例如， 牛皮癣， 荨麻疹， 假膜性喉头炎， 慢性天 疱疮， 大疱性类天疱疮和皮肤全身性红斑狼疮 )， 血液性疾病 ( 如例如， 血小板减少性紫癜， 血栓性血小板减少性紫癜， 输血后紫癜和自身免疫溶血性贫血 )， 动脉硬化症， 葡萄膜炎， 自 身免疫听力疾病 ( 如例如， 内耳病和听力损失 )， 白塞氏病， 雷诺氏综合征， 皮肌炎， 器官移 植和自身免疫内分泌障碍 ( 如例如， 糖尿病相关自身免疫疾病例如胰岛素 - 依赖性糖尿病 (IDDM)， 爱迪生氏病和自身免疫甲状腺疾病 ( 例如格雷夫斯氏病和甲状腺炎 ))。更优选的 这些疾病包括例如 RA， IBD， 包括克罗恩病和溃疡性结肠炎， ANCA- 相关的血管炎， 狼疮， MS， 干燥综合征， 格雷夫斯氏病， IDDM， 恶性贫血， 甲状腺炎和血管球性肾炎。甚至更优选的是 RA， IBD， 狼疮和 MS， 并且更优选 RA 和 IBD， 最优选 RA。
     示例性非自身免疫适应症包括滤泡性淋巴瘤， 动脉硬化症， 病毒诱导的肝炎， 支气 管哮喘和病毒休克综合征。
     在一个实施方案中， 本结合分子用于治疗风湿性关节炎。如本文中使用的，″风 湿性关节炎″或″ RA″是指识别的疾病状态， 其可根据 2000 修订的 American Rheumatoid Association 的 RA 分类标准或任何类似的标准来诊断， 并且包括主动早期和初期 RA， 如下 面定义的。 RA 的生理指标包括对称关节肿胀， 其是特征性的， 尽管在风湿性关节炎中不是不 变的。手的近侧指间 (PIP) 关节以及掌骨指骨 (MCP)， 腕关节， 肘， 膝， 踝关节和跖趾 (MTP) 关节的梭形肿胀通常受到影响， 并且肿胀容易被检测。被动运动中的疼痛是关节炎症的最 敏感的测试， 并且炎症和结构变形通常限制受到影响的关节的活动范围。典型的可见的变 化包括 MCP 关节处手指的尺骨偏差、 伸直过度、 或 MCP 和 PIP 关节的屈曲过度、 肘的屈曲性 挛缩和腕骨和趾部的半脱位。患有 RA 的受试者可耐 DMARD， 因为 DMARD 在治疗症状中不是 有效的或不是完全有效的。在一个实施方案中， 根据本发明的疗法的候选物包括对于之前或目前使用 TNF 抑 制剂的治疗经历不充分的应答的那些。
     在一个实施方案中， 本发明的结合分子用于治疗主动风湿性关节炎。″主动风湿 性关节炎″的患者是指患者具有主动但非潜伏性的 RA 症状。″早期主动风湿性关节炎″ 的受试者是那样的受试者， 其根据 RA 分类的 1987 修改的 ACR 标准诊断患有主动 RA 至少 8 周但是不长于 4 年。″早期风湿性关节炎″的受试者是那样的受试者， 其根据 RA 分类的 1987 修改的 ACR 标准诊断患有 RA 至少 8 周但是不长于 4 年。早期 RA 包括例如青少年型 RA， 幼年特发性关节炎 (JIA) 或少年 RA(JRA)。
     在一个实施方案中， 本发明的结合分子用于治疗初期风湿性关节炎。″初期 RA″ 患者具有早期多发性关节炎， 其并未完全满足诊断 RA 的 ACR 标准， 但是相关于存在 RA- 特 异性前兆生物标记， 例如抗 -CCP 和共享的抗原表位。它们包括阳性抗 -CCP 抗体患者， 其患 有多发性关节炎， 但是并未诊断 RA， 其处于发展 bonafide ACR 标准 RA 的高风险中 (95％可 能性 )。
     ″关节损伤″以最广泛的意义使用， 并且是指一个或多个关节的任意部分损坏或 者部分或全部破坏， 包括结缔组织和软骨， 其中损坏包括任何原因的结构和 / 或功能损害， 并且可以或不可以引起关节疼痛 / 关节痛。其包括但不限于相关于或源自炎性关节病以及 非炎性关节病的关节损伤。该损害可由任何病症引起， 例如自身免疫疾病， 特别是关节炎， 最特别是 RA。示例性这种病症包括急性和慢性关节炎， RA 包括青少年型 RA， 幼年特发性 关节炎 (JIA) 或少年 RA(JRA)， 以及阶段例如类风湿性滑膜炎， 痛风或痛风性关节炎， 急性 免疫关节炎， 慢性炎症性关节炎， 退化性关节炎， II 型胶原质 - 诱导的关节炎， 感染性关节 炎， 脓毒性关节炎， 莱姆关节炎， 增生性关节炎， 牛皮癣性关节炎， 斯提耳病， 脊椎关节炎， 骨 关节炎， 关节炎慢性 progrediente， 变形性关节炎， 多发性关节炎慢性 primaria， 反应性关 节炎， 更年期关节炎， 雌激素耗尽关节炎和强直性脊椎炎 / 类风湿性脊椎炎 )， 除了 RA 的风 湿性自身免疫疾病， 和 RA 的次级明显系统性发展 ( 包括但不限于血管炎， 肺纤维化或费耳 提氏综合征 )。为了本文目的， 关节是骨骼元件之间 ( 脊椎动物例如动物 ) 和围绕并支持 其的部分的接触点， 包括但不限于例如髋关节， 脊柱的椎骨之间的关节， 脊柱和骨盆 ( 骶髂 关节 ) 之间的关节， 附接骨骼的腱和韧带中的关节， 肋骨和脊柱， 肩部， 膝盖， 脚， 肘， 手， 指， 踝， 和趾部之间的关节， 但特别是手和脚中的关节。
     在一个实施方案中， 受试者之前从未使用药物进行治疗， 例如未使用免疫抑制剂 治疗疾患， 但在特定实施方案中， 之前从未使用 TNF 拮抗剂进行治疗。在可选择的实施方案 中， 受试者之前使用药物进行治疗以治疗疾患， 包括 TNF 拮抗剂。
     在又一方面中， 患者复发疾患。在可选择的实施方案中， 患者并未复发疾患。
     在另外的方面中， 本发明的抗体是施用至受试者以治疗疾患的仅有的药物。在可 选择的方面中， 本文的结合分子是用于治疗疾患的仅有的药物。
     在又一方面中， 受试者仅患有 RA 作为自身免疫疾患。
     或者， 受试者仅患有 MS 作为自身免疫疾患。甚至或者， 受试者仅患有狼疮或 ANCA- 相关的血管炎或干燥综合征作为自身免疫疾患。
     VIII. 药物组合物和施用方法
     LT- 特异性结合分子的制备以及向需要的受试者进行施用的方法已为本领域技术人员熟知或容易确定。结合分子的施用途径可以是 ( 例如 ) 口服， 肠胃外， 通过吸入或局部 施用。 此处所用的术语肠胃外施用包括 ( 例如 ) 静脉内， 动脉内， 腹膜内， 肌肉内， 皮下， 直肠 或阴道施用。尽管所有这些施用的形式均明确在本发明的范围内， 但是其中一种施用形式 是供注射， 特别是供静脉或动脉注射或者滴注的溶液。注射用的合适的药物组合物通常可 包含缓冲液 ( 例如， 醋酸盐， 磷酸盐或柠檬酸盐缓冲液 )， 表面活性剂 ( 例如， 聚山梨醇酯 )， 任选的稳定剂 ( 例如， 人白蛋白 ) 等。然而， 在另一种与此技术一致的方法中， 结合分子可 直接传递至有害细胞群的位点， 从而提高该疾病组织对该治疗剂的暴露。
     肠胃外施用的制剂包括无菌水溶液或非水溶液， 悬浮液和乳剂。非水溶剂的例子 为丙二醇， 聚乙二醇， 植物油 ( 例如橄榄油 )， 以及可注射的有机酯 ( 例如油酸乙酯 )。水溶 液载体包括水， 酒精 / 水溶液， 乳剂或悬浮液， 包括盐水和缓冲介质。本发明中药学上可接 受的载体包括但不限于 0.01-0.1M， 优选 0.05M 磷酸盐缓冲液或 0.8％盐水。其他常用的肠 胃外载体包括磷酸钠溶液， Ringer 右旋糖， 右旋糖和氯化钠， Ringer 乳酸盐， 或固定油。静 脉内载体包括液体和营养补充剂， 电解质补充剂， 例如基于 Ringer 右旋糖的电解质补充剂 等。还可包括防腐剂和其他添加剂， 例如抗菌剂， 抗氧化剂， 鳌合剂， 以及惰性气体等。
     更具体地， 适于注射用途的药物组合物包括无菌水溶液 ( 溶于水时 ) 或分散液以 及用作可无菌注射溶液或分散液的临时制剂的无菌粉末。此时， 该组合物应当无菌且具有 足够的流动性以进行注射。它应在生产和贮存条件下保持稳定， 并优选可耐受微生物 ( 例 如细菌和真菌 ) 的污染。该载体可以是溶剂或分散介质， 其包含， 例如水， 乙醇， 多元醇 ( 丙 三醇， 丙二醇， 以及液体聚乙二醇等 )， 及其适当的混合物。适当的流动性可通过多种方式 维持， 例如， 通过适用卵磷脂等包覆， 对于分散剂通过保持所需的颗粒尺寸以及通过表面活 性剂的使用。用于此处披露的治疗方法的合适制剂披露于 Remington′ s Pharmaceutical Sciences， Mack Publishing Co.， 16th ed.(1980)。
     微生物作用的预防可通过各种抗菌和抗真菌剂 ( 例如， 防腐剂， 氯丁醇， 苯酚， 抗 坏血酸， 硫柳汞等 ) 实现。在许多情况下该组合物中优选包含等张剂， 例如， 糖， 多元醇 ( 例 如甘露醇， 山梨糖醇 )， 或氯化钠。可注射组合物的长期吸收可通过在组合物中包含一种延 缓吸收的试剂 ( 例如， 单硬脂酸铝和明胶 ) 来实现。
     在任意情况下， 无菌可注射溶液可通过将所需量的活性化合物 ( 例如本发明的结 合分子 ) 与此处所列成份的一种或组合溶于适当的溶剂中， 并根据要求过滤灭菌而制备得 到。一般而言， 分散剂可通过将活性化合物与包含了基础分散介质和所需其他上述成分的 无菌载体结合得到。对于可用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末， 其优选制备方法为真空 干燥和冷冻干燥， 通过制备得到的粉末包含活性成分和从其无菌过滤溶液得到的任何附加 所需成分。该注射制剂经处理后将根据本领域已知方法填充入容器 ( 例如安瓶， 袋， 瓶， 注 射器或小瓶 )， 并在无菌条件下密封。 此外， 该制剂可经过包装以试剂盒的形式出售， 如共同 未决申请 U.S.S.N.09/259,337(US-2002-0102208 A1) 所述， 其通过引用的方式全文并入本 文中。 该产品优选包含标签或说明书以指示该相关组合物可用于治疗患有或易患自体免疫 或肿瘤性病症的受试者。
     用于治疗高度增殖紊乱的本发明组合物的有效剂量取决于多种因素， 包括施用方 法， 靶标位点， 患者的生理状态， 该患者是人或动物， 施用的其他药物， 以及用于治疗还是预 防。该患者通常为人， 但也可治疗包括转基因动物在内的非人类哺乳动物。可采用本领域技术人员已知的常规方法对治疗剂量进行滴定测量以获得最佳的安全性和有效性。
     采用抗体或其片段对高度增殖紊乱进行治疗时， 该剂量相对宿主体重可以为， 例 如， 从 约 0.0001 至 100mg/kg， 更 通 常 为 0.01 至 5mg/kg( 例 如， 0.02mg/kg， 0.25mg/kg， 0.5mg/kg， 0.75mg/kg， 1mg/kg， 2mg/kg 等 )。例如该剂量可以是 1mg/kg 体重或 10mg/kg 体 重或在 1-10mg/kg 范围内， 优选至少 1mg/kg。上述范围的中间剂量在本发明的范围之内。 受试者给药可采取每天施用， 隔日施用， 每周施用或根据任何其他通过实证分析得到的进 度施用。一种示例性治疗需要在较长的期限内 ( 例如， 至少六个月 ) 进行多剂量施用。一 种示例性治疗方案需要每两周或每月一次或是每 3 至 6 个月一次施用。示例性剂量给法包 括连续每天 1-10mg/kg 或 15mg/kg， 隔日 30mg/kg 或每周 60mg/kg。在一些方法中同时给用 两种或多种具有不同结合特异性的单克隆抗体或其他治疗剂， 其中各抗体或治疗剂的施用 剂量均在指示的范围之内。
     此处披露的 LT- 特异性结合分子可在多种时间施用。单独剂量之间的间隔可以为 数周， 数月或数年。 根据对患者体内靶多肽或靶分子血液水平的测量所示， 该间隔也可是不 规律的。在一些方法中可对剂量进行调整以使血浆多肽浓度在 1-1000μg/ml， 在一些方法 中该浓度为 25-300μg/ml。可选择地， 结合分子可作为缓释制剂施用， 此时可减少给药频 率。剂量和频率的变化取决于抗体在患者体内的半衰期。结合分子还可通过与稳定多肽或 部分 ( 例如， 白蛋白或 PEG) 相融合来延长半衰期。一般而言， 人源化抗体显示了最长的半 衰期， 其次是嵌合抗体和非人源抗体。 在一个实施方案中， 本发明的结合分子可以未结合形 式施用。 在另一实施方案中， 本文公开的方法中使用的该结合分子可以结合形式多次施用。 在另一实施方案中， 本发明的结合分子可先以不结合方式， 再以结合方式施用， 或以相反的 顺序施用。
     施用剂量和频率可依据该治疗为预防性或治疗性而发生变化。在预防性应用中， 包含抗体或其混合物的组合物被施用至未处于疾病状态或在疾病前状态的患者以增强该 患者的抵抗力。该种数量被定义为 “预防有效剂量” 。对于该用途， 其确切的数量在以依赖 于患者的健康和总体免疫力状态， 但通常在每个剂量约 0.1 至 25mg 的范围内， 特别在每个 剂量 0.5 至 2.5mg 的范围内。可以相对低的剂量在较长的一段时间内以相对较低的频率施 用。部分患者将接受终生持续治疗。
     在治疗性应用中， 有时需要以相对高的剂量 ( 例如， 从约 1 至 400mg/kg 的结合分 子， 例如， 每个剂量的抗体， 放射免疫结合物通常采用从 5 至 25mg 的剂量， 细胞毒素药物结 合的分子将采用更高的剂量 ) 在相对短的间隔内施用直至疾病的进展被减缓或终止， 并优 选直至该患者显示部分或完全改善疾病症状。此后， 该患者可以预防方案进行施用。
     在一个实施方案中， 可采用包含编码 LT- 特异性抗体或其免疫特异性片段的核酸 分子 ( 例如， 包含在载体中 ) 的核酸分子治疗受试者。编码多肽的核酸的剂量范围为每个 患者约 10ng 至 1g、 100ng 至 100mg、 1μg 至 10mg 或 30-300μg DNA。传染性病毒载体的剂 量在每剂 10-100 或更多病毒体。
     用于预防性和 / 或治疗性治疗的治疗剂可通过肠胃外， 局部， 静脉内， 口服， 皮下， 动脉内， 头颅内， 腹膜内， 鼻内或肌肉内的方式施用。 在部分方法中， 药剂被直接注射进入特 定的 LTbR- 表达细胞被积聚的组织， 例如头颅内注射。抗体施用优选采用肌肉注射或静脉 输注。在部分方法中， 特定的治疗性抗体被直接注射入颅内。在一些方法中， 该抗体作为缓释组合物或仪器 ( 例如 MedipadTM 仪 ) 进行给药。
     LT 结合分子可任选与其他对病症或症状的治疗 ( 例如， 预防或治疗 ) 有效的试剂 联合施用。
     在本公开披露的范围内， 本发明的 LT- 特异性结合分子可通过上述治疗方法在足 以产生治疗或预防效果的数量下施用于人或其他动物。本发明的 LT- 特异性抗体结合分子 可以常规剂型施用于人或其他动物， 该剂型可参照已知技术将本发明抗体结合常规药学上 可接受载体或稀释液进行制备。 本领域技术人员均可理解该药学上可接受的载体或稀释液 的形式和特征由其结合的活性成分的量， 给药途径和其他公知变量所决定。本领域技术人 员将进一步理解包含一种或多种如本发明所述的结合分子的混合剂可能会特别有效。
