通过抑制血管内皮生长因子 (VEGF) 的天然反义转录子治 疗 VEGF 相关的疾病 交叉引用
本申请要求 2008 年 12 月 4 日提出的美国临时申请 61/119,957 的优先权， 通过引 用将该申请整体并入本文。
发明领域
本发明的实施方案包括调节 VEGF 和相关分子的表达和 / 或功能的寡核苷酸。
背景
DNA-RNA 和 RNA-RNA 杂交对核酸功能的许多方面 ( 包括 DNA 复制、 转录和翻译 ) 是重要的。杂交对于检测特定核酸或改变其表达的多种技术也很重要。例如， 反义核苷酸 通过和靶 RNA 杂交从而干扰 RNA 剪接、 转录、 翻译和复制而破坏基因表达。反义 DNA 还具有 DNA-RNA 杂交体作为核糖核酸酶 H 消化 ( 大多数细胞类型中存在的活动 ) 的底物的额外特 征。 反义分子可以被送入细胞 ( 如在寡脱氧核苷酸 (ODN) 的例子中 )， 或者它们可由内源基 TM 因表达为 RNA 分子。FDA 最近批准了一种反义药—— VITRAVENE ( 用于治疗巨细胞病毒视 网膜炎 )， 这反映反义有治疗实用性。
概述
本概述用于介绍本发明的概况， 以简要指明本发明的实质和内容。它随着下列理 解而提出， 即不能将它用于解释或限制权利要求的范围或含义。
在一个实施方案中， 本发明提供通过使用反义寡核苷酸抑制天然反义转录子作用 的方法， 所述反义寡核苷酸靶向天然反义转录子的任何区域， 导致相应有义基因的上调。 本 文还预期天然反义转录子的抑制可以通过 siRNA、 核酶和小分子来实现， 这些也被认为在本 发明的范围内。
一个实施方案提供在体内或体外调节患者细胞或组织里的 VEGF 多核苷酸的功能 和 / 或表达的方法， 其包括使所述细胞或组织与 5-30 个核苷酸长度的反义寡核苷酸接触， 从而在体内或体外调节患者细胞或组织中的 VEGF 多核苷酸的功能和 / 或表达， 其中所述寡 核苷酸与包含 SEQ ID NO ： 2 的核苷酸 1-643 或 SEQ ID NO ： 3 的核苷酸 1-513( 图 3) 内的 5-30 个连续核苷酸的多核苷酸的反向互补具有至少 50％序列同一性。
在另一个优选的实施方案中， 寡核苷酸靶向 VEGF 多核苷酸的天然反义序列 ( 例如 SEQ ID NO ： 2 和 3 中展示的核苷酸 )， 及其任何变体、 等位基因、 同系物、 突变体、 衍生物、 片 段和互补序列。反义寡核苷酸的实例如 SEQ ID NO ： 4-9( 图 4) 所展示。
另一个实施方案提供在体内或体外调节患者细胞或组织中的 VEGF 多核苷酸的功 能和 / 或表达的方法， 所述方法包括 ： 使所述细胞或组织与 5-30 个核苷酸长度的反义寡核 苷酸接触， 从而在体内或体外调节患者细胞或组织中的 VEGF 多核苷酸的功能和 / 或表达， 其中所述寡核苷酸与 VEGF 多核苷酸的反义的反向互补具有至少 50％序列同一性。
另一个实施方案提供在体内或体外调节患者细胞或组织中的 VEGF 多核苷酸的功 能和 / 或表达的方法， 所述方法包括 ： 使所述细胞或组织与 5-30 个核苷酸长度的反义寡核苷酸接触， 从而在体内或体外调节患者细胞或组织中的 VEGF 多核苷酸的功能和 / 或表达， 其中所述寡核苷酸与 VEGF 反义多核苷酸的反义寡核苷酸具有至少 50％序列同一性。
在一个优选的实施方案中， 组合物包含与有义和 / 或反义 VEGF 多核苷酸结合的一 种或多种反义寡核苷酸。
在另一个优选的实施方案中， 寡核苷酸包含一个或多个修饰的或取代的核苷酸。
在另一个优选的实施方案中， 寡核苷酸包含一个或多个修饰的键。
在另一个实施方案中， 修饰的核苷酸包含修饰的碱基， 其包含硫代磷酸酯、 甲基膦 酸酯、 肽核酸、 2’ -O- 甲基、 氟代或碳、 亚甲基或其它锁定核酸 (LNA) 分子。优选修饰的核苷 酸是锁定核酸分子， 包括 α-L-LNA。
在另一个优选的实施方案中， 寡核苷酸通过皮下、 肌内、 静脉内或腹膜内给予患 者。
在另一个优选的实施方案中， 寡核苷酸以药物组合物给药。治疗方案包括给予患 者至少一次反义化合物 ； 但是， 该治疗可改为在一段时间内包括多次给药。 该治疗可以结合 其它一种或多种类型的疗法。
在另一个优选的实施方案中， 寡核苷酸包裹于脂质体内或依附于载体分子 ( 例如 胆固醇、 TAT 肽 )。 以下介绍其它方面。
附图简述
图1：
图 1A 和 1B 为 实 时 PCR 结 果 图， 其 显 示 相 对 于 对 照， HepG2 细 胞 用 使 用 Lipofectamine 2000 引入的硫代磷酸酯寡核苷酸处理后， VEGF mRNA 的倍数改变和标准差。 实时 PCR 结果表明， 用针对 vegfaas 设计的 siRNA 之一 (vefaas1_2， P ＝ 0.05) 并可能用第 二条 ： vefaas1_3(P ＝ 0.1， 图 1A) 处理后 48 小时， HepG2 细胞中的 VEGFA mRNA 的水平显著 升高。 在相同的样品中， 用 vefaas1_2 或 vefaas1_3 处理后， vegfaas RNA 的水平显著降低， 但是用 vefaas1_5 处理后不变， vefaas1_5 也对 VEGFA mRNA 水平没有影响 ( 图 1B)。标示 为 vegfas1_2、 vegfas1_3、 vegfas1_5 的柱分别对应于用 SEQ ID NO 4、 5 和 6 处理的样品。
图 1C ： 图 1 为 实 时 PCR 结 果 图， 其 显 示 相 对 于 对 照， HepG2 细 胞 用 使 用 Lipofectamine 2000 引入的硫代磷酸酯寡核苷酸处理后， VEGF mRNA 的倍数改变和标准 差。实时 PCR 结果表明， 用针对 vegRas 设计的 siRNA 中的两条 (vegRas1_2， P ＝ 0.02 和 vegRas1_3， P ＝ 0.06) 处理后 48 小时， HepG2 细胞中的 VEGFA mRNA 的水平显著升高。 vegRas RNA 水平改变的结果待定。标示为 vegRas1_2、 vegRas1_3、 vegRas1_5 的柱分别对应于用 SEQ ID NO 7、 8 和 9 处理的样品。
图 2 显示 SEQ ID NO ： 1： 人血管内皮生长因子 (VEGF)， 转录子变体 1， mRNA(NCBI 注 册号 ： NM_001025366.1) 和 SEQ ID NO ： 1a 显示 VEGF 的基因组序列 ( 外显子显示为大写字 母， 内含子显示为小写字母 )。
图 3 显示
SEQ ID NO ： 2： VEGF 天然反义序列 (NCBI 注册号 ： BI045995)
SEQ ID NO ： 3： VEGR 天然反义序列 (NCBI 注册号 ： BF829784)
图 4 显示针对 VEGF 天然反义序列设计的反义寡核苷酸， SEQ ID NO ： 4-6。
图 5 显示针对 VEGR 天然反义序列设计的反义寡核苷酸， SEQ ID NO ： 7-9。
图 6 显示靶序列 VEGFA 外显子 1(SEQ ID NO ： 10) ； 由 Applied Biosystems Taqman Gene Expression Assay(Hs00173626_m1) 设计的定制试验的正向引物序列 (SEQ ID N O ： 11 和 12)、 反向引物序列 (SEQ ID NO ： 13 和 14) 和报道序列 (SEQ ID NO ： 15 和 16)。
发明详述
为了说明， 下面参考实例应用来描述本发明的几个方面。 应当理解， 所阐释的许多 具体细节、 关系和方法是为了提供本发明的完整理解。 但是， 相关领域的普通技术人员容易 认识到本发明无需一个或多个具体细节或与其它方法一起也可以实施。 本发明不受行为或 事件顺序的限制， 因为某些行为可按不同的顺序出现和 / 或与其它行为或事件一起出现。 另外， 为了实施根据本发明的方法并不需要所有说明的行为或事件。
本文公开的所有基因、 基因名和基因产品旨在和来自本文公开的组合物和方法所 适用的任何种类的同系物相应。因此， 所述术语包括但不限于来自人和小鼠的基因和基因 产品。 应当理解当来自特定物种的基因和基因产品被公开时， 该公开旨在仅仅举例， 不应理 解为限制， 除非它所在的上下文清楚指明。因此， 例如， 本文公开的基因 ( 它们在某些实施 方案中涉及哺乳动物核酸和氨基酸序列 ) 旨在包括来自其它动物的同源和 / 或种间同源基 因和基因产品， 所述其它动物包括但不限于其它哺乳动物、 鱼类、 两栖类、 爬行类和鸟类。 在 优选的实施方案中， 基因或核酸序列是人的。 定义
本文所用的术语只用于描述特定实施方案的目的， 且不旨在限制本发明。如本文 所用的单数形式″一″和″该″旨在也包括复数形式， 除非上下文清楚指明。另外， 在术 语″包括″、″具有″或它们的变体用于发明详述和 / 或权利要求书的程度内， 这些术语 旨在以和术语 “包含” 相似的方式表示包含性。
术语″大约″或″近似″意指对于本领域普通技术人员测定的特定值在可接受 的误差范围之内， 其部分依赖于该值如何被测量或测定， 即测量系统的限制。 例如″大约″ 按照本领域的实践可意指在 1 或大于 1 标准差以内。或者， ″大约″可意指给定值的最高 20％， 优选最高 10％， 更优选最高 5％， 且更优选最高 1％的范围。或者， 特别对生物系统或 方法而言， 该术语可意指在一个值的数量级范围内， 优选 5 倍内， 更优选 2 倍内。在本申请 和权利要求中描述特定值时， 除非另有指明， 否则应假定术语″大约″意指特定值的可接 受误差范围之内。
本文所用的术语″ mRNA″意指靶基因的目前已知的 mRNA 转录子， 以及任何可被 阐明的其它转录子。
″反义寡核苷酸″或″反义化合物″意指结合另一 RNA 或 DNA( 靶 RNA、 DNA) 的 RNA 或 DNA 分子。 例如， 如果它是 RNA 寡核苷酸， 它以 RNA-RNA 相互作用的方式结合另一 RNA 靶， 并改变靶 RNA 的活性 (Eguchi 等 (1991)Ann.Rev.Biochem.60， 631-652)。反义寡核苷 酸能上调或下调特定多核苷酸的表达和 / 或功能。该定义意欲包括任何从治疗、 诊断或其 它观点来看有用的外源 RNA 或 DNA 分子。这样的分子包括例如反义 RNA 或 DNA 分子、 干扰 RNA(RNAi)、 微小 RNA、 诱饵 RNA(decoy RNA) 分子、 siRNA、 酶促 RNA、 治疗编辑 RNA 和激动剂 以及拮抗剂 RNA、 反义寡聚化合物、 反义寡核苷酸、 外部引导序列 (EGS) 寡核苷酸、 可变剪接 子、 引物、 探针和杂交至靶核酸至少一部分的其它寡聚化合物。因此， 这些化合物可以以单
链、 双链、 部分单链或环形寡聚化合物的形式导入。
本发明的上下文中， 术语″寡核苷酸″指核糖核酸 (RNA) 或脱氧核糖核酸 (DNA) 的寡聚体或多聚体或它们的模拟物。术语″寡核苷酸″也包含天然和 / 或修饰的单体或键 合的线性或环状寡聚体， 包括脱氧核糖核苷、 核糖核苷、 它们的取代形式和 α 端基异构形 式、 肽核酸 (PNA)、 锁定核酸 (LNA)、 硫代磷酸酯、 甲基膦酸酯等。寡核苷酸能以单体 - 单体 相互作用的常规形式 ( 例如华生 - 克里克 (Watson-Crick) 型碱基配对、 型碱基配对等 ) 特异性地结合靶多核苷酸。 寡核苷酸可以是″嵌合的″， 也就是由不同的区域组成。 在本发明的上下文中， ″ 嵌合的″化合物是包含两个或更多个化学区域 ( 例如 DNA 区域、 RNA 区域、 PNA 区域等 ) 的 寡核苷酸。每个化学区域由至少一个单体单元 ( 即寡核苷酸化合物例子中的核苷酸 ) 组 成。 这些寡核苷酸通常包含至少一个其中寡核苷酸被修饰以显示一种或多种期望性质的区 域。寡核苷酸的所述期望性质包括但不限于例如增大的对核酸酶降解的抗性、 增大的细胞 摄取和 / 或增大的对靶核酸的结合亲和力。寡核苷酸的不同区域可以因此具有不同的性 质。 本发明的嵌合寡核苷酸可以形成上述两种或更多种寡核苷酸、 修饰的寡核苷酸、 寡核苷 和 / 或寡核苷酸类似物的混合结构。
或反寡核苷酸可以由可在″寄存器 (register)″中连接 ( 即当单体被连续连接时， 如 在天然 DNA 中 ) 或通过间隔物连接的区域组成。间隔物旨在构成区域之间的共价″桥″， 并且在优选的例子中其长度不超过大约 100 个碳原子。间隔物可以带有不同的功能性， 例 如带正电荷或负电荷、 带特殊核酸结合性质 ( 插入剂、 槽结合剂 (groove binder)、 毒素、 荧 光体等 )、 亲脂、 诱导特殊二级结构 ( 例如诱导 α 螺旋的含丙氨酸的肽 )。
本文所用的″ VEGF″和″血管内皮生长因子 A″包括所有的家族成员、 突变体、 等位基因、 片段、 种 (specy)、 编码和非编码序列、 有义和反义多核苷酸链等。
本文所用词语血管内皮生长因子 A、 VEGF、 VEGFA 在本申请中可互换使用。
本文所用的术语″对…特异的寡核苷酸″或″靶向…的寡核苷酸″指具有下列 序列的寡核苷酸， 该序列 (i) 能与靶基因的一部分形成稳定复合体， 或 (ii) 能与靶基因的 mRNA 转录子的一部分形成稳定双链体。所述复合体和双链体的稳定性可通过理论计算和 / 或体外试验测定。测定杂交复合体和双链体的稳定性的示例性试验描述于下面的实施例。
本文所用的术语″靶核酸″包括 DNA、 从这种 DNA 转录而来的 RNA( 包括前 mRNA 和 mRNA)、 以及从这种 RNA 衍生而来的 cDNA、 编码、 非编码序列、 有义或反义多核苷酸。寡聚化 合物与其靶核酸的特异杂交干扰核酸的正常功能。 这种通过和靶核酸特异杂交的化合物调 节靶核酸的功能一般称为″反义″。被干扰的 DNA 的功能包括， 例如复制和转录。被干扰 的 RNA 的功能包括所有重要功能， 例如 RNA 移位至蛋白翻译的位点、 从 RNA 翻译蛋白、 剪接 RNA 产生一个或多个 mRNA 种类和由 RNA 参与或促进的催化活性。 这种干扰靶核酸功能的总 体效果是编码产物或寡核苷酸的表达的调节。
RNA 干 扰 ″ RNAi ″ 由 双 链 RNA(dsRNA) 分 子 ( 所 述 分 子 与 其 ″ 靶 ″ 核 酸 序 列 具 有 序 列 特 异 性 同 源 性 ) 介 导 (Caplen， N.J. 等 (2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98 ： 9742-9747)。在本发明的某些实施方案中， 介质是 5-25 核苷酸的″小干扰″ RNA 双链体 (siRNA)。 siRNA 来自通过称为 Dicer 的 RNase 酶处理 dsRNA(Bernstein， E. 等 (2001)Nature 409 ： 363-366)。 siRNA 双链体产品被纳入术语称为 RISC(RNA Induced Silencing Complex，
RNA 诱导的沉默复合体 ) 的多蛋白 siRNA 复合体。不希望被任何特定理论束缚， RISC 据信 被指引至靶核酸 ( 适宜 mRNA)， 在这里 siRNA 双链体以序列特异方式相互作用， 从而以催化 形式介导切割 (Bernstein， E. 等 (2001)Nature 409 ： 363-366 ； Boutla， A. 等 (2001)Curr. Biol.11 ： 1776-1780)。 可根据本发明使用的小干扰 RNA 可以根据本领域公知的和普通技术 人员所熟悉的程序合成和使用。用于本发明方法的小干扰 RNA 适合包含大约 1 到大约 50 个之间的核苷酸 (nt)。在非限制性实施方案的实施例中， siRNA 可以包含大约 5 到大约 40 个 nt、 大约 5 到大约 30 个 nt、 大约 10 到大约 30 个 nt、 大约 15 到大约 25 个 nt 或者大约 20-25 个核苷酸。
通过使用自动排列核酸序列和标明同一性或同源性区域的计算机程序， 适合的寡 核苷酸的选择得以促进。这种程序用于比较核酸序列， 所述核酸序列例如通过搜索数据库 ( 例如 GenBank) 或通过对 PCR 产品测序而获得。 比较一系列物种之间的核酸序列可以选择 在物种之间表现出适当同一性程度的核酸序列。在没有被测序的基因的例子中， 进行 DNA 印迹法 (Southern blots) 以测定目标物种和其它物种的基因之间的同一性程度。本领域 公知， 通过在不同严格程度进行 DNA 印迹法， 可能获得同一性的近似度量。这些程序可以选 择寡核苷酸， 所述寡核苷酸展示出与待控制对象中的靶核酸序列的高互补度， 和与其它物 种中的相应核酸序列的较低互补度。 本领域技术人员将会意识到选择用于本发明的基因的 合适区域有相当大的范围。 ″ 酶 促 RNA ″ 意 指 具 有 酶 活 性 的 RNA 分 子 (Cech， (1988)J.American.Med. Assoc.260， 3030-3035)。酶促核酸 ( 核酶 ) 通过首先结合靶 RNA 而起作用。这种结合通过 酶促核酸的靶结合部分而发生， 所述酶促核酸与起切割靶 RNA 作用的分子的酶促部分保持 紧密接近。因此酶促核酸首先识别靶 RNA 然后通过碱基配对与之结合， 一旦结合到正确的 位点， 即以酶的形式起剪切靶 RNA 的作用。
″诱饵 RNA ″意指模拟配体的天然结合结构域的 RNA 分子。因此诱饵 RNA 与天 然结合靶竞争结合特异配体。例如， 已显示 HIV 反式激活应答 (TAR)RNA 的过度表达可以 充当″诱饵″， 并且有效结合 HIV tat 蛋白， 从而阻止其结合 HIV RNA 中编码的 TAR 序列 (Sullenger 等 (1990)Cell， 63， 601-608)。这是一个具体的实例。本领域技术人员将认识 到这仅是一个实例， 利用本领域公知的技术可以容易地产生其它实施方案。
本文所用的术语″单体″通常指由磷酸二酯键或其类似物连接从而形成大小从 几个单体单元 ( 例如从大约 3-4 个 ) 到几百个单体单元的寡核苷酸的单体。磷酸二酯键合 的类似物包括硫代磷酸酯、 二硫代磷酸酯， 甲基膦酸酯、 硒代磷酸酯、 氨基磷酸酯等， 下面会 做更全面的介绍。
术语″核苷酸″覆盖天然存在的核苷酸以及非天然存在的核苷酸。本领域技术 人员应该清楚， 以前认为″非天然存在的″多种核苷酸随后已经在自然界找到。因此，″ 核苷酸″不仅包括已知的包含嘌呤和嘧啶杂环的分子， 也包含杂环类似物和它们的互变异 构体。其它类型核苷酸的示例性的实例是包含以下的分子 ： 腺嘌呤、 鸟嘌呤、 胸腺嘧啶、 胞 嘧啶、 尿嘧啶、 嘌呤、 黄嘌呤、 二氨基嘌呤、 8- 氧代 -N6- 甲基腺嘌呤、 7- 脱氮黄嘌呤、 7- 脱 氮鸟嘌呤、 N4， N4- 桥亚乙基胞嘧啶、 N6， N6- 桥亚乙基 -2， 6- 二氨基嘌呤、 5- 甲基胞嘧啶、 5-(C3-C6)- 炔基胞嘧啶、 5- 氟尿嘧啶、 5- 溴尿嘧啶、 假异胞嘧啶、 2- 羟基 -5- 甲基 -4- 三唑 并吡啶、 异胞嘧啶、 异鸟嘌呤、 肌苷和描述于 Benner 等， 美国专利号 5,432,272 中的″非天
然存在的″核苷酸。 术语″核苷酸″旨在覆盖这些实例的每个和所有以及它们的类似物和 互变异构体。特别令人感兴趣的核苷酸是那些包含腺嘌呤、 鸟嘌呤、 胸腺嘧啶、 胞嘧啶和尿 嘧啶的核苷酸， 它们被认为是与人类的治疗和诊断应用相关的天然存在的核苷酸。核苷酸 包含天然的 2′ - 脱氧和 2′ - 羟基糖 ( 例如描述于 Kornberg 和 Baker， DNA Replication， 第二版 (Freeman， San Francisco， 1992)) 和它们的类似物。
和核苷酸有关的″类似物″包括具有修饰的碱基部分和 / 或修饰的糖部分的 合成核苷酸 ( 参见例如， 由 Scheit 总体描述的 Nucleotide Analogs， John Wiley， New York， 1980 ； Freier & Altmann， (1997)Nucl.Acid.Res.， 25(22)， 4429-4443， Toulmé， J.J.， (2001)Nature Biotechnology 19 ： 17-18 ； Manoharan M.， (1999)Biochemica et Biophysica Acta 1489 ： 117-139 ； Freier S.M.， (1997)Nucleic Acid Research， 25 ： 4429-4443， Uhlman， E.， (2000)Drug Discovery & Development， 3： 203-213， Herdewin P.， (2000)Antisense & Nucleic Acid Drug Dev.， 10 ： 297-310) ； 2′ -O、 3′ -C- 连接的 [3.2.0] 二环阿拉伯糖核苷 ( 参见例如 N.K Christiensen.， 等 (1998)J.Am.Chem.Soc.， 120 ： 5458-5463 ； Prakash TP， Bhat B.(2007)Curr Top Med Chem.7(7) ： 641-9 ； Cho EJ 等 (2009)Annual Review of Analytical Chemistry， 2， 241-264)。 这样的类似物包括被设计 用于提高结合性质 ( 例如双链体或三链体稳定性、 特异性等 ) 的合成核苷酸。 本文所用的″杂交″意指寡聚化合物的基本互补的链的配对。 一种配对机制包括 寡聚化合物链的互补核苷或核苷酸碱基 ( 核苷酸 ) 之间的氢键合， 其可以是华生 - 克里克、
或反氢键合。例如， 腺嘌呤和胸腺嘧啶是通过形成氢键而配对的互补核苷酸。杂交可以在不同环境下发生。
当反义化合物与靶核酸的结合干扰靶核酸的正常功能而引起功能和 / 或活性的 调节， 且在期望有特异性结合的条件下 ( 即体内试验或治疗处理情况中的生理条件下， 和 在体外试验情况中进行试验的条件下 ) 有足够的互补度以避免反义化合物非特异性地结 合非靶核酸序列时， 所述反义化合物是″能特异性杂交的″。
本文所用的短语″严格杂交条件″或″严格条件″指下列条件， 在该条件下， 本 发明的化合物将和它的靶序列杂交， 但只和最少量的其它序列杂交。 严格条件依赖于序列， 且在不同的环境中会不同， 在本发明的上下文中， 寡聚化合物在″严格条件″下和靶序列 杂交， 该″严格条件″取决于寡聚化合物的性质和组成以及研究它们的试验。一般地， 严 格杂交条件包括低浓度 ( ＜ 0.15M) 的带有无机阳离子例如 Na++ 或 K++( 即低离子强度 ) 的盐， 高于 20℃ -25℃低于寡聚化合物 ： 靶序列复合体的 Tm 的温度， 以及存在例如甲酰胺、 二甲基甲酰胺、 二甲基亚砜或去污剂十二烷基硫酸钠 (SDS) 的变性剂。例如， 对于每 1 ％ 甲酰胺， 杂交率降低 1.1 ％。高严格性杂交条件的实例是 0.1X 氯化钠 - 柠檬酸钠缓冲液 (SSC)/0.1％ ( 重量 / 体积 )SDS， 60℃， 30 分钟。
本文所用的″互补″指在一条或两条寡聚体链上的两个核苷酸之间的精确配对 的能力。例如， 如果反义化合物的特定位置上的核碱基 (nucleobase) 能与靶核酸的特定位 置上的核碱基氢键合， 所述靶核酸为 DNA、 RNA 或寡核苷酸分子， 那么寡核苷酸和靶核酸之 间的氢键合的位置就被认为是互补位置。 当每个分子的足量互补位置被能彼此氢键合的核 苷酸占据时， 寡聚化合物和其它 DNA、 RNA 或寡核苷酸分子彼此互补。因此，″能特异性杂 交″和″互补″是用于表示足量核苷酸上足够的精确配对或互补程度使得寡聚化合物和靶核酸之间存在稳定和特异结合的术语。
本领域应当理解寡聚化合物的序列不需要 100％互补于其将特异杂交的靶核酸的 序列。而且， 寡核苷酸可以在一个或多个片段上杂交从而在杂交事件中不包括间隔或相邻 的片段 ( 例如， 环结构、 错配或发夹结构 )。本发明的寡聚化合物与它们将靶向的靶核酸序 列内的靶区域具有至少大约 70％、 或至少大约 75％、 或至少大约 80％、 或至少大约 85％、 或至少大约 90％、 或至少大约 95％或至少大约 99％的序列互补性。例如， 其中反义化合物 的 20 个核苷酸中的 18 个与靶区域互补并因此将特异性杂交的反义化合物将代表 90％的 互补性。在该实例中， 余下的非互补核苷酸可以集群或与互补核苷酸散布且不需要彼此邻 近或与互补核苷酸邻近。因此， 长度为 18 个核苷酸， 有 4( 四 ) 个非互补核苷酸 ( 它们两侧 有和靶核酸完全互补的两个区域 ) 的反义化合物与靶核酸的总互补性将为 77.8％， 因而将 落在本发明的范围内。 反义化合物与靶核酸的区域的百分比互补性可常规地使用本领域已 知的 BLAST 程序 ( 基本本地排列搜索工具 ) 和 PowerBLAST 程序测定 (Altschul 等 (1990) J.Mol.Biol.， 215， 403-410 ； Zhang 和 Madden， (1997)Genome Res.， 7， 649-656)。百分比同 源性、 序列同一性或互补性可以通过例如使用 Smith 和 Waterman 算法 (Adv.Appl.Math.， (1981)2， 482-489) 的 Gap 程序 (Wisconsin Sequence Analysis Package， Version 8 for Unix， Genetics Computer Group， University Research Park， Madison Wis.) 用默认设置 测定。 本文所用的术语″热熔点 (Tm)″指在规定的离子强度、 pH 和核酸浓度下的温度， 在该温度下 50％的互补于靶序列的寡核苷酸与靶序列的杂交达到平衡。通常， 严格条件如 下， 其中 pH7.0 到 8.3 时， 盐浓度是至少大约 0.01 到 1.0M Na 离子浓度 ( 或其它盐 )， 且对 于短寡核苷酸 ( 例如 10-50 个核苷酸 ) 温度是至少大约 30℃。严格条件也可以通过添加去 稳定剂例如甲酰胺实现。