     本发明的实施将采用 ( 除非另行指出 ) 细胞生物学， 细胞培养， 分子生物学， 转 基 因 生 物 学， 微 生 物 学， 重 组 DNA 以 及 免 疫 学 的 常 规 技 术， 其均在本领域的技术范 围 之 内。 该 类 技 术 在 文 献 中 得 到 了 充 分 的 解 释。 例 如， 参 见 Molecular Cloning A Laboratory Manual， 2nd Ed.， Sambrook et al.， ed.， Cold Spring Harbor Laboratory Press ： (1989) ； Molecular Cloning ： A Laboratory Manual， Sambrook et al.， ed.， Cold Springs Harbor Laboratory， New York(1992)， DNA Cloning， D.N.Glover ed.， Volumes I and II(1985) ； Oligonucleotide Synthesis， M.J.Gait ed.， (1984) ； Mullis et al.U.S.Pat.No ： 4， 683， 195 ； Nucleic Acid Hybridization， B.D.Hames&S.J.Higgins eds.(1984) ； Transcription And Translation， B.D.Hames&S.J.Higgins eds.(1984) ； Culture Of Animal Cells， R.I.Freshney， Alan R.Liss， Inc.， (1987) ； Immobilized Cells And Enzymes， IRL Press， (1986) ； B.Perbal， A Practical Guide To Molecular Cloning(1984) ； the treatise， Methods In Enzymology， Academic Press， Inc.， N.Y. ； Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells， J.H.Miller and M.P.Calos eds.， Cold Spring Harbor Laboratory(1987) ； Methods In Enzymology， Vols.154 and 155(Wu et al.eds.) ； Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology， Mayer and Walker， eds.， Academic Press， London(1987) ； Handbook Of Experimental Immunology， Volumes I-IV， D.M.Weir and C.C.Blackwell， eds.， (1986) ； Manipulating the Mouse Embryo， Cold Spring Harbor Laboratory Press， Cold Spring Harbor， N.Y.， (1986) ； 和 Ausubel et al.， Current Protocols in Molecular Biology， John Wiley and Sons， Baltimore， Maryland(1989)。
     抗 体 工 程 的 一 般 原 则 可 参 见 Antibody Engineering， 2nd edition， C.A.K.Borrebaeck， Ed.， Oxford Univ.Press(1995)。蛋白工程的一般原则可参见 Protein Engineering， A Practical Approach， Rickwood， D.， et al.， Eds.， IRL Press at Oxford Univ.Press， Oxford， Eng.(1995)。抗体和抗体一半抗原结合的一般原则可参见 Nisonoff， A.， Molecular Immunology， 2nd ed.， Sinauer Associates， Sunderland， MA(1984) 和 Steward， M.W.， Antibodies， Their Structure and Function， Chapman and Hall， New York， NY(1984)。 此 外， 本 领 域 已 知 且 未 具 体 描 述 的 免 疫 学 标 准 方 法 可 参 照 Current Protocols in Immunology， John Wiley&Sons， New York ； Stites et al.(eds)， Basic and Clinical-Immunology(8th ed.)， Appleton&Lange， Norwalk， CT(1994)and Mishell and Shiigi(eds)， Selected Methods in Cellular Immunology， W.H.Freeman and Co.， NewYork(1980)。
     阐 述 了 免 疫 学 基 本 原 理 的 标 准 参 考 著 作 包 括 Current Protocols in Immunology， John Wiley&Sons， New York ； Klein， J.， Immunology ： The Science of Self-Nonself Discrimination， John Wiley&Sons， New York(1982) ； Kennett， R.， et al.， eds.， Monoclonal Antibodies， Hybridoma ： A New Dimension in Biological Analyses， Plenum Press， New York(1980) ； Campbell， A.， “Monoclonal Antibody Technology” in Burden， R.， et al.， eds.， Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology， Vol.13， Elsevere， Amsterdam(1984)， Kuby Immunology 4 th ed.Ed.Richard A.Goldsby， Thomas J.Kindt and Barbara A.Osborne， H.Freemand&Co.(2000) ； Roitt， th I.， Brostoff， J.and Male D.， Immunology 6 ed.London ： Mosby(2001) ； Abbas A.， Abul， A.and Lichtman， A.， Cellular and Molecular Immunology Ed.5， Elsevier Health Sciences Division(2005) ； Kontermann and Dubel， Antibody Engineering， Springer Verlan(2001) ； Sambrook and Russell， Molecular Cloning ： A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Press(2001) ； Lewin， Genes VIII， Prentice Hall(2003) ； Harlow and Lane， Antibodies ： A Laboratory Manual， Cold Spring Harbor Press(1988) ； Dieffenbach and Dveksler， PCR Primer Cold Spring Harbor Press(2003)。
     前文及本文中引用的所有参考文献均以引用的方式全文并入本文中。 实施例 实施例 1. 抗 - 淋巴细胞毒素抗体的克隆
     通过珠上存在的 LTα1β2 注射小鼠来制备针对人淋巴细胞毒素 (LT) 的小鼠单克 隆抗体 (mAbs)。LTα1β2 使用本领域识别的技术 ( 使用抗 -myc 抗体或通过 CnBr 固定至 珠表面 ) 连接至珠。
     来自鼠杂交瘤细胞的全细胞 RNA 使用 Qiagen RNeasy mini 试剂盒按照生产商推 荐的方案来制备。编码重链和轻链的可变区的 cDNA 由来自全细胞 RNA 的 RT-PCR 使用第 一链 cDNA 的引物的随机六聚体来克隆。对于具有完整信号序列的鼠免疫球蛋白可变结构 域的 PCR 扩增， 杂交至多鼠免疫球蛋白基因家族信号序列的降解正向引物和特异于鼠恒定 结构域的 5’ 端的单一反向引物的混合体 (cocktail)。按照生产商推荐的方案， PCR 使用 Clontech Advantage 2 聚合酶混合物。PCR 产物经凝胶纯化， 并且使用它们的 TOPO 克隆试 剂盒按照生产商推荐的方案亚克隆到 Invitrogen’ s pCR2.1TOPO 载体。来自多个独立亚克 隆的插入物被测序以建立共有序列。 降低成熟的免疫球蛋白 N- 末端和通过杂交瘤的 Edman 降解所测定的那些一致。
     特 异 性 亚 基 的 分 配 基 于 BLAST 分 析 使 用 来 自 Kabat 数 据 库 的 共 有 免 疫 球 蛋 白 可 变 结 构 域 序 列 (Kabat et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest.5th Edition， U.S.Dept.of Health and Human Services.U.S.Govt.Printing Office.) 来进行。使用 Kabat 定义来表示下面的 CDR。
     mAb A0D9
     下面示出 A0D9 成熟重链可变结构域蛋白序列， CDR 有下划线 ：
     1 QVQLKQSGPG LVQPSQSLSI TCTVSGFSLS TYGVHWVRQF PGKGLEWLGV
     51 IWRGGNTNYN AAFMSRLTIS KDNSKSQVFF KMNSLQAKDT AIYYCVRNQI
     101 YDGYYDYAMD YWGQGTSVTV SS(SEQ ID NO ： )
     A0D9 重链是鼠亚基 I(B) 重链
     下面示出 A0D9 重链可变结构域的 DNA 序列 ( 来自 pYL460)， 其信号序列有下划线 ( 重链编码的信号是 MAVLGLLFCLVTFPSCVLS(SEQ IDNO ： )) ：
     1 ATGGCTGTCC TGGGGCTGCT CTTCTGCCTG GTGACATTCC CAAGCTGTGT
     51 CCTGTCCCAG GTGCAGCTGA AGCAGTCAGG ACCTGGCCTA GTGCAGCCCT
     101 CACAGAGCCT GTCCATCACC TGCACAGTCT CTGGTTTCTC ATTATCTACC
     151 TATGGTGTCC ACTGGGTTCG CCAGTTTCCA GGAAAGGGTC TGGAGTGGCT
     201 GGGAGTGATA TGGAGAGGTG GAAACACAAA CTATAATGCA GCTTTCATGT
     251 CCAGACTGAC CATCAGCAAG GACAATTCCA AGAGTCAAGT TTTCTTTAAA
     301 ATGAACAGTC TGCAAGCTAA AGACACAGCC ATATATTATT GTGTCAGAAA
     351 CCAGATCTAT GATGGTTACT ACGACTATGC TATGGACTAC TGGGGTCAGG
     401 GAACCTCAGT CACCGTCTCC TCA(SEQ ID NO ： )
     下面示出 A0D9 成熟轻链可变结构域蛋白序列， CDR 有下划线 ：
     1 DIKMTQSPSS MYASLGERVT ITCKASQDIN TYLNWLQQKP GKSPKTLIYR
     51 ANRLVDGVPS RFSGRGSGQD YSLTISSLEY EDVGIYYCLH YDAFPWTFGG
     101 GTKLEIK
     A0D9 轻链是鼠亚基 V kappa 轻链
     下面示出成熟轻链可变结构域的 DNA 序列 ( 来自 pYL463)， 其信号序列有下划线 ( 轻链编码的信号 MRAPAQFFGFLLLWFPGIKC(SEQ ID NO ： )) ：
     1 ATGAGGGCCC CTGCTCAGTT TTTTGGCTTC TTGTTGCTCT GGTTTCCAGG
     51 TATCAAATGT GACATCAAGA TGACCCAGTC TCCATCTTCC ATGTATGCAT
     101 CTCTAGGAGA GAGAGTCACT ATCACTTGCA AGGCGAGTCA GGACATTAAT
     151 ACCTATTTAA ACTGGCTCCA GCAGAAACCA GGGAAATCTC CTAAGACCCT
     201 GATCTATCGT GCAAACAGAT TGGTAGATGG GGTCCCATCA AGGTTCAGTG
     251 GCCGTGGATC TGGGCAAGAT TATTCTCTCA CCATCAGCAG CCTGGAATAT
     301 GAAGATGTGG GAATTTATTA TTGTCTACAC TATGATGCAT TTCCGTGGAC
     351 GTTCGGCGGA GGCACCAAGC TGGAAATCAA A(SEQ ID NO ： )
     mAb A1D5
     下面示出 A1D5 成熟重链可变结构域蛋白序列， CDR 有下划线 ：
     1 EVQLQQSGPE LVKPGASVKI SCKASGYSFT GYFMNWMRQS HGKSLEWIGR
     51 INPYNGDSFY NQKFKDKATL TVDKSSTTAH MELLSLTSED SAVYYCGRGY
     101 DAMDYWGQGT SVTVSS(SEQ ID NO ： )
     A1D5 重链是鼠亚基 I(B) 重链
     下面示出 A1D5 重链可变结构域的 DNA 序列 ( 来自 pYL338)， 其信号序列有下划线 ( 重链编码的信号 MGWSCVMLFLL SVTVGVFS(SEQ IDNO ： )) ：
     1 ATGGGATGGA GCTGTGTAAT GCTCTTTCTC CTGTCAGTAA CTGTAGGTGT
     51 GTTTTCTGAG GTTCAGCTGC AGCAGTCTGG ACCTGAGCTG GTGAAGCCTG101 GGGCTTCAGT GAAGATATCC TGCAAGGCTT CTGGTTACTC ATTTACTGGC
     151 TACTTTATGA ACTGGATGAG GCAGAGCCAT GGAAAGAGCC TTGAGTGGAT
     201 TGGACGTATT AATCCTTACA ATGGTGATTC TTTCTACAAC CAGAAGTTCA
     251 AGGACAAGGC CACATTGACT GTAGACAAAT CCTCTACCAC AGCCCACATG
     301 GAGCTCCTGA GCCTGACATC TGAGGACTCT GCAGTCTATT ATTGTGGAAG
     351 AGGATACGAC GCTATGGACT ACTGGGGTCA AGGAACCTCA GTCACCGTCT
     401 CCTCA(SEQ ID NO ： )
     下面示出 A1D5 成熟轻链可变结构域蛋白序列， CDR 有下划线 ：
     1 DIQMTQTTSS LSASLGDRVT ISCRASQDIS NFLTWYQQKP DGTVKLLIYY
     51 TSKLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEP GDIATYYCQQ VSKFPWTFGG
     101 GAKLEIK(SEQ ID NO)
     A1D5 轻链是鼠亚基 V kappa 轻链
     下面示出成熟轻链可变结构域的 DNA 序列 ( 来自 pYL352)， 其信号序列有下划线 ( 轻链编码的信号 MVSTAQFLGLLLLCFQGTRC(SEQ ID NO ： )) ：
     1 ATGGTGTCCA CAGCTCAGTT CCTTGGTCTC CTGTTGCTCT GTTTTCAAGG
     51 TACCAGATGT GATATCCAGA TGACACAGAC TACATCCTCC CTGTCTGCCT
     101 CTCTGGGAGA CAGAGTCACC ATTAGTTGCA GGGCAAGTCA GGACATTAGC
     151 AATTTTTTAA CCTGGTATCA GCAGAAACCA GATGGAACTG TTAAACTCCT
     201 GATCTACTAC ACATCAAAAT TACACTCAGG AGTCCCATCA AGGTTCAGTG
     251 GCAGTGGGTC TGGGACAGAT TATTCTCTCA CCATTAGCAA CCTGGAACCG
     301 GGTGATATTG CCACTTACTA TTGCCAACAG GTTAGTAAGT TTCCGTGGAC
     351 GTTCGGTGGA GGCGCCAAGC TGGAAATCAA A(SEQ ID NO ： )
     mAbs LT101 和 LT103
     发现抗体 LT101(P1G4.4) 和 LT103(P1G9.1) 是相同的。下面示出 LT101 和 LT103 成熟重链可变结构域蛋白序列， CDR 有下划线 ：
     1 QVQLQQSGPE LVKPGASVQI SCKASGYVFS SSWMNWVKQR PGRGLEWIGR
     51 IYPGDGDTDY TGKFKGKATL TADKSSNTAY MQLSSLTSVD SAVYFCASGY
     101 FDFWGQGTPL TVSS(SEQ ID NO)
     抗体 LT101 和 LT103 的重链是鼠亚基 II(B) 重链
     下面示出 LT101 重链可变结构域的 DNA 序列 ( 来自 pYL458 或 pYL459)， 其信号序 列有下划线 ( 重链编码的信号 MGWSCIMFFLLSITAGVHC(SEQ IDNO ： )) ：
     1 ATGGGATGGA GCTGTATCAT GTTCTTCCTC CTGTCAATAA CTGCAGGTGT
     51 CCATTGCCAG GTCCAGCTGC AGCAGTCTGG ACCTGAGCTG GTGAAGCCTG
     101 GGGCCTCAGT GCAGATTTCC TGCAAAGCTT CTGGCTACGT TTTCAGTAGT
     151 TCTTGGATGA ACTGGGTGAA GCAGAGGCCT GGACGGGGTC TTGAGTGGAT
     201 TGGGCGGATT TATCCTGGAG ATGGAGATAC TGACTACACT GGGAAGTTCA
     251 AGGGCAAGGC CACACTGACT GCAGACAAAT CCTCCAACAC AGCCTACATG
     301 CAGCTCAGCA GCCTGACCTC TGTGGACTCT GCGGTCTATT TCTGTGCAAG
     351 TGGGTACTTT GACTTCTGGG GCCAAGGCAC CCCTCTCACC GTCTCCTCA(SEQ ID NO)
     下面示出 LT101 和 LT103 成熟轻链可变结构域蛋白序列， CDR 有下划线 ：
     1 DITMTQSPSS MYASLGERVT ITCKASQDMN NYLRWFQQKP GKSPQTLIFR
     51 ANRLVDGVPS RFSGSGSGQD YSLTISSLEF EDMGIYYCLQ HDKFPPTFGG
     101 GTKLEIK(SEQ ID NO ： )
     LT101 和 LT103 的轻链是鼠亚基 V kappa 轻链
     下面示出成熟轻链可变结构域的 DNA 序列 ( 来自 pYL461 或 pYL4622)， 其信号序列 有下划线 ( 轻链编码的信号 MRAPAQFLGILLLWFPGIKC(SEQ ID NO ： )) ：
     1 ATGAGGGCCC CTGCTCAGTT TCTTGGCATC TTGTTGCTCT GGTTTCCAGG
     51 TATCAAATGT GACATCACGA TGACCCAGTC TCCATCTTCC ATGTATGCAT
     101 CTCTAGGAGA GAGAGTCACT ATCACTTGCA AGGCGAGTCA GGACATGAAT
     151 AACTATTTAA GGTGGTTCCA GCAGAAACCA GGGAAGTCTC CTCAGACCCT
     201 GATCTTTCGT GCAAACAGAT TGGTCGATGG GGTCCCATCA AGGTTCAGTG
     251 GCAGTGGATC TGGGCAAGAT TATTCTCTCA CCATCAGCAG CCTGGAATTT
     301 GAAGATATGG GAATTTATTA TTGTCTACAG CATGATAAAT TTCCTCCGAC
     351 GTTCGGTGGA GGCACCAAGC TGGAAATCAA A(SEQ ID NO ： )
     mAb LT102
     下面示出 LT102(P1G8.2) 成熟重链可变结构域蛋白序列， CDR 有下划线 ：
     1 EVKLVESGGG LVKPGGSLKL SCAVSGFTFS DYYMYWIRQT PEKRLEWVAT
     51 IGDGTSYTHY PDSVQGRFTI SRDYATNNLY LQMTSLRSED TALYYCARDL
     101 GTGPFAYWGQ GTLVTVSA(SEQ ID NO)
     LT102 重链是鼠亚基 III(D) 重链
     下面示出 LT102 重链可变结构域的 DNA 序列 ( 来自 pYL375)， 其信号序列有下划线 ( 重链编码的信号 MDFGLSWVFLVLVLKGVQC(SEQ IDNO ： )) ：
     1 ATGGACTTCG GGTTGAGCTG GGTTTTCCTT GTCCTTGTTT TAAAAGGTGT
     51 CCAGTGTGAA GTGAAGCTGG TGGAGTCTGG AGGAGGCTTA GTGAAGCCTG
     101 GAGGGTCCCT GAAACTCTCC TGTGCAGTCT CTGGATTCAC TTTCAGTGAC
     151 TATTATATGT ATTGGATTCG CCAGACTCCG GAAAAGCGGC TGGAGTGGGT
     201 CGCAACCATT GGTGATGGTA CTAGTTACAC CCACTATCCA GACAGTGTGC
     251 AGGGGCGATT CACCATCTCC AGAGACTATG CCACGAACAA CCTGTACCTG
     301 CAAATGACTA GTCTGAGGTC TGAAGACACA GCCTTATATT ACTGTGCAAG
     351 AGATCTTGGA ACCGGGCCTT TTGCTTACTG GGGCCAGGGG ACTCTGGTCA
     401 CTGTCTCTGC A(SEQ ID NO ： )
     下面示出 LT102 成熟轻链可变结构域蛋白序列， CDR 有下划线 ：
     1 DVLMTQTPRS LPVSLGDQAS ISCRSSQNIV HSNGNTYLEW YLQKPGQSPK
     51 LLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YYCFQGSHFP
     101 WTFGGGTKLE IK(SEQ ID NO ： )
     LT102 轻链是鼠亚基 II kappa 轻链
     下面示出成熟轻链可变结构域的 DNA 序列 ( 来自 pYL378)， 其信号序列有下划线( 轻链编码的信号 MKLPVRLLVLMFWIPASSS(SEQ ID NO ： )) ：
     1 ATGAAGTTGC CTGTTAGGCT GTTGGTGCTG ATGTTCTGGA TTCCTGCTTC
     51 CAGCAGTGAC GTTTTGATGA CCCAAACTCC ACGCTCCCTG CCTGTCAGTC
     101 TTGGAGATCA AGCCTCCATC TCTTGCAGAT CTAGTCAGAA CATTGTTCAT
     151 AGTAATGGAA ACACCTATTT AGAATGGTAC CTGCAGAAAC CAGGCCAGTC
     201 TCCAAAGCTC CTGATCTACA AAGTTTCCAA CCGATTTTCT GGGGTCCCAG
     251 ACAGGTTCAG TGGCAGTGGA TCAGGGACAG ATTTCACACT CAAGATCAGC
     301 AGAGTGGAGG CTGAGGATCT GGGAGTTTAT TACTGCTTTC AAGGTTCACA
     351 TTTTCCTTGG ACATTCGGTG GAGGCACCAA GCTGGAGATC AAA
     (SEQ ID NO ： )
     mAb LT105
     下面示出 LT105(P2E9.7) 成熟重链可变结构域蛋白序列， CDR 有下划线 ：
     1 DVQLQESGPG LVKPSQSLSL TCSVTGYSIT SGYYWNWIRQ FPGNKLEGMG
     51 YISYDGSNNY NPSLKNRISI TRDSSKNQFF LKLNSVTAED SGTYYCARDA
     101 YSYGMDYWGQ GTSVTVSS(SEQ ID NO ： )
     LT105 重链是鼠亚基 I(A) 重链
     下面示出 LT105 重链可变结构域的 DNA 序列 ( 来自 pYL382)， 其信号序列有下划线 ( 重链编码的信号 MMVLSLLYLLTAIPGILS(SEQ ID NO ： )) ：
     1 ATGGACTTCG GGTTGAGCTG GGTTTTCCTT GTCCTTGTTT TAAAAGGTGT
     51 CCAGTGTGAA GTGAAGCTGG TGGAGTCTGG AGGAGGCTTA GTGAAGCCTG
     101 GAGGGTCCCT GAAACTCTCC TGTGCAGTCT CTGGATTCAC TTTCAGTGAC
     151 TATTATATGT ATTGGATTCG CCAGACTCCG GAAAAGCGGC TGGAGTGGGT
     201 CGCAACCATT GGTGATGGTA CTAGTTACAC CCACTATCCA GACAGTGTGC
     251 AGGGGCGATT CACCATCTCC AGAGACTATG CCACGAACAA CCTGTACCTG
     301 CAAATGACTA GTCTGAGGTC TGAAGACACA GCCTTATATT ACTGTGCAAG
     351 AGATCTTGGA ACCGGGCCTT TTGCTTACTG GGGCCAGGGG ACTCTGGTCA
     401 CTGTCTCTGC A(SEQ ID NO ： )
     下面示出 LT105 成熟轻链可变结构域蛋白序列， CDR 有下划线 ：
     1 DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCRASESVD NYGISFMHWY QQKPGQPPKL
     51 LIYRASNLES GIPARFSGSG SRTDFTLTIN PVETDDVATF YCQQSNKDPY
     101 TFGGGTKLEI K(SEQ ID NO ： )
     LT105 轻链是鼠亚基 III kappa 轻链
     下面示出成熟轻链可变结构域的 DNA 序列 ( 来自 pYL383)， 其信号序列有下划线 ( 轻链编码的信号 METDTLLLWVLLLWVPGSTG(SEQ ID NO ： )) ：
     1 ATGGAGACAG ACACACTCCT GCTATGGGTG CTGCTGCTCT GGGTTCCAGG
     51 TTCCACAGGT GACATTGTGC TGACCCAATC TCCAGCTTCT TTGGCTGTGT
     101 CTCTAGGGCA GAGGGCCACC ATCTCCTGCA GAGCCAGCGA AAGTGTTGAT
     151 AATTATGGCA TTAGTTTTAT GCACTGGTAC CAGCAGAAAC CAGGACAGCC
     201 ACCCAAACTC CTCATCTATC GTGCATCCAA CCTAGAATCT GGGATCCCTG251 CCAGGTTCAG TGGCAGTGGG TCTAGGACAG ACTTCACCCT CACCATTAAT
     301 CCTGTGGAGA CTGATGATGT TGCAACCTTT TACTGTCAGC AAAGTAATAA
     351 GGATCCGTAC ACGTTCGGAG GGGGGACCAA GCTGGAAATA AAA
     (SEQ ID NO ： )
     mAb LT107
     下面示出 LT107(P5C4.1) 成熟重链可变结构域蛋白序列， CDR 有下划线 ：
     1 QVQLKQSGPG LVQPSQ I TCTVSGFSLT NYGIHWIRQP PGKGLEWLGV
     51 IWSGGSTDHN AAFISRLSIS KDNSKSQVFF TMNSLEVDDT AIYYCARNRA
     101 YYRYEGGMDY WGQGTSVTVS S
     LT107 鼠亚基 I(B) 重链 . 注意 FR1 中潜在的 N- 连接的糖基化位点上面粗体示出。
     下面示出 LT107 重链可变结构域的 DNA 序列 ( 来自 pYL382)， 其信号序列有下划线 ( 重链编码的信号 MAVLGLLFCLVTFPSCVLS(SEQ ID NO ： )) ：
     1 ATGGCTGTCC TGGGGCTGCT CTTCTGCCTG GTGACATTCC CAAGCTGTGT
     51 CCTATCCCAG GTGCAGCTGA AACAGTCAGG ACCTGGCCTC GTGCAGCCCT
     101 CACAGAACCT GTCCATCACC TGCACAGTCT CTGGTTTCTC ATTAACTAAC
     151 TATGGTATAC ACTGGATTCG CCAGCCTCCA GGAAAGGGTC TGGAGTGGCT
     201 GGGAGTGATA TGGAGTGGTG GAAGCACAGA CCATAATGCT GCTTTCATAT
     251 CCAGACTGAG CATCAGCAAG GACAACTCCA AGAGCCAAGT TTTCTTTACA
     301 ATGAACAGTC TGGAAGTTGA TGACACAGCC ATATACTACT GTGCCAGAAA
     351 TAGAGCCTAC TATAGGTACG AGGGGGGTAT GGACTATTGG GGTCAAGGAA
     401 CCTCAGTCAC CGTCTCCTCA(SEQ ID NO ： )
     下面示出 LT107 成熟轻链可变结构域蛋白序列， CDR 有下划线 ：
     1 DIKMTQSPSS MYASLGERVT ITCKASQDIN TYLNWFQQKP GKSPMTLIYR
     51 ADRLLDGVPS RFSGSGSGQD YSLTISSLED EDMGIYYCQQ YDDFPLTFGA
     101 GTKLELK(SEQ ID NO ： )
     这是鼠亚基 V kappa 轻链。下面示出成熟轻链可变结构域的 DNA 序列 ( 来自 pYL448)， 其信号序列有下划线 ( 轻链编码的信号 MVSSAQFLGILLLWFPGIKC(SEQ ID NO ： )) ：
     1 ATGGTATCCT CAGCTCAGTT CCTTGGAATC TTGTTGCTCT GGTTTCCAGG
     51 TATCAAATGT GACATCAAGA TGACCCAGTC TCCATCTTCC ATGTATGCAT
     101 CTCTAGGAGA GAGAGTCACT ATCACTTGCA AGGCGAGTCA GGACATTAAT
     151 ACCTATTTAA ACTGGTTCCA GCAGAAACCA GGGAAATCTC CTATGACCCT