本文所用的″调节″意指增大 ( 刺激 ) 或减小 ( 抑制 ) 基因的表达。
当用于多核苷酸序列的上下文时， 术语″变体″可以包含与野生型基因相关的多 核苷酸序列。该定义也可以包括， 例如″等位基因″、″剪接″、″种″或″多态性″变 体。剪接变体可以和参比分子有显著同一性， 但是由于 mRNA 处理期间外显子的交替剪接， 将一般含有更多或更少数量的多核苷酸。 相应的多肽可以包含附加的功能结构域或结构域 的缺失。种变体是在种与种之间相异的多核苷酸序列。在本发明中具有特定用途的是野生 型基因产品的变体。变体可以由核酸序列中的至少一个突变获得， 且可以导致改变的 mRNA 或者结构或功能会或不会改变的多肽。任何给定的天然或重组基因可以含有 0、 1 或许多等 位基因形式。产生变体的普通突变变化一般归因于核苷酸的天然缺失、 增加或取代。这些 变化类型的每一种可以在给定序列中单独出现或与其它联合出现一次或多次。
得到的多肽一般相对于彼此将具有显著的氨基酸同一性。多态性变体是给定物 种的个体之间特定基因的多核苷酸序列的变化。多态性变体也可以包括″单核苷酸多态 (SNP)″， 或单碱基突变体 ( 其中多核苷酸序列中一个碱基变化 )。 SNP 的存在可以是， 例如， 对疾病状态具有倾向性 ( 即易感性对抵抗性 ) 的特定种群的指示。
衍生多核苷酸包含进行了化学修饰 ( 例如， 由烷基、 酰基或氨基基团取代氢 ) 的核 酸。衍生物， 例如衍生寡核苷酸， 可以包含非天然存在的部分， 例如改变的糖部分或糖内键 合。其中的示例是硫代磷酸酯和其它本领域已知的含硫物种。衍生核酸也可以包含标记，
包括放射性核苷酸、 酶、 荧光剂、 化学发光剂、 显色剂、 底物、 辅因子、 抑制剂、 磁性颗粒等。
″衍生″多肽或肽是通过例如糖基化、 聚乙二醇化 (pegylation)、 磷酸化、 硫酸 化、 还原 / 烷基化、 酰化、 化学耦合或温和福尔马林处理修饰的一种多肽或肽。衍生物也可 以被修饰为包含可检测的标记， 直接或间接地包括但不限于放射性同位素、 荧光和酶标记。
本文所用的术语″动物″或″患者″意欲包括， 例如人、 绵羊、 麋鹿、 鹿、 长耳鹿、 水貂、 哺乳动物、 猴、 马、 牛、 猪、 山羊、 狗、 猫、 大鼠、 小鼠、 鸟、 鸡、 爬行动物、 鱼、 昆虫和蛛形纲 动物。
″哺乳动物″覆盖通常有医疗护理的温血哺乳动物 ( 例如人和驯养动物 )。实例 包括猫科动物、 犬科动物、 马科动物、 牛科动物和人， 以及只包括人。
″进行治疗″或″治疗″覆盖哺乳动物中的疾病状态的治疗， 且包括 ： (a) 预防 疾病状态在哺乳动物中出现， 特别是当这种哺乳动物对疾病状态易感但还没有被诊断患 病； (b) 抑制疾病状态， 例如阻止其发展 ； 和 / 或 (c) 减轻疾病状态， 例如引起疾病状态的消 退直至达到期望的终点。 治疗也包括疾病症状的改善 ( 例如减轻疼痛或不适 )， 其中这种改 善可以直接影响或可以不直接影响疾病 ( 例如引起、 传播、 表达等 )。
本文所用术语″癌症″指任何恶性肿瘤， 特别是在肺、 肾或甲状腺中产生的恶性 肿瘤。癌症自身展示为″肿瘤″或包含癌症恶性细胞的组织。肿瘤的实例包括肉瘤和癌， 例如但不限于 ： 纤维肉瘤、 粘液肉瘤、 脂肉瘤、 软骨肉瘤、 骨肉瘤、 脊索瘤、 血管肉瘤、 内皮肉 瘤、 淋巴管肉瘤、 淋巴管内皮肉瘤、 滑膜瘤、 间皮瘤、 尤因肉瘤、 平滑肌肉瘤、 横纹肌肉瘤、 结 肠癌、 胰腺癌、 乳腺癌、 卵巢癌、 前列腺癌、 鳞状细胞癌、 基底细胞癌、 腺癌、 汗腺癌、 皮脂腺 癌、 乳头状癌、 乳头腺癌、 囊腺癌、 髓样癌、 肺癌、 肾细胞癌、 肝癌、 胆管癌、 绒毛膜癌、 精原细 胞癌、 胚胎癌、 维尔姆斯氏肿瘤 (Wilm’ s tumor)、 子宫颈癌、 睾丸肿瘤、 肺癌、 小细胞肺癌、 膀 胱癌、 上皮癌、 神经胶质瘤、 星形细胞瘤、 髓母细胞瘤、 颅咽管瘤、 室管膜瘤、 松果体瘤、 成血 管细胞瘤、 听神经瘤、 少突神经胶质瘤、 脑膜瘤、 黑素瘤、 神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤。 如上所述， 本发明特定地允许区别诊断肺、 肾和甲状腺瘤。
多核苷酸和寡核苷酸组合物和分子
靶： 在一个实施方案中， 靶包含血管内皮生长因子 (VEGF) 的核酸序列， 非限制性 地包括和 VEGF 相关的有义和 / 或反义的非编码和 / 或编码序列。
血管内皮生长因子 (VEGF) 是血管再生和心血管渗透性的有力的刺激因子。有 8 种功能不同或有时功能重叠的同种型。作用的机制还在研究之中， 新出现的认识是和其 它受体 ( 例如神经毡 (neurophilin)， 它们之前与血管再生无关 ) 之间的重叠通路和串扰 (cross-talk)。VEGF 对胚胎发育、 愈合和月经周期有重要的生理作用。它在与自身免疫疾 病相关的病理条件中扮演重要的角色。
示例性的血管内皮生长因子介导的疾病和病症 ( 它们可以用从反义化合物获得 的干细胞再生的细胞 / 组织治疗 ) 包括特征为过量血管内壁细胞增殖的疾病 ； 由心血管机 能不全导致的心血管疾病 ( 例如冠状动脉疾病、 充血性心力衰竭和周围性血管疾病 ) ； 特征 或起因是异常或过剩血管再生的病症， 包括但不限于 ： 癌症 ( 例如致癌基因的激活、 肿瘤抑 制物的损失 ) ； 感染性疾病 ( 例如病原体表达血管基因、 增强血管再生程序 ) ； 自身免疫障 碍 ( 例如肥大细胞和其它白细胞的激活 )， 包括类风湿性关节炎 ； 血管畸形 ( 例如 Tie-2 突 变)； DiGeorge 综合症 ( 例如低 VEGF 和神经毡 (neuropilin)-1 表达 ) ； HHT( 例如内皮糖蛋白 (endoglin) 或 LK-1 的突变 )、 海绵状血管瘤 ( 例如 Cx37 和 Cx40 的损失 ) ； 动脉粥样硬化 ； 移植动脉病 (ateriopathy) ； 肥胖症 ( 例如由脂肪饮食诱发的血管再生、 血管再生抑制因子 诱发的体重减轻 ) ； 牛皮癣 ； 疣； 变应性皮炎 ； 疤痕疙瘩 ； 脓性肉芽肿 ； 发疱疾病 ； 艾滋病患 者的卡波西肉瘤 ； 持久性增生性玻璃状综合症 ( 例如 Ang-2 或 VEGF164 的损失 ) ； 常染色体 显性多囊性肾病 (ADPKD) ； 糖尿病视网膜病 ； 早产儿视网膜病 ； 年龄相关的黄斑部退化 ； 脉 络膜新血管形成 ( 例如 TIMP-3 突变 ) ； 原发性肺动脉高压 ( 例如种系 BMPR-2 突变、 体细胞 EC 突变 ) ； 哮喘 ； 鼻息肉 ； 炎性肠病、 神经损伤、 脑损伤和神经组织退化性疾病 ( 例如阿尔茨 海默氏病、 帕金森氏病、 肌萎缩侧索硬化等 ) ； 牙周病 ； 腹水 ； 腹膜粘连 ； 子宫内膜异位 ； 子 宫出血 ； 卵巢囊肿 ； 卵巢过刺激 ； 关节炎 ； 滑膜炎 ； 骨髓炎 ； 和 / 或骨赘形成 ； 溃疡 ； 寻常疣 ； 结节性脑硬化血管纤维瘤 ； 葡萄酒色痣 ； 斯德奇 - 韦伯综合症 ； Kippel-Trenaunay-Weber 综合症 ； Osler-Weber-Rendu 综合症和任何其它与细胞或组织中的 VEGF-R 水平相关的疾病 或症状。
在一个优选的实施方案中， 寡核苷酸对 VEGF 的多核苷酸 ( 其非限制性地包括非编 码区域 ) 特异。VEGF 靶包含 VEGF 的变体、 VEGF 的突变体 ( 包括 SNP)、 VEGF 的非编码序列、 等位基因、 片段等。优选寡核苷酸是反义 RNA 分子。
根据本发明的实施方案， 靶核酸分子不仅限于 VEGF 多核苷酸， 还延及 VEGF 的任何 同种型、 受体、 同系物、 非编码区域等。
在另一个优选的实施方案中， 寡核苷酸靶向 VEGF 靶的天然反义序列 ( 编码和非编 码区域的天然反义 )， 非限制性地包括它的变体、 等位基因、 同系物、 突变体、 衍生物、 片段和 互补序列。优选寡核苷酸是反义 RNA 或 DNA 分子。
在另一个优选的实施方案中， 本发明的寡聚化合物也包括在化合物的一个或多个 核苷酸位置上存在不同碱基的变体。 例如， 如果第一个核苷酸是腺嘌呤， 可产生在此位置含 有胸苷、 鸟苷、 胞苷或其它天然或非天然的核苷酸的变体。 这可以在反义化合物的任何位置 完成。这些化合物然后使用本文描述的方法来测试， 以测定它们抑制靶核酸表达的能力。
在某些实施方案中， 反义化合物和靶之间的同源性、 序列同一性或互补性为大约 50 ％到大约 60 ％。在某些实施方案中， 同源性、 序列同一性或互补性为大约 60 ％到大约 70％。在某些实施方案中， 同源性、 序列同一性或互补性为大约 70％到大约 80％。在某些 实施方案中， 同源性、 序列同一性或互补性为大约 80％到大约 90％。在某些实施方案中， 同 源性、 序列同一性或互补性为大约 90％、 大约 92％、 大约 94％、 大约 95％、 大约 96％、 大约 97％、 大约 98％、 大约 99％或大约 100％。
当反义化合物与靶核酸的结合干扰靶核酸的正常功能而引起活性损失， 且在期望 有特异性结合的条件下有足够的互补度以避免反义化合物非特异性地结合非靶核酸序列 时， 所述反义化合物是能特异性杂交的。 这样的条件包括， 即体内试验或治疗处理情况中的 生理条件下， 和在体外试验情况中进行试验的条件下。
当反义化合物 ( 不论 DNA、 RNA、 嵌合体、 取代体等 ) 与靶 DNA 或 RNA 分子的结合 干扰靶 DNA 或 RNA 的正常功能而引起功效损失， 且在期望有特异性结合的条件下 ( 即体内 试验或治疗处理情况中的生理条件下， 和在进行试验的条件下在体外试验情况中 ) 有足够 的互补度以避免反义化合物非特异性地结合非靶序列时， 所述反义化合物是能特异性杂交 的。在另一个优选的实施方案中， VEGF 的靶向 ( 非限制性地包括使用例如 PCR、 杂交 等鉴别或扩展的反义序列、 SEQ ID NO. ： 2 展示的序列中的一种或多种等 ) 调节 VEGF 的表 达或功能。在一个实施方案中， 相对于对照， 表达或功能被上调。在另一个优选的实施方案 中， 相对于对照， 表达或功能被下调。
在另一个优选的实施方案中， 寡核苷酸包括 SEQ ID NO ： 4-9 展示的核酸序列， 这些 核酸序列包含使用例如 PCR、 杂交等鉴别和扩展的反义序列。 这些寡核苷酸可以包含一个或 多个修饰的核苷酸、 较短或较长的片段、 修饰的键等。 修饰的键或核苷酸间键合的实例包括 硫代磷酸酯、 二硫代磷酸酯等。在另一个优选的实施方案中， 核苷酸包含磷衍生物。可以依 附于本发明的修饰的寡核苷酸的糖或糖类似物部分的磷衍生物 ( 或修饰的磷酸酯基团 ) 可 以是一磷酸酯、 二磷酸酯、 三磷酸酯、 烷基磷酸酯、 烷烃磷酸酯、 硫代磷酸酯等。制备上述磷 酸酯类似物， 和将它们导入核苷酸、 修饰的核苷酸和寡核苷酸本身也是已知的， 不需要在此 描述。
反义的特异性和灵敏性也可被本领域技术人员在治疗用途中利用。 反义寡核苷酸 已经作为治疗部分用于治疗动物和人的疾病状态。反义寡核苷酸已被安全和有效地给予 人， 且许多临床试验目前也在进行当中。 因此已确定寡核苷酸可以是有用的治疗手段， 所述 治疗手段可经设置用于治疗细胞、 组织和动物 ( 尤其是人 ) 的治疗方案。 在本发明的实施方案中， 寡聚反义化合物， 特别是寡核苷酸， 结合靶核酸分子并调 节由靶基因编码的分子的表达和 / 或功能。待干扰的 DNA 的功能包括例如复制和转录。待 干扰的 RNA 的功能包括所有重要的功能， 例如 RNA 移位至蛋白翻译的位点、 从 RNA 翻译蛋 白、 剪接 RNA 产生一个或多个 mRNA 种类和由 RNA 参与或促进的催化活性。 根据期望的功能， 该功能可被上调或抑制。
反义化合物包括反义寡聚化合物、 反义寡核苷酸、 外部引导序列 (EGS) 寡核苷酸、 可变剪接子、 引物、 探针和杂交至靶核酸至少一部分的其它寡聚化合物。因此， 这些化合物 可以以单链、 双链、 部分单链或环形寡聚化合物的形式导入。
在本发明的上下文中， 将反义化合物靶向特定核酸分子可以是多步骤过程。该过 程通常以靶核酸 ( 其功能待调节 ) 的鉴别开始。该靶核酸可以是， 例如其表达与特定病症 或疾病状态相关的细胞基因 ( 或从该基因转录的 mRNA)， 或者来自传染剂中的核酸分子。 在 本发明中， 靶核酸编码血管内皮生长因子 (VEGF)。
靶向过程通常也包括测定靶核酸内的至少一个靶区域、 片段或位点， 使反义相互 作用发生， 从而产生期望的效果 ( 例如表达的调节 )。在本发明的上下文内， 术语″区域″ 定义为具有至少一个可鉴别结构、 功能或特征的靶核酸的一部分。靶核酸的区域内是片 段。″片段″定义为靶核酸内的区域的更小部分或亚部分。本发明所用的″位点″定义为 靶核酸内的位置。
在一个优选的实施方案中， 反义寡核苷酸结合血管内皮生长因子 (VEGF) 的天然 反义序列并调节血管内皮生长因子 (VEGF)(SEQ ID NO ： 1) 的表达和 / 或功能。反义序列的 实例包括 SEQ ID NO ： 2-9。
在另一个优选的实施方案中， 反义寡核苷酸结合血管内皮生长因子 (VEGF) 多核 苷酸的一个或多个片段， 并调节血管内皮生长因子 (VEGF) 的表达和 / 或功能。所述片段包 含血管内皮生长因子 (VEGF) 有义或反义多核苷酸的至少 5 个连续核苷酸。
在另一个优选的实施方案中， 反义寡核苷酸对血管内皮生长因子 (VEGF) 的天然 反义序列特异， 其中寡核苷酸和血管内皮生长因子 (VEGF) 的天然反义序列的结合调节血 管内皮生长因子 (VEGF) 的表达和 / 或功能。
在另一个优选的实施方案中， 寡核苷酸化合物包括 SEQ ID NO ： 4-9 展示的序列， 使 用例如 PCR、 杂交等鉴别和扩展的反义序列。 这些寡核苷酸可以包含一个或多个修饰的核苷 酸、 较短或较长的片段、 修饰的键等。修饰的键或核苷酸间键合的实例包含硫代磷酸酯、 二 硫代磷酸酯等。在另一个优选的实施方案中， 核苷酸包含磷衍生物。磷衍生物 ( 或修饰的 磷酸酯基团 )( 其可依附于本发明的修饰的寡核苷酸中的糖或糖类似物部分 ) 可以是一磷 酸酯、 二磷酸酯、 三磷酸酯、 烷基磷酸酯、 烷烃磷酸酯、 硫代磷酸酯等。制备上述磷酸酯类似 物， 和将它们导入核苷酸、 修饰的核苷酸和寡核苷酸本身也是已知的， 不需要在此描述。
如本领域已知的， 由于翻译起始密码子通常是 5′ -AUG( 在转录的 mRNA 分子中 ； 在相应的 DNA 分子中是 5′ -ATG)， 翻译起始密码子也称作″ AUG 密码子″、″起始密码 子″或″ AUG 起始密码子″。少数基因具有 RNA 序列为 5′ -GUG、 5′ -UUG 或 5′ -CUG 的 翻译起始密码子 ； 且已显示 5′ -AUA、 5′ -ACG 和 5′ -CUG 在体内起作用。因此术语″翻 译起始密码子″和″起始密码子″可包含许多密码子序列， 尽管起始氨基酸在每个例子中 通常是甲硫氨酸 ( 在真核生物中 ) 或甲酰甲硫氨酸 ( 在原核生物中 )。真核和原核基因可 以有两个或更多个可选的起始密码子， 它们中的任何一个可在特定细胞类型或组织中或在 特定条件组合下优先用于翻译起始。在本发明的上下文中， ″起始密码子″和″翻译起始 密码子″指在体内用于启动从编码血管内皮生长因子 (VEGF) 的基因转录而来的 mRNA 的翻 译的密码子， 而不管这些密码子的序列。基因的翻译终止密码子 ( 或″终止密码子″ ) 可 以具有以下三个序列中的一个， 即 5′ -UAA、 5′ -UAG 和 5′ -UGA( 相应的 DNA 序列分别是 5′ -TAA、 5′ -TAG 和 5′ -TGA)。
术语″起始密码子区域″和″翻译起始密码子区域″指从翻译起始密码子沿着 任一方向 ( 即 5′或 3′ ) 包含大约 25 到大约 50 个连续核苷酸的 mRNA 或基因的一部分。 类似地， 术语″终止密码子区域″和″翻译终止密码子区域″指从翻译终止密码子沿着任 一方向 ( 即 5′或 3′ ) 包含大约 25 到大约 50 个连续核苷酸的 mRNA 或基因的一部分。因 此， ″起始密码子区域″ ( 或″翻译起始密码子区域″ ) 和″终止密码子区域″ ( 或″翻 译终止密码子区域″ ) 都是可以用本发明的反义化合物有效靶向的区域。
可译框架 (open reading frame， ORF) 或″编码区″ ( 它在本领域中已知指翻译 起始密码子和翻译终止密码子之间的区域 ) 也是可以被有效靶向的区域。在本发明的上下 文中， 靶向区域是包含基因的可译框架 (ORF) 的翻译起始或终止密码子的基因内区域。
另一个靶区域包括 5′非翻译区域 (5′ UTR)， 在本领域中已知指从翻译起始密码 子沿着 5′方向的 mRNA 的一部分， 因此包含 mRNA 的 5′帽位点和翻译起始密码子之间的核 苷酸 ( 或基因上相应的核苷酸 )。另一个靶区域包含 3′非翻译区域 (3′ UTR)， 在本领域 中已知指从翻译终止密码子沿着 3′方向的 mRNA 的一部分， 因此包含 mRNA 的翻译终止密码 子和 3′末端之间的核苷酸 ( 或基因上相应的核苷酸 )。mRNA 的 5′帽位点包含 N7 甲基化 的鸟苷残基， 其通过 5′ -5′三磷酸酯键合与 mRNA 的最 5′ (5′ -most) 残基结合。mRNA 的 5′帽区域被认为包含 5′帽结构本身和与该帽位点相邻的头 50 个核苷酸。本发明的另 一个靶区域是 5′帽区域。虽然某些真核 mRNA 转录子被直接翻译， 但是许多包含一个或多个称为″内含 子″的区域， 其在被翻译之前被从转录子切除。余下的 ( 因此被翻译的 ) 区域称作″外显 子″并被剪接在一起形成连续的 mRNA 序列。在一个实施方案中， 靶向剪接位点 ( 即内含 子 - 外显子接点或外显子 - 内含子接点 ) 在疾病中牵涉异常剪接的情况， 或疾病中牵涉过 度产生特定剪接产物的情况时尤其有用。 由重排或缺失造成的异常融合接点是靶位点的另 一个实施方案。 通过剪接来自不同基因来源的两个 ( 或更多个 )mRNA 的过程而产生的 mRNA 转录子称作″融合转录子″。使用靶向例如 DNA 或前 mRNA 的反义化合物可以有效地靶向 内含子。
在另一个优选的实施方案中， 反义寡核苷酸结合靶多核苷酸的编码和 / 或非编码 区域， 并调节靶分子的表达和 / 或功能。
在另一个优选的实施方案中， 反义寡核苷酸结合天然反义多核苷酸， 并调节靶分 子的表达和 / 或功能。
在另一个优选的实施方案中， 反义寡核苷酸结合有义多核苷酸， 并调节靶分子的 表达和 / 或功能。
可选的 RNA 转录子可以从 DNA 的相同基因组区域产生。这些可选的转录子一般称 为″变体″。更具体地， ″前 mRNA 变体″是由相同基因组 DNA 产生的转录子， 所述转录子 与相同基因组 DNA 产生的其它转录子在它们的起始或终止位置不同并包含内含子和外显 子序列两者。
在剪接的时候剪切掉一个或多个外显子或内含子区域、 或它们的部分时， 前 mRNA 变体产生更小的″ mRNA 变体″。因此， mRNA 变体是经处理的前 mRNA 变体， 每个独特的前 mRNA 变体必定总是由于剪接而产生独特的 mRNA 变体。 这些 mRNA 变体也称为″可选的剪接 变体″。如果不存在前 mRNA 变体的剪接， 则前 mRNA 变体与 mRNA 变体相同。
变体可通过使用可选的信号来起始或终止转录而产生。前 mRNA 和 mRNA 可以具有 不止一个起始密码子或终止密码子。使用可选的起始密码子的源自前 mRNA 或 mRNA 的变体 称为该前 mRNA 或 mRNA 的″可选的起始变体″。那些使用可选的终止密码子的转录子称 为该前 mRNA 或 mRNA 的″可选的终止变体″。一种可选的终止变体的具体类型是″多聚 A(polyA) 变体″， 其中产生的多个转录子由转录机构的″多聚 A 终止信号″之一的可选选 择而产生， 因此产生在独特的多聚 A 位点终止的转录子。在本发明的上下文中， 本文描述的 变体的类型也是靶核酸的实施方案。
靶核酸上反义化合物杂交的位置定义为活性反义化合物靶向的靶区域的至少 5 个核苷酸长度的部分。
虽然本文展示了某些示例性靶片段的具体序列， 但是本领域技术人员将认识到这 些用于说明和描述本发明范围内的特定实施方案。 本领域技术人员考虑到本申请公开可容 易地鉴别另外的靶片段。
包含一段至少五 (5) 个连续核苷酸 ( 它们选自说明性的优选靶片段 ) 的靶片段 ( 其长度为 5-100 个核苷酸 ) 也被认为适合靶向。
靶片段可以包括 DNA 或 RNA 序列， 所述序列包含始自说明性的优选靶片段之一的 5′末端的至少 5 个连续核苷酸 ( 余下的核苷酸是相同 DNA 或 RNA 的连续段， 从靶片段的 5′ 末端上游立即开始并延续直到 DNA 或 RNA 包含大约 5 到大约 100 个核苷酸 )。类似优选的靶片段由 DNA 或 RNA 序列代表， 所述序列包含始自说明性的优选靶片段之一的 3′末端的至 少 5 个连续核苷酸 ( 余下的核苷酸是相同 DNA 或 RNA 的连续段， 从靶片段的 3′末端下游立 即开始并延续直到 DNA 或 RNA 包含大约 5 到大约 100 个核苷酸 )。本领域技术人员在理解 本文说明的靶片段后将能 ( 无需过度试验 ) 鉴别进一步优选的靶片段。
一旦一个或多个靶区域、 片段或位点得到鉴别， 即选择和靶充分互补 ( 即杂交足 够好且具有足够特异性 ) 的反义化合物， 以产生期望的效果。
在本发明的实施方案中， 寡核苷酸结合特定靶的反义链。寡核苷酸长度为至少 5 个核苷酸， 并可合成为每个寡核苷酸靶向重叠的序列， 使得寡核苷酸合成为覆盖靶多核苷 酸的整个长度。靶也包括编码和非编码区域。
在一个实施方案中， 优选由反义寡核苷酸靶向具体的核酸。使反义化合物靶向特 定核酸是一个多步骤过程。该过程通常以鉴别其功能待调节的核酸序列开始。这可以是例 如其表达与特定病症或疾病状态相关的细胞基因 ( 或从该基因转录的 mRNA)， 或者非编码 多核苷酸如非编码 RNA(ncRNA)。
RNA 可分类为 (1) 翻译成蛋白的信使 RNA(mRNA)， 和 (2) 非蛋白编码 RNA(ncRNA)。 ncRNA 包含微小 RNA(microRNA)、 反义转录子和其它包含高密度的终止密码子并缺乏任何 广阔 (extensive)″可译框架″的转录单元 (TU)。 许多 ncRNA 似乎始于蛋白编码场所的 3′ 非翻译区域 (3′ UTR) 中的起始位点。ncRNA 通常罕见， 且由 FANTOM 协会测序的 ncRNA 的 至少一半似乎不是多腺苷酸化的。 大多数研究人员因为显而易见的原因聚焦于经处理并输 送至细胞质的多腺苷酸化的 mRNA。最近已显示非多腺苷酸化的核 RNA 的集合可能非常大， 且许多这样的转录子由所谓的基因间区域产生 (Cheng， J. 等 .(2005)Science 308(5725)， 1149-1154 ； Kapranov， P. 等 (2005).Genome Res 15(7)， 987-997)。ncRNA 可以借以调节基 因表达的机制是通过与靶转录子的碱基配对。通过碱基配对起作用的 RNA 能分组为 (1) 顺 式编码 RNA， 它们在与它们所作用的 RNA 相同的基因位置， 但是在相对链上被编码， 因此展 现出与它们的靶的完美互补性， 和 (2) 反式编码 RNA， 它们在与它们所作用的 RNA 不同的染 色体位置上被编码， 且一般不会展示出与它们的靶的完美碱基配对潜力。
不希望被理论束缚， 通过本文描述的反义寡核苷酸干扰反义多核苷酸能改变相应 有义信使 RNA 的表达。但是， 这种调节可以是不一致的 ( 反义降低 (knockdown) 导致信使 RNA 升高 ) 或一致的 ( 反义降低导致伴随的信使 RNA 减少 )。在这些情况下， 反义寡核苷酸 能靶向反义转录子的重叠或非重叠部分， 导致其降低或隔绝。编码和非编码反义能以相同 的方式被靶向， 任一种类都能以一致或不一致的方式调节相应的有义转录子。在鉴别新的 针对靶所使用的寡核苷酸中采用的策略可以基于通过反义寡核苷酸降低反义 RNA 转录子 或任何其它调节期望的靶的方式。
策略 1 ： 在不一致调节的例子中， 降低反义转录子提高常规 ( 有义 ) 基因的表 达。如果后面的基因编码已知或推定的药物靶， 那么可以想象， 降低其反义相对部分 (counterpart) 可以模拟受体激动剂或酶刺激剂的作用。