     201 GATCTATCGT GCAGACAGAT TGTTAGATGG GGTCCCATCA AGGTTCAGTG
     251 GCAGTGGATC TGGGCAAGAT TATTCTCTCA CCATCAGCAG CCTGGAGGAT
     301 GAGGATATGG GAATTTACTA TTGTCAACAG TATGATGACT TTCCTCTCAC
     351 GTTCGGTGCT GGGACCAAGC TGGAGCTGAA A(SEQ ID NO ： )
     mAb LT108
     下面示出 LT108(P4F2.2) 成熟重链可变结构域蛋白序列， CDR 有下划线 ：
     1 QVQLKQSGPG LVQPSQSLSI TCTVSGFSLT DYGIHWIRQP PGKGLEWLGV
     51 IWSGGSTDHN AVFTSRL KDNSKSQVFF KMNSLEPDDT AMYYCARNRA101 YYRYEGGMDY WGQGTSVTVS S(SEQ ID NO ： )
     这是鼠亚基 I(B) 重链。注意 FR3 中潜在的 N- 连接的糖基化位点上面粗体示出。 下面示出 LT107 重链可变结构域的 DNA 序列 ( 来自 pYL449)， 其信号序列有下划线 ( 重链编 码的信号 MAVLALLFCLVTFPSCVLS(SEQ IDNO ： )) ：
     1 ATGGCTGTCT TAGCGCTGCT CTTCTGCCTG GTGACATTCC CAAGCTGTGT
     51 CCTATCCCAG GTGCAGCTGA AGCAGTCAGG ACCTGGCCTC GTGCAGCCCT
     101 CACAGAGCCT GTCCATCACC TGCACAGTCT CTGGTTTCTC ATTAACTGAC
     151 TATGGTATAC ACTGGATTCG CCAGCCTCCA GGAAAGGGTC TGGAGTGGCT
     201 GGGAGTGATA TGGAGTGGTG GAAGCACAGA CCATAATGCT GTCTTCACAT
     251 CCAGACTGAA TATCAGCAAG GACAACTCCA AGAGTCAAGT TTTCTTTAAA
     301 ATGAACAGTC TGGAACCTGA TGACACAGCC ATGTACTACT GTGCCAGAAA
     351 TAGAGCCTAC TATAGGTACG AGGGGGGTAT GGACTACTGG GGTCAAGGAA
     401 CCTCAGTCAC CGTCTCCTCA(SEQ ID NO ： )
     LT107 和 LT108 的重链的蛋白水平 93.4％相同， 并且 IgBLAST 分析表示它们衍生 自类似的 V-D-J 重组事件。下面示出 LT107( 上 ) 和 LT108( 下 ) 重链可变结构域之间的比 对：
     . . . .
     1 QVQLKQSGPGLVQPSQ ITCTVSGFSLTNYGIHWIRQPPGKGLEWLGV 50
     ||||||||||||||||.|||||||||||||.|||||||||||||||||||
     1 QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTDYGIHWIRQPPGKGLEWLGV 50
     . . . . .
     51 IWSGGSTDHNAAFISRLSISKDNSKSQVFFTMNSLEVDDTAIYYCARNRA 100
     ||||||||||| | |||.|||||||||||| ||||| ||||.||||||||
     51 IWSGGSTDHNAVFTSRL KDNSKSQVFFKMNSLEPDDTAMYYCARNRA 100
     . .
     101 YYRYEGGMDYWGQGTSVTVSS 121
     |||||||||||||||||||||
     101 YYRYEGGMDYWGQGTSVTVSS 121
     下面示出 LT108 成熟轻链可变结构域蛋白序列， CDR 有下划线 ：
     1 DIKMTQSPSS MYASLGERVT ITCKASQDIN TYLNWFQQKP GKSPMTLIYR
     51 ADRLLDGVPS RFSGSGSGQD YSLTISSLED EDMGIYYCQQ YDDFPLTFGA
     101 GTKLELK(SEQ ID NO ： )
     这是鼠亚基 V kappa 轻链。在蛋白水平， 其和 LT107 轻链 100％相同。下面示出 成熟轻链可变结构域的 DNA 序列 ( 来自 pYL450)， 其信号序列有下划线 ( 轻链编码的信号 MVSSAQFLGILLLWFPGIKC(SEQ ID NO ： )) ：
     1 ATGGTATCCT CAGCTCAGTT CCTTGGAATC TTGTTGCTCT GGTTTCCAGG
     51 TATCAAATGT GACATCAAGA TGACCCAGTC TCCATCTTCC ATGTATGCAT
     101 CTCTAGGAGA GAGAGTCACT ATCACTTGCA AGGCGAGTCA GGACATTAAT
     151 ACCTATTTAA ACTGGTTCCA GCAGAAACCA GGGAAATCTC CTATGACCCT201 GATCTATCGT GCAGACAGAT TGTTAGATGG GGTCCCATCA AGGTTCAGTG 251 GCAGTGGATC TGGGCAAGAT TATTCTCTCA CCATCAGCAG CCTGGAGGAT 301 GAAGATATGG GAATTTACTA TTGTCAACAG TATGATGACT TTCCTCTCAC 351 GTTCGGTGCT GGGACCAAGC TGGAGCTGAA A(SEQ ID NO ： ) 其在单核苷酸处和 LT107 的轻链有区别 ： 残基 E81 的密码子中沉默摇摆位置的改变。 下面是 9B4 成熟重链可变结构域蛋白序列， CDR 有下划线 ：
     1 QVTLKESGPG ILQPSQTLSL TCSFSGFSLS TSGMGVSWIR QPSGKGLEWL
     51 AHIYWDDDKR YNPSLRSRLT ISKDTSRNQV FLKITSVDTA DTATYYCARR
     101 EGYYGSSFDF DVWGAGTTVT VSS
     抗体 9B4 的重链是鼠亚基 I(B) 重链
     下面示出 9B4 重链可变结构域的 DNA 序列 ( 来自 pYL573)， 其信号序列有下划线 ( 重链编码的信号 MGRLTFSFLL LIVPAYVLS(SEQ ID NO ： )) ：
     1 ATGGGCAGAC TTACATTCTC ATTCCTGCTG CTGATTGTCC CTGCATATGT
     51 CCTTTCCCAG GTTACCCTGA AAGAGTCTGG CCCTGGGATA TTGCAGCCCT
     101 CCCAGACCCT CAGTCTGACT TGTTCTTTCT CTGGGTTTTC ACTGAGCACT
     151 TCTGGGATGG GTGTGAGCTG GATTCGTCAG CCTTCAGGAA AGGGTCTGGA
     201 GTGGCTGGCA CACATTTACT GGGATGATGA CAAGCGCTAT AACCCATCCC
     251 TGAGGAGCCG GCTCACAATC TCCAAGGATA CCTCCAGAAA CCAGGTATTC
     301 CTCAAGATCA CCAGTGTGGA CACTGCAGAT ACTGCCACAT ACTACTGTGC
     351 TCGAAGAGAG GGTTACTACG GTAGTAGCTT CGACTTCGAT GTCTGGGGCG
     401 CAGGGACCAC GGTCACCGTC TCCTCT
     下面示出 LT 9B4 成熟轻链可变结构域蛋白序列， CDR 有下划线 ：
     1 QIVLSQSPAI LSASPGEKVT MTCRASSSVS YMIWYQQKPG SSPKPWIYAT
     51 SSLASGVPTR FSGSGSGTSY SLTISRVEAA DAATYYCQQW SYNPLTFGAG
     101 TKLELK
     这是鼠亚基 kappa VI kappa 轻链。下面示出成熟轻链可变结构域的 DNA 序列 ( 来自 pYL9B4)， 其信号序列有下划线 ( 轻链编码的信号 MDLQVQIFSFLLISASVKMSRG(SEQ ID NO ： )) ：
     1 ATGGATTTAC AGGTGCAGAT TTTCAGCTTC CTGCTAATCA GTGCTTCAGT
     51 CAAAATGTCC AGAGGACAAA TTGTTCTCTC CCAGTCTCCA GCAATCCTGT
     101 CTGCATCTCC AGGGGAGAAG GTCACAATGA CTTGCAGGGC CAGCTCAAGT
     151 GTGAGTTACA TGATCTGGTA CCAACAGAAG CCAGGATCCT CCCCCAAACC
     201 CTGGATTTAT GCCACATCCA GCCTGGCTTC TGGAGTCCCT ACTCGCTTCA
     251 GTGGCAGTGG GTCTGGGACC TCTTACTCTC TCACAATCAG CAGAGTGGAG
     301 GCTGCAGATG CTGCCACTTA TTACTGCCAG CAGTGGAGTT ATAACCCGCT
     351 CACGTTCGGT GCTGGGACCA AGCTGGAGCT GAAA
     CDR 共有序列
     各种抗 -LTα1β2 抗体的序列分析鉴定 CDR 内的许多共有序列。表 1 描述了鉴定
     用于重链序列的共有序列， 并且表 2 描述了鉴定用于轻链序列的共有序列。
     实施例 2 ： 抗 - 淋巴细胞毒(LT) 抗体的体外活性IL-8 释放测定 IL-8 释放测定用于确定实施例 1 中所述的抗 -LT 抗体的功能活性。IL-8 释放测定基于 IL-8 的分泌， 其在可溶性重组人淋巴细胞毒素 α1β2 结合 A375 细胞 ( 人黑素瘤细 胞系 ) 上的细胞表面淋巴细胞毒素 β 受体后观察到。IL-8 释放测定测量通过结合可溶性 淋巴细胞毒素 α1β2 从而抑制结合淋巴细胞毒素 β 受体， 抗体阻断该 IL-8 分泌的能力。 然后使用 ELISA 测定来测量分泌到培养基上清中的 IL-8。
     将抗体稀释至合适的浓度， 并且和可溶性重组人淋巴细胞毒素 α1β2(170ng/ml) 在室温下在 96- 孔微量滴定板中孵育 1 小时淋巴细胞毒素 α1β2 的浓度通过确定 IL-8 释 放最大量的滴定试验来优化。
     然后将 15,000 至 20,000 个 A375 细胞加入各孔， 并且将板在 37 ℃ 5 ％ CO2 孵育 17 小时。在孵育结束时， 将板离心并且收获上清。使用标准夹心 ELISA 测定来测试上清的 IL-8 浓度。IL-8 浓度针对抗体浓度作图， 并且从数据的 4- 参数曲线拟合 ( 参见图 1A 和 1B 的抑制曲线 ) 来确定 IC50。表 3 描述了各抗体的计算的 IC50 值。在计算 IC50 值中， 使用 LTα1β2 预孵育的过程中存在抗体浓度 ( 而不是在加入细胞和缓冲液后的抗体浓度， 其小 4x)。
     表3： 测定 IL-8 释放抑制的 IC50 和 IL-8 释放抑制百分率的概述
     抗体 9B4 102 103 105 107 108 A1D5 A0D9 C37 B27 B9
     IC50nM 0.6 0.406 ； 0.991 1.11 0.52 ； 1.056 0.53 1.3 2.5 1.67 约 500nM( 估计 ) 最大抑制％ 95 92 90 100 95 100 94 94 未抑制 未抑制 53％ @667nMLTα3 ELISA
     另外， 结合试验揭示出在实施例 1 所述的抗 -LT 抗体中， 只有 mAbLT101/LT103 结 合 LTα3( 可溶性同源三聚体 )， 而其他并未结合。 MAbLT101/LT103 能够阻断 LTα1β2-LTBR 相互作用 ( 最大阻断约 70％ )， 这使用下列测定来测量。然而， LT101/103 不能阻断 LTα3和 TNFR-Ig(p55) 之间的相互作用 ( 以阻断 elisa 格式来评价 )。
     对于 LTa3 ELISA， 微量滴定板包覆 LTα3(1 或 5ug/ml， 在 PBS 中 )， 然后非特异性 结合位点被 1％酪蛋白缓冲液阻断。将样品 ( 抗体， 受体 -Ig) 加入并且使用 HRP- 缀合的 抗 - 鼠 Ig 抗体检测结合。为了评价 mAbs 阻断 LTα3 和 TNFR-hIg(p55) 之间的相互作用的 能力， 将板包覆 LTα3 并且如上所述进行阻断。在加入 TNFR-Ig 之前 30 分钟， 将序列稀释 的抗体加入板。TNFR-hIg 与板结合的 LTα3 的结合使用 HPR 缀合的抗 - 人 Ig 抗体来检测。
     LTBR-Ig 阻断测定 (II-23 测定 )
     将 II-23 细胞和 50ng/ml PMA 在 37℃ 5％ CO2 孵育 4 小时。将细胞洗涤， 并且将 500,000 细胞加入 96 孔板的各孔中。将抗体稀释至合适的浓度， 并且加入 II-23 细胞。在 4℃下 30 分钟的孵育时间后， 将生物素标记的 LTβR-Ig 加入各孔至最终浓度为 1ug/ml。 将 细胞在 4℃孵育另外 30 分钟， 然后洗涤 3 次。将抗生蛋白链菌素 -PE 稀释至 1/500， 并且加 入各孔， 在 4℃下孵育 1 小时。将细胞洗涤一次， 并且通过 FACS 分析来读取。将平均荧光强 度针对抗体浓度作图， 并且从数据的 4- 参数曲线拟合来确定 IC50。
     多种鉴定的 mAb 在 II-23 测定中具有大于 90 ％的效力， 包括 LT105， 9B4LT102， A1.D5 和 AOD9。mAb LT102 和 LT105 在 II-23 测定中具有大于 98％的阻断。如图 4 中所示， LT102 和 LT105 在 II-23 阻断测定中相对于抗 -LT 抗体 B9( 参加美国专利 No.5,925,351)， C37 和 B27(C37 和 B27 都描述于 Browning et al.(1995)J Immunol 154 ： 33) 表现出优异 的效力。数据的概述示于表 4。
     表 4.LTβR 与 LT 结合的最大抑制百分率
     抗体 A0D9 105 9B4 103 102 107 108 A1D5 B9
     最大抑制％ 92 97 99 77 98 80 81 92 44交叉反应性
     LT105， 9B4 和 A1D5 也结合食蟹猴 (Macaca fascicularis) 的 LT， 如 LT102 在低的 稳定状态下所进行的那样。一些抗 -LT mAb 的交叉反应性评价的概述下面描述于表 5。值得注意的是某些现有技术的抗体不结合 Cyno LT( 例如 B9)。
     表5
     抗原表位分析
     进行交叉阻断试验以确定实施例 1 中所述的新型抗 -LT 抗体结合的抗原表位。还 测定本领域已知的抗 -LT 抗体的交叉反应性。表 6 提供交叉阻断研究的综述。
     LT012 LT102 LT105 9B4 LT107 A1D5 A0D9 B9 C37 B27
     + + + + + LT105 9B4 + LT107 A1D5 A0D9 B9 C37 B27 -表6： 交叉阻断结果如表 6 中所述， 在新抗 -LT 抗体中存在有限的交叉反应性。另外， LT102， LT105， 9B4， LT9B4， LT107， A1D5， A0D9 都结合的抗原表位不同于抗 -LT 抗体 B9， C37 和 B27 结合的 抗原表位。