策略 2 ： 在一致调节的例子中， 可一致地降低反义和有义转录子两者， 从而实现常 规 ( 有义 ) 基因表达的协同减少。如果， 例如反义寡核苷酸用于实现降低， 那么这个策略能 用于施用一个靶向有义转录子的反义寡核苷酸和另一个靶向相应的反义转录子的反义寡 核苷酸， 或者施用单一的积极对称的反义寡核苷酸， 它同时靶向重叠的有义和反义转录子。根据本发明， 反义化合物包括反义寡核苷酸、 核酶、 外部引导序列 (EGS) 寡核苷 酸、 siRNA 化合物、 单或双链 RNA 干扰 (RNAi) 化合物 ( 例如 siRNA 化合物 ) 和其它杂交至 靶核酸的至少一部分并调节其功能的寡聚化合物。因此， 它们可以是 DNA、 RNA、 DNA 样、 RNA 样或它们的混合物， 或可以是这些中的一种或多种的模拟物。这些化合物可以是单链、 双 链、 环状或发夹寡聚化合物， 并可包含结构元素， 例如内部或末端膨胀、 错配或环。 反义化合 物通常线性制备， 但可以被连接或者制备成环状和 / 或分枝状。反义化合物可以包括例如 下面的构建体 (construet) ： 两条链杂交形成整体或部分双链的化合物， 或者单链， 该单链 具有足够自身互补性以允许杂交和形成整体或部分双链的化合物。 所述两条链可以内部连 接而留下自由的 3′或 5′末端， 或可以连接而形成连续的发夹结构或环。发夹结构可以在 5′或 3′末端包含产生单链特征延伸的突出端。 双链化合物可任选在末端包含突出端。 进 一步的修饰可以包含缀合基团， 它们依附于末端、 选定的核苷酸位置、 糖位置之一或依附于 核苷间键合之一。或者， 两条链可以通过非核酸部分或连接基团连接。当仅由一条链形成 时， dsRNA 可以采取自身向后折回形成双链体的自身互补的发夹型分子的形式。 因此， dsRNA 可以整体或部分是双链。基因表达的具体调节可通过 dsRNA 发夹在转基因细胞系中的稳定 表达实现， 但在某些实施方案中， 基因表达或功能被上调。当由两条链， 或单链 ( 它采取自 身向后折回形成双链体的自身互补的发夹型分子的形式 ) 形成时， 这两条链 ( 或单链的形 成双链体的区域 ) 是以华生 - 克里克形式碱基配对的互补 RNA 链。
一旦引入系统， 本发明的化合物可以引发一种或多种酶或结构蛋白的作用， 导致 对靶核酸的切割或其它修饰， 或者可以通过基于占有 (occupancy-based) 的机制而工作。 总体上， 核酸 ( 包括寡核苷酸 ) 可以描述为″ DNA 样″ ( 即一般具有一个或多个 2′ - 脱氧 糖， 和一般为 T 而非 U 碱基 ) 或″ RNA 样″ ( 即一般具有一个或多个 2′ - 羟基或 2′ - 修 饰的糖， 和一般为 U 而非 T 碱基 )。核酸螺旋可以采用不止一种结构类型， 最常见的是 A 和 B 型。据信， 一般具有 B 型样结构的寡核苷酸是″ DNA 样″的， 而那些具有 A 型样结构的寡 核苷酸则是″ RNA 样″的。在某些 ( 嵌合 ) 实施方案中， 反义化合物可以包含 A 和 B 型区 域两者。
在 另 一 个 优 选 的 实 施 方 案 中， 期望的寡核苷酸或反义化合物包含以下的至 少一种 ： 反义 RNA、 反义 DNA、 嵌合反义寡核苷酸、 包含修饰键合的反义寡核苷酸、 干扰 RNA(RNAi)、 短干扰 RNA(siRNA)、 微小的干扰 RNA(miRNA)、 小的时序 (temporal)RNA(stRNA) 或短的发夹 RNA(shRNA)、 小 RNA 诱导的基因激活 (RNAa)、 小激活 RNA(saRNA) 或它们的组 合。
dsRNA 也可以激活基因表达， 机制已经被术语称为″小 RNA 诱导的基因激活″或 RNAa。靶向基因启动子的 dsRNA 诱导相关基因的强效转录激活。RNAa 在人细胞中利用合成 dsRNA( 术语称为″小激活 RNA″ (saRNA)) 得到证实。目前不知道 RNAa 是否保存于其它生 物中。
小双链 RNA(dsRNA)， 例如小干扰 RNA(siRNA) 和微小 RNA(miRNA)， 已被发现是称为 RNA 干扰 (RNAi) 的进化保守 (conserved) 机制的触发物。RNAi 总是通过改造染色质导致 基因沉默， 从而抑制转录、 降解互补 mRNA 或阻断蛋白翻译。但是， 在下面的实施例部分详细 描述的例子中， 显示寡核苷酸增加血管内皮生长因子 (VEGF) 多核苷酸和其编码产物的表 达和 / 或功能。dsRNA 也可以充当小激活 RNA(saRNA)。不希望被理论所束缚， 通过靶向基因启动子中的序列， saRNA 将在称为 dsRNA 诱导的转录激活 (RNAa) 的现象中诱导靶基因表 达。
在一个进一步的实施方案中， 本文鉴别的″优选靶片段″可以用于筛选调节血管 内皮生长因子 (VEGF) 多核苷酸表达的另外的化合物。″调节剂″是减小或增大编码血管 内皮生长因子 (VEGF) 的核酸分子的表达的那些化合物， 其包含与优选的靶片段互补的至 少 5 个核苷酸部分。筛选方法包括以下步骤 ： 使编码血管内皮生长因子 (VEGF) 的有义或天 然反义多核苷酸的核酸分子的优选靶片段与一种或多种候选调节剂接触， 和选择减小或增 大编码血管内皮生长因子 (VEGF) 多核苷酸的核酸分子表达的一种或多种候选调节剂， 例 如 SEQ ID NO ： 4-9。一旦显示候选调节剂能调节 ( 例如减小或者增大 ) 编码血管内皮生长 因子 (VEGF) 多核苷酸的核酸分子的表达， 则该调节剂可用于血管内皮生长因子 (VEGF) 多 核苷酸的功能的进一步探索性研究， 或根据本发明用作研究、 诊断或治疗剂。
靶向天然反义序列优选调节靶基因的功能。例如 VEGF 基因 (NM_001025366.1， 图 2)。在一个优选的实施方案中， 靶是血管内皮生长因子 A 基因的反义多核苷酸。在一个 优选的实施方案中， 反义寡核苷酸靶向血管内皮生长因子 (VEGF) 多核苷酸 ( 例如注册号 NM_001025366.1， 图 2) 的有义和 / 或天然反义序列、 它们的变体、 等位基因、 同种型、 同系 物、 突变体、 衍生物、 片段和互补序列。优选寡核苷酸是反义分子， 且靶包括反义和 / 或有义 VEGF 多核苷酸的编码和非编码区域。
本发明优选的靶片段也可以和它们各自的本发明互补反义化合物结合， 从而形成 稳定的双链 ( 双链体 ) 寡核苷酸。
本领域已经显示了这样的双链寡核苷酸部分通过反义机制调节靶表达和调节翻 译以及 RNA 处理。 另外， 双链部分可以进行化学修饰 (Fire 等 (1998)Nature， 391， 806-811 ； Timmons 和 Fire， (1998)Nature， 395， 854 ； Timmons 等 (2001)Gene， 263， 103-112 ； Tabara 等 (1998)Science， 282， 430-431 ； Montgomery 等 (1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 95， 15502-15507 ； Tuschl 等 (1999)Genes Dev.， 13， 3191-3197 ； Elbashir 等 (2001)Nature， 411， 494-498 ； Elbashir 等 (2001)Genes Dev.15， 188-200)。例如， 已经显示了这样的双链 部分通过双链体反义链与靶的经典杂交而抑制靶， 从而触发靶的酶促降解 (Tijsterman 等 (2002)Science， 295， 694-697)。
在一个优选的实施方案中， 反义寡核苷酸靶向血管内皮生长因子 (VEGF) 多核苷 酸 ( 例如注册号 NM_001025366.1)、 其变体、 等位基因、 同种型、 同系物、 突变体、 衍生物、 片 段和互补序列。优选寡核苷酸是反义分子。
根据本发明的实施方案， 靶核酸分子并不仅限于血管内皮生长因子 (VEGF)， 还延 及血管内皮生长因子 (VEGF) 分子的任何同种型、 受体、 同系物等。
在另一个优选的实施方案中， 寡核苷酸靶向 VEGF 多核苷酸的天然反义序列， 例如 SEQ ID NO ： 2 和 3 展示的多核苷酸， 及其任何变体、 等位基因、 同系物、 突变体、 衍生物、 片段 和互补序列。反义寡核苷酸的实例如 SEQ ID NO ： 4-9 所展示。
在一个实施方案中， 寡核苷酸和血管内皮生长因子 (VEGF) 反义的核酸序列 ( 非限 制性地包括与血管内皮生长因子 (VEGF) 多核苷酸有关的非编码有义和 / 或反义序列 ) 互 补或结合， 并调节血管内皮生长因子 (VEGF) 分子的表达和 / 或功能。
在另一个优选的实施方案中， 寡核苷酸和 VEGF 天然反义的核酸序列 ( 如 SEQ IDNO ： 2 和 3 所展示 ) 互补或结合， 并调节 VEGF 分子的表达和 / 或功能。
在一个优选的实施方案中， 寡核苷酸包含 SEQ ID NO ： 4-9 的至少 5 个连续核苷酸 的序列， 并调节血管内皮生长因子 (VEGF) 分子的表达和 / 或功能。
多核苷酸靶包括 VEGF( 包含其家族成员 )、 VEGF 的变体、 VEGF 的突变体 ( 包含 SNP)、 VEGF 的非编码序列、 VEGF 的等位基因、 种变体、 片段等。优选寡核苷酸是反义分子。
在另一个优选的实施方案中， 靶向血管内皮生长因子 (VEGF) 多核苷酸的寡核 苷酸包括 ： 反 义 DNA、 干 扰 RNA(RNAi)、 短 干 扰 RNA(siRNA)、 微 小 干 扰 RNA(miRNA)、 小的 时 序 RNA(stRNA)、 或 短 的 发 夹 RNA(shRNA)、 小 RNA 诱 导 的 基 因 激 活 (RNAa) 或 小 激 活 RNA(saRNA)。
在另一个优选的实施方案中， 靶向血管内皮生长因子 (VEGF) 多核苷酸 ( 例如 SEQ ID NO ： 2 和 3) 调节这些靶的表达或功能。在一个实施方案中， 表达或功能相对于对照被上 调。在另一个优选的实施方案中， 表达或功能相对于对照被下调。
在另一个优选的实施方案中， 反义化合物包括 SEQ ID NO ： 4-9 展示的序列。这些 寡核苷酸可包含一个或多个修饰的核苷酸、 较短或较长片段、 修饰的键等。
在另一个优选的实施方案中， SEQ ID NO ： 4-9 包含一个或多个 LNA 核苷酸。
期望的靶核酸的调节可按本领域已知的几种方式进行。 例如反义寡核苷酸、 siRNA 等。酶促核酸分子 ( 例如核酶 ) 是能催化多种反应中的一种或多种的核酸分子， 其包括以 核苷酸碱基序列特异性方式反复切割其它单独的核酸分子的能力。 这种酶促核酸分子可用 于， 例如实际靶向任何 RNA 转录子 (Zaug 等， 324， Nature 429 1986 ； Cech， 260 JAMA 3030， 1988 ； 和 Jefieries 等， 17 Nucleic Acids Research 1371， 1989)。
因为它们的序列特异性， 反式切割酶促核酸分子显示作为人疾病治疗剂的希望 (Usman & McSwiggen， (1995)Ann.Rep.Med.Chem.30， 285-294 ； Christoffersen 和 Marr， (1995)J.Med.Chem.38， 2023-2037)。酶促核酸分子可设计成在细胞 RNA 的背景下切割具体 RNA 靶。这种切割事件使 mRNA 无功能并取消从该 RNA 的蛋白表达。以这种方式， 与疾病状 态相关的蛋白的合成能被选择性地抑制。
总的来说， 具有 RNA 切割活性的酶促核酸通过首先结合靶 RNA 而起作用。这种结 合通过酶促核酸的靶结合部分发生， 该酶促核酸与作用为切割靶 RNA 的分子的酶促部分保 持紧密接近。因此， 酶促核酸首先识别靶 RNA 然后通过互补性碱基配对与之结合， 一旦结合 到正确的位点， 即起酶促作用切割靶 RNA。 策略性切割这种靶 RNA 将破坏其直接合成编码蛋 白的能力。酶促核酸已结合和切割它的 RNA 靶后， 将它从该 RNA 释放出来， 寻找另一个靶， 并可重复结合和切割新靶。
几 种 方 法 ( 例 如 体 外 选 择 ( 进 化 ) 策 略 (Orgel， (1979)Proc.R.Soc.London， B 205， 435)) 已被用于进化新的能催化多种反应 ( 例如磷酸二酯键合和酰胺键合的切割 和连接 ) 的核酸催化剂 (Joyce， (1989)Gene， 82， 83-87 ； Beaudry 等 (1992)Science 257， 635-641 ； Joyce， (1992)Scientific American 267， 90-97 ； Breaker 等 (1994)TIBTECH 12， 268 ； Bartel 等 (1993)Science 261 ： 1411-1418 ； Szostak， (1993)TIBS 17， 89-93 ； Kumar 等 (1995)FASEB J.， 9， 1183 ； Breaker， (1996)Curr.Op.Biotech.， 7， 442)。
开发催化活性最佳的核酶将显著帮助任何出于调节基因表达的目的而采用 RNA 切割核酶的策略。例如锤头状核酶在有饱和浓度的 Mg2+(10mM) 辅助因子存在下的催化速率 (kcat) 大约是 1 分钟 -1。已显示人造″ RNA 连接酶″核酶以大约 100 分钟 -1 的速率催 化相应的自修饰反应。 另外， 已知某些修饰的锤头状核酶 ( 它们具有由 DNA 构成的底物结合 臂 ) 以接近 100 分钟 -1 的多重周转率 (multiple turn-over rate) 催化 RNA 切割。最后， 用特定核苷酸类似物替换锤头的催化核心内的具体残基产生修饰的核酶， 它们显示多达 10 倍的催化速率改进。这些发现表明核酶能促进化学转化， 其催化速率显著大于绝大多数天 然自切割核酶在体外所展示的催化速率。 因此可以优化某些自切割核酶的结构而产生最大 催化活性， 或可以制备对 RNA 磷酸二酯切割展示显著更快速率的全新 RNA 结构域。
通过适合″锤头″模型的 RNA 催化剂在分子间切割 RNA 底物首次显示于 1987 年 (Uhlenbeck， O.C.(1987)Nature， 328 ： 596-600)。 RNA 催化剂被回收并与多个 RNA 分子反应， 这表明了它真正具有催化性。
通过在催化 RNA 中进行适当的碱基变化以保持和靶序列的必要碱基配对， 已将基 于 “锤头状” 结构域设计的催化 RNA 用于切割具体靶序列 (Haseloff 和 Gerlach， (1988) Nature， 334， 585 ； Walbot 和 Bruening， (1988)Nature， 334， 196 ； Uhlenbeck， O.C.(1987) Nature， 328 ： 596-600 ； Koizumi， M. 等 (1988)FEBS Lett.， 228 ： 228-230)。这已经允许使用 催化 RNA 切割具体靶序列， 并表明根据″锤头″模型设计的催化 RNA 可能可以在体内切割 具体的底物 RNA( 参见 Haseloff 和 Gerlach， (1988)Nature， 334， 585 ； Walbot 和 Bruening， (1988)Nature， 334， 196 ； Uhlenbeck， O.C.(1987)Nature， 328 ： 596-600)。 RNA 干扰 (RNAi) 已经变成用于调节哺乳动物和哺乳动物细胞的基因表达的强有 力工具。该方法需要使用表达质粒或病毒以及用于小发夹 RNA( 它们处理成 siRNA) 的编码 序列， 递送作为 RNA 自身或作为 DNA 的小干扰 RNA(siRNA)。该系统能将前 siRNA 有效运输 至细胞质， 在那里它们有活性并允许使用经调节的和组织特异性的基因表达启动子。
在一个优选的实施方案中， 寡核苷酸或反义化合物包括核糖核酸 (RNA) 和 / 或脱 氧核糖核酸 (DNA) 的寡聚体或多聚体， 或它们的模拟物、 嵌合体、 类似物或同系物。该术语 包括由天然存在的核苷酸、 糖和共价核苷间 ( 骨架 ) 键合组成的寡核苷酸， 以及具有非天然 存在部分 ( 其功能类似 ) 的寡核苷酸。由于期望的性质 ( 例如提高的细胞摄取、 提高的对 靶核酸的亲和力、 核酸酶存在下的增大的稳定性 )， 这些经修饰或取代的寡核苷酸通常相对 于天然形式为人所期望。
根据本发明， 寡核苷酸或″反义化合物″包括反义寡核苷酸 ( 例如 RNA、 DNA、 它们 的模拟物、 嵌合体、 类似物或同系物 )、 核酶、 外部引导序列 (EGS) 寡核苷酸、 siRNA 化合物、 单或双链 RNA 干扰 (RNAi) 化合物例如 siRNA 化合物、 saRNA、 aRNA 和其它杂交至靶核酸的 至少一部分并调节其功能的寡聚化合物。因此， 它们可以是 DNA、 RNA、 DNA 样、 RNA 样、 或它 们的混合物、 或可以是这些中的一种或多种的模拟物。这些化合物可以是单链、 双链、 环状 或发夹寡聚化合物， 并可以包含例如内部或末端膨胀、 错配或环的结构元素。 反义化合物通 常线性制备， 但可以被连接或者制备成环状和 / 或分枝状。反义化合物可以包括构建体， 例如两条链杂交形成整体或部分双链的化合物， 或者单链， 该单链具有足够自身互补性以 允许杂交和形成整体或部分双链的化合物。所述两条链可以内部连接而留下自由的 3′或 5′末端， 或可以连接而形成连续的发夹结构或环。发夹结构可以在 5′或 3′末端包含产 生单链特征延伸的突出端。双链化合物可任选在末端包含突出端。进一步的修饰可以包含 缀合基团， 所述缀合基团依附于末端、 选定的核苷酸位置、 糖位置之一或依附于核甘间键合
之一。或者， 两条链可以通过非核酸部分或连接基团连接。当仅由一条链形成时， dsRNA 可 以采取自身向后折回形成双链体的自身互补的发夹型分子的形式。因此， dsRNA 可以整体 或部分是双链。基因表达的具体调节可通过 dsRNA 发夹在转基因细胞系中的稳定表达实现 (Hammond 等 (1991)Nat.Rev.genet.， 2， 110-119 ； Matzke 等 (2001)Curr.Opin.genet.Dev.， 11， 221-227 ； Sharp， (2001)Genes Dev.， 15， 485-490)。 当由两条链， 或单链 ( 它采取自身向 后折回形成双链体的自身互补的发夹型分子的形式 ) 形成时， 这两条链 ( 或单链的形成双 链体的区域 ) 是以华生 - 克里克形式碱基配对的互补 RNA 链。
一旦引入系统， 本发明的化合物可以引发一种或多种酶或结构蛋白的作用， 导致 对靶核酸的切割或其它修饰， 或者可以通过基于占有 (occupancy-based) 的机制而工作。 总体上， 核酸 ( 包括寡核苷酸 ) 可以描述为″ DNA 样″ ( 即一般具有一个或多个 2′ - 脱氧 糖， 和一般为 T 而非 U 碱基 ) 或″ RNA 样″ ( 即一般具有一个或多个 2′ - 羟基或 2′ - 修 饰的糖， 和一般为 U 而非 T 碱基 )。核酸螺旋可以采用不止一种结构类型， 最常见的是 A 和 B 型。据信， 一般具有 B 型样结构的寡核苷酸是″ DNA 样″的， 而那些具有 A 型样结构的寡 核苷酸则是″ RNA 样″的。在某些 ( 嵌合 ) 实施方案中， 反义化合物可以包含 A 和 B 型区 域两者。
根据本发明的反义化合物能包含长度大约 5 到大约 80 个核苷酸 ( 即大约 5 到大 约 80 个连接的核苷 ) 的反义部分。这指的是反义化合物的反义链或部分的长度。换句话 说， 本发明的单链反义化合物包含 5 到大约 80 个核苷酸， 而本发明的双链反义化合物 ( 例 如 dsRNA) 包含长度是 5 到大约 80 个核苷酸的有义和反义链或部分。本领域普通技术人员 将理解这包含长度为 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 51、 52、 53、 54、 55、 56、 57、 58、 59、 60、 61、 62、 63、 64、 65、 66、 67、 68、 69、 70、 71、 72、 73、 74、 75、 76、 77、 78、 79 或 80 个核苷酸， 或它们之间的任何范围的反义部分。
在一个实施方案中， 本发明的反义化合物具有长度是 10 到 50 个核苷酸的反义部 分。本领域普通技术人员将理解这使寡核苷酸具体化为具有长度是 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49 或 50 个核苷酸， 或它们之间的任何范围的反义部分。 在某些 实施方案中， 寡核苷酸长度是 15 个核苷酸。
在一个实施方案中， 本发明的反义或寡核苷酸化合物具有长度是 12 或 13 到 30 个 核苷酸的反义部分。本领域普通技术人员将理解这使反义化合物具体化为具有长度是 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29 或 30 个核苷酸， 或它们之间的 任何范围的反义部分。
在另一个优选的实施方案中， 本发明的寡聚化合物也包含变体， 其中该化合物内 一个或多个核苷酸位置上存在不同的碱基。 例如， 如果第一个核苷酸是腺苷， 可产生在此位 置含有胸苷、 鸟苷或胞苷的变体。这可以在反义或 dsRNA 化合物的任何位置完成。这些化 合物然后使用本文描述的方法来测试， 以测定它们抑制靶核酸表达的能力。
在某些实施方案中， 反义化合物和靶之间的同源性、 序列同一性或互补性是大约 40 ％到大约 60 ％。在某些实施方案中， 同源性、 序列同一性或互补性是大约 60 ％到大约 70％。在某些实施方案中， 同源性、 序列同一性或互补性是大约 70％到大约 80％。在某些实施方案中， 同源性、 序列同一性或互补性是大约 80％到大约 90％。在某些实施方案中， 同 源性、 序列同一性或互补性是大约 90％、 大约 92％、 大约 94％、 大约 95％、 大约 96％、 大约 97％、 大约 98％、 大约 99％或大约 100％。
在另一个优选的实施方案中， 反义寡核苷酸 ( 例如 SEQ ID NO ： 4-9 展示的核酸分 子 ) 包含一种或多种取代或修饰。在一个实施方案中， 核苷酸被锁定核酸 (LNA) 取代。
在另一个优选的实施方案中， 寡核苷酸靶向与 VEGF 相关的编码和 / 或非编码序列 以及 SEQ ID NO ： 1-3 所展示的序列的核酸分子有义和 / 或反义的一个或多个区域。寡核苷 酸也靶向 SEQ ID NO ： 1-3 的重叠区域。
本发明的某些优选寡核苷酸是嵌合寡核苷酸。在本发明的上下文中，″嵌合寡 核苷酸″或″嵌合体″是包含两个或更多个化学不同区域 ( 每个由至少一个核苷酸组成 ) 的寡核苷酸。这些寡核苷酸通常包含至少一个修饰的核苷酸的区域 ( 它赋予一种或多种有 益性质 ( 例如增大的核酸酶抗性、 增大的进入细胞的摄取、 增大的对靶的结合亲和力 ))， 和 是酶 ( 它能切割 RNA:DNA 或 RNA:RNA 杂交体 ) 的底物的区域。举例来说， RNase H 是切割 RNA:DNA 双链体的 RNA 链的细胞内切核酸酶。因此， RNase H 的激活导致 RNA 靶的切割， 从 而极大提高基因表达的反义调节的效率。因此， 和杂交至相同靶区域的硫代磷酸酯脱氧寡 核苷酸相比， 在使用嵌合寡核苷酸时用较短的寡核苷酸经常可以获得可比的结果。 RNA 靶的 切割通常可由凝胶电泳检测， 必要时由本领域已知的关联核酸杂交技术检测。在一个优选 的实施方案中， 嵌合寡核苷酸包含至少一个经修饰以增大靶结合亲和力的区域， 且通常包 含充当 RNAseH 的底物的区域。寡核苷酸与其靶 ( 在这种情况下为编码 ras 的核酸 ) 的亲 和力通常通过测量寡核苷酸 / 靶配对的 Tm 而测定， Tm 是寡核苷酸和靶分离时的温度， 分离 由分光光度法检测。Tm 越高， 寡核苷酸与靶的亲和力越大。
本发明的嵌合反义化合物可作为上述两种或更多种寡核苷酸、 修饰的寡核苷酸、 寡核苷和 / 或寡核苷酸模拟物的复合结构而形成。这样的化合物在本领域也已被称为杂合 物或间合物 (gapmer)。教导制备这种杂合物结构的代表性的美国专利包括但不限于美国 专 利 号 5,013,830、 5,149,797、 5,220,007、 5,256,775、 5,366,878、 5,403,711、 5,491,133、 5,565,350、 5,623,065、 5,652,355、 5,652,356 和 5,700,922， 通过引用将每一项并入本文。
在另一个优选的实施方案中， 经修饰的寡核苷酸的区域包含至少一个在糖的 2′ 位置修饰的核苷酸， 最优选 2′ -O 烷基、 2′ -O- 烷基 -O- 烷基或 2’ - 氟代修饰的核苷酸。 在其它优选的实施方案中， RNA 修饰包括在嘧啶核糖、 脱碱基残基或在 RNA 3′末端的倒置 碱基 (inverted base) 上的 2′ - 氟代、 2′ - 氨基和 2′ O- 甲基修饰。通常将这样的修饰 并入寡核苷酸， 且已显示这些寡核苷酸比 2′ - 脱氧寡核苷酸对给定的靶具有更高的 Tm( 即 更高的靶结合亲和力 )。这种增大的亲和力的效果极大地提高基因表达的 RNAi 寡核苷酸 抑制。RNAse H 是切割 RNA:DNA 双链体的 RNA 链的细胞内切核酸酶， 因此该酶的激活导致 RNA 靶的切割， 因此能极大地提高 RNAi 抑制的效率。RNA 靶的切割通常可由凝胶电泳证实。 在另一个优选的实施方案中， 嵌合寡核苷酸也被修饰以提高核酸酶抗性。细胞包含多种可 以降解核酸的内切或外切核酸酶。 已显示许多核苷酸和核苷修饰使将它们并入的寡核苷酸 比天然寡脱氧核苷酸对核酸酶降解的抗性更大。 核酸酶抗性通常通过用细胞提取物或分离 的核酸酶溶液培养寡核苷酸， 并测量 ( 通常通过凝胶电泳测量 ) 随时间剩余的完整寡核苷 酸的程度而进行测量。 经过修饰以提高它们的核酸酶抗性的寡核苷酸比未修饰的寡核苷酸完整存活更长的时间。已表明多种寡核苷酸修饰提高或赋予核酸酶抗性。目前更优选包含 至少一个硫代磷酸酯修饰的寡核苷酸。在某些情况下， 提高靶结合亲和力的寡核苷酸修饰 也能独立地提高核酸酶抗性。某些期望的修饰可见于 De Mesmaeker 等 (1995)Acc.Chem. Res.， 28 ： 366-374。