     相对于人 LT， LT102 以更低稳定状态来结合 cyno LT。该结果显示 LT102 的关键 的接触点可能在 cyno 和人 LT 之间非同源区域。这样， 基于分子建模包括下列氨基酸取代在该区域中设计人 LTβ 的变体形式 ： D151R/Q153R ； R193A/R194A ； D151R/Q153R/R193A/ R194A ； PLK(96， 97， 98)WMS ； TTK(106， 107， 108)ASQ ； TTK(106， 107， 108)AWQ ； FA(231， 232) YR ； T114R ； DAE(121， 122， 123)PTH ； 和 P172R。
     结果显示浓度为 100ng/ml 和 10ng/ml 的 LTBR-Fc( 阳性对照 ) 结合突变 LT 组的 所有成员。然而， 抗体 LT102 结合突变 LT 组的所有成员 ( 以和 LTBR-Fc 阳性对照相同的浓 度 )， 除了突变体 R193A/R194A 和 D151R/Q153R/R193A/R194A。因此， 残基 R193 和 R194 对 于 LT102 与人 LT 的结合是关键的。
     发现抗体 LT105 结合 cyno LT 而不是鼠 LT。该结果显示 LT105 关键的接触点可 能在 cyno 和鼠 LT 之间非同源区域。在该区域 ( 基于和 LTBR 相互作用的可能性 ) 内设 计人 LT 的突变形式。基于分子建模包括下列氨基酸取代设计人 LT 的变体形式 ： D151R/ Q153R ； R193A/R194A ； D151R/Q153R/R193A/R194A ； PLK(96， 97， 98)WMS ； TTK(106， 107， 108) ASQ ； TTK(106， 107， 108)AWQ ； FA(231， 232)YR ； T114R ； DAE(121， 122， 123)PTH ； 和 P172R。
     这些结果显示浓度为 100ng/ml 和 10ng/ml 的 LTBR-Fc( 阳性对照 ) 结合突变 LT 组的所有成员。 然而， 抗体 LT105 不结合突变体 PLK(96， 97， 98)WMS ； TTK(106， 107， 108)ASQ ； 和 TTK(106， 107， 108)AWQ。因此， 发现 P96/L97/K98 和 T106/T107/K108 对于 LT 与 LT105 的 结合是关键的。发现 9B4 交叉竞争 LT105， 并且其结合受到 P96/L97/K98 突变至 LT 的影响， 但在位 106， 107 或 108 并不突变。
     总之， 使用人 LTβ 的突变形式的 LT102， LT105， 9B4 和 A1D5 的抗原表位映射显示 出 R193/R194 对于 LT102 结合是关键的， 并且 P96/L97/K98 和 T106/T107/K108 对于 LT105 和 9B4 结合是关键的残基。类似的突变研究揭示出残基 P172 对于 A1D5 与人 LT 的结合是 关键的， 并且残基 D151/Q153 对于 LT107 和 A0D9 的结合是关键的。
     LT 异源三聚体的图示于图 6。在亚基 LTα 上， D50N 和 Y108F 突变限定了 αβ/ βα 裂口的侧面。另外， 阻断 LT105 结合的 LTB 突变紧密地对齐 Y108F 位点。
     实施例 3 ： 抗 - 淋巴细胞毒(LT) 抗体的体内活性下列材料和方法用于该实施例 ：
     小鼠 ： NOD-scid IL2rgnull pups( ＜ 72hrs 龄 ) 被辐射 (100rads) 并且通过 RO 窦 注射立即接受 3x104 人 CD34+ 脐带血细胞。对于另外的细节， 参见 Pearson et al.(2008) Curr Top Microbiol Immunol 324 ： 25。
     试剂 ： LT102， LT105 和 B9 是鼠抗 - 人 LTa1b2(mIgG1) 抗体 (BIIB， 不交叉鼠 LT)。 BBF6 是仓鼠抗 - 鼠 LTa1b2 抗体 (BIIB， 不交叉人 LT)。鼠 LTBR-mIgG1 用作阻断 LT-LTBR 相 互租用的阳性对照 ( 显示比鼠 LT 低～ 2X 的亲和性结合人 LT)。MOPC-21 是用作同种型对 照抗体的鼠 IgG1 抗体。 给药 ： 在约 4 月龄， 将重构的小鼠随机分组 (n ＝ 5 只小鼠 / 组 )。以 50ug/ 小鼠 / 周 ( 图 2) 或 200ug/ 小鼠 / 周 ( 图 3)( 腹膜内施用， 总共 5 次注射， n ＝ 5 小鼠 / 组 ) 给小 鼠注射同种型对照 (MOPC-21)， 阳性对照 (mLTBR-mIgG1)， BBF6， B9， LT102 或 LT105。在最 后注射 7 天后， 收集组织用于分析。
     组织学分析 ： PNAd/MECA79(HEV) ： 将淋巴结组织固定在 10％中性缓冲的福尔马林 24 小时， 并且储存在石蜡切片中。切出 3um 切片， 去石蜡并且进行抗原回取 (Dako)。进行 内源性过氧化物酶切片 (Dako) 和 Fc 切片 ( 兔的血清 )， 之后施加大鼠抗 - 小鼠 PNAd 初级
     抗体 (1 ∶ 300)(BD)。使用生物素化的兔抗 - 大鼠 IgG(H+L) 次级抗体 (Vector) 和 ABC 标 准试剂盒 (Vectastain)， 之后使 DAB 底物 (Vector) 显像。苏木精 - 明矾染剂 (Sigma) 核染 液是最后的步骤， 之后将载玻片在 95％和 100％乙醇中依次脱水并且使用 Permount 盖玻片 储存。
     唾液酸粘附素 /MOMA-1 ： 将 10um 切片从在 OCT 中用甲基丁烷冰冻的脾脏组织中切 除， 并且储存在 -80℃。将切片固定在丙酮中， 在 lx TBS 中重新水合， 并且进行内源过氧化 酶阻断和 Fc 阻断 (BSA)。 将切片用大鼠抗 - 小鼠 MOMA-1 FITC 初级抗体 (1 ∶ 100)(Serotec) 染色。使用抗 -FITC-AP 次级抗体 (Roche)， 之后使用 AP Substrate Kit(Vector) 显像。将 切片用 Crystal Mount 覆盖， 并且允许在室温下空气干燥过夜。
     为了研究抗 - 人 LTα1β2 mAbs 的功能活性， 相对于嫁接 CD34+ 人脐带血细胞的 组织学 mAb， B9， NOD-scid IL2rynull 小鼠， 使用 LT102 和 LT105。这些小鼠支持开发功能 人免疫系统的多种组分。特别地， 嵌合小鼠已经成功地重构， 并且证实 MECA-79+HEV 在外周 淋巴结， 并且唾液酸粘附素 /MOMA-1+ 巨噬细胞环在脾脏。这些结构是 LT-LTβR 依赖性的， 并且因此可用作施用的抗 -LT 抗体的活性的读出。
     注射 MOPC-21 的嵌合 (huSCID) 小鼠具有类似于野生型 C57BL/6 小鼠中观察到的 脾脏唾液酸粘附素 /MOMA-1+ 嗜金属巨噬细胞环， 这由阳性 MOMA-1 染色证实 ( 参见图 2A 和 2B)。组织学分析显示人 LTα1β2 的阻断导致脾脏 MOMA-1+ 嗜金属巨噬细胞的损失。通过 使用 mLTβR-mIg 注射 huSCID 小鼠而抑制 LTβR， 这导致 MOMA-1+ 嗜金属巨噬细胞的消失 ( 参见图 2C)。这并未用注射抗体 BBF6( 鼠 LTα1β2 的阻断 mAb) 的 huSCID 小鼠来概述 ( 参见图 2D)， 从而证实 L Tα1β2 源是人。注射人 LTα1β2 的新抗体 (LT102 和 LT105) 的 HuSCID 小鼠也显示 MOMA-1 染色的类似的损失 ( 参见图 2F 和 2G)。明显地， 用现有技术 抗 - 人 LT 抗体 B9 处理并会导致 MOMA-1+ 巨噬细胞结构的损失 ( 图 2E)。
     高内皮微静脉 (HEV) 是特殊结构， 其辅助细胞进入淋巴结。这些结构的开发和保 持已经显示依赖于 LTβR 表达。组织学分析显示 HEV 能够使用人 LTα1β2 的阻断来降低。 在嵌合模型中， HEV 类似地证实存在于野生型小鼠 (C57BL/6) 和注射 MOPC-21 的 huSCID 小 鼠 ( 图 3A， B)， 尽管频率减少， 但类似地依赖于 LTBR 信号传导， 因为它们使用 LTβR-Ig 处理 ( 注射 mLTBR-mIgG1 的 huSCID 小鼠 ) 时未损失 ( 图 3C)。如所预计的， 将抗 - 鼠 LTα1β2 mAb(BBF6) 施用至 huSCID 小鼠没有效果 ( 图 3D)。huLTα1β2 在注射 LT102 或 LT105 的 huSCID 小鼠中的阻断明显地降低 HEV( 图 3F 和 3G)， 而使用现有技术抗体 B9 的处理对于 HEV 结构具有最小的效果 ( 图 3E)。
     总之， 显示新抗 - 人 LT 抗体， LT102 和 LT105 的功能性体内活性优于现有技术 mAb， B9， 包括在可能对于人疾病的治疗关键的靶上。这由 CD169+( 唾液酸粘附素 /MOMA-1/ Siglec-1) 巨噬细胞的密度降低来证实。该结论还由 HEV 和功能性 PNAd/MAdCAM 的密度的 降低来支持 ( 中断运输至淋巴结 )。
     实施例 4 ： 抗 - 淋巴细胞毒(LT) 抗体 LT105 的人源化鼠 LT105 轻链和重链的序列如下所示 ： 轻链 ： 1 D VLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCR SES DNYGI SF HWYQQKP GQPPKLL YR 50 51 NLESGIPA RFS SGSRTD TLTINP VET DDVATFYCQ SNKD YTFGG 100101 GTKLEIK(SEQ ID NO ： ) 重链 ： 1 DVQLQESGPG LVKPSQSLSL TCS T SGY Y NWIRQF PGNKLEGMGY 50 51 ISYD SNNYN PSLKNRISIT DSSKNQFFL K LNSVTAEDSGTY YCA DAYSYGM 100a 101 DYWGQGTSVT VSS(SEQ ID NO ： ) 下划线 ： Kabat CDR 残基在该实施例中根据 Kabat 图表来进行编号。
     鼠可变区的分析
     互补决定区 (CDR) 含有最可能结合抗原的残基， 并且必须保留在改造的抗体中。 CDR 根据 Kabat et al(1991) 由序列定义。 CDR 落入规范类别 (Chothia et al， 1989)， 其中 关键残基在较大程度上确定 CDR 环的结构构象。这些残基几乎一直保留在改造的抗体中。 重链和轻链的 CDR 如下所示分类为规范类别 ：
     对于这些 CDR 类别重要的规范残基示于表 4 中。 表4： 规范残基 mAb LT105对于鼠和人亚基， 使用 BLAST 程序和编译的共有与种系 blast 蛋白序列数据库， 可变轻链和重链比较于共有 (Kabat et al， 1991) 和种系序列 (Matsuda et al， 1998， Brensing-Kuppers et al， 1997)。
     可变轻链是鼠亚基 Kappa 3(111 氨基酸重叠中 89％的一致性 ； CDR-L3 比通常的情 况短 1 个残基 ) 的成员， 并且可能源自鼠 mu21-5 种系 ( 在 99 氨基酸重叠的 94％一致性 )， 如下所示。
     mu21-5
     LT105 ： 1 DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDNYGISFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLES 60
     DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVD+YG SFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLES
     Mu21-5 ： 1 DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDSYGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLE
     S 60 LT015 ： 61 GIPARFSGSGSRTDFTLTINPVETDDVATFYCQQSNKDP 99
     GIPARFSGSGSRTDFTLTINPVE DDVAT+YCQQSN+DP
     Mu21-5 ： 61 GIPARFSGSGSRTDFTLTINPVEADDVATYYCQQSNEDP 99
     可变重链是鼠亚基重链 1A(117 氨基酸中 81％的一致性 ； CDR-H1 和 CDR-H2 均比通 常的情况短 1 个残基 ) 的成员， 并且可能源自鼠 VH36-60 种系 ( 在 97 氨基酸重叠的 81％一 致性 )， 如下所示。
     muVH36-60
     LT105 ： 1 DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITSGYYWNWIRQFPGNKLEGMGYISYDGSNNY 60
     +VQLQESGP LVKPSQ+LSLTCSVTG SITS Y WNWIR+FPGNKLE MGYISY GS Y
     muVH3-60 ： 1 EVQLQESGPSLVKPSQTLSLTCSVTGDSITSDY-WNWIRKFPGNKLEYMGYISYSGST YY 59
     LT105 ： 61 NPSLKNRISITRDSSKNQFFLKLNSVTAEDSGTYYCAR 98
     NPSLK+RISITRD+SKNQ++L+LNSVT+ED+ TYYCAR
     muVH3-60 ： 60 NPSLKSRISITRDTSKNQYYLQLNSVTSEDTATYYCAR 97
     可变轻链对应于人亚基 Kappa 4(111 氨基酸中 67％的一致性 ； CDR-L1 比通常的情 况短 2 个残基 ) 并且最接近人 B3 种系 ( 在 99 氨基酸重叠的 66％一致性 )， 如下所示。
     huB3
     LT105 ： 1 DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESV--DNYGISFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNL 58
     DIV+TQSP SLAVSLG+RATI+C++S+SV + +++ WYQQKPGQPPKLLIY AS
     huB3 ： 1 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTR 60
     LT105 ： 59 ESGIPARFSGSGSRTDFTLTINPVETDDVATFYCQQSNKDP 99
     ESG+P RFSGSGS TDFTLTI+ ++ +DVA +YCQQ P
     huB3 ： 61 ESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSTP 101
     可变重链对应于人亚基重链 2(114 氨基酸中 69％的一致性 ； CDR-H1 比通常的情况 短 1 个残基 ； CDR-H2 比通常的情况短 3 个残基 ) 并且最接近人 VH4-28 种系 ( 在 98 氨基酸 重叠的 68％一致性 )， 如下所示。
     huVH4-28
     LT105 ： 2 VQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITSGYYWNWIRQFPGNKLEGMGYISYDGSNNYN 61