本发明展望的某些优选寡核苷酸的具体实例包括那些包含修饰的骨架 ( 例 如硫代磷酸酯、 磷酸三酯、 甲基膦酸酯、 短链烷基或环烷基糖间键合或短链杂原子或杂 环糖间键合 ) 的寡核苷酸。最优选有硫代磷酸酯骨架和那些有杂原子骨架 ( 特别是 CH2--NH--O--CH2、 CH， --N(CH3)--O--CH2[ 称 为 亚 甲 基 ( 甲 基 亚 氨 基 ) 或 MMI 骨 架 ]、 CH2--O--N(CH3)--CH2、 CH2-N(CH3)--N(CH3)--CH2 和 O--N(CH3)--CH2--CH2 骨 架 ) 的 寡 核苷酸， 其中天然磷酸二酯骨架表示为 O--P--O-CH， 。也优选被 De Mesmaeker 等 (1995) Acc.Chem.Res.28 ： 366-374 公开的酰胺骨架。还优选具有吗啉代骨架结构的寡核苷酸 (Summerton 和 Weller， 美国专利号 5,034,506)。在其它优选的实施方案中， 例如寡核苷酸 的肽核酸 (PNA) 骨架、 磷酸二酯骨架被聚酰胺骨架取代， 核苷酸被直接或间接地结合于聚 酰胺骨架上的氮杂氮原子 (Nielsen 等 (1991)Science 254， 1497)。 寡核苷酸也可以包含一 种或多种取代的糖部分。优选的寡核苷酸在 2′位置包含下列之一 ： OH、 SH、 SCH3、 F、 OCN、 OCH3 OCH3、 OCH3 O(CH2)n CH3、 O(CH2)n NH2 或 O(CH2)n CH3( 其中 n 是从 1 到大约 10) ； C1 到 C10 低级烷基、 烷氧基烷氧基、 取代的低级烷基、 烷芳基或芳烷基 ； Cl ； Br ； CN ； CF3 ； OCF3 ； O-、 S- 或 N- 烷基 ； O-、 S- 或 N- 烯基 ； SOCH3 ； SO2 CH3 ； ONO2 ； NO2 ； N3 ； NH2 ； 杂环烷基 ； 杂环烷芳基 ； 氨基烷基氨基 ； 聚烷基氨基 ； 取代的甲硅烷基 ； RNA 切割基团 ； 报道基团 ； 插入 基团 ； 改进寡核苷酸药物动力学性质的基团 ； 或改进寡核苷酸药效学性质的基团和其它具 有类似性质的取代基。优选的修饰包括 2′ - 甲氧基乙氧基 [2′ -O-CH2 CH2OCH3， 也称为 2′ -O-(2- 甲氧基乙基 )](Martin 等 (1995)Helv.Chim.Acta， 78， 486)。 其它优选的修饰包 括 2′ - 甲氧基 (2′ -O--CH3)， 2′ - 丙氧基 (2′ -OCH2 CH2CH3) 和 2′ - 氟代 (2′ -F)。 类似的修饰也可以在寡核苷酸的其它位置上进行， 特别是在 3′末端核苷酸上的糖的 3′ 位置和 5′末端核苷酸上的 5′位置。寡核苷酸也可以有糖模拟物， 例如环丁基代替戊呋喃 糖 (pentofuranosyl) 基团。
寡核苷酸也可另外地或可选地包括核碱基 ( 本领域经常简称为″碱基″ ) 修饰 或取代。本文所用的″未修饰″或″天然″核苷酸包括腺嘌呤 (A)、 鸟嘌呤 (G)、 胸腺嘧啶 (T)、 胞嘧啶 (C) 和尿嘧啶 (U)。修饰的核苷酸包括在天然核酸中仅仅少见或临时见到的 核苷酸， 例如次黄嘌呤、 6- 甲基腺嘌呤、 5- 甲基嘧啶， 特别是 5- 甲基胞嘧啶 ( 也称为 5- 甲 基 -2′脱氧胞嘧啶， 在本领域中常称为 5-Me-C)、 5- 羟甲基胞嘧啶 (HMC)、 糖基 HMC 和龙胆 二糖基 (gentobiosyl)HMC 和合成核苷酸例如 2- 氨基腺嘌呤、 2-( 甲氨基 ) 腺嘌呤、 2-( 咪 唑基烷基 ) 腺嘌呤、 2-( 氨基烷基氨基 ) 腺嘌呤或其它杂取代的烷基腺嘌呤、 2- 硫尿嘧啶、 2- 硫胸腺嘧啶、 5- 嗅尿嘧啶、 5- 羟甲基尿嘧啶、 8- 氮杂鸟嘌呤、 7- 脱氮鸟嘌呤、 N6(6- 氨基 己基 ) 腺嘌呤和 2， 6- 二氨基嘌呤 (Kornberg， A.， DNA Replication， W.H.Freeman & Co.， San Francisco， 1980， pp75-77 ； Gebeyehu， G.， (1987) 等 Nucl.Acids Res.15 ： 4513)。可 包括本领域已知的″通用″碱基， 例如肌苷。已显示 5-Me-C 取代增大核酸双链体的稳定性 0.6-1.2℃ (Sanghvi， Y.S.， in Crooke， S.T. 和 Lebleu， B.， eds.， Antisense Research and Applications， CRC Press， Boca Raton， 1993， pp.276-278)， 且是目前优选的碱基取代。本发明寡核苷酸的另一种修饰包括将一个或多个部分或缀合物 ( 它们提高寡核 苷酸的活性或细胞摄取 ) 化学连接到寡核苷酸。这样的部分包括但不限于脂部分例如胆 固醇部分、 胆固醇基部分 (Letsinger 等 (1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86， 6553)、 胆酸 (Manoharan 等 (1994)Bioorg.Med.Chem.Let.4， 1053)、 硫醚， 例如己基 -S- 三苯甲基硫醇 (Manoharan 等 (1992)Ann.N.Y.Acad.Sci.660， 306 ； Manoharan 等 (1993)Bioorg.Med.Chem. Let.3， 2765)、 硫代胆固醇 (Oberhauser 等 (1992)Nucl.Acids Res.20， 533)、 脂肪族链， 例 如十二烷二醇或十一烷基残基 (Saison-Behmoaras 等 EMBO J.1991， 10， 111 ； Kabanov 等 (1990)FEBS Lett.259， 327 ； Svinarchuk 等 (1993)Biochimie 75， 49)、 磷脂， 例如二 - 十六 烷基 -rac- 甘油或三乙基铵 1， 2- 二 -O- 十六烷基 -rac- 甘油基 -3-H- 膦酸酯 (Manoharan 等 (1995)Tetrahedron Lett.36， 3651 ； Shea 等 (1990)Nucl.Acids Res.18， 3777)、 多胺或 聚乙二醇链 (Manoharan 等 (1995)Nucleosides & Nucleotides， 14， 969) 或金刚烷乙酸 (Manoharan 等 (1995)Tetrahedron Lett.36， 3651)。本领域已知包含亲脂部分的寡核苷酸 和制备这样的寡核苷酸的方法， 例如美国专利号 5,138,045、 5,218,105 和 5,459,255。
不必对给定的寡核苷酸的所有位点进行一致的修饰， 实际上上述不止一种修饰可 以并入单一寡核苷酸甚至寡核苷酸内的单一核苷内。 本发明也包括是上文定义的嵌合寡核 苷酸的寡核苷酸。
在另一个实施方案中， 本发明的核酸分子缀合了另一部分， 其包括但不限于脱碱 基核苷酸、 聚醚、 多胺、 聚酰胺、 肽、 糖、 脂或聚烃化合物。本领域技术人员将认识到这些分 子能在糖、 碱基或磷酸酯基团的几个位置上连接到一个或多个任意的包含核酸分子的核苷 酸。
根据本发明使用的寡核苷酸可以通过公知的固相合成技术方便和常规地制备。 几 个供货商出售用于这种合成的设备， 包括 Applied Biosystems。也可采用任何其它用于这 种合成的装置， 本领域普通技术人员熟知寡核苷酸的实际合成。也公知使用相似技术制备 其它寡核苷酸， 例如硫代磷酸酯和烷基化衍生物。也公知使用类似技术和市售的修饰的阿 米迪特 (amidite) 和可控孔度玻璃 (CPG) 产品 ( 例如生物素、 荧光素、 吖啶或补骨脂素修饰 的阿米迪特和 / 或 CPG(Glen Research， Sterling VA 有售 ))， 以合成荧光标记的、 生物素 化的或其它修饰的寡核苷酸， 例如胆固醇修饰的寡核苷酸。
根据本发明， 使用修饰例如使用 LNA 单体以提高作用的潜能、 特异性和持续时间 并拓宽寡核苷酸的给药路线， 包括当前的化学， 例如 MOE、 ANA、 FANA、 PS 等 (Uhlman 等 (2000) Current Opinions in Drug Discovery & Development Vol.3 No 2)。这可通过由 LNA 单 体取代当前寡核苷酸中的某些单体实现。LNA 修饰的寡核苷酸的大小可以与母体化合物相 似或可以更大或优选更小。优选这样的 LNA 修饰的寡核苷酸包含小于大约 70％、 更优选小 于大约 60％， 最优选小于大约 50％ LNA 单体， 它们的大小在大约 5 和 25 个核苷酸之间， 更 优选在大约 12 和 20 个核苷酸之间。
优选的修饰的寡核苷酸骨架包括但不限于硫代磷酸酯、 手性硫代磷酸酯、 二硫代 磷酸酯、 磷酸三酯、 氨基烷基磷酸三酯、 甲基和其它烷基膦酸酯， 包括 3′烯基膦酸酯和手性 膦酸酯、 亚膦酸酯、 氨基磷酸酯， 包含 3′ - 氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯、 硫羰基 氨基磷酸酯、 硫羰基烷基膦酸酯、 硫羰基烷基磷酸三酯和具有正常 3′ -5′键合的硼烷磷 酸酯、 这些的 2′ -5′连接的类似物和那些具有倒置极性 (inverted polarity) 的， 其中相邻核苷单元对 3′ -5′和 5′ -3′连接或 2′ -5′和 5′ -2′连接。也包括各种盐、 混合 盐和游离酸形式。
教导制备上述含磷键合的代表性的美国专利包括但不限于美国专利号 3,687,808 、 4,469,863 、 4,476,301 、 5,023,243 、 5,177,196 、 5,188,897 、 5,264,423 、 5,276,019 、 5,278,302 、 5,286,717 、 5,321,131 、 5,399,676 、 5,405,939 、 5,453,496 、 5,455,233 、 5,466,677 、 5,476,925 、 5,519,126 、 5,536,821 、 5,541,306 、 5,550,111 、 5,563,253、 5,571,799、 5,587,361 和 5,625,050， 通过引用将每一项并入本文。
优选的修饰的寡核苷酸骨架 ( 其中不包括磷原子 ) 具有由以下形成的骨架 ： 短链 烷基或环烷基核苷间键合、 混合的杂原子和烷基或环烷基核苷间键合或一种或多种短链杂 原子或杂环核苷间键合。这些包括具有以下的那些 ： 吗啉代键合 ( 部分由核苷的糖部分形 成 )、 硅氧烷骨架、 硫化物、 亚砜和砜骨架、 甲酰乙酰基 (Formacetyl) 和硫代甲酰乙酰基骨 架、 亚甲基甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基骨架、 含烯骨架、 氨基磺酸酯骨架、 亚甲基亚氨基 和亚甲基肼基骨架、 磺酸酯和磺酰胺骨架、 酰胺骨架和其它具有混合的 N、 O、 S 和 CH2 组分部 分的骨架。
教导制备上述寡核苷的代表性的美国专利包括但不限于美国专利号 5,034,506、 5,166,315 、 5,185,444 、 5,214,134 、 5,216,141 、 5,235,033 、 5,264,562 、 5,264,564 、 5,405,938 、 5,434,257 、 5,466,677 、 5,470,967 、 5,489,677 、 5,541,307 、 5,561,225 、 5,596,086 、 5,602,240 、 5,610,289 、 5,602,240 、 5,608,046 、 5,610,289 、 5,618,704 、 5,623,070、 5,663,312、 5,633,360、 5,677,437 和 5,677,439， 通过引用将每一项并入本文。
在其它优选的寡核苷酸模拟物中， 核苷酸单元的糖和核苷间键合 ( 即骨架 ) 被新 的基团取代。碱基单元被保留用于与合适的核酸靶化合物杂交。一种这样的寡聚化合物 ( 已显示具有优良杂交性质的寡核苷酸模拟物 ) 称为肽核酸 (PNA)。在 PNA 化合物中， 寡核 苷酸的糖骨架被含酰胺的骨架 ( 特别是氨基乙基甘氨酸骨架 ) 取代。核碱基被保留并直接 或间接结合骨架酰胺部分的氮杂氮原子。教导制备 PNA 化合物的代表性美国专利包括但不 限于美国专利号 5,539,082、 5,714,331 和 5,719,262， 通过引用将每一项并入本文。PNA 化 合物的其它教导可见于 Nielsen 等 (1991)Science 254， 1497-1500。
在本发明的另一个优选实施方案中， 寡核苷酸具有硫代磷酸酯骨架和寡核苷具有 杂原子骨架， 特别是 CH2-NH-O-CH2-、 称为亚甲基 ( 甲基亚氨基 ) 或 MMI 骨架的 -CH2-N(CH3 )-O-CH2-、 -CH2-O-N(CH3)-CH2-、 -CH2N(CH3)-N(CH3)CH2- 和 -O-N(CH3)-CH2-CH2-， 其中天 然磷酸二酯骨架表示成上面引用的美国专利号 5,489,677 的 -O-P-O-CH2-， 和上面引用的 美国专利号 5,602,240 的酰胺骨架。也优选上面引用的美国专利号 5,034,506 的具有吗啉 代骨架结构的寡核苷酸。
修饰的寡核苷酸也可含有一种或多种取代的糖部分。优选的寡核苷酸在 2 ′位 置包含以下之一 ： OH ； F； O-、 S-、 或 N- 烷基 ； O-、 S-、 或 N- 烯基 ； O-、 S- 或 N- 炔基 ； 或O烷 基 -O- 烷基， 其中烷基、 烯基和炔基可以是取代或未取代的 C 到 CO 烷基或 C2 到 CO 烯基和炔 基 (C to CO alkyl or C2 to CO alkenyl and alkynyl)。尤其优选的是 O(CH2)n OmCH3、 O(CH2)n， OCH3、 O(CH2)nNH2、 O(CH2)nCH3、 O(CH2)nONH2 和 O(CH2nON(CH2)nCH3)2， 其中 n 和 m 可以是 1 到大约 10。其它优选的寡核苷酸在 2′位置包含以下之一 ： C 到 CO、 低级烷基、 取代的低级烷基、 烷芳基、 芳烷基、 O- 烷芳基或 O- 芳烷基、 SH、 SCH3、 OCN、 Cl、 Br、 CN、 CF3、OCF3、 SOCH3、 SO2CH3、 ONO2、 NO2、 N3、 NH2、 杂环烷基、 杂环烷芳基、 氨基烷基氨基、 聚烷基氨 基、 取代的甲硅烷基、 RNA 切割基团、 报道基团、 插入基团、 改进寡核苷酸药物动力学性质的 基团、 或改进寡核苷酸药效学性质的基团和其它具有相似性质的取代基。优选的修饰包括 2 ′ - 甲氧基乙氧基 (2 ′ -O-CH2CH2OCH3， 也称为 2 ′ -O-(2- 甲氧基乙基 ) 或 2 ′ -MOE) (Martin 等 (1995)Helv.Chim.Acta， 78， 486-504)， 即烷氧基烷氧基基团。其它优选的修饰 包含 2′ - 二甲基氨基氧基乙氧基 ( 即 O(CH2)2ON(CH3)2 基团， 也称为 2′ -DMAOE， 如本文 以下实施例所述， 和 2′ - 二甲基氨基乙氧基乙氧基 ( 本领域也称为 2′ -O- 二甲基氨基乙 氧基乙基或 2′ -DMAEOE)， 即 2′ -O-CH2-O-CH2-N(CH2)2。
其 它 优 选 的 修 饰 包 括 2 ′ - 甲 氧 基 (2 ′ -OCH3)、 2′-氨基丙氧基 (2′ -OCH2CH2CH2NH2) 和 2′ - 氟代 (2′ -F)。类似的修饰也可以在寡核苷酸的其它位置 上进行， 特别是在 3′末端核苷酸上的糖的 3′位置或 2′ -5′连接的寡核苷酸中和 5′末 端核苷酸的 5′位置。寡核苷酸也可以具有糖模拟物例如环丁基部分取代戊呋喃糖基糖。 教导制备这种修饰的糖结构的美国专利包括但不限于美国专利号 4,981,957、 5,118,800、 5,319,080 、 5,359,044 、 5,393,878 、 5,446,137 、 5,466,786 、 5,514,785 、 5,519,134 、 5,567,811 、 5,576,427 、 5,591,722 、 5,597,909 、 5,610,300 、 5,627,053 、 5,639,873 、 5,646,265、 5,658,873、 5,670,633 和 5,700,920， 通过引用将每一项并入本文。
寡核苷酸也可以包括核碱基 ( 本领域经常简称为″碱基″ ) 修饰或取代。本文 所用的″未修饰″或″天然″核苷酸包含嘌呤碱基腺嘌呤 (A) 和鸟嘌呤 (G)， 和嘧啶碱基 胸腺嘧啶 (T)、 胞嘧啶 (C) 和尿嘧啶 (U)。修饰的核苷酸包括其它合成和天然核苷酸， 例如 5- 甲基胞嘧啶 (5-me-C)， 5- 羟甲基胞嘧啶， 黄嘌呤， 次黄嘌呤， 2- 氨基腺嘌呤， 腺嘌呤和鸟 嘌呤的 6- 甲基和其它烷基衍生物， 腺嘌呤和鸟嘌呤的 2- 丙基和其它烷基衍生物， 2- 硫尿 嘧啶， 2- 硫胸腺嘧啶和 2- 硫胞嘧啶， 5- 卤素尿嘧啶和胞嘧啶， 5- 丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶， 6- 氮杂尿嘧啶、 胞嘧啶和胸腺嘧啶， 5- 尿嘧啶 ( 假尿嘧啶 )， 4- 硫尿嘧啶， 8- 卤素、 8- 氨基、 8- 硫醇、 8- 硫代烷基、 8- 羟基和其它 8- 取代的腺嘌呤和鸟嘌呤， 5- 卤素特别是 5- 溴、 5- 三 氟甲基和其它 5- 取代的尿嘧啶和胞嘧啶， 7- 甲基奎宁和 7- 甲基腺嘌呤， 8- 氮杂鸟嘌呤和 8- 氮杂腺嘌呤， 7- 脱氮鸟嘌呤和 7- 脱氮腺嘌呤和 3- 脱氮鸟嘌呤和 3- 脱氮腺嘌呤。
另 外， 核 苷 酸 包 括 那 些 公 开 于 美 国 专 利 号 3,687,808、 那 些 公 开 于 ′ The Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering ′， 858-859 页， Kroschwitz， J.I. 编辑 John Wiley & Sons， 1990、 那些公开于 Englisch 等′ Angewandle Chemie， International Edition ′， 1991， 30， 613 页 和 那 些 公 开 于 Sanghvi， Y.S.， 15 章，′ Antisense Research and Applications′， 289-302 页， Crooke， S.T. 和 Lebleu， B.ea.， CRC Press， 1993 中的核苷酸。这些核苷酸中特定的一些对增大本发明的寡聚化合 物的结合亲和力特别有用。这些包括 5- 取代的嘧啶、 6- 氮杂嘧啶和 N-2、 N-6 和 0-6 取代 的嘌呤， 包括 2- 氨基丙基腺嘌呤、 5- 丙炔基尿嘧啶和 5- 丙炔基胞嘧啶。已显示 5- 甲基 胞嘧啶取代增大核酸双链体稳定性 0.6-1.2 ℃ (Sanghvi， Y.S.， Crooke， S.T. 和 Lebleu， B.， 编 辑 ′ Antisense Research and Applications ′， CRC Press， Boca Raton， 1993， pp.276-278)， 且为目前优选的碱基取代， 当结合 2′ -O 甲氧基乙基糖修饰时， 它更被特别 优选。
教导制备上述修饰的核苷酸和其它修饰的核苷酸的代表性美国专利包括但不限于美国专利号 3,687,808、 以及 4,845,205、 5,130,302、 5,134,066、 5,175,273、 5,367,066、 5,432,272 、 5,457,187 、 5,459,255 、 5,484,908 、 5,502,177 、 5,525,711 、 5,552,540 、 5,587,469、 5,596,091、 5,614,617、 5,750,692 和 5,681,941， 通过引用将每一项并入本文。
本发明寡核苷酸的另一种修饰包括将一个或多个部分或缀合物 ( 它们提高寡核 苷酸的活性、 细胞分布或细胞摄取 ) 化学连接到寡核苷酸。
这样的部分包括但不限于脂部分例如胆固醇部分 (Letsinger 等 (1989)Proc. Natl.Acad.Sci.USA 86， 6553-6556)、 胆酸 (Manoharan 等 (1994)Bioorg.Med.Chem.Let.4， 1053-1060)、 硫 醚， 例 如 己 基 -S- 三 苯 甲 基 硫 醇 (Manoharan 等 (1992)Ann.N.Y.Acad. Sci.660， 306-309 ； Manoharan 等 (1993)Bioorg.Med.Chem.Let.3， 2765-2770)、 硫代胆固醇 (Oberhauser 等 (1992)Nucl.Acids Res.20， 533-538)、 脂肪族链， 例如十二烷二醇或十一烷 基残基 (Kabanov 等 (1990)FEBS Lett.259， 327-330 ； Svinarchuk 等 (1993)Biochimie 75， 49-54)、 磷脂， 例如二 - 十六烷基 -rac- 甘油或三乙基铵 1， 2- 二 -O- 十六烷基 -rac- 甘油 基 -3-H- 磷酸酯 (Manoharan 等 (1995)Tetrahedron Lett.36， 3651-3654 ； Shea 等 (1990) Nucl.Acids Res.18， 3777-3783)、 多胺或聚乙二醇链 (Manoharan 等 (1995)Nucleosides & Nucleotides， 14， 969-973) 或金刚烷乙酸 (Manoharan 等 (1995)Tetrahedron Lett.36， 3651-3654)、 棕榈基部分 (Mishra 等 (1995)Biochim.Biophys.Acta， 1264， 229-237) 或十八 烷基胺或己基氨基 - 羰基 - 叔羟胆固醇部分 (Crooke 等 (1996)J.Pharmacol.Exp.Ther.， 277， 923-937)。
教导制备这些寡核苷酸缀合物的代表性美国专利包括但不限于美国专利 号 4,828,979 、 4,948,882 、 5,218,105 、 5,525,465 、 5,541,313 、 5,545,730 、 5,552,538 、 5,578,717 、 5,580,731 、 5,580,731 、 5,591,584 、 5,109,124 、 5,118,802 、 5,138,045 、 5,414,077 、 5,486,603 、 5,512,439 、 5,578,718 、 5,608,046 、 4,587,044 、 4,605,735 、 4,667,025 、 4,762,779 、 4,789,737 、 4,824,941 、 4,835,263 、 4,876,335 、 4,904,582 、 4,958,013 、 5,082,830 、 5,112,963 、 5,214,136 、 5,082,830 、 5,112,963 、 5,214,136 、 5,245,022 、 5,254,469 、 5,258,506 、 5,262,536 、 5,272,250 、 5,292,873 、 5,317,098 、 5,371,241 、 5,391,723 、 5,416,203 、 5,451,463 、 5,510,475 、 5,512,667 、 5,514,785 、 5,565,552 、 5,567 ,810 、 5,574,142 、 5,585,481 、 5,587,371 、 5,595,726 、 5,597,696 、 5,599,923、 5,599,928 和 5,688,941， 通过引用将每一项并入本文。
药物发现 ： 本发明的化合物也可用于药物发现和靶确认的领域。本发明包括在 药物发现努力中使用本文鉴别的化合物和优选靶片段， 进而阐述存在于血管内皮生长因子 (VEGF) 多核苷酸和疾病状态、 显型或症状之间的关系。这些方法包括检测或调节血管内皮 生长因子 (VEGF) 多核苷酸， 包括使样品、 组织、 细胞或生物接触本发明的化合物， 测量血管 内皮生长因子 (VEGF) 多核苷酸的核酸或蛋白水平和 / 或在治疗后某时间的相关表型或化 学终点， 以及任选地将测量的值和未处理样品或用本发明其它化合物处理的样品比较。这 些方法也可以与其它实验平行进行或联合进行， 进而测定未知基因对于靶确认过程的功能 或者测定特定基因产品作为治疗或预防特定疾病、 症状或表型的靶的有效性。
评价基因表达的上调或抑制 ：
将外源核酸转入宿主细胞或生物体可以通过直接检测细胞或生物体中该核酸的 存在来评价。 这种检测可用本领域已知的几种方法实现。 例如， 外源核酸的存在可通过 DNA印迹法 (Southern blot) 或通过聚合酶链式反应 (PCR) 技术 ( 它使用特异性放大和核酸有 关的核苷酸序列的引物 ) 而检测。外源核酸的表达也可以使用包括基因表达分析的常规方 法来测量。例如， 从外源核酸产生的 mRNA 可以使用 DNA 印迹法和反转录 PCR(RT-PCR) 检测 和定量。
从外源核酸表达 RNA 也可以通过测量酶活性或报道蛋白活性来检测。例如， 反义 调节活性可以间接地按照靶核酸表达的减小或增大 ( 它作为外源核酸产生效应子 RNA 的 指示 ) 而测量。基于序列保守性 (conservation)， 引物可被设计和用于放大靶基因的编码 区域。最初， 来自每个基因的最高度表达的编码区可用来建立模型对照基因， 但也可以使 用任何编码或非编码区。每个对照基因通过在报道编码区和其多聚 (A) 信号之间插入每 个编码区而装配。这些质粒将产生在基因的上游部分具有报道基因和在 3′非编码区具有 潜在 RNAi 靶的 mRNA。通过调节报道基因将使单个反义寡核苷酸的有效性得到试验。在本 发明方法中有用的报道基因包括乙酰羟酸合酶 (AHAS)、 碱性磷酸酶 (AP)、 β 半乳糖苷酶 (LacZ)、 β- 葡萄糖透明质酸酶 (GUS)、 氯霉素乙酰转移酶 (CAT)、 绿色荧光蛋白 (GFP)、 红色 荧光蛋白 (RFP)、 黄色荧光蛋白 (YFP)、 青色荧光蛋白 (CFP)、 辣根过氧化物酶 (HRP)、 萤光素 酶 (Luc)、 胭脂氨酸合成酶 (NOS)、 章鱼碱合成酶 (OCS) 和它们的衍生物。可用多种可选标 记， 它们赋予针对氨苄青霉素、 博来霉素、 氯霉素、 庆大霉素、 潮霉素、 卡那霉素、 林可霉素、 氨甲喋呤、 膦丝菌素、 嘌呤霉素和四环素的抗性。 测定报道基因的调节的方法在本领域是公 知的， 且包括但不限于荧光法 ( 例如荧光光谱法、 荧光激活细胞分选术 (FACS)、 荧光显微镜 术 )、 抗生素抗性测定。
试剂盒、 研究试剂、 诊断和治疗
本发明的化合物可以用于诊断、 治疗和预防， 以及作为研究试剂和试剂盒的组件。 另外， 能以精密的特异性抑制基因表达的反义寡核苷酸， 经常被本领域普通技术人员用于 阐释特定基因的功能或用于区分生物路径的各种成员之间的功能。
对于用于试剂盒和诊断以及各种生物系统， 本发明的化合物 ( 单独或联合其它化 合物或治疗 ) 可用作有差别的和 / 或组合的分析中的工具， 以阐释细胞和组织内表达的基 因的一部分或整个互补的表达模式。
本文所用的术语″生物系统″或″系统″定义为表达， 或使之有能力表达血管内 皮生长因子 (VEGF) 基因的产物的任何生物体、 细胞、 细胞培养物或组织。这些包括但不限 于人、 转基因动物、 细胞、 细胞培养物、 组织、 异种移植物、 移植物和它们的组合。
作为一个非限制性的实例， 比较用一种或多种反义化合物处理的细胞或组织和未 用反义化合物处理的对照细胞或组织的表达模式， 并分析产生的模式的不同基因表达水 平， 它们与被检测基因的例如疾病关联、 信号通路、 细胞定位、 表达水平、 大小、 结构或功能 相关。 这些分析可以在经刺激或未经刺激的细胞上和在存在或不存在影响表达模式的其它 化合物时进行。
本领域已知的基因表达分析的方法的实例包括 DNA 阵列或微阵列 (Brazma 和 Vilo， (2000)FEBS Lett.， 480， 17-24 ； Celis 等 (2000)FEBS Lett.， 480， 2-16)、 SAGE( 基因 表达的连续分析 )(Madden 等 (2000)Drug Discov.Today， 5， 415-425)、 READS( 消化的 cDNA 的限制性酶放大 )(Prashar 和 Weissman， (1999)Methods Enzymol.， 303， 258-72)、 TOGA( 全 基因表达分析 )(Sutcliffe 等 (2000)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.， 97， 1976-81)、 蛋白质阵列和蛋白组学 (Celis 等 (2000)FEBS Lett.， 480， 2-16 ； Jungblut 等， Electrophoresis， 1999， 20， 2100-10)、 表达的序列标签 (EST) 测序 (Celis 等， FEBS Lett.， 2000， 480， 2-16 ； Larsson 等， J.Biotechnol.， 2000， 80， 143-57)、 消减式 RNA 指纹法 (SuRF)(Fuchs 等， (2000) Anal.Biochem.286， 91-98 ； Larson 等， (2000)Cytometry 41， 203-208)、 消减式克隆、 差异 展示 (DD)(Jurecic 和 Belmont， (2000)Curr.Opin.Microbiol.3， 316-21)、 比较基因组杂 交 (Carulli 等， (1998)J.Cell Biochem.Suppl.， 31， 286-96)、 FISH( 荧 光 原 位 杂 交 ) 技 术 (Going 和 Gusterson， (1999)Eur.J.Cancer， 35， 1895-904) 和质谱法 (To， Comb.(2000) Chem.High Throughput Screen， 3， 235-41)。
本发明的化合物可用于研究和诊断， 因为这些化合物杂交至编码血管内皮生长因 子 (VEGF) 的核酸。例如， 寡核苷酸 ( 它们在本文公开的使它们成为有效的血管内皮生长因 子 (VEGF) 调节剂的效率和条件下杂交 ) 在有利于基因放大或检测的条件下分别是有效的 引物或探针。这些引物和探针可用于需要核酸分子 ( 它们编码血管内皮生长因子 (VEGF)) 的特异性检测的方法中， 和用于所述核酸分子的放大 ( 用于检测或用于进一步研究血管内 皮生长因子 (VEGF)) 中。本发明的反义寡核苷酸 ( 特别是引物和探针 ) 和编码血管内皮生 长因子 (VEGF) 的核酸的杂交可通过本领域已知的方法检测。这样的方法可以包括将酶缀 合到寡核苷酸、 放射标记寡核苷酸或任何其它适合的检测方法。也可以制备将这样的检测 方法用于检测样品中的血管内皮生长因子 (VEGF) 水平的试剂盒。
为了治疗用途， 本领域技术人员也利用反义的特异性和灵敏性。已将反义化合物 用作治疗动物 ( 包括人 ) 的疾病状态的治疗部分。反义寡核苷酸药物已经安全和有效地给 予人， 目前也在进行许多临床试验。 因此已确定寡核苷酸可以是有用的治疗手段， 所述治疗 手段可经设置用于治疗细胞、 组织和动物 ( 尤其是人 ) 的治疗方案。
对于治疗， 通过给予根据本发明的反义化合物来治疗疑似具有疾病或病症 ( 其可 通过调节血管内皮生长因子 (VEGF) 多核苷酸的表达来治疗 ) 的动物 ( 优选为人 )。例如， 在一个非限制性实施方案中， 方法包括将治疗有效量的血管内皮生长因子 (VEGF) 调节剂 给予需要治疗的动物的步骤。本发明的血管内皮生长因子 (VEGF) 调节剂有效地调节血管 内皮生长因子 (VEGF) 的活性或调节血管内皮生长因子 (VEGF) 蛋白的表达。在一个实施方 案中， 相对于对照， 动物中血管内皮生长因子 (VEGF) 的活性或表达被抑制大约 10％。优选 动物中血管内皮生长因子 (VEGF) 的活性或表达被抑制大约 30％。更优选动物中血管内皮 生长因子 (VEGF) 的活性或表达被抑制 50％或更多。因此， 相对于对照， 寡聚化合物调节血 管内皮生长因子 (VEGF)mRNA 的表达至少 10％、 至少 50％、 至少 25％、 至少 30％、 至少 40％、 至少 50％、 至少 60％、 至少 70％、 至少 75％、 至少 80％、 至少 85％、 至少 90％、 至少 95％、 至 少 98％、 至少 99％或 100％。
在一个实施方案中， 相对于对照， 动物中血管内皮生长因子 (VEGF) 的活性或表达 增大了大约 10％。优选动物中血管内皮生长因子 (VEGF) 的活性或表达增大了大约 30％。 更优选动物中血管内皮生长因子 (VEGF) 的活性或表达增大了大约 50％或更多。因此， 相 对于对照， 寡聚化合物调节血管内皮生长因子 (VEGF)mRNA 的表达至少 10％、 至少 50％、 至 少 25％、 至少 30％、 至少 40％、 至少 50％、 至少 60％、 至少 70％、 至少 75％、 至少 80％、 至少 85％、 至少 90％、 至少 95％、 至少 98％、 至少 99％或 100％。
例如， 血管内皮生长因子 (VEGF) 的表述的减少可以在血清、 血液、 脂肪组织、 肝脏或动物的任何其它体液、 组织或器官中测量。 优选被分析的所述液体、 组织或器官中所含的 细胞含有编码血管内皮生长因子 (VEGF) 肽和 / 或血管内皮生长因子 (VEGF) 蛋白自身的核 酸分子。
通过添加有效量的化合物到适合的药学可接受的稀释剂或载体中， 本发明的化合 物可用于药学组合物。本发明的化合物和方法的用途也可用于预防。
缀合物
本发明寡核苷酸的另一种修饰包括将一个或多个部分或缀合物 ( 它们提高寡核 苷酸的活性、 细胞分布或细胞摄取 ) 化学连接到寡核苷酸。这些部分或缀合物可以包括共 价连接到官能团 ( 例如初级或次级羟基 ) 的缀合基团。本发明的缀合基团包括插入基团、 报道分子、 多胺、 聚酰胺、 聚乙二醇、 聚醚、 提高寡聚体药效性质的基团和提高寡聚体药物动 力学性质的基团。典型的缀合基团包括胆固醇、 脂质、 磷脂、 生物素、 吩嗪、 叶酸酯、 菲啶、 蒽 醌、 吖啶、 荧光素、 罗丹明、 香豆素和染料。在本发明的上下文中， 提高药效学性质的基团包 括改进摄取、 提高降解抗性和 / 或增强和靶核酸的序列特异性杂交的基团。在本发明的上 下文中， 提高药物动力学性质的基团包括改进本发明化合物的摄取、 分布、 代谢或排泄的基 团。代表性的缀合基团公开于 1992 年 10 月 23 号提出的国际专利申请号 PCT/US92/09196， 和美国专利号 6,287,860， 通过引用将它们并入本文。 缀合物部分包括但不限于脂质部分例 如胆固醇部分、 胆酸、 硫醚， 例如己基 -5- 三苯甲基硫醇、 硫代胆固醇、 脂肪族链， 例如十二 烷二醇或十一烷基残基、 磷脂， 例如二 - 十六烷基 -rac- 甘油或三乙基铵 1， 2- 二 -O- 十六 烷基 -rac- 甘油基 -3-H 膦酸酯、 多胺或聚乙二醇链、 或金刚烷乙酸、 棕榈基部分、 或十八烷 基胺或己基氨基 - 羰基 - 羟胆固醇部分。本发明的寡核苷酸也可以缀合到活性药物物质， 例如阿司匹林、 华法林、 保泰松、 布洛芬、 舒洛芬、 芬布芬、 酮洛芬、 (S)-(+)- 普拉洛芬、 卡洛 芬、 丹磺酰肌氨酸、 2， 3， 5- 三碘苯甲酸、 氟芬那酸、 亚叶酸、 苯并噻二嗪、 氯噻嗪、 二氮杂卓 (diazepine)、 吲哚美辛、 巴比妥酸盐、 头孢菌素、 磺胺药、 抗糖尿病药、 抗菌药或抗生素。
教导制备这些寡核苷酸缀合物的代表性的美国专利包括但不限于美国专利 号： 4,828,979 、 4,948,882、 5,218,105 、 5,525,465 、 5,541,313 、 5,545,730 、 5,552,538、 5,578,717 、 5,580,731 、 5,580,731 、 5,591,584 、 5,109,124 、 5,118,802 、 5,138,045 、 5,414,077 、 5,486,603 、 5,512,439 、 5,578,718 、 5,608,046 、 4,587,044 、 4,605,735 、 4,667,025 、 4,762,779 、 4,789,737 、 4,824,941 、 4,835,263 、 4,876,335 、 4,904,582 、 4,958,013 、 5,082,830 、 5,112,963 、 5,214,136 、 5,082,830 、 5,112,963 、 5,214,136 、 5,245,022 、 5,254,469 、 5,258,506 、 5,262,536 、 5,272,250 、 5,292,873 、 5,317,098 、 5,371,241 、 5,391,723 、 5,416,203 、 5,451,463 、 5,510,475 、 5,512,667 、 5,514,785 、 5,565,552 、 5,567,810 、 5,574,142 、 5,585,481 、 5,587,371 、 5,595,726 、 5,597,696 、 5,599,923、 5,599,928 和 5,688,941。
制剂
本发明的化合物也可以和其它分子、 分子结构或化合物的混合物混合、 制成胶囊、 缀合或关联， 成为例如脂质体、 靶向受体的分子、 口服、 直肠、 局部或其它制剂， 以协助摄取、 分布和 / 或吸收。 教导制备这种协助摄取、 分布和 / 或吸收的制剂的代表性美国专利包括但 不限于美国专利号 5,108,921、 5,354,844、 5,416,016、 5,459,127、 5,521,291、 5,543,165、 5,547,932 、 5,583,020 、 5,591,721 、 4,426,330 、 4,534,899 、 5,013,556 、 5,108,921 、5,213,804 、 5,227,170 、 5,264,221 、 5,356,633 、 5,395,619 、 5,416,016 、 5,417,978 、 5,462,854 、 5,469,854 、 5,512,295 、 5,527,528 、 5,534,259 、 5,543,152 、 5,556,948 、 5,580,575 和 5,595,756， 通过引用将每一项并入本文。
虽然， 为了调节靶表达和 / 或功能， 反义寡核苷酸不需要在载体的环境中给药， 但 本发明的实施方案涉及用于反义寡核苷酸的表达的表达载体构建体， 包含启动子、 杂交启 动子基因序列并具有强组成启动子活性， 或在期望的情形下能被诱导的启动子活性。
在一个实施方案中， 发明实施包括用合适的核酸递送系统给予前述反义寡核苷酸 的至少一种。在一个实施方案中， 该系统包含可操作地连接到多核苷酸的非病毒载体。这 样的非病毒载体的实例包括只有寡核苷酸 ( 例如 SEQ ID NO ： 4-9 中的任一种或多种 ) 或者 寡核苷酸联合合适的蛋白、 多糖或脂质制剂。
另外合适的核酸递送系统包括病毒载体， 通常是来自腺病毒、 腺病毒相关的病毒 (AAV)、 依赖辅助的腺病毒 (helper-dependent adenovirus)、 逆转录病毒或日本脂质体的 血细胞凝集素病毒 (hemagglutinatin virus)(HVJ) 复合物的至少一种的序列。优选病毒 载体包含可操作地连接到多核苷酸的强真核启动子， 例如巨细胞病毒 (CMV) 启动子。
另外优选的载体包括病毒载体、 融合蛋白和化学缀合物。逆转录病毒载体包括莫 洛尼鼠白血病病毒和基于 HIV 的病毒。一个优选的基于 HIV 的病毒载体包含至少两个载 体， 其中 gag 和 pol 基因来自 HIV 基因组， env 基因来自另一个病毒。优选 DNA 病毒载体。 这些载体包括诸如正痘 (orthopox) 或禽痘 (avipox) 载体的痘载体、 诸如单纯疱疹 I 病毒 (HSV) 载体的疱疹病毒载体 [Geller， A.I. 等 (1995)J.Neurochem， 64 ： 487 ； Lim， F. 等， 于 DNA Cloning ： Mammalian Systems， D.Glover， Ed.(Oxford Univ.Press， Oxford England) (1995) ； Geller， A.I. 等 (1993)Proc Natl.Acad.Sci. ： U.S.A. ： 90 7603 ； Geller， A.I. 等 (1990)Proc Natl.Acad.Sci USA ： 87 ： 1149]、 腺病毒载体 (LeGal LaSalle 等， Science， 259 ： 988(1993) ； Davidson 等， (1993)Nat.Genet.3 ： 219 ； Yang 等 (1995)J.Virol.69 ： 2004) 和腺 关联病毒载体 (Kaplitt， M.G. 等 (1994)Nat.Genet.8 ： 148)。
本发明的反义化合物包括任何药学可接受的盐、 酯、 或这样的酯的盐、 或任何其它 化合物， 其在给予包括人的动物时能 ( 直接或间接 ) 提供生物活性代谢物或其剩余物。
术语″药学可接受的盐″指本发明化合物的生理和药学可接受的盐， 即保留母体 化合物的期望的生物活性， 且不使其具有不期望的毒性效果的盐。 对于寡核苷酸， 优选的药 学可接受的盐的实例和它们的用途进一步描述于美国专利号 6,287,860， 通过引用将其并 入本文。
本发明也包括包含本发明的反义化合物的药学组合物和制剂。 本发明的药学组合 物可根据期望的是局部还是全身治疗以及待治疗的部位而用多种方式给药。 给药可以是局 部给药 ( 包括眼部给药和向粘膜给药 ( 包括阴道和直肠递送 ))、 肺部给药 ( 例如通过吸入 或吹入粉末或气雾剂 ( 包括通过喷雾器 )、 气管内、 鼻内、 表皮和经皮给药 )、 口服或胃肠外 给药。胃肠外给药包括静脉内、 动脉内、 皮下、 腹膜内或肌内注射或注入、 或颅内 ( 例如鞘膜 内或心室内 ) 给药。据信具有至少一个 2′ -O- 甲氧基乙基修饰的寡核苷酸对于口服给药 特别有用。用于局部给药的药学组合物和制剂可以包括经皮贴剂、 药膏、 洗剂、 乳剂、 凝胶 剂、 滴剂、 栓剂、 喷雾剂、 液体和粉末。常规药学载体、 水性、 粉末或油性基底、 增稠剂等可以 是必需或期望的。经涂布的避孕套、 手套等也可以是有用的。本发明的药学制剂 ( 其可以便利地以单元剂量形式存在 ) 可根据药学工业公知的 常规技术制备。这样的技术包括使活性成分和药学载体或赋形剂关联的步骤。一般而言， 制剂通过使活性成分和液体载体或精细分开的固体载体或这两者均匀地和密切地相关联， 然后在必要时使产物成型， 而制备。
本发明的组合物可以配制成任意的许多可能剂型， 例如但不限于片剂、 胶囊、 凝胶 胶囊、 液体糖浆剂、 软凝胶、 栓剂和灌肠剂。 本发明的组合物也可以配制成水性、 非水性或混 合介质中的悬浮液。水性悬浮液可以进一步包含增大悬浮液粘度的物质， 例如羧甲基纤维 素钠、 山梨糖醇和 / 或葡聚糖。悬浮液也可以包含稳定剂。
本发明的药学组合物包括但不限于溶液、 乳剂、 泡沫和含脂质体的制剂。 本发明的 药学组合物和制剂可以包含一种或多种渗透促进剂、 载体、 赋形剂或其它活性或非活性成 分。
乳剂通常是一种液体以直径通常超过 0.1μm 的液滴的形式分散于另一种的非均 相体系。除了分散的相和活性药物 ( 其可以作为水相或油相中的溶液存在或者自身作为单 独的相存在 )， 乳剂可以包含另外的组分。 本发明的实施方案包括微乳剂。 乳剂及其用途在 本领域是公知的， 并进一步描述于美国专利号 6,287,860。
本发明的制剂包括脂质体制剂。 本文所用的术语″脂质体″意指由排列成球形双 层的两亲的脂质组成的囊泡。脂质体是单层或多层囊泡， 其具有由亲脂材料形成的膜和包 含待递送组合物的水性内部。阳离子脂质体是带正电的脂质体， 据信它们与带负电的 DNA 分子互相作用形成稳定的复合体。据信对 pH 敏感或带负电的脂质体捕获 DNA 而不是与它 复合。阳离子和非阳离子脂质体都已被用于向细胞递送 DNA。
脂质体也包括″立体稳定的″脂质体， 本文所用的该术语指包含一种或多种专门 脂质的脂质体。当并入脂质体时， 这些专门脂质得到相对于没有这些专门脂质的脂质体具 有提高的循环寿命的脂质体。立体稳定的脂质体的实例是以下那些， 其中脂质体中形成囊 泡的脂质部分的一部分包含一种或多种糖脂， 或者衍生自一种或多种亲水聚合物， 例如聚 乙二醇 (PEG) 部分。脂质体和它们的用途进一步描述于美国专利号 6,287,860。
本发明的药学制剂和组合物也可以包括表面活性剂。表面活性剂在药品、 制剂 和乳剂中的用途是本领域公知的。表面活性剂和它们的用途进一步描述于美国专利号 6,287,860， 通过引用将其并入本文。
在一个实施方案中， 本发明采用多种渗透促进剂进行核酸 ( 特别是寡核苷酸 ) 的 有效递送。 除了帮助非亲脂性药物扩散穿过细胞膜， 渗透促进剂也提高亲脂药物的渗透性。 渗透促进剂可以分类成属于五个宽泛的类型 ( 即表面活性剂、 脂肪酸、 胆汁盐、 螯合剂和非 螯合非表面活性剂 ) 之一。 渗透促进剂和它们的用途进一步描述于美国专利号 6,287,860， 通过引用将其并入本文。
本领域技术人员将认识到制剂通常根据它们的预期用途， 即给药途径而设计。
优选的用于局部给药的制剂包括那些本发明的寡核苷酸与局部递送剂 ( 例如脂 质、 脂质体、 脂肪酸、 脂肪酸酯、 类固醇、 螯合剂和表面活性剂 ) 混合的制剂。优选的脂质 和脂质体包括中性 ( 例如二油酰基 - 磷脂酰基 DOPE 乙醇胺、 二肉豆蔻酰基磷脂酰基胆碱 DMPC、 二硬脂酰基磷脂酰基胆碱 )、 阴性 ( 例如二肉豆蔻酰基磷脂酰基甘油 DMPG) 和阳离子 性 ( 例如二油酰基四甲基氨基丙基 DOTAP 和二油酰基 - 磷脂酰基乙醇胺 DOTMA)。对于局部或其它给药， 本发明寡核苷酸可被脂质体包裹在内或可与之形成复合 物， 特别是和阳离子性脂质体。 或者， 寡核苷酸可以和脂质复合， 特别是和阳离子性脂质。 优 选的脂肪酸和酯， 它们的药学可接受盐和它们的用途进一步描述于美国专利号 6,287,860。
用于口服给药的组合物和制剂包括粉末或粒料、 微颗粒、 纳颗粒、 在水或非水性介 质中的悬浮液或溶液、 胶囊、 凝胶胶囊、 囊剂、 片剂或小片剂。 可以期望增稠剂、 调味剂、 稀释 剂、 乳化剂、 分散助剂或粘合剂。 优选的口服制剂是那些其中本发明的寡核苷酸与一种或多 种渗透促进剂表面活性和螯合剂联合给药的制剂。优选的表面活性剂包括脂肪酸和 / 或其 酯或其盐、 胆酸和 / 或其盐。优选的胆酸 / 盐和脂肪酸以及它们的用途进一步描述于美国 专利号 6,287,860， 通过引用将其并入本文。还优选渗透促进剂的组合物， 例如脂肪酸 / 盐 联合胆酸 / 盐。特别优选的组合物是月桂酸的钠盐、 癸酸和 UDCA。其它渗透促进剂包括聚 氧乙烯 -9- 月桂基醚、 聚氧乙烯 -20- 鲸蜡基醚。本发明的寡核苷酸可以粒料形式 ( 包括喷 雾的干燥颗粒或复合形成微颗粒或纳颗粒 ) 口服递送。寡核苷酸复合剂和它们的用途进一 步描述于美国专利号 6,287,860， 通过引用将其并入本文。
用于肠道外、 鞘膜内或心室内给药的组合物和制剂可以包括无菌水溶液， 该无菌 水溶液也可以包含缓冲剂、 稀释剂和其它合适添加剂例如但不限于渗透促进剂、 载体化合 物和其它药学可接受的载体或赋形剂。
本发明的某些实施方案提供包含通过一种或多种寡聚化合物和一种或多种通 过非反义机制起作用的其它化学治疗剂的药学组合物。这些化学治疗剂的实例包括 但不限于癌症化学治疗药物例如柔红霉素、 道诺霉素、 更生霉素、 阿霉素、 表柔比星、 伊 达比星、 依索比星、 博来霉素、 马磷酰胺、 异环磷酰胺、 阿糖胞苷、 二氯乙基 - 亚硝基脲 (bischloroethyl-nitrosurea)、 白消安、 丝裂霉素 C、 放线菌素 D、 普卡霉素、 泼尼松、 羟孕 酮、 睾丸酮、 他莫昔芬、 氮烯唑胺、 甲基苄肼、 六甲蜜胺、 五甲蜜胺、 米托蒽醌、 安吖啶、 苯丁 酸氮芥、 甲基环己基亚硝基脲 (methylcyclohexylnitrosurea)、 氮芥、 美法仑、 环磷酰胺、 6- 巯基嘌呤、 6- 硫代鸟嘌呤、 阿糖胞苷、 5- 氮杂胞苷、 羟基脲、 脱氧柯福霉素、 4- 羟基过氧环 磷酰胺、 5- 氟尿嘧啶 (5-FU)、 5- 氟脱氧尿嘧啶 (5-FUdR)、 甲氨蝶呤 (MTX)、 秋水仙碱、 泰素、 长春新碱、 长春碱、 依托泊苷 (VP-16)、 三甲曲沙、 伊立替康、 托泊替康、 吉西他滨、 替尼泊苷、 顺铂和己烯雌酚 (DES)。当与本发明的化合物联用时， 这些化学治疗剂可单独使用 ( 例如 5-FU 和寡核苷酸 )、 依序使用 ( 例如 5-FU 和寡核苷酸用一段时间， 接着用 MTX 和寡核苷酸 ) 或与一种或多种其它这样的化学治疗剂联用 ( 例如 5-FU、 MTX 和寡核苷酸， 或 5-FU、 放射治 疗和寡核苷酸 )。消炎药 ( 包括但不限于非类固醇消炎药和皮质激素 ) 和抗病毒药物 ( 包 括但不限于利巴韦林 (ribivirin)、 阿糖腺苷、 阿昔洛韦和更昔洛韦 ) 也可以结合到本发明 的组合物。反义化合物和其它非反义药物的组合也落在本发明的范围内。两种或更多种相 结合的化合物可以一起使用或依序使用。
在另一个相关的实施方案中， 本发明的组合物可以包含一种或多种靶向第一核酸 的反义化合物 ( 特别是寡核苷酸 ) 和一种或多种靶向第二核酸靶的另外的反义化合物。 例如第一个靶可以是血管内皮生长因子 (VEGF) 的特定反义序列， 且第二个靶可以是来自 另一个核苷酸序列的区域。或者， 本发明的组合物可以包含靶向相同血管内皮生长因子 (VEGF) 核酸靶的不同区域的两种或更多种反义化合物。本文说明了反义化合物的许多实 例， 其它可选自本领域已知的适合的化合物。两种或更多种相结合的化合物可以一起使用或依序使用。
给药 ：
治疗组合物的配方和它们的后续服药 ( 给药 ) 相信是在本领域技术人员的技能之 内。 给药取决于待治疗疾病状态的严重性和反应， 治疗过程可持续几天到几月， 或直到治愈 或实现疾病状态的减轻。最佳给药方案可从患者体内药物累积的测量来计算。普通技术人 员能容易地确定最佳剂量、 给药方法和重复率。最佳剂量可以根据个别寡核苷酸的相对功 效而变化， 且一般可以根据在体外和体内动物模型中发现有效的 EC50 来估算。总体而言， 剂量是从 0.01μg 到 100g 每千克体重， 可以每天、 每周、 每月或每年给药一次或多次， 甚至 每 2 到 20 年给药一次。本领域普通技术人员能根据在体液或组织中测量的药物的停留时 间和浓度容易地估算给药重复率。成功治疗后， 可期望让患者经历持续治疗以防止疾病状 态的复发， 其中寡核苷酸以持续剂量给药， 剂量范围从 0.01μg 到 100g 每千克体重， 每天一 次或多次到每 20 年一次。