     VQLQESGPGLVKPS +LSLTC+V+GYSI+S +W WIRQ PG LE +GYI Y GS YN
     huVH4-28 ： 2 VQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGYSISSSNWWGWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTY YN 61
     LT105 ： 62 PSLKNRISITRDSSKNQFFLKLNSVTAEDSGTYYCAR 98
     PSLK+R++++ D+SKNQF LKL+SVTA D+ YYCAR
     huVH4-28 ： 62PSLKSRVTMSVDTSKNQFSLKLSSVTAVDTAVYYCAR 98
     可变区结构的建模
     为了该人源化， 基于轻链和重链的晶体结构 PDB ID 2F58、 使用 Modeler、 SCWRL 侧 链取代、 和使用 Gromos96 43b1 参数测定真空简单最小化， 构建 LT105 可变区的模型。2F58 和 LT105 具有 CDR 和相等长度的框架区。
     改造的可变区的分析
     为了选择轻链和重链的抗体受体框架序列， 在规范、 界面和镶饰区残基鉴定的候 选物具有和鼠 LT105 序列的高度类似性 ； 如果可能相同长度的 CDR( 除了 CDR-H3) ； 最少数 量的回复突变 ( 即， 人受体的框架残基类型改变至 LT105 成熟鼠抗体 )。还考虑。人种系序 列填充在 FR4 框架区中的人共有残基。
     选择的框架 ： 人种系序列 huL6( 共有人 KV3 FR4) 和人 gi|3004688 分别选自作为 轻链和重链的受体框架的多种候选物 ( 参见下述序列 )。和稳定的 KV3 和 HV3 共有类别差 异最大的受体框架被选择以改善人源化设计的物理化学性能。
     ＞ LT105L
     DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDNYGISFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLESGIPARFSGS G
     SRTDFTLTINPVETDDVATFYCQQSNKDPYTFGGGTKLEIK
     ＞ huL6
     EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSG
     SGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC
     ＞共有人 KV3FR4 区
     --------------------------------------------------------------------
     -------------------------------FGQGTKVEIK
     ＞ LT105H
     DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITSGYYWNWIRQFPGNKLEGMGYIS YDGSNNYNPSLKNRISI
     TRDSSKNQFFLKLNSVTAEDSGTYYCARDAYSYGMDYWGQGTSVTVSS
     ＞ gi|3004688
     EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYEMNWVRQAPGKGLEWISYISNGDNTIYYADSVKGRFT I
     SRDSAKNSLYLHMHSLRAEDTAVYYCARGDYGGNGYFYYYAMDVWGQGTTVTVSS
     CDR 包括 Chothia 定义具有下划线。
     LT105 的人源化设计
     人源化 LT105 轻链的三种不同版本如下所示。 LT105 的人源化轻链包括 ： 种系 huL6 框架 // 共有人 KV4 FR4//LT105L CDR。下面在 L1、 L2 和 L3 所述的回复突变为小写字体、 粗字体。包括 Chothia 定义的 CDR 有下划线。
     ＞ L0 ＝嫁接
     EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVDNVGISFMHWVQQKPGQAPRLLIVRASNLESGIPARFSGS GSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSNKDPYTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO ： ) ＞ L1 IVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVDNYGISFMHWYQQKPGQAPRLLIYRASNLESGIPARFSGS FTLTISSLEPEDFAVYYCQQSNKDPYTFGQGTKVEIK(SEQID NO ： ) ＞ L2 IVLTQSPATLSLSPGERAT SCRASESVDNYGISFMHWYQQKPGQAPRLLIYRASNLESGIPARFSG FTLTISSLEPEDFAV YCQQSNKDPYTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO ： ) ＞ L3 IVLTQSPATLSLSPGERAT SCRASESVDNYGISFMHWYQQKPGQAPRLLIYRASNLESGIPARFSGGSGTD
     SGSGTD
     SGS TD FTLTISSLEPEDFAV YCQQSNKDPYTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO ： )
     下 面 示 出 人 源 化 LT105 重 链 的 四 种 不 同 版 本。LT105 的 人 源 化 重 链 包 括 gi|3004688 框架 //LT105H CDR。下面在 H1， H2， H3 和 H4 所述的回复突变为小写字体、 粗字 体。包括 Chothia 定义的 CDR 有下划线。
     ＞ H0 ＝嫁接
     EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSITSGYYWNWVRQAPGKGLEWISYISYDGSNNYNPSLKNRFT ISRDS
     AKNSLYLHMHSLRAEDTAVYYCARDAYSYGMDYWGQGTTVTVSS
     (SEQ ID NO ： )
     ＞ H1
     EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCA SGYSITSGYYWNWVRQAPGKGLE ISYISYDGSNNYNPSLKNRFTISRDS
     AKNS YLHMHSLRAEDTAVYYCARDAYSYGMDYWGQGTTVTVSS
     (SEQ ID NO ： )
     ＞ H2
     EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCA SGYSITSGYYWNW RQAPGKGLE I YISYDGSNNYNPSLKNR TISRDS
     AKNS YLHMHSLRAEDTAVYYCARDAYSYGMDYWGQGTTVTVSS
     (SEQ ID NO ： )
     ＞ H3 VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCA GYSITSGYYWNW RQAPGKGLE I YISYDGSNNYNPSLKNR TISRDS
     AKNS YLHMHSLRAEDTAVYYCARDAYSYGMDYWGQGTTVTVSS
     (SEQ ID NO ： )
     ＞ H4 VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCA GYSITSGYYWNW RQAPGKGLE YISYDGSNNYNPSLKNR TISRDS
     AKNS YLH HSLRAEDTAVYYCARDAYSYGMDYWGQGTTVTVSS
     (SEQ ID NO ： )
     实施例 5 ： 抗 - 淋巴细胞毒(LT) 抗体 LT102 的人源化鼠 LT102 轻链和重链的序列如下所示 ： 轻链 ： 1 D LMTQTPRS LPVSLGDQAS ISCR SQN VHSNGN TY EWYLQKP GQSPKLL YK 50 51 NRFSGVPD RFS SGSGTD TLKISR VEA EDLGVYYCF GSHF WTFGG 100 101 GTKLEIK(SEQ ID NO ： ) 重链 ： 1 EV KLVESGGG LVKPGGSLKL SCA S DY Y YWIRQT PEKRLEWVAT 50 51 IGDG SYTHYP DSVQGRFTIS DYATNNLYL QMTSLRSEDTALY YCA DLGTGPF 100a 101 AY WGQGTLVT VSA(SEQ ID NO ： ) 下划线 ： Kabat CDR 残基在该实施例中根据 Kabat 图表来进行编号。
     鼠可变区的分析
     互补决定区 (CDR) 含有最可能结合抗原的残基， 并且必须保留在改造的抗体中。 CDR 根据 Kabat et al(1991) 由序列定义。 CDR 落入规范类别 (Chothia et al， 1989)， 其中 关键残基在较大程度上确定 CDR 环的结构构象。这些残基几乎一直保留在改造的抗体中。 重链和轻链的 CDR 如下所示分类为规范类别 ：
     对于这些 CDR 类别重要的规范残基示于表 1 中。 表5对 于 鼠 和 人 亚 基， 使 用 BLAST 程 序 和 查 询 包 含 共 有 与 种 系 序 列 的 数 据 库， 可 变 轻 链 和 重 链 比 较 于 共 有 (Kabat et al， 1991) 和 种 系 序 列 (Matsuda et al， 1998， Brensing-Kuppers et al， 1997)。CDR 排除于和种系比较的序列。
     LT102 的可变轻链是鼠亚基 Kappa 2(112 氨基酸重叠中 94％的一致性 ) 的成员， 并且可能源自鼠 mucr1 种系 ( 在 100 氨基酸重叠的 97％一致性 )。LT102 的 VL 和 mucr1 之 间的比较如下所示。
     mucr1 查询： 1DVLMTQTPRSLPVSLGDQASISCRSSQNIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRF60
     DVLMTQTP SLPVSLGDQASISCRSSQ+IVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRF Sbjct ： 1 DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRF60 查询 ： 61 SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHFP 100
     SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSH P
     Sbjct ： 61 SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVP 100
     可变重链是鼠亚基重链 3D(118 氨基酸中 80％的一致性 ) 的成员， 并且可能源自鼠 VH37.1 种系 ( 在 98 氨基酸重叠的 86％一致性 )。LT102 的 VH 和 VH37.1 之间的比较如下 所示。
     muVH37.1
     查 询： 1 EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAVSGFTFSDYYMYWIRQTPEKRLEWVATIGDGTSYTHY 60
     EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCA SGFTFS Y M W+RQTPEKRLEWVATI G SYT+Y
     Sbjct ： 1 EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYGMSWVRQTPEKRLEWVATISGGGSYTYY 60
     查询 ： 61 PDSVQGRFTISRDYATNNLYLQMTSLRSEDTALYYCAR 98
     PDSV+GRFTISRD A NNLYLQM+SLRSEDTALYYCAR
     Sbjct ： 61 PDSVKGRFTISRDNAKNNLYLQMSSLRSEDTALYYCAR 98
     可变轻链对应于人亚基 Kappa 2(112 氨基酸中 77％的一致性 ) 并且最接近人 A3 种系 ( 在 100 氨基酸重叠的 76％一致性 )。LT102 的 VL 和 huA3 之间的比较如下所示。
     ＞ huA3
     查 询： 1 DVLMTQTPRSLPVSLGDQASISCRSSQNIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRF 60
     D++MTQ+P SLPV+ G+ ASISCRSSQ+++HSNG YL+WYLQKPGQSP+LLIY SNR
     Sbjct ： 1 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRA 60
     查询 ： 61 SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHFP 100
     SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAED+GVYYC Q P
     Sbjct ： 61 SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTP 100
     可变重链对应于人亚基重链 3(117 氨基酸中 72 ％的一致性 ) 并且最接近人 VH3-21 种系 ( 在 98 氨基酸重叠的 73％一致性 )。LT102 的 VH 和 huVH3-21 之间的比较如 下所示。
     ＞ huVH3-21
     查 询： 1 EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAVSGFTFSDYYMYWIRQTPEKRLEWVATIGDGTSYTHY 60
     EV+LVESGGGLVKPGGSL+LSCA SGFTFS Y M W+RQ P K LEWV++I +SY +Y
     Sbjct ： 1 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYY60 查询 ： 61 PDSVQGRFTISRDYATNNLYLQMTSLRSEDTALYYCAR 98
     DSV+GRFTISRD A N+LYLQM SLR+EDTA+YYCAR
     Sbjct ： 61 ADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR 98
     可变区结构的建模
     为了 LT102 的人源化， 基于轻链和重链的晶体结构 PDB ID 1CLZ、 使用 Modeler、 SCWRL 侧链取代、 和使用 Gromos96 43b1 参数测定真空简单最小化， 构建 LT102 可变区的模 型。1CLZ 在 CDR-H3 中具有 1 个特别残基。