尽管上面已经描述了本发明的多个实施方案， 应当理解的是它们仅以实施例的方 式展示， 而非限制。根据本文的公开， 不脱离本发明的精神或范围， 可对公开的实施方案进 行许多改变。因此， 本发明的宽度和范围不应该被任何上述实施方案限制。
本文提到的所有文献都通过引用并入本文。 本申请中引用的所有出版物和专利文 献都出于所有目的通过引用并入本文， 引用的程度和仿佛每篇单独的出版物或专利文献被 单独这样指出一样。通过在本文中引用多种参考文献， 申请人并不承认任何特定参考文献 是他们的发明的 “现有技术” 。本发明的组合物和方法的实施方案在下列实施例中加以说 明。 实施例 以下非限制性实施例用于说明本发明经选择的实施方案。 应理解的是显示的比例 的变化和组分元素的选择对本领域技术人员来说是显而易见的， 且在本发明实施方案的范 围内。
实施例 1 ： 设计对血管内皮生长因子 (VEGF) 多核苷酸的核酸分子反义和或有义链 特异的反义寡核苷酸
如上指明的， 术语″对…特异的寡核苷酸″或″靶向…的寡核苷酸″指具有如下 序列的寡核苷酸， 所述序列 ： (i) 能与靶向的基因的一部分形成稳定的复合体， 或 (ii) 能与 靶向的基因的 mRNA 转录子的一部分形成稳定的双链体。
通过使用自动排列核酸序列和标明同一性或同源性区域的计算机程序， 适合的寡 核苷酸的选择得以促进。这种程序用于比较通过例如搜索数据库 ( 例如 GenBank) 或通过 测序 PCR 产品而获得的核酸序列。比较来自一系列物种的核酸序列允许选择在物种之间展 示出合适同一性程度的核酸序列。在没有被测序的基因的例子中， 进行 DNA 印迹法以测定 目标物种和其它物种的基因之间的同一性程度。本领域公知， 通过在不同的严格程度进行 DNA 印迹法， 可能获得同一性的近似度量。这些程序可以选择寡核苷酸， 所述寡核苷酸展示 出与待控制对象中的靶核酸序列的高互补度， 和与其它物种中的相应核酸序列的较低互补 度。本领域的技术人员将会意识到选择用于本发明的基因的合适区域有相当大的范围。
当反义化合物与靶核酸的结合干扰靶核酸的正常功能而引起功能和 / 或活性的
调节， 且在期望有特异性结合的条件下 ( 即体内试验或治疗处理情况中的生理条件下， 和 在体外试验情况中进行试验的条件下 ) 有足够的互补度以避免反义化合物和非靶核酸序 列的非特异性结合时， 所述反义化合物是″能特异性杂交的″。
本文描述的寡核苷酸的杂交性质可以通过本领域已知的一种或多种体外试验测 定。例如， 本文描述的寡核苷酸的性质可以通过使用熔化曲线试验测定靶天然反义和潜在 药物分子之间的结合强度而获得。
靶天然反义和潜在药物分子 ( 分子 ) 之间的结合强度可以使用任何已经建立的测 量分子内相互作用强度的方法 ( 例如熔化曲线试验 ) 来估算。
熔化曲线试验测定天然反义 / 分子复合体出现从双链到单链构象快速转化时的 温度。该温度被广泛接受为两个分子之间的相互作用强度的可靠度量。
熔化曲线试验能使用和分子的结合位点相应的实际天然反义 RNA 分子或合成 DNA 或 RNA 核苷酸的 cDNA 拷贝进行。 已有多种包含进行该试验的所有必需试剂的试剂盒 ( 例如 Applied Biosystems Inc.MeltDoctor 试剂盒 )。这些试剂盒包括合适的缓冲溶液， 所述缓 冲溶液含有双链 DNA(dsDNA) 结合染料 ( 例如 ABI HRM 染料， SYBR Green， SYTO 等 ) 之一。 dsDNA 染料的性质是它们在自由形式时几乎不发射荧光， 而当结合 dsDNA 时是高荧光性的。
为了进行试验， 以特定制造商的操作步骤规定的浓度将 cDNA 或相应的寡核苷酸 和分子混合。将混合物加热到 95℃以解离所有预先形成的 dsDNA 复合体， 然后缓慢冷却到 室温或试剂盒制造商规定的其它较低温度以使 DNA 分子退火。然后将新形成的复合体缓慢 加热到 95℃， 同时连续收集由反应产生的荧光量数据。荧光强度与反应中存在的 dsDNA 的 量成反比。数据可用与试剂盒兼容的实时 PCR 仪器 ( 例如 ABI 的 StepOne Plus Real Time PCR System 或 LightTyper 仪器， Roche Diagnostics， Lewes， UK) 收集。
用适当的软件 ( 例如 LightTyper(Roche) 或 SDS Dissociation Curve， ABI) 通过 将荧光对温度的负导数 (-d( 荧光 )/dT)， 在 y 轴 ) 相对于温度 (x- 轴 ) 作图而构建熔化峰。 分析数据， 鉴别从 dsDNA 复合体到单链分子快速转变的温度。 该温度称为 Tm， 且与两个分子 之间的相互作用强度成正比。通常 Tm 将超过 40℃。
实施例 2 ： 调节 VEGF 多核苷酸
来 自 ATCC 的 HepG2 细 胞 (cat# HB-8065) 在 37 ℃ 和 5 ％ CO2 下 生 长 于 生 长 培 养 基 (MEM/EBSS(Hyclone cat #SH30024，或 Mediatech cat # MT-10-010-CV)+10 ％ FBS(Mediatech cat# MT35-011-CV)+ 青霉素 / 链霉素 (Mediatech cat# MT30-002-CI))。 实验的前一天， 以 1.5×105/ml 的密度将细胞移植于 6 孔板中， 并于 37℃和 5％ CO2 下培养。 实验当天将 6 孔板中的培养基换成新鲜生长培养基。将所有的反义寡核苷酸稀释到 20μM 的浓度。将 2μl 的该溶液与 400μl 的 Opti-MEM 培养基 (Gibco cat#31985-070) 和 4μl 的 Lipofectamine 2000(Invitrogen cat# 11668019) 在室温下培养 20 分钟， 施用于有 HepG2 细胞的 6 孔板的每个孔。 包含 2μl 的水而不是寡核苷酸溶液的类似混合物用于模拟 转染对照。在 37℃和 5％ CO2 下培养 3-18 小时后， 将培养基换成新鲜生长培养基。加入反 义寡核苷酸 48 小时后， 去掉培养基， 根据制造商的说明书， 使用来自 Promega 的 SV Total RNA Isolation System(cat# Z3105) 或来自 Qiagen 的 RNeasy Total RNA Isolation 试 剂盒 (cat# 74181) 从细胞中提取 RNA。将 600ng 的 RNA 加入反转录反应中， 所述反转录反 应使用来自 Thermo Scientific 的 Verso cDNA 试剂盒 (cat# AB1453B) 或 High CapacitycDNA Reverse Transcription Kit(cat# 4368813) 按制造商的操作步骤的描述而进行。 使 用 ABI Taqman Gene Expression Mix(cat#4369510) 和 ABI 设计的引物 / 探针 (Applied Biosystems Taqman Gene Expression Assay ： Hs00173626_m1， Applied Biosystems Inc.， Foster City CA)， 通过实时 PCR 将来自该反转录反应的 cDNA 用于监测基因表达。 使用下列 PCR 循环 ： 50℃ 2 分钟， 95℃ 10 分钟， 40 个循环的 (95℃ 15 秒， 60℃ 1 分钟 )， 使用 StepOne Plus Real Time PCR Machine(Applied Biosystems)。
根据经处理和经模拟转染的样品之间的 18S 标准化的 dCt 值差异， 计算用反义寡 核苷酸处理后的基因表达的倍数变化。
用于针对 VEGF 天然反义 VEGFA(SEQ ID NO ： 10)( 图 6) 的用户定制设计的 Taqman 试验的引物和探针
靶序列 VEGFA 外显子 1 ： ATGCCAAGTGGTCCCAGGCTGCACC(SEQ ID NO ： 10)
正向引物序列
Vegfas1 ANYf ： GTAGCCTGTCCCCTTCAAGAG(SEQ ID NO ： 11)
Vegfas2 ANYf ： GCGGATAGCCTGGGAGCTA(SEQ ID NO ： 12)
反向引物序列 Vegfas1 ANYR ： CAGACATCCTGAGGTGTGTTCT(SEQ ID NO ： 13)
Vegfas2 ANYR ： TGTTCGGTTGCTGTGACTGT(SEQ ID NO ： 14)
报道染料 (Reporter Dye) ： FAM
Vegfas1 ANYM1 ： ATGCCTGCCAAGCCCA(SEQ ID NO ： 15)
Vegfas2 ANYM1 ： CAGCCAGCCCTCTGC(SEQ ID NO ： 16)
结果 ：
VEGFAas RNA 下调
实时 PCR 结果显示， 用针对 vegfaas 设计的 siRNA 中的一条 (vefaas1_2， P ＝ 0.05) 和可能地用第二条 vefaas1_3(P ＝ 0.1， 图 1A) 处理后 48 小时， HepG2 细胞中的 VEGFA mRNA 的水平显著升高。在相同的样品中， 用 vefaas1_2 或 vefaas1_3 处理后， vegfaas RNA 的水 平显著降低， 但是用 vefaas1_5 处理后保持不变， vefaas1_5 也对 VEGFA mRNA 水平没有影 响 ( 图 1B)。
VEGRas RNA 下调
实时 PCR 结果显示， 用针对 vegRas 设计的 siRNA 中的两条 (vegRas1_2， P ＝ 0.02 和 vegRas1_3， P ＝ 0.06， 图 1C) 处理后 48 小时， HepG2 细胞中的 VEGFA mRNA 的水平显著升 高。vegRas RNA 水平变化的结果待定。
虽然针对一个或多个实施例对本发明进行了说明和描述， 在阅读和理解本说明书 和附图后， 本领域其他技术人员会想到等价变化和修改。 另外， 虽然本发明的特定特征可能 只用几个实施例中的一个进行了公开， 当可能被期望时和对任何给定或特定应用有利时， 这样的特征可以和其它实施例的一个或多个其它特征结合。
本公开的摘要将使读者快速确定技术公开的本质。 应当理解的是不能将它用于解 释或限制权利要求的范围或含义。
本申请要求 2008 年 12 月 4 日提出的美国临时申请 61/119,957 的优先权， 通过引 用将该申请整体并入本文。
【发明领域】
本发明的实施方案包括调节 VEGF 和相关分子的表达和 / 或功能的寡核苷酸。
背景
DNA-RNA 和 RNA-RNA 杂交对核酸功能的许多方面 ( 包括 DNA 复制、 转录和翻译 ) 是重要的。杂交对于检测特定核酸或改变其表达的多种技术也很重要。例如， 反义核苷酸 通过和靶 RNA 杂交从而干扰 RNA 剪接、 转录、 翻译和复制而破坏基因表达。反义 DNA 还具有 DNA-RNA 杂交体作为核糖核酸酶 H 消化 ( 大多数细胞类型中存在的活动 ) 的底物的额外特 征。 反义分子可以被送入细胞 ( 如在寡脱氧核苷酸 (ODN) 的例子中 )， 或者它们可由内源基 TM 因表达为 RNA 分子。FDA 最近批准了一种反义药—— VITRAVENE ( 用于治疗巨细胞病毒视 网膜炎 )， 这反映反义有治疗实用性。
概述
本概述用于介绍本发明的概况， 以简要指明本发明的实质和内容。它随着下列理 解而提出， 即不能将它用于解释或限制权利要求的范围或含义。
在一个实施方案中， 本发明提供通过使用反义寡核苷酸抑制天然反义转录子作用 的方法， 所述反义寡核苷酸靶向天然反义转录子的任何区域， 导致相应有义基因的上调。 本 文还预期天然反义转录子的抑制可以通过 siRNA、 核酶和小分子来实现， 这些也被认为在本 发明的范围内。
一个实施方案提供在体内或体外调节患者细胞或组织里的 VEGF 多核苷酸的功能 和 / 或表达的方法， 其包括使所述细胞或组织与 5-30 个核苷酸长度的反义寡核苷酸接触， 从而在体内或体外调节患者细胞或组织中的 VEGF 多核苷酸的功能和 / 或表达， 其中所述寡 核苷酸与包含 SEQ ID NO ： 2 的核苷酸 1-643 或 SEQ ID NO ： 3 的核苷酸 1-513( 图 3) 内的 5-30 个连续核苷酸的多核苷酸的反向互补具有至少 50％序列同一性。
在另一个优选的实施方案中， 寡核苷酸靶向 VEGF 多核苷酸的天然反义序列 ( 例如 SEQ ID NO ： 2 和 3 中展示的核苷酸 )， 及其任何变体、 等位基因、 同系物、 突变体、 衍生物、 片 段和互补序列。反义寡核苷酸的实例如 SEQ ID NO ： 4-9( 图 4) 所展示。
另一个实施方案提供在体内或体外调节患者细胞或组织中的 VEGF 多核苷酸的功 能和 / 或表达的方法， 所述方法包括 ： 使所述细胞或组织与 5-30 个核苷酸长度的反义寡核 苷酸接触， 从而在体内或体外调节患者细胞或组织中的 VEGF 多核苷酸的功能和 / 或表达， 其中所述寡核苷酸与 VEGF 多核苷酸的反义的反向互补具有至少 50％序列同一性。
另一个实施方案提供在体内或体外调节患者细胞或组织中的 VEGF 多核苷酸的功 能和 / 或表达的方法， 所述方法包括 ： 使所述细胞或组织与 5-30 个核苷酸长度的反义寡核苷酸接触， 从而在体内或体外调节患者细胞或组织中的 VEGF 多核苷酸的功能和 / 或表达， 其中所述寡核苷酸与 VEGF 反义多核苷酸的反义寡核苷酸具有至少 50％序列同一性。
在一个优选的实施方案中， 组合物包含与有义和 / 或反义 VEGF 多核苷酸结合的一 种或多种反义寡核苷酸。
在另一个优选的实施方案中， 寡核苷酸包含一个或多个修饰的或取代的核苷酸。
在另一个优选的实施方案中， 寡核苷酸包含一个或多个修饰的键。
在另一个实施方案中， 修饰的核苷酸包含修饰的碱基， 其包含硫代磷酸酯、 甲基膦 酸酯、 肽核酸、 2’ -O- 甲基、 氟代或碳、 亚甲基或其它锁定核酸 (LNA) 分子。优选修饰的核苷 酸是锁定核酸分子， 包括 α-L-LNA。
在另一个优选的实施方案中， 寡核苷酸通过皮下、 肌内、 静脉内或腹膜内给予患 者。
在另一个优选的实施方案中， 寡核苷酸以药物组合物给药。治疗方案包括给予患 者至少一次反义化合物 ； 但是， 该治疗可改为在一段时间内包括多次给药。 该治疗可以结合 其它一种或多种类型的疗法。
在另一个优选的实施方案中， 寡核苷酸包裹于脂质体内或依附于载体分子 ( 例如 胆固醇、 TAT 肽 )。 以下介绍其它方面。
附图简述
图1：
图 1A 和 1B 为 实 时 PCR 结 果 图， 其 显 示 相 对 于 对 照， HepG2 细 胞 用 使 用 Lipofectamine 2000 引入的硫代磷酸酯寡核苷酸处理后， VEGF mRNA 的倍数改变和标准差。 实时 PCR 结果表明， 用针对 vegfaas 设计的 siRNA 之一 (vefaas1_2， P ＝ 0.05) 并可能用第 二条 ： vefaas1_3(P ＝ 0.1， 图 1A) 处理后 48 小时， HepG2 细胞中的 VEGFA mRNA 的水平显著 升高。 在相同的样品中， 用 vefaas1_2 或 vefaas1_3 处理后， vegfaas RNA 的水平显著降低， 但是用 vefaas1_5 处理后不变， vefaas1_5 也对 VEGFA mRNA 水平没有影响 ( 图 1B)。标示 为 vegfas1_2、 vegfas1_3、 vegfas1_5 的柱分别对应于用 SEQ ID NO 4、 5 和 6 处理的样品。
图 1C ： 图 1 为 实 时 PCR 结 果 图， 其 显 示 相 对 于 对 照， HepG2 细 胞 用 使 用 Lipofectamine 2000 引入的硫代磷酸酯寡核苷酸处理后， VEGF mRNA 的倍数改变和标准 差。实时 PCR 结果表明， 用针对 vegRas 设计的 siRNA 中的两条 (vegRas1_2， P ＝ 0.02 和 vegRas1_3， P ＝ 0.06) 处理后 48 小时， HepG2 细胞中的 VEGFA mRNA 的水平显著升高。 vegRas RNA 水平改变的结果待定。标示为 vegRas1_2、 vegRas1_3、 vegRas1_5 的柱分别对应于用 SEQ ID NO 7、 8 和 9 处理的样品。
图 2 显示 SEQ ID NO ： 1： 人血管内皮生长因子 (VEGF)， 转录子变体 1， mRNA(NCBI 注 册号 ： NM_001025366.1) 和 SEQ ID NO ： 1a 显示 VEGF 的基因组序列 ( 外显子显示为大写字 母， 内含子显示为小写字母 )。
图 3 显示
SEQ ID NO ： 2： VEGF 天然反义序列 (NCBI 注册号 ： BI045995)
SEQ ID NO ： 3： VEGR 天然反义序列 (NCBI 注册号 ： BF829784)
图 4 显示针对 VEGF 天然反义序列设计的反义寡核苷酸， SEQ ID NO ： 4-6。
图 5 显示针对 VEGR 天然反义序列设计的反义寡核苷酸， SEQ ID NO ： 7-9。
图 6 显示靶序列 VEGFA 外显子 1(SEQ ID NO ： 10) ； 由 Applied Biosystems Taqman Gene Expression Assay(Hs00173626_m1) 设计的定制试验的正向引物序列 (SEQ ID N O ： 11 和 12)、 反向引物序列 (SEQ ID NO ： 13 和 14) 和报道序列 (SEQ ID NO ： 15 和 16)。
发明详述
为了说明， 下面参考实例应用来描述本发明的几个方面。 应当理解， 所阐释的许多 具体细节、 关系和方法是为了提供本发明的完整理解。 但是， 相关领域的普通技术人员容易 认识到本发明无需一个或多个具体细节或与其它方法一起也可以实施。 本发明不受行为或 事件顺序的限制， 因为某些行为可按不同的顺序出现和 / 或与其它行为或事件一起出现。 另外， 为了实施根据本发明的方法并不需要所有说明的行为或事件。
本文公开的所有基因、 基因名和基因产品旨在和来自本文公开的组合物和方法所 适用的任何种类的同系物相应。因此， 所述术语包括但不限于来自人和小鼠的基因和基因 产品。 应当理解当来自特定物种的基因和基因产品被公开时， 该公开旨在仅仅举例， 不应理 解为限制， 除非它所在的上下文清楚指明。因此， 例如， 本文公开的基因 ( 它们在某些实施 方案中涉及哺乳动物核酸和氨基酸序列 ) 旨在包括来自其它动物的同源和 / 或种间同源基 因和基因产品， 所述其它动物包括但不限于其它哺乳动物、 鱼类、 两栖类、 爬行类和鸟类。 在 优选的实施方案中， 基因或核酸序列是人的。 定义
本文所用的术语只用于描述特定实施方案的目的， 且不旨在限制本发明。如本文 所用的单数形式″一″和″该″旨在也包括复数形式， 除非上下文清楚指明。另外， 在术 语″包括″、″具有″或它们的变体用于发明详述和 / 或权利要求书的程度内， 这些术语 旨在以和术语 “包含” 相似的方式表示包含性。
术语″大约″或″近似″意指对于本领域普通技术人员测定的特定值在可接受 的误差范围之内， 其部分依赖于该值如何被测量或测定， 即测量系统的限制。 例如″大约″ 按照本领域的实践可意指在 1 或大于 1 标准差以内。或者， ″大约″可意指给定值的最高 20％， 优选最高 10％， 更优选最高 5％， 且更优选最高 1％的范围。或者， 特别对生物系统或 方法而言， 该术语可意指在一个值的数量级范围内， 优选 5 倍内， 更优选 2 倍内。在本申请 和权利要求中描述特定值时， 除非另有指明， 否则应假定术语″大约″意指特定值的可接 受误差范围之内。
本文所用的术语″ mRNA″意指靶基因的目前已知的 mRNA 转录子， 以及任何可被 阐明的其它转录子。
″反义寡核苷酸″或″反义化合物″意指结合另一 RNA 或 DNA( 靶 RNA、 DNA) 的 RNA 或 DNA 分子。 例如， 如果它是 RNA 寡核苷酸， 它以 RNA-RNA 相互作用的方式结合另一 RNA 靶， 并改变靶 RNA 的活性 (Eguchi 等 (1991)Ann.Rev.Biochem.60， 631-652)。反义寡核苷 酸能上调或下调特定多核苷酸的表达和 / 或功能。该定义意欲包括任何从治疗、 诊断或其 它观点来看有用的外源 RNA 或 DNA 分子。这样的分子包括例如反义 RNA 或 DNA 分子、 干扰 RNA(RNAi)、 微小 RNA、 诱饵 RNA(decoy RNA) 分子、 siRNA、 酶促 RNA、 治疗编辑 RNA 和激动剂 以及拮抗剂 RNA、 反义寡聚化合物、 反义寡核苷酸、 外部引导序列 (EGS) 寡核苷酸、 可变剪接 子、 引物、 探针和杂交至靶核酸至少一部分的其它寡聚化合物。因此， 这些化合物可以以单
链、 双链、 部分单链或环形寡聚化合物的形式导入。
本发明的上下文中， 术语″寡核苷酸″指核糖核酸 (RNA) 或脱氧核糖核酸 (DNA) 的寡聚体或多聚体或它们的模拟物。术语″寡核苷酸″也包含天然和 / 或修饰的单体或键 合的线性或环状寡聚体， 包括脱氧核糖核苷、 核糖核苷、 它们的取代形式和 α 端基异构形 式、 肽核酸 (PNA)、 锁定核酸 (LNA)、 硫代磷酸酯、 甲基膦酸酯等。寡核苷酸能以单体 - 单体 相互作用的常规形式 ( 例如华生 - 克里克 (Watson-Crick) 型碱基配对、 型碱基配对等 ) 特异性地结合靶多核苷酸。 寡核苷酸可以是″嵌合的″， 也就是由不同的区域组成。 在本发明的上下文中， ″ 嵌合的″化合物是包含两个或更多个化学区域 ( 例如 DNA 区域、 RNA 区域、 PNA 区域等 ) 的 寡核苷酸。每个化学区域由至少一个单体单元 ( 即寡核苷酸化合物例子中的核苷酸 ) 组 成。 这些寡核苷酸通常包含至少一个其中寡核苷酸被修饰以显示一种或多种期望性质的区 域。寡核苷酸的所述期望性质包括但不限于例如增大的对核酸酶降解的抗性、 增大的细胞 摄取和 / 或增大的对靶核酸的结合亲和力。寡核苷酸的不同区域可以因此具有不同的性 质。 本发明的嵌合寡核苷酸可以形成上述两种或更多种寡核苷酸、 修饰的寡核苷酸、 寡核苷 和 / 或寡核苷酸类似物的混合结构。
或反寡核苷酸可以由可在″寄存器 (register)″中连接 ( 即当单体被连续连接时， 如 在天然 DNA 中 ) 或通过间隔物连接的区域组成。间隔物旨在构成区域之间的共价″桥″， 并且在优选的例子中其长度不超过大约 100 个碳原子。间隔物可以带有不同的功能性， 例 如带正电荷或负电荷、 带特殊核酸结合性质 ( 插入剂、 槽结合剂 (groove binder)、 毒素、 荧 光体等 )、 亲脂、 诱导特殊二级结构 ( 例如诱导 α 螺旋的含丙氨酸的肽 )。
本文所用的″ VEGF″和″血管内皮生长因子 A″包括所有的家族成员、 突变体、 等位基因、 片段、 种 (specy)、 编码和非编码序列、 有义和反义多核苷酸链等。
本文所用词语血管内皮生长因子 A、 VEGF、 VEGFA 在本申请中可互换使用。
本文所用的术语″对…特异的寡核苷酸″或″靶向…的寡核苷酸″指具有下列 序列的寡核苷酸， 该序列 (i) 能与靶基因的一部分形成稳定复合体， 或 (ii) 能与靶基因的 mRNA 转录子的一部分形成稳定双链体。所述复合体和双链体的稳定性可通过理论计算和 / 或体外试验测定。测定杂交复合体和双链体的稳定性的示例性试验描述于下面的实施例。
本文所用的术语″靶核酸″包括 DNA、 从这种 DNA 转录而来的 RNA( 包括前 mRNA 和 mRNA)、 以及从这种 RNA 衍生而来的 cDNA、 编码、 非编码序列、 有义或反义多核苷酸。寡聚化 合物与其靶核酸的特异杂交干扰核酸的正常功能。 这种通过和靶核酸特异杂交的化合物调 节靶核酸的功能一般称为″反义″。被干扰的 DNA 的功能包括， 例如复制和转录。被干扰 的 RNA 的功能包括所有重要功能， 例如 RNA 移位至蛋白翻译的位点、 从 RNA 翻译蛋白、 剪接 RNA 产生一个或多个 mRNA 种类和由 RNA 参与或促进的催化活性。 这种干扰靶核酸功能的总 体效果是编码产物或寡核苷酸的表达的调节。
RNA 干 扰 ″ RNAi ″ 由 双 链 RNA(dsRNA) 分 子 ( 所 述 分 子 与 其 ″ 靶 ″ 核 酸 序 列 具 有 序 列 特 异 性 同 源 性 ) 介 导 (Caplen， N.J. 等 (2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98 ： 9742-9747)。在本发明的某些实施方案中， 介质是 5-25 核苷酸的″小干扰″ RNA 双链体 (siRNA)。 siRNA 来自通过称为 Dicer 的 RNase 酶处理 dsRNA(Bernstein， E. 等 (2001)Nature 409 ： 363-366)。 siRNA 双链体产品被纳入术语称为 RISC(RNA Induced Silencing Complex，
RNA 诱导的沉默复合体 ) 的多蛋白 siRNA 复合体。不希望被任何特定理论束缚， RISC 据信 被指引至靶核酸 ( 适宜 mRNA)， 在这里 siRNA 双链体以序列特异方式相互作用， 从而以催化 形式介导切割 (Bernstein， E. 等 (2001)Nature 409 ： 363-366 ； Boutla， A. 等 (2001)Curr. Biol.11 ： 1776-1780)。 可根据本发明使用的小干扰 RNA 可以根据本领域公知的和普通技术 人员所熟悉的程序合成和使用。用于本发明方法的小干扰 RNA 适合包含大约 1 到大约 50 个之间的核苷酸 (nt)。在非限制性实施方案的实施例中， siRNA 可以包含大约 5 到大约 40 个 nt、 大约 5 到大约 30 个 nt、 大约 10 到大约 30 个 nt、 大约 15 到大约 25 个 nt 或者大约 20-25 个核苷酸。
通过使用自动排列核酸序列和标明同一性或同源性区域的计算机程序， 适合的寡 核苷酸的选择得以促进。这种程序用于比较核酸序列， 所述核酸序列例如通过搜索数据库 ( 例如 GenBank) 或通过对 PCR 产品测序而获得。 比较一系列物种之间的核酸序列可以选择 在物种之间表现出适当同一性程度的核酸序列。在没有被测序的基因的例子中， 进行 DNA 印迹法 (Southern blots) 以测定目标物种和其它物种的基因之间的同一性程度。本领域 公知， 通过在不同严格程度进行 DNA 印迹法， 可能获得同一性的近似度量。这些程序可以选 择寡核苷酸， 所述寡核苷酸展示出与待控制对象中的靶核酸序列的高互补度， 和与其它物 种中的相应核酸序列的较低互补度。 本领域技术人员将会意识到选择用于本发明的基因的 合适区域有相当大的范围。 ″ 酶 促 RNA ″ 意 指 具 有 酶 活 性 的 RNA 分 子 (Cech， (1988)J.American.Med. Assoc.260， 3030-3035)。酶促核酸 ( 核酶 ) 通过首先结合靶 RNA 而起作用。这种结合通过 酶促核酸的靶结合部分而发生， 所述酶促核酸与起切割靶 RNA 作用的分子的酶促部分保持 紧密接近。因此酶促核酸首先识别靶 RNA 然后通过碱基配对与之结合， 一旦结合到正确的 位点， 即以酶的形式起剪切靶 RNA 的作用。
″诱饵 RNA ″意指模拟配体的天然结合结构域的 RNA 分子。因此诱饵 RNA 与天 然结合靶竞争结合特异配体。例如， 已显示 HIV 反式激活应答 (TAR)RNA 的过度表达可以 充当″诱饵″， 并且有效结合 HIV tat 蛋白， 从而阻止其结合 HIV RNA 中编码的 TAR 序列 (Sullenger 等 (1990)Cell， 63， 601-608)。这是一个具体的实例。本领域技术人员将认识 到这仅是一个实例， 利用本领域公知的技术可以容易地产生其它实施方案。
本文所用的术语″单体″通常指由磷酸二酯键或其类似物连接从而形成大小从 几个单体单元 ( 例如从大约 3-4 个 ) 到几百个单体单元的寡核苷酸的单体。磷酸二酯键合 的类似物包括硫代磷酸酯、 二硫代磷酸酯， 甲基膦酸酯、 硒代磷酸酯、 氨基磷酸酯等， 下面会 做更全面的介绍。
术语″核苷酸″覆盖天然存在的核苷酸以及非天然存在的核苷酸。本领域技术 人员应该清楚， 以前认为″非天然存在的″多种核苷酸随后已经在自然界找到。因此，″ 核苷酸″不仅包括已知的包含嘌呤和嘧啶杂环的分子， 也包含杂环类似物和它们的互变异 构体。其它类型核苷酸的示例性的实例是包含以下的分子 ： 腺嘌呤、 鸟嘌呤、 胸腺嘧啶、 胞 嘧啶、 尿嘧啶、 嘌呤、 黄嘌呤、 二氨基嘌呤、 8- 氧代 -N6- 甲基腺嘌呤、 7- 脱氮黄嘌呤、 7- 脱 氮鸟嘌呤、 N4， N4- 桥亚乙基胞嘧啶、 N6， N6- 桥亚乙基 -2， 6- 二氨基嘌呤、 5- 甲基胞嘧啶、 5-(C3-C6)- 炔基胞嘧啶、 5- 氟尿嘧啶、 5- 溴尿嘧啶、 假异胞嘧啶、 2- 羟基 -5- 甲基 -4- 三唑 并吡啶、 异胞嘧啶、 异鸟嘌呤、 肌苷和描述于 Benner 等， 美国专利号 5,432,272 中的″非天
然存在的″核苷酸。 术语″核苷酸″旨在覆盖这些实例的每个和所有以及它们的类似物和 互变异构体。特别令人感兴趣的核苷酸是那些包含腺嘌呤、 鸟嘌呤、 胸腺嘧啶、 胞嘧啶和尿 嘧啶的核苷酸， 它们被认为是与人类的治疗和诊断应用相关的天然存在的核苷酸。核苷酸 包含天然的 2′ - 脱氧和 2′ - 羟基糖 ( 例如描述于 Kornberg 和 Baker， DNA Replication， 第二版 (Freeman， San Francisco， 1992)) 和它们的类似物。
和核苷酸有关的″类似物″包括具有修饰的碱基部分和 / 或修饰的糖部分的 合成核苷酸 ( 参见例如， 由 Scheit 总体描述的 Nucleotide Analogs， John Wiley， New York， 1980 ； Freier & Altmann， (1997)Nucl.Acid.Res.， 25(22)， 4429-4443， Toulmé， J.J.， (2001)Nature Biotechnology 19 ： 17-18 ； Manoharan M.， (1999)Biochemica et Biophysica Acta 1489 ： 117-139 ； Freier S.M.， (1997)Nucleic Acid Research， 25 ： 4429-4443， Uhlman， E.， (2000)Drug Discovery & Development， 3： 203-213， Herdewin P.， (2000)Antisense & Nucleic Acid Drug Dev.， 10 ： 297-310) ； 2′ -O、 3′ -C- 连接的 [3.2.0] 二环阿拉伯糖核苷 ( 参见例如 N.K Christiensen.， 等 (1998)J.Am.Chem.Soc.， 120 ： 5458-5463 ； Prakash TP， Bhat B.(2007)Curr Top Med Chem.7(7) ： 641-9 ； Cho EJ 等 (2009)Annual Review of Analytical Chemistry， 2， 241-264)。 这样的类似物包括被设计 用于提高结合性质 ( 例如双链体或三链体稳定性、 特异性等 ) 的合成核苷酸。 本文所用的″杂交″意指寡聚化合物的基本互补的链的配对。 一种配对机制包括 寡聚化合物链的互补核苷或核苷酸碱基 ( 核苷酸 ) 之间的氢键合， 其可以是华生 - 克里克、
或反氢键合。例如， 腺嘌呤和胸腺嘧啶是通过形成氢键而配对的互补核苷酸。杂交可以在不同环境下发生。
当反义化合物与靶核酸的结合干扰靶核酸的正常功能而引起功能和 / 或活性的 调节， 且在期望有特异性结合的条件下 ( 即体内试验或治疗处理情况中的生理条件下， 和 在体外试验情况中进行试验的条件下 ) 有足够的互补度以避免反义化合物非特异性地结 合非靶核酸序列时， 所述反义化合物是″能特异性杂交的″。
本文所用的短语″严格杂交条件″或″严格条件″指下列条件， 在该条件下， 本 发明的化合物将和它的靶序列杂交， 但只和最少量的其它序列杂交。 严格条件依赖于序列， 且在不同的环境中会不同， 在本发明的上下文中， 寡聚化合物在″严格条件″下和靶序列 杂交， 该″严格条件″取决于寡聚化合物的性质和组成以及研究它们的试验。一般地， 严 格杂交条件包括低浓度 ( ＜ 0.15M) 的带有无机阳离子例如 Na++ 或 K++( 即低离子强度 ) 的盐， 高于 20℃ -25℃低于寡聚化合物 ： 靶序列复合体的 Tm 的温度， 以及存在例如甲酰胺、 二甲基甲酰胺、 二甲基亚砜或去污剂十二烷基硫酸钠 (SDS) 的变性剂。例如， 对于每 1 ％ 甲酰胺， 杂交率降低 1.1 ％。高严格性杂交条件的实例是 0.1X 氯化钠 - 柠檬酸钠缓冲液 (SSC)/0.1％ ( 重量 / 体积 )SDS， 60℃， 30 分钟。
本文所用的″互补″指在一条或两条寡聚体链上的两个核苷酸之间的精确配对 的能力。例如， 如果反义化合物的特定位置上的核碱基 (nucleobase) 能与靶核酸的特定位 置上的核碱基氢键合， 所述靶核酸为 DNA、 RNA 或寡核苷酸分子， 那么寡核苷酸和靶核酸之 间的氢键合的位置就被认为是互补位置。 当每个分子的足量互补位置被能彼此氢键合的核 苷酸占据时， 寡聚化合物和其它 DNA、 RNA 或寡核苷酸分子彼此互补。因此，″能特异性杂 交″和″互补″是用于表示足量核苷酸上足够的精确配对或互补程度使得寡聚化合物和靶核酸之间存在稳定和特异结合的术语。
本领域应当理解寡聚化合物的序列不需要 100％互补于其将特异杂交的靶核酸的 序列。而且， 寡核苷酸可以在一个或多个片段上杂交从而在杂交事件中不包括间隔或相邻 的片段 ( 例如， 环结构、 错配或发夹结构 )。本发明的寡聚化合物与它们将靶向的靶核酸序 列内的靶区域具有至少大约 70％、 或至少大约 75％、 或至少大约 80％、 或至少大约 85％、 或至少大约 90％、 或至少大约 95％或至少大约 99％的序列互补性。例如， 其中反义化合物 的 20 个核苷酸中的 18 个与靶区域互补并因此将特异性杂交的反义化合物将代表 90％的 互补性。在该实例中， 余下的非互补核苷酸可以集群或与互补核苷酸散布且不需要彼此邻 近或与互补核苷酸邻近。因此， 长度为 18 个核苷酸， 有 4( 四 ) 个非互补核苷酸 ( 它们两侧 有和靶核酸完全互补的两个区域 ) 的反义化合物与靶核酸的总互补性将为 77.8％， 因而将 落在本发明的范围内。 反义化合物与靶核酸的区域的百分比互补性可常规地使用本领域已 知的 BLAST 程序 ( 基本本地排列搜索工具 ) 和 PowerBLAST 程序测定 (Altschul 等 (1990) J.Mol.Biol.， 215， 403-410 ； Zhang 和 Madden， (1997)Genome Res.， 7， 649-656)。百分比同 源性、 序列同一性或互补性可以通过例如使用 Smith 和 Waterman 算法 (Adv.Appl.Math.， (1981)2， 482-489) 的 Gap 程序 (Wisconsin Sequence Analysis Package， Version 8 for Unix， Genetics Computer Group， University Research Park， Madison Wis.) 用默认设置 测定。 本文所用的术语″热熔点 (Tm)″指在规定的离子强度、 pH 和核酸浓度下的温度， 在该温度下 50％的互补于靶序列的寡核苷酸与靶序列的杂交达到平衡。通常， 严格条件如 下， 其中 pH7.0 到 8.3 时， 盐浓度是至少大约 0.01 到 1.0M Na 离子浓度 ( 或其它盐 )， 且对 于短寡核苷酸 ( 例如 10-50 个核苷酸 ) 温度是至少大约 30℃。严格条件也可以通过添加去 稳定剂例如甲酰胺实现。
本文所用的″调节″意指增大 ( 刺激 ) 或减小 ( 抑制 ) 基因的表达。
当用于多核苷酸序列的上下文时， 术语″变体″可以包含与野生型基因相关的多 核苷酸序列。该定义也可以包括， 例如″等位基因″、″剪接″、″种″或″多态性″变 体。剪接变体可以和参比分子有显著同一性， 但是由于 mRNA 处理期间外显子的交替剪接， 将一般含有更多或更少数量的多核苷酸。 相应的多肽可以包含附加的功能结构域或结构域 的缺失。种变体是在种与种之间相异的多核苷酸序列。在本发明中具有特定用途的是野生 型基因产品的变体。变体可以由核酸序列中的至少一个突变获得， 且可以导致改变的 mRNA 或者结构或功能会或不会改变的多肽。任何给定的天然或重组基因可以含有 0、 1 或许多等 位基因形式。产生变体的普通突变变化一般归因于核苷酸的天然缺失、 增加或取代。这些 变化类型的每一种可以在给定序列中单独出现或与其它联合出现一次或多次。
得到的多肽一般相对于彼此将具有显著的氨基酸同一性。多态性变体是给定物 种的个体之间特定基因的多核苷酸序列的变化。多态性变体也可以包括″单核苷酸多态 (SNP)″， 或单碱基突变体 ( 其中多核苷酸序列中一个碱基变化 )。 SNP 的存在可以是， 例如， 对疾病状态具有倾向性 ( 即易感性对抵抗性 ) 的特定种群的指示。
衍生多核苷酸包含进行了化学修饰 ( 例如， 由烷基、 酰基或氨基基团取代氢 ) 的核 酸。衍生物， 例如衍生寡核苷酸， 可以包含非天然存在的部分， 例如改变的糖部分或糖内键 合。其中的示例是硫代磷酸酯和其它本领域已知的含硫物种。衍生核酸也可以包含标记，
包括放射性核苷酸、 酶、 荧光剂、 化学发光剂、 显色剂、 底物、 辅因子、 抑制剂、 磁性颗粒等。
″衍生″多肽或肽是通过例如糖基化、 聚乙二醇化 (pegylation)、 磷酸化、 硫酸 化、 还原 / 烷基化、 酰化、 化学耦合或温和福尔马林处理修饰的一种多肽或肽。衍生物也可 以被修饰为包含可检测的标记， 直接或间接地包括但不限于放射性同位素、 荧光和酶标记。
本文所用的术语″动物″或″患者″意欲包括， 例如人、 绵羊、 麋鹿、 鹿、 长耳鹿、 水貂、 哺乳动物、 猴、 马、 牛、 猪、 山羊、 狗、 猫、 大鼠、 小鼠、 鸟、 鸡、 爬行动物、 鱼、 昆虫和蛛形纲 动物。
″哺乳动物″覆盖通常有医疗护理的温血哺乳动物 ( 例如人和驯养动物 )。实例 包括猫科动物、 犬科动物、 马科动物、 牛科动物和人， 以及只包括人。
″进行治疗″或″治疗″覆盖哺乳动物中的疾病状态的治疗， 且包括 ： (a) 预防 疾病状态在哺乳动物中出现， 特别是当这种哺乳动物对疾病状态易感但还没有被诊断患 病； (b) 抑制疾病状态， 例如阻止其发展 ； 和 / 或 (c) 减轻疾病状态， 例如引起疾病状态的消 退直至达到期望的终点。 治疗也包括疾病症状的改善 ( 例如减轻疼痛或不适 )， 其中这种改 善可以直接影响或可以不直接影响疾病 ( 例如引起、 传播、 表达等 )。
本文所用术语″癌症″指任何恶性肿瘤， 特别是在肺、 肾或甲状腺中产生的恶性 肿瘤。癌症自身展示为″肿瘤″或包含癌症恶性细胞的组织。肿瘤的实例包括肉瘤和癌， 例如但不限于 ： 纤维肉瘤、 粘液肉瘤、 脂肉瘤、 软骨肉瘤、 骨肉瘤、 脊索瘤、 血管肉瘤、 内皮肉 瘤、 淋巴管肉瘤、 淋巴管内皮肉瘤、 滑膜瘤、 间皮瘤、 尤因肉瘤、 平滑肌肉瘤、 横纹肌肉瘤、 结 肠癌、 胰腺癌、 乳腺癌、 卵巢癌、 前列腺癌、 鳞状细胞癌、 基底细胞癌、 腺癌、 汗腺癌、 皮脂腺 癌、 乳头状癌、 乳头腺癌、 囊腺癌、 髓样癌、 肺癌、 肾细胞癌、 肝癌、 胆管癌、 绒毛膜癌、 精原细 胞癌、 胚胎癌、 维尔姆斯氏肿瘤 (Wilm’ s tumor)、 子宫颈癌、 睾丸肿瘤、 肺癌、 小细胞肺癌、 膀 胱癌、 上皮癌、 神经胶质瘤、 星形细胞瘤、 髓母细胞瘤、 颅咽管瘤、 室管膜瘤、 松果体瘤、 成血 管细胞瘤、 听神经瘤、 少突神经胶质瘤、 脑膜瘤、 黑素瘤、 神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤。 如上所述， 本发明特定地允许区别诊断肺、 肾和甲状腺瘤。
多核苷酸和寡核苷酸组合物和分子
靶： 在一个实施方案中， 靶包含血管内皮生长因子 (VEGF) 的核酸序列， 非限制性 地包括和 VEGF 相关的有义和 / 或反义的非编码和 / 或编码序列。
血管内皮生长因子 (VEGF) 是血管再生和心血管渗透性的有力的刺激因子。有 8 种功能不同或有时功能重叠的同种型。作用的机制还在研究之中， 新出现的认识是和其 它受体 ( 例如神经毡 (neurophilin)， 它们之前与血管再生无关 ) 之间的重叠通路和串扰 (cross-talk)。VEGF 对胚胎发育、 愈合和月经周期有重要的生理作用。它在与自身免疫疾 病相关的病理条件中扮演重要的角色。
示例性的血管内皮生长因子介导的疾病和病症 ( 它们可以用从反义化合物获得 的干细胞再生的细胞 / 组织治疗 ) 包括特征为过量血管内壁细胞增殖的疾病 ； 由心血管机 能不全导致的心血管疾病 ( 例如冠状动脉疾病、 充血性心力衰竭和周围性血管疾病 ) ； 特征 或起因是异常或过剩血管再生的病症， 包括但不限于 ： 癌症 ( 例如致癌基因的激活、 肿瘤抑 制物的损失 ) ； 感染性疾病 ( 例如病原体表达血管基因、 增强血管再生程序 ) ； 自身免疫障 碍 ( 例如肥大细胞和其它白细胞的激活 )， 包括类风湿性关节炎 ； 血管畸形 ( 例如 Tie-2 突 变)； DiGeorge 综合症 ( 例如低 VEGF 和神经毡 (neuropilin)-1 表达 ) ； HHT( 例如内皮糖蛋白 (endoglin) 或 LK-1 的突变 )、 海绵状血管瘤 ( 例如 Cx37 和 Cx40 的损失 ) ； 动脉粥样硬化 ； 移植动脉病 (ateriopathy) ； 肥胖症 ( 例如由脂肪饮食诱发的血管再生、 血管再生抑制因子 诱发的体重减轻 ) ； 牛皮癣 ； 疣； 变应性皮炎 ； 疤痕疙瘩 ； 脓性肉芽肿 ； 发疱疾病 ； 艾滋病患 者的卡波西肉瘤 ； 持久性增生性玻璃状综合症 ( 例如 Ang-2 或 VEGF164 的损失 ) ； 常染色体 显性多囊性肾病 (ADPKD) ； 糖尿病视网膜病 ； 早产儿视网膜病 ； 年龄相关的黄斑部退化 ； 脉 络膜新血管形成 ( 例如 TIMP-3 突变 ) ； 原发性肺动脉高压 ( 例如种系 BMPR-2 突变、 体细胞 EC 突变 ) ； 哮喘 ； 鼻息肉 ； 炎性肠病、 神经损伤、 脑损伤和神经组织退化性疾病 ( 例如阿尔茨 海默氏病、 帕金森氏病、 肌萎缩侧索硬化等 ) ； 牙周病 ； 腹水 ； 腹膜粘连 ； 子宫内膜异位 ； 子 宫出血 ； 卵巢囊肿 ； 卵巢过刺激 ； 关节炎 ； 滑膜炎 ； 骨髓炎 ； 和 / 或骨赘形成 ； 溃疡 ； 寻常疣 ； 结节性脑硬化血管纤维瘤 ； 葡萄酒色痣 ； 斯德奇 - 韦伯综合症 ； Kippel-Trenaunay-Weber 综合症 ； Osler-Weber-Rendu 综合症和任何其它与细胞或组织中的 VEGF-R 水平相关的疾病 或症状。
在一个优选的实施方案中， 寡核苷酸对 VEGF 的多核苷酸 ( 其非限制性地包括非编 码区域 ) 特异。VEGF 靶包含 VEGF 的变体、 VEGF 的突变体 ( 包括 SNP)、 VEGF 的非编码序列、 等位基因、 片段等。优选寡核苷酸是反义 RNA 分子。
根据本发明的实施方案， 靶核酸分子不仅限于 VEGF 多核苷酸， 还延及 VEGF 的任何 同种型、 受体、 同系物、 非编码区域等。
在另一个优选的实施方案中， 寡核苷酸靶向 VEGF 靶的天然反义序列 ( 编码和非编 码区域的天然反义 )， 非限制性地包括它的变体、 等位基因、 同系物、 突变体、 衍生物、 片段和 互补序列。优选寡核苷酸是反义 RNA 或 DNA 分子。
在另一个优选的实施方案中， 本发明的寡聚化合物也包括在化合物的一个或多个 核苷酸位置上存在不同碱基的变体。 例如， 如果第一个核苷酸是腺嘌呤， 可产生在此位置含 有胸苷、 鸟苷、 胞苷或其它天然或非天然的核苷酸的变体。 这可以在反义化合物的任何位置 完成。这些化合物然后使用本文描述的方法来测试， 以测定它们抑制靶核酸表达的能力。
在某些实施方案中， 反义化合物和靶之间的同源性、 序列同一性或互补性为大约 50 ％到大约 60 ％。在某些实施方案中， 同源性、 序列同一性或互补性为大约 60 ％到大约 70％。在某些实施方案中， 同源性、 序列同一性或互补性为大约 70％到大约 80％。在某些 实施方案中， 同源性、 序列同一性或互补性为大约 80％到大约 90％。在某些实施方案中， 同 源性、 序列同一性或互补性为大约 90％、 大约 92％、 大约 94％、 大约 95％、 大约 96％、 大约 97％、 大约 98％、 大约 99％或大约 100％。
当反义化合物与靶核酸的结合干扰靶核酸的正常功能而引起活性损失， 且在期望 有特异性结合的条件下有足够的互补度以避免反义化合物非特异性地结合非靶核酸序列 时， 所述反义化合物是能特异性杂交的。 这样的条件包括， 即体内试验或治疗处理情况中的 生理条件下， 和在体外试验情况中进行试验的条件下。
当反义化合物 ( 不论 DNA、 RNA、 嵌合体、 取代体等 ) 与靶 DNA 或 RNA 分子的结合 干扰靶 DNA 或 RNA 的正常功能而引起功效损失， 且在期望有特异性结合的条件下 ( 即体内 试验或治疗处理情况中的生理条件下， 和在进行试验的条件下在体外试验情况中 ) 有足够 的互补度以避免反义化合物非特异性地结合非靶序列时， 所述反义化合物是能特异性杂交 的。在另一个优选的实施方案中， VEGF 的靶向 ( 非限制性地包括使用例如 PCR、 杂交 等鉴别或扩展的反义序列、 SEQ ID NO. ： 2 展示的序列中的一种或多种等 ) 调节 VEGF 的表 达或功能。在一个实施方案中， 相对于对照， 表达或功能被上调。在另一个优选的实施方案 中， 相对于对照， 表达或功能被下调。
在另一个优选的实施方案中， 寡核苷酸包括 SEQ ID NO ： 4-9 展示的核酸序列， 这些 核酸序列包含使用例如 PCR、 杂交等鉴别和扩展的反义序列。 这些寡核苷酸可以包含一个或 多个修饰的核苷酸、 较短或较长的片段、 修饰的键等。 修饰的键或核苷酸间键合的实例包括 硫代磷酸酯、 二硫代磷酸酯等。在另一个优选的实施方案中， 核苷酸包含磷衍生物。可以依 附于本发明的修饰的寡核苷酸的糖或糖类似物部分的磷衍生物 ( 或修饰的磷酸酯基团 ) 可 以是一磷酸酯、 二磷酸酯、 三磷酸酯、 烷基磷酸酯、 烷烃磷酸酯、 硫代磷酸酯等。制备上述磷 酸酯类似物， 和将它们导入核苷酸、 修饰的核苷酸和寡核苷酸本身也是已知的， 不需要在此 描述。
反义的特异性和灵敏性也可被本领域技术人员在治疗用途中利用。 反义寡核苷酸 已经作为治疗部分用于治疗动物和人的疾病状态。反义寡核苷酸已被安全和有效地给予 人， 且许多临床试验目前也在进行当中。 因此已确定寡核苷酸可以是有用的治疗手段， 所述 治疗手段可经设置用于治疗细胞、 组织和动物 ( 尤其是人 ) 的治疗方案。 在本发明的实施方案中， 寡聚反义化合物， 特别是寡核苷酸， 结合靶核酸分子并调 节由靶基因编码的分子的表达和 / 或功能。待干扰的 DNA 的功能包括例如复制和转录。待 干扰的 RNA 的功能包括所有重要的功能， 例如 RNA 移位至蛋白翻译的位点、 从 RNA 翻译蛋 白、 剪接 RNA 产生一个或多个 mRNA 种类和由 RNA 参与或促进的催化活性。 根据期望的功能， 该功能可被上调或抑制。
反义化合物包括反义寡聚化合物、 反义寡核苷酸、 外部引导序列 (EGS) 寡核苷酸、 可变剪接子、 引物、 探针和杂交至靶核酸至少一部分的其它寡聚化合物。因此， 这些化合物 可以以单链、 双链、 部分单链或环形寡聚化合物的形式导入。
在本发明的上下文中， 将反义化合物靶向特定核酸分子可以是多步骤过程。该过 程通常以靶核酸 ( 其功能待调节 ) 的鉴别开始。该靶核酸可以是， 例如其表达与特定病症 或疾病状态相关的细胞基因 ( 或从该基因转录的 mRNA)， 或者来自传染剂中的核酸分子。 在 本发明中， 靶核酸编码血管内皮生长因子 (VEGF)。
靶向过程通常也包括测定靶核酸内的至少一个靶区域、 片段或位点， 使反义相互 作用发生， 从而产生期望的效果 ( 例如表达的调节 )。在本发明的上下文内， 术语″区域″ 定义为具有至少一个可鉴别结构、 功能或特征的靶核酸的一部分。靶核酸的区域内是片 段。″片段″定义为靶核酸内的区域的更小部分或亚部分。本发明所用的″位点″定义为 靶核酸内的位置。
在一个优选的实施方案中， 反义寡核苷酸结合血管内皮生长因子 (VEGF) 的天然 反义序列并调节血管内皮生长因子 (VEGF)(SEQ ID NO ： 1) 的表达和 / 或功能。反义序列的 实例包括 SEQ ID NO ： 2-9。
在另一个优选的实施方案中， 反义寡核苷酸结合血管内皮生长因子 (VEGF) 多核 苷酸的一个或多个片段， 并调节血管内皮生长因子 (VEGF) 的表达和 / 或功能。所述片段包 含血管内皮生长因子 (VEGF) 有义或反义多核苷酸的至少 5 个连续核苷酸。
在另一个优选的实施方案中， 反义寡核苷酸对血管内皮生长因子 (VEGF) 的天然 反义序列特异， 其中寡核苷酸和血管内皮生长因子 (VEGF) 的天然反义序列的结合调节血 管内皮生长因子 (VEGF) 的表达和 / 或功能。
在另一个优选的实施方案中， 寡核苷酸化合物包括 SEQ ID NO ： 4-9 展示的序列， 使 用例如 PCR、 杂交等鉴别和扩展的反义序列。 这些寡核苷酸可以包含一个或多个修饰的核苷 酸、 较短或较长的片段、 修饰的键等。修饰的键或核苷酸间键合的实例包含硫代磷酸酯、 二 硫代磷酸酯等。在另一个优选的实施方案中， 核苷酸包含磷衍生物。磷衍生物 ( 或修饰的 磷酸酯基团 )( 其可依附于本发明的修饰的寡核苷酸中的糖或糖类似物部分 ) 可以是一磷 酸酯、 二磷酸酯、 三磷酸酯、 烷基磷酸酯、 烷烃磷酸酯、 硫代磷酸酯等。制备上述磷酸酯类似 物， 和将它们导入核苷酸、 修饰的核苷酸和寡核苷酸本身也是已知的， 不需要在此描述。