    [1000] 改造的可变区的分析

    [1001] 方法 ： 为了选择轻链和重链的抗体受体框架序列， 我们使用抗体序列数据库和查 询工具以鉴定合适的模板， 其最类似于在规范、 界面和镶饰区残基中的鼠 LT102 ； 相同长度 的 CDR( 除了 CDR-H3) ； 最少数量的回复突变 ( 即， 人受体的框架残基类型改变至 LT102 成 熟鼠抗体 ) ； 以及在所有位置 (L 4， 38， 43， 44， 58， 62， 65-69， 73， 85， 98 和 H 2， 4， 36， 39， 43， 45， 69， 70， 74， 92) 没有根本没有回复突变 ( 参见 Carter and Presta， 2000)。还考虑人种 系序列填充在 FR4 框架区中的人共有残基。

    [1002] 选择的框架 ： 人种系序列 huA3( 共有 HUMKV2 FR4) 和人种系序列 huVH3-11( 共有 HUMHV3 FR4) 分别选自作为轻链和重链的受体框架的多种候选物。序列如下所示。

    [1003] ＞ LT102L

    [1004] DVLMTQTPRSLPVSLGDQASISCRSSQNIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSG SGSGT

    [1005] DFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHFPWTFGGGTKLEIK

    [1006] ＞ huA3

    [1007] DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSG SGSGT

    [1008] DFTLKISRVEAEDVGVYYC

    [1009] ＞共有人 KV2FR4 区

    [1010] ------------------------------------------------------------------------

    [1011] ----------------------------FGQGTKVEIK

    [1012] ＞ LT102H

    [1013] EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAVSGFTFSDYYMYWIRQTPEKRLEWVATIGDGTSYTHYPDSVQGRFT ISRDY

    [1014] ATNNLYLQMTSLRSEDTALYYCARDLGTGPFAYWGQGTLVTVSA

    [1015] ＞ huVH3-11

    [1016] QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFT ISRDN

    [1017] AKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR

    [1018] ＞共有人 HV3 FR4 区
     ----------------------------------------------------------------------------------------------------------WGQGTLVTVSS

    [1021] CDR 包括 Chothia 定义具有下划线。

    [1022] 对于该抗体， 并非所有规范残基回复突变可避免 ： 种系 huA3 在 3 规范残基 (L 2， 27b， 51) 区别于 LT102 L， 并且种系 huVH3-11 在 1 规范残基 (H24) 区别于 LT102 H。

    [1023] 设计可变轻链改造链的一种版本， 并且设计可变重链改造链的四种版本， 除了轻 链和重链 CDR 嫁接序列。对于重链， 第一版本含有最少的回复突变， 后续版本含有更多回复 突变 ( 即它们至少是″人源化″的 )。在所有版本的重链中鼠 A113 被 S113( 存在于人 HV FR4) 取代， 并且不作为回复突变来进行分析。根据 Kabat 图表进行编号。

    [1024] 改造的 VL 中的回复突变

    [1025] 人 源 化 LT102(huLT102) 的 改 造 的 轻 链 包 括 种 系 huA3 框 架、 共 有 人 KV2FR4 和 LT102 L CDR。hu102 的轻链中的回复突变包括 ： I2V。V2 是支持 CDR-L1 的规范残基。

    [1026] 改造的 VH 中的回复突变

    [1027] 人源化 LT102(huLT012) 的改造的重链的四种版本均包括种系 huVH3-11 框架、 共 有人 HV3 FR4 和 LT102 H CDR。

    [1028] LT102 的人源化设计

    [1029] 下面示出人源化 LT102 轻链序列 ( 有关回复突变的细节参见上面 )。LT102 的人 源化轻链包括 ： 种系 huA3 框架 // 共有人 KV2 FR4//LT102 LCDR。回复突变为小写粗体字。 包括 Chothia 定义的 CDR 有下划线。

    [1030] ＞ L0 ＝嫁接

    [1031] DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQNIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSG SGSGT

    [1032] DFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHFPWTFGQGTKVEIK

    [1033] ＞ L1

    [1034] D VMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQNIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFS GSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHFPWTFGQGTKVEIK

    [1035] 下面示出人源化 LT102 重链的四种不同版本。LT102 的人源化重链包括 ： 人种系 huVH3-11 框架 // 共有人 HV3 FR4//LT102 H CDR。下面在 H1， H2， H3 和 H4 所述的回复突变 为小写字体、 粗字体。包括 Chothia 定义的 CDR 有下划线。

    [1036] ＞ H0 ＝嫁接

    [1037] QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMYWIRQAPGKGLEWVSTIGDGTSYTHYPDSVQGRFT ISRDN

    [1038] AKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLGTGPFAYWGQGTLVTVSS

    [1039] ＞ H1

    [1040] QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCA SGFTFSDYYMYWIRQAPGKGLEWVSTIGDGTSYTHYPDSVQGRF TISRDN

    [1041] AKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLGTGPFAYWGQGTLVTVSS

    [1042] ＞ H2

    [1020] VQLVESGGGLVKPGGSLRLSCASGFTFSDYYMYWIRQAPGKGLEWVSTIGDGTSYTHYPDSVQGRFTISRD

    [1044] AKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLGTGPFAYWGQGTLVTVSS ＞ H3 V LVESGGGLVKPGGSLRLSCA SGFTFSDYYMYWIRQAPGKGLEWVSTIGDGTSYTHYPDSVQGR AKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLGTGPFAYWGQGTLVTVSS ＞ H4 V LVESGGGLVKPGGSLRLSCA SGFTFSDYYMYWIRQAPGKGLEWVSTIGDGTSYTHYPDSVQGRFTISRD

    [1047] FTISRD A N LYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLGTGPFAYWGQGTLVTVSS

    [1051] 实施例 6. 改变以改善溶解度

    [1052] L0 H1(105 抗体版本 0 的轻链 /105 抗体版本 1 的重链 ) 联合人源化 105 轻链和重 链被选择用于表达和稳定性研究 ：

    [1053] L0

    [1054] 1 EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGISFMHWY QQKPGQAPRL

    [1055] 51 LIYRASNLES GIPARFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY YCQQSNKDPY

    [1056] 101 TFGQGTKVEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV

    [1057] 151 QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV

    [1058] 201 THQGLSSPVT KSFNRGEC

    [1059] (SEQ ID NO ： )

    [1060] H1

    [1061] 1 EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAVSGYSIT SGYYWNWVRQ APGKGLEGIS

    [1062] 51 YISYDGSNNY NPSLKNRFTI SRDSAKNSFY LHMHSLRAED TAVYYCARDA

    [1063] 101 YSYGMDYWGQ GTTVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY

    [1064] 151 FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI

    [1065] 201 CNVNHKPSNT KVDKKVEPKS CDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD

    [1066] 251 TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST

    [1067] 301 YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY

    [1068] 351 TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD

    [1069] 402 SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPG

    [1070] (SEQ ID NO ： )

    [1071] 人源化 105 的 H1/L0 版本的溶解度测定为 9.9mg/ml。对数个轻链 CDR 残基进行 突变， 认为负责于分子的自身缔合 ( 并因此不溶 )。制备 ： 具有在 CDRL2 中 Kabat 位 54 的 R 突变为 K 的轻链的第一版本 ( 版本 A)、 具有在 CDRL2 中 Kabat 位 57 的 N 突变为 S 的第二版 本 ( 版本 B)、 以及在 CDRL2 具有两种突变的第三版本 ( 包含在 Kabat 位 54 的 K 和在 Kabat 位 57 的 S ； 版本 C)。版本 A 显示在 28.6mg/ml 时析出， 版本 B 显示在 34.9mg/ml 时析出。

    [1072] 版本 A

    [1073] 1 EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGISFMHWY QQKPGQAPRL

    [1050] 51LIYASNLES GIPARFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY YCQQSNKDPY KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV KSFNRGEC LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGISFMHWY QQKPGQAPRL KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV KSFNRGEC LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGISFMHWY QQKPGQAPRL101 TFGQGTKVEI 151 QWKVDNALQS 201 THQGLSSPVT 版本 B 1 EIVLTQSPAT 51 LIYRAS 101 TFGQGTKVEI 151 QWKVDNALQS 201 THQGLSSPVT 版本 C 1 EIVLTQSPAT 51 LIYLES GIPARFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY YCQQSNKDPYLES GIPARFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY YCQQSNKDPY101 TFGQGTKVEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV

    [1088] 151 QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV

    [1089] 201 THQGLSSPVT KSFNRGEC

    [1090] 在试图进一步改善溶解度时， 制备新版本的轻链， 其包括轻链的版本 C 中发现的 R54K 和 N57S CDRL2 突变， 并且还包括新框架， 所述新框架被选择以提供增加的总电荷， 从 而达到所得序列 L10 ：

    [1091] L10

    [1092] 1 AIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASESVD NYGISFMHWY QQKPGKAPKL

    [1093] 51 LIYKASSLES GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLQPEDFATY YCQQSNKDPY

    [1094] 101 TFGQGTKVEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV

    [1095] 151 QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV

    [1096] 201 THQGLSSPVT KSFNRGEC

    [1097] 当联合 H1 时轻链的 L10 版本显示溶解度大于 100mg/ml。

    [1098] 还制备轻链的另外的版本， 包括 L12 和 L13 ：

    [1099] L12

    [1100] 1 DIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASESVD NYGISFMHWY RQKPGKAPKL

    [1101] 51 LIYKASSLES GVPSRFSGRG SGTDFTLTIS SLQPEDFATY YCQQSNKDPY

    [1102] 101 TFGQGTKVEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV

    [1103] 151 QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV

    [1104] 201 THQGLSSPVT KSFNRGEC

    [1105] L13

    [1106] 1 DIRLTQSPSS LSASVGQRVT ISCRASESVD NYGISFMHWY RQKPGKAPKL

    [1107] 51 LIYKASSLES GVPSRFSGRG SGTDFTLTIS SLQPEDFATY YCQQSNKDPY

    [1108] 101 TFGQGTKVEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV

    [1109] 151 QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV

    [1110] 201 THQGLSSPVT KSFNRGEC当联合 H1 时轻链的 L12 还显示在 100mg/ml 时未析出， L13 联合 H1 显示在 48mg/ ml 时未析出。

    [1112] 还制备重链的另外的版本， 包括 H11 和 H14。

    [1113] H11

    [1114] 1 EVQLVESGGG LVQPRGSLRL SCAVSGYSIT SGYYWNWIRQ APGKGLEWVS

    [1115] 51 YISYDGSNNY NPSLKNRFTI SRDNSKNTFY LQMNNLRAED TAAYYCARDA

    [1116] 101 YSYGMDYWGQ GTTVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY

    [1117] 151 FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI

    [1118] 201 CNVNHKPSNT KVDKKVEPKS CDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD

    [1119] 251 TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST

    [1120] 301 YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY

    [1121] 351 TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD

    [1122] 401 SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPG

    [1123] H14

    [1124] 1 EVQLQESGGG LVKPRGSLRL SCAVSGYSIT SGYYWNWIRQ APGKGLEWVS

    [1125] 51 YISYDGSNNY NPSLKNRFSI SRDNSKNTFY LKMNRLRAED SAAYYCARDA

    [1126] 101 YSYGMDYWGQ GTTVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY

    [1127] 151 FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI

    [1128] 201 CNVNHKPSNT KVDKKVEPKS CDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD

    [1129] 251 TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST

    [1130] 301 YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY

    [1131] 351 TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD

    [1132] 401 SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPG

    [1133] L10 联合 H11 或 H14 显示的溶解度分别比联合 H1 时低 3.7， 并且大于 28mg/ml。还 测试另外的联合， 并且数据展示于下表中 ：

    [1134] 实施例 7. 抗体与 LT 的结合使用下列方法测定存在竞争剂时 LTbR 结合位点的适用性。

    [1138] Biacore 芯片制备 . 使用 Biacore 3000 装置进行所有试验。根据生产商的说明， 使用 Biacore Amine Coupling 试剂盒抗 -Flag 抗体 M2 固定在 CM5 传感芯片上。 简言之， 抗 体在 10mM 乙酸盐， pH 5.0 中稀释至 50μg/ml， 并且将 30μl 注射在芯片表面， 该表面已经 使用注射 30μl 的 1 ∶ 1N- 羟基琥珀酰亚胺 (NHS) ∶ 1- 乙基 -3(3- 二甲基氨基丙基 )- 碳 化二亚胺盐酸盐 (EDC) 来活化。然后将过量的游离胺基团用注射 50μl 的 1M 乙醇胺来捕 获。 典型的固定水平是 4000-6000RU。 所有样品都在测定缓冲液 (10mM HEPES pH7.0+150mM NaCl+0.05％去污剂 p-20+0.05％ BSA) 中制备。该相同的缓冲液用作样品分析过程中的运 行缓冲液。为了固定， 使用相同的缓冲液但是没有 BSA。

    [1139] Biacore 结合测定 . 可溶性 Flag- 标签的 LTα1β2 在测定缓冲液中稀释至 200nM， 并且以流速 25μl/min 注射在 M2 衍生的表面上或作为背景对照的未衍生的表面上。 该表面 允许稳定 2 分钟， 同时缓冲液以 25μl/min 流过表面。以 25μl/min 注射饱和浓度的竞争 剂 ( 基 8μM LTβR-Ig， 2μM 抗体 LT105， 4μM 抗体 B9， 4μM 抗体 LT102 或 2μM 抗体 9B4 ； 在单独试验中测定 )3 分钟。再次该表面允许在缓冲液流动下稳定 3 分钟。在稳定后， 将在 测定缓冲液中的 20μM 单体 LTβR 以 25μl/min 注射在表面上 4 分钟。然后将表面注射两 次在 0.5M KCl 中的 3M 盐酸胍来再生。

    [1140] 如下所示测定各组分与亲和捕获的 LTα1β2 的结合的化学计量的量。

    [1141] (1) 可得竞争剂位点＝ [( 竞争剂分子量 )/( 配体分子量 )]x( 配体应答 )

    [1142] (2) 结合的竞争剂＝ ( 净竞争剂应答 )/( 可得竞争剂位点 )

    [1143] (3) 可得 LTβR 位点＝ [(LTβR 分子量 )/( 配体分子量 )]x( 净配体应答 )

    [1144] (4) 结合的 LTβR ＝ ( 净 LTβR 应答 )/( 可得 LTβR 位点 )

    [1145] 使用这些方法， 2LTβR 结合位点在 LTα1β2 上鉴定， 由它们对于 LTbR 的亲和性来 区别 ( 位点 1 显示出亲和性约 50nM 并且位点 2 显示出亲和性约为 1500nM)。

    [1146] 相比于完整抗体， 测试的抗体以该表观亲和性 (0.3nM 或更高 ) 结合， 而测试的 Fab 片段 (LT105 和 B9) 以较低亲和性 (2nM 或更弱 ) 结合。因此， 各测试的抗体以较高亲和性 二价结合单 LTα1β2 三聚体。

    [1147] 如下表所示， 在存在结合的 LTβR-Ig， LT105， LT102 或 9B4 时， 不可得到 LTβR 结 合位点， 而在存在 B9 时， 一个 LTβR 结合位点保持可得。因此， 尽管现有技术 B9 抗体能够 以二价高亲和性和 LTα1β2 相互作用， 但是其仅可阻断一个受体结合位点。相反， 在存在 结合的 LT105， LT102 和 9B4 抗体 ( 本文已经证实更加完全阻断 LT 与 LTβR 的结合 ) 时， 不 可得到 LTβR 结合位点。

    [1148] 等同形式

    [1150] 本领域技术人员使用不超过常规的试验将认识到或能够识别本文所述发明的特 定实施方案的多种等同形式。这些等同形式旨在包括在所附权利要求书内。

    [1149]