如本领域已知的， 由于翻译起始密码子通常是 5′ -AUG( 在转录的 mRNA 分子中 ； 在相应的 DNA 分子中是 5′ -ATG)， 翻译起始密码子也称作″ AUG 密码子″、″起始密码 子″或″ AUG 起始密码子″。少数基因具有 RNA 序列为 5′ -GUG、 5′ -UUG 或 5′ -CUG 的 翻译起始密码子 ； 且已显示 5′ -AUA、 5′ -ACG 和 5′ -CUG 在体内起作用。因此术语″翻 译起始密码子″和″起始密码子″可包含许多密码子序列， 尽管起始氨基酸在每个例子中 通常是甲硫氨酸 ( 在真核生物中 ) 或甲酰甲硫氨酸 ( 在原核生物中 )。真核和原核基因可 以有两个或更多个可选的起始密码子， 它们中的任何一个可在特定细胞类型或组织中或在 特定条件组合下优先用于翻译起始。在本发明的上下文中， ″起始密码子″和″翻译起始 密码子″指在体内用于启动从编码血管内皮生长因子 (VEGF) 的基因转录而来的 mRNA 的翻 译的密码子， 而不管这些密码子的序列。基因的翻译终止密码子 ( 或″终止密码子″ ) 可 以具有以下三个序列中的一个， 即 5′ -UAA、 5′ -UAG 和 5′ -UGA( 相应的 DNA 序列分别是 5′ -TAA、 5′ -TAG 和 5′ -TGA)。
术语″起始密码子区域″和″翻译起始密码子区域″指从翻译起始密码子沿着 任一方向 ( 即 5′或 3′ ) 包含大约 25 到大约 50 个连续核苷酸的 mRNA 或基因的一部分。 类似地， 术语″终止密码子区域″和″翻译终止密码子区域″指从翻译终止密码子沿着任 一方向 ( 即 5′或 3′ ) 包含大约 25 到大约 50 个连续核苷酸的 mRNA 或基因的一部分。因 此， ″起始密码子区域″ ( 或″翻译起始密码子区域″ ) 和″终止密码子区域″ ( 或″翻 译终止密码子区域″ ) 都是可以用本发明的反义化合物有效靶向的区域。
可译框架 (open reading frame， ORF) 或″编码区″ ( 它在本领域中已知指翻译 起始密码子和翻译终止密码子之间的区域 ) 也是可以被有效靶向的区域。在本发明的上下 文中， 靶向区域是包含基因的可译框架 (ORF) 的翻译起始或终止密码子的基因内区域。
另一个靶区域包括 5′非翻译区域 (5′ UTR)， 在本领域中已知指从翻译起始密码 子沿着 5′方向的 mRNA 的一部分， 因此包含 mRNA 的 5′帽位点和翻译起始密码子之间的核 苷酸 ( 或基因上相应的核苷酸 )。另一个靶区域包含 3′非翻译区域 (3′ UTR)， 在本领域 中已知指从翻译终止密码子沿着 3′方向的 mRNA 的一部分， 因此包含 mRNA 的翻译终止密码 子和 3′末端之间的核苷酸 ( 或基因上相应的核苷酸 )。mRNA 的 5′帽位点包含 N7 甲基化 的鸟苷残基， 其通过 5′ -5′三磷酸酯键合与 mRNA 的最 5′ (5′ -most) 残基结合。mRNA 的 5′帽区域被认为包含 5′帽结构本身和与该帽位点相邻的头 50 个核苷酸。本发明的另 一个靶区域是 5′帽区域。虽然某些真核 mRNA 转录子被直接翻译， 但是许多包含一个或多个称为″内含 子″的区域， 其在被翻译之前被从转录子切除。余下的 ( 因此被翻译的 ) 区域称作″外显 子″并被剪接在一起形成连续的 mRNA 序列。在一个实施方案中， 靶向剪接位点 ( 即内含 子 - 外显子接点或外显子 - 内含子接点 ) 在疾病中牵涉异常剪接的情况， 或疾病中牵涉过 度产生特定剪接产物的情况时尤其有用。 由重排或缺失造成的异常融合接点是靶位点的另 一个实施方案。 通过剪接来自不同基因来源的两个 ( 或更多个 )mRNA 的过程而产生的 mRNA 转录子称作″融合转录子″。使用靶向例如 DNA 或前 mRNA 的反义化合物可以有效地靶向 内含子。
在另一个优选的实施方案中， 反义寡核苷酸结合靶多核苷酸的编码和 / 或非编码 区域， 并调节靶分子的表达和 / 或功能。
在另一个优选的实施方案中， 反义寡核苷酸结合天然反义多核苷酸， 并调节靶分 子的表达和 / 或功能。
在另一个优选的实施方案中， 反义寡核苷酸结合有义多核苷酸， 并调节靶分子的 表达和 / 或功能。
可选的 RNA 转录子可以从 DNA 的相同基因组区域产生。这些可选的转录子一般称 为″变体″。更具体地， ″前 mRNA 变体″是由相同基因组 DNA 产生的转录子， 所述转录子 与相同基因组 DNA 产生的其它转录子在它们的起始或终止位置不同并包含内含子和外显 子序列两者。
在剪接的时候剪切掉一个或多个外显子或内含子区域、 或它们的部分时， 前 mRNA 变体产生更小的″ mRNA 变体″。因此， mRNA 变体是经处理的前 mRNA 变体， 每个独特的前 mRNA 变体必定总是由于剪接而产生独特的 mRNA 变体。 这些 mRNA 变体也称为″可选的剪接 变体″。如果不存在前 mRNA 变体的剪接， 则前 mRNA 变体与 mRNA 变体相同。
变体可通过使用可选的信号来起始或终止转录而产生。前 mRNA 和 mRNA 可以具有 不止一个起始密码子或终止密码子。使用可选的起始密码子的源自前 mRNA 或 mRNA 的变体 称为该前 mRNA 或 mRNA 的″可选的起始变体″。那些使用可选的终止密码子的转录子称 为该前 mRNA 或 mRNA 的″可选的终止变体″。一种可选的终止变体的具体类型是″多聚 A(polyA) 变体″， 其中产生的多个转录子由转录机构的″多聚 A 终止信号″之一的可选选 择而产生， 因此产生在独特的多聚 A 位点终止的转录子。在本发明的上下文中， 本文描述的 变体的类型也是靶核酸的实施方案。
靶核酸上反义化合物杂交的位置定义为活性反义化合物靶向的靶区域的至少 5 个核苷酸长度的部分。
虽然本文展示了某些示例性靶片段的具体序列， 但是本领域技术人员将认识到这 些用于说明和描述本发明范围内的特定实施方案。 本领域技术人员考虑到本申请公开可容 易地鉴别另外的靶片段。
包含一段至少五 (5) 个连续核苷酸 ( 它们选自说明性的优选靶片段 ) 的靶片段 ( 其长度为 5-100 个核苷酸 ) 也被认为适合靶向。
靶片段可以包括 DNA 或 RNA 序列， 所述序列包含始自说明性的优选靶片段之一的 5′末端的至少 5 个连续核苷酸 ( 余下的核苷酸是相同 DNA 或 RNA 的连续段， 从靶片段的 5′ 末端上游立即开始并延续直到 DNA 或 RNA 包含大约 5 到大约 100 个核苷酸 )。类似优选的靶片段由 DNA 或 RNA 序列代表， 所述序列包含始自说明性的优选靶片段之一的 3′末端的至 少 5 个连续核苷酸 ( 余下的核苷酸是相同 DNA 或 RNA 的连续段， 从靶片段的 3′末端下游立 即开始并延续直到 DNA 或 RNA 包含大约 5 到大约 100 个核苷酸 )。本领域技术人员在理解 本文说明的靶片段后将能 ( 无需过度试验 ) 鉴别进一步优选的靶片段。
一旦一个或多个靶区域、 片段或位点得到鉴别， 即选择和靶充分互补 ( 即杂交足 够好且具有足够特异性 ) 的反义化合物， 以产生期望的效果。
在本发明的实施方案中， 寡核苷酸结合特定靶的反义链。寡核苷酸长度为至少 5 个核苷酸， 并可合成为每个寡核苷酸靶向重叠的序列， 使得寡核苷酸合成为覆盖靶多核苷 酸的整个长度。靶也包括编码和非编码区域。
在一个实施方案中， 优选由反义寡核苷酸靶向具体的核酸。使反义化合物靶向特 定核酸是一个多步骤过程。该过程通常以鉴别其功能待调节的核酸序列开始。这可以是例 如其表达与特定病症或疾病状态相关的细胞基因 ( 或从该基因转录的 mRNA)， 或者非编码 多核苷酸如非编码 RNA(ncRNA)。
RNA 可分类为 (1) 翻译成蛋白的信使 RNA(mRNA)， 和 (2) 非蛋白编码 RNA(ncRNA)。 ncRNA 包含微小 RNA(microRNA)、 反义转录子和其它包含高密度的终止密码子并缺乏任何 广阔 (extensive)″可译框架″的转录单元 (TU)。 许多 ncRNA 似乎始于蛋白编码场所的 3′ 非翻译区域 (3′ UTR) 中的起始位点。ncRNA 通常罕见， 且由 FANTOM 协会测序的 ncRNA 的 至少一半似乎不是多腺苷酸化的。 大多数研究人员因为显而易见的原因聚焦于经处理并输 送至细胞质的多腺苷酸化的 mRNA。最近已显示非多腺苷酸化的核 RNA 的集合可能非常大， 且许多这样的转录子由所谓的基因间区域产生 (Cheng， J. 等 .(2005)Science 308(5725)， 1149-1154 ； Kapranov， P. 等 (2005).Genome Res 15(7)， 987-997)。ncRNA 可以借以调节基 因表达的机制是通过与靶转录子的碱基配对。通过碱基配对起作用的 RNA 能分组为 (1) 顺 式编码 RNA， 它们在与它们所作用的 RNA 相同的基因位置， 但是在相对链上被编码， 因此展 现出与它们的靶的完美互补性， 和 (2) 反式编码 RNA， 它们在与它们所作用的 RNA 不同的染 色体位置上被编码， 且一般不会展示出与它们的靶的完美碱基配对潜力。
不希望被理论束缚， 通过本文描述的反义寡核苷酸干扰反义多核苷酸能改变相应 有义信使 RNA 的表达。但是， 这种调节可以是不一致的 ( 反义降低 (knockdown) 导致信使 RNA 升高 ) 或一致的 ( 反义降低导致伴随的信使 RNA 减少 )。在这些情况下， 反义寡核苷酸 能靶向反义转录子的重叠或非重叠部分， 导致其降低或隔绝。编码和非编码反义能以相同 的方式被靶向， 任一种类都能以一致或不一致的方式调节相应的有义转录子。在鉴别新的 针对靶所使用的寡核苷酸中采用的策略可以基于通过反义寡核苷酸降低反义 RNA 转录子 或任何其它调节期望的靶的方式。
策略 1 ： 在不一致调节的例子中， 降低反义转录子提高常规 ( 有义 ) 基因的表 达。如果后面的基因编码已知或推定的药物靶， 那么可以想象， 降低其反义相对部分 (counterpart) 可以模拟受体激动剂或酶刺激剂的作用。
策略 2 ： 在一致调节的例子中， 可一致地降低反义和有义转录子两者， 从而实现常 规 ( 有义 ) 基因表达的协同减少。如果， 例如反义寡核苷酸用于实现降低， 那么这个策略能 用于施用一个靶向有义转录子的反义寡核苷酸和另一个靶向相应的反义转录子的反义寡 核苷酸， 或者施用单一的积极对称的反义寡核苷酸， 它同时靶向重叠的有义和反义转录子。根据本发明， 反义化合物包括反义寡核苷酸、 核酶、 外部引导序列 (EGS) 寡核苷 酸、 siRNA 化合物、 单或双链 RNA 干扰 (RNAi) 化合物 ( 例如 siRNA 化合物 ) 和其它杂交至 靶核酸的至少一部分并调节其功能的寡聚化合物。因此， 它们可以是 DNA、 RNA、 DNA 样、 RNA 样或它们的混合物， 或可以是这些中的一种或多种的模拟物。这些化合物可以是单链、 双 链、 环状或发夹寡聚化合物， 并可包含结构元素， 例如内部或末端膨胀、 错配或环。 反义化合 物通常线性制备， 但可以被连接或者制备成环状和 / 或分枝状。反义化合物可以包括例如 下面的构建体 (construet) ： 两条链杂交形成整体或部分双链的化合物， 或者单链， 该单链 具有足够自身互补性以允许杂交和形成整体或部分双链的化合物。 所述两条链可以内部连 接而留下自由的 3′或 5′末端， 或可以连接而形成连续的发夹结构或环。发夹结构可以在 5′或 3′末端包含产生单链特征延伸的突出端。 双链化合物可任选在末端包含突出端。 进 一步的修饰可以包含缀合基团， 它们依附于末端、 选定的核苷酸位置、 糖位置之一或依附于 核苷间键合之一。或者， 两条链可以通过非核酸部分或连接基团连接。当仅由一条链形成 时， dsRNA 可以采取自身向后折回形成双链体的自身互补的发夹型分子的形式。 因此， dsRNA 可以整体或部分是双链。基因表达的具体调节可通过 dsRNA 发夹在转基因细胞系中的稳定 表达实现， 但在某些实施方案中， 基因表达或功能被上调。当由两条链， 或单链 ( 它采取自 身向后折回形成双链体的自身互补的发夹型分子的形式 ) 形成时， 这两条链 ( 或单链的形 成双链体的区域 ) 是以华生 - 克里克形式碱基配对的互补 RNA 链。
一旦引入系统， 本发明的化合物可以引发一种或多种酶或结构蛋白的作用， 导致 对靶核酸的切割或其它修饰， 或者可以通过基于占有 (occupancy-based) 的机制而工作。 总体上， 核酸 ( 包括寡核苷酸 ) 可以描述为″ DNA 样″ ( 即一般具有一个或多个 2′ - 脱氧 糖， 和一般为 T 而非 U 碱基 ) 或″ RNA 样″ ( 即一般具有一个或多个 2′ - 羟基或 2′ - 修 饰的糖， 和一般为 U 而非 T 碱基 )。核酸螺旋可以采用不止一种结构类型， 最常见的是 A 和 B 型。据信， 一般具有 B 型样结构的寡核苷酸是″ DNA 样″的， 而那些具有 A 型样结构的寡 核苷酸则是″ RNA 样″的。在某些 ( 嵌合 ) 实施方案中， 反义化合物可以包含 A 和 B 型区 域两者。
在 另 一 个 优 选 的 实 施 方 案 中， 期望的寡核苷酸或反义化合物包含以下的至 少一种 ： 反义 RNA、 反义 DNA、 嵌合反义寡核苷酸、 包含修饰键合的反义寡核苷酸、 干扰 RNA(RNAi)、 短干扰 RNA(siRNA)、 微小的干扰 RNA(miRNA)、 小的时序 (temporal)RNA(stRNA) 或短的发夹 RNA(shRNA)、 小 RNA 诱导的基因激活 (RNAa)、 小激活 RNA(saRNA) 或它们的组 合。
dsRNA 也可以激活基因表达， 机制已经被术语称为″小 RNA 诱导的基因激活″或 RNAa。靶向基因启动子的 dsRNA 诱导相关基因的强效转录激活。RNAa 在人细胞中利用合成 dsRNA( 术语称为″小激活 RNA″ (saRNA)) 得到证实。目前不知道 RNAa 是否保存于其它生 物中。
小双链 RNA(dsRNA)， 例如小干扰 RNA(siRNA) 和微小 RNA(miRNA)， 已被发现是称为 RNA 干扰 (RNAi) 的进化保守 (conserved) 机制的触发物。RNAi 总是通过改造染色质导致 基因沉默， 从而抑制转录、 降解互补 mRNA 或阻断蛋白翻译。但是， 在下面的实施例部分详细 描述的例子中， 显示寡核苷酸增加血管内皮生长因子 (VEGF) 多核苷酸和其编码产物的表 达和 / 或功能。dsRNA 也可以充当小激活 RNA(saRNA)。不希望被理论所束缚， 通过靶向基因启动子中的序列， saRNA 将在称为 dsRNA 诱导的转录激活 (RNAa) 的现象中诱导靶基因表 达。
在一个进一步的实施方案中， 本文鉴别的″优选靶片段″可以用于筛选调节血管 内皮生长因子 (VEGF) 多核苷酸表达的另外的化合物。″调节剂″是减小或增大编码血管 内皮生长因子 (VEGF) 的核酸分子的表达的那些化合物， 其包含与优选的靶片段互补的至 少 5 个核苷酸部分。筛选方法包括以下步骤 ： 使编码血管内皮生长因子 (VEGF) 的有义或天 然反义多核苷酸的核酸分子的优选靶片段与一种或多种候选调节剂接触， 和选择减小或增 大编码血管内皮生长因子 (VEGF) 多核苷酸的核酸分子表达的一种或多种候选调节剂， 例 如 SEQ ID NO ： 4-9。一旦显示候选调节剂能调节 ( 例如减小或者增大 ) 编码血管内皮生长 因子 (VEGF) 多核苷酸的核酸分子的表达， 则该调节剂可用于血管内皮生长因子 (VEGF) 多 核苷酸的功能的进一步探索性研究， 或根据本发明用作研究、 诊断或治疗剂。
靶向天然反义序列优选调节靶基因的功能。例如 VEGF 基因 (NM_001025366.1， 图 2)。在一个优选的实施方案中， 靶是血管内皮生长因子 A 基因的反义多核苷酸。在一个 优选的实施方案中， 反义寡核苷酸靶向血管内皮生长因子 (VEGF) 多核苷酸 ( 例如注册号 NM_001025366.1， 图 2) 的有义和 / 或天然反义序列、 它们的变体、 等位基因、 同种型、 同系 物、 突变体、 衍生物、 片段和互补序列。优选寡核苷酸是反义分子， 且靶包括反义和 / 或有义 VEGF 多核苷酸的编码和非编码区域。
本发明优选的靶片段也可以和它们各自的本发明互补反义化合物结合， 从而形成 稳定的双链 ( 双链体 ) 寡核苷酸。
本领域已经显示了这样的双链寡核苷酸部分通过反义机制调节靶表达和调节翻 译以及 RNA 处理。 另外， 双链部分可以进行化学修饰 (Fire 等 (1998)Nature， 391， 806-811 ； Timmons 和 Fire， (1998)Nature， 395， 854 ； Timmons 等 (2001)Gene， 263， 103-112 ； Tabara 等 (1998)Science， 282， 430-431 ； Montgomery 等 (1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 95， 15502-15507 ； Tuschl 等 (1999)Genes Dev.， 13， 3191-3197 ； Elbashir 等 (2001)Nature， 411， 494-498 ； Elbashir 等 (2001)Genes Dev.15， 188-200)。例如， 已经显示了这样的双链 部分通过双链体反义链与靶的经典杂交而抑制靶， 从而触发靶的酶促降解 (Tijsterman 等 (2002)Science， 295， 694-697)。
在一个优选的实施方案中， 反义寡核苷酸靶向血管内皮生长因子 (VEGF) 多核苷 酸 ( 例如注册号 NM_001025366.1)、 其变体、 等位基因、 同种型、 同系物、 突变体、 衍生物、 片 段和互补序列。优选寡核苷酸是反义分子。
根据本发明的实施方案， 靶核酸分子并不仅限于血管内皮生长因子 (VEGF)， 还延 及血管内皮生长因子 (VEGF) 分子的任何同种型、 受体、 同系物等。
在另一个优选的实施方案中， 寡核苷酸靶向 VEGF 多核苷酸的天然反义序列， 例如 SEQ ID NO ： 2 和 3 展示的多核苷酸， 及其任何变体、 等位基因、 同系物、 突变体、 衍生物、 片段 和互补序列。反义寡核苷酸的实例如 SEQ ID NO ： 4-9 所展示。
在一个实施方案中， 寡核苷酸和血管内皮生长因子 (VEGF) 反义的核酸序列 ( 非限 制性地包括与血管内皮生长因子 (VEGF) 多核苷酸有关的非编码有义和 / 或反义序列 ) 互 补或结合， 并调节血管内皮生长因子 (VEGF) 分子的表达和 / 或功能。
在另一个优选的实施方案中， 寡核苷酸和 VEGF 天然反义的核酸序列 ( 如 SEQ IDNO ： 2 和 3 所展示 ) 互补或结合， 并调节 VEGF 分子的表达和 / 或功能。
在一个优选的实施方案中， 寡核苷酸包含 SEQ ID NO ： 4-9 的至少 5 个连续核苷酸 的序列， 并调节血管内皮生长因子 (VEGF) 分子的表达和 / 或功能。
多核苷酸靶包括 VEGF( 包含其家族成员 )、 VEGF 的变体、 VEGF 的突变体 ( 包含 SNP)、 VEGF 的非编码序列、 VEGF 的等位基因、 种变体、 片段等。优选寡核苷酸是反义分子。
在另一个优选的实施方案中， 靶向血管内皮生长因子 (VEGF) 多核苷酸的寡核 苷酸包括 ： 反 义 DNA、 干 扰 RNA(RNAi)、 短 干 扰 RNA(siRNA)、 微 小 干 扰 RNA(miRNA)、 小的 时 序 RNA(stRNA)、 或 短 的 发 夹 RNA(shRNA)、 小 RNA 诱 导 的 基 因 激 活 (RNAa) 或 小 激 活 RNA(saRNA)。
在另一个优选的实施方案中， 靶向血管内皮生长因子 (VEGF) 多核苷酸 ( 例如 SEQ ID NO ： 2 和 3) 调节这些靶的表达或功能。在一个实施方案中， 表达或功能相对于对照被上 调。在另一个优选的实施方案中， 表达或功能相对于对照被下调。
在另一个优选的实施方案中， 反义化合物包括 SEQ ID NO ： 4-9 展示的序列。这些 寡核苷酸可包含一个或多个修饰的核苷酸、 较短或较长片段、 修饰的键等。
在另一个优选的实施方案中， SEQ ID NO ： 4-9 包含一个或多个 LNA 核苷酸。
期望的靶核酸的调节可按本领域已知的几种方式进行。 例如反义寡核苷酸、 siRNA 等。酶促核酸分子 ( 例如核酶 ) 是能催化多种反应中的一种或多种的核酸分子， 其包括以 核苷酸碱基序列特异性方式反复切割其它单独的核酸分子的能力。 这种酶促核酸分子可用 于， 例如实际靶向任何 RNA 转录子 (Zaug 等， 324， Nature 429 1986 ； Cech， 260 JAMA 3030， 1988 ； 和 Jefieries 等， 17 Nucleic Acids Research 1371， 1989)。
因为它们的序列特异性， 反式切割酶促核酸分子显示作为人疾病治疗剂的希望 (Usman & McSwiggen， (1995)Ann.Rep.Med.Chem.30， 285-294 ； Christoffersen 和 Marr， (1995)J.Med.Chem.38， 2023-2037)。酶促核酸分子可设计成在细胞 RNA 的背景下切割具体 RNA 靶。这种切割事件使 mRNA 无功能并取消从该 RNA 的蛋白表达。以这种方式， 与疾病状 态相关的蛋白的合成能被选择性地抑制。
总的来说， 具有 RNA 切割活性的酶促核酸通过首先结合靶 RNA 而起作用。这种结 合通过酶促核酸的靶结合部分发生， 该酶促核酸与作用为切割靶 RNA 的分子的酶促部分保 持紧密接近。因此， 酶促核酸首先识别靶 RNA 然后通过互补性碱基配对与之结合， 一旦结合 到正确的位点， 即起酶促作用切割靶 RNA。 策略性切割这种靶 RNA 将破坏其直接合成编码蛋 白的能力。酶促核酸已结合和切割它的 RNA 靶后， 将它从该 RNA 释放出来， 寻找另一个靶， 并可重复结合和切割新靶。
几 种 方 法 ( 例 如 体 外 选 择 ( 进 化 ) 策 略 (Orgel， (1979)Proc.R.Soc.London， B 205， 435)) 已被用于进化新的能催化多种反应 ( 例如磷酸二酯键合和酰胺键合的切割 和连接 ) 的核酸催化剂 (Joyce， (1989)Gene， 82， 83-87 ； Beaudry 等 (1992)Science 257， 635-641 ； Joyce， (1992)Scientific American 267， 90-97 ； Breaker 等 (1994)TIBTECH 12， 268 ； Bartel 等 (1993)Science 261 ： 1411-1418 ； Szostak， (1993)TIBS 17， 89-93 ； Kumar 等 (1995)FASEB J.， 9， 1183 ； Breaker， (1996)Curr.Op.Biotech.， 7， 442)。
开发催化活性最佳的核酶将显著帮助任何出于调节基因表达的目的而采用 RNA 切割核酶的策略。例如锤头状核酶在有饱和浓度的 Mg2+(10mM) 辅助因子存在下的催化速率 (kcat) 大约是 1 分钟 -1。已显示人造″ RNA 连接酶″核酶以大约 100 分钟 -1 的速率催 化相应的自修饰反应。 另外， 已知某些修饰的锤头状核酶 ( 它们具有由 DNA 构成的底物结合 臂 ) 以接近 100 分钟 -1 的多重周转率 (multiple turn-over rate) 催化 RNA 切割。最后， 用特定核苷酸类似物替换锤头的催化核心内的具体残基产生修饰的核酶， 它们显示多达 10 倍的催化速率改进。这些发现表明核酶能促进化学转化， 其催化速率显著大于绝大多数天 然自切割核酶在体外所展示的催化速率。 因此可以优化某些自切割核酶的结构而产生最大 催化活性， 或可以制备对 RNA 磷酸二酯切割展示显著更快速率的全新 RNA 结构域。
通过适合″锤头″模型的 RNA 催化剂在分子间切割 RNA 底物首次显示于 1987 年 (Uhlenbeck， O.C.(1987)Nature， 328 ： 596-600)。 RNA 催化剂被回收并与多个 RNA 分子反应， 这表明了它真正具有催化性。
通过在催化 RNA 中进行适当的碱基变化以保持和靶序列的必要碱基配对， 已将基 于 “锤头状” 结构域设计的催化 RNA 用于切割具体靶序列 (Haseloff 和 Gerlach， (1988) Nature， 334， 585 ； Walbot 和 Bruening， (1988)Nature， 334， 196 ； Uhlenbeck， O.C.(1987) Nature， 328 ： 596-600 ； Koizumi， M. 等 (1988)FEBS Lett.， 228 ： 228-230)。这已经允许使用 催化 RNA 切割具体靶序列， 并表明根据″锤头″模型设计的催化 RNA 可能可以在体内切割 具体的底物 RNA( 参见 Haseloff 和 Gerlach， (1988)Nature， 334， 585 ； Walbot 和 Bruening， (1988)Nature， 334， 196 ； Uhlenbeck， O.C.(1987)Nature， 328 ： 596-600)。 RNA 干扰 (RNAi) 已经变成用于调节哺乳动物和哺乳动物细胞的基因表达的强有 力工具。该方法需要使用表达质粒或病毒以及用于小发夹 RNA( 它们处理成 siRNA) 的编码 序列， 递送作为 RNA 自身或作为 DNA 的小干扰 RNA(siRNA)。该系统能将前 siRNA 有效运输 至细胞质， 在那里它们有活性并允许使用经调节的和组织特异性的基因表达启动子。
在一个优选的实施方案中， 寡核苷酸或反义化合物包括核糖核酸 (RNA) 和 / 或脱 氧核糖核酸 (DNA) 的寡聚体或多聚体， 或它们的模拟物、 嵌合体、 类似物或同系物。该术语 包括由天然存在的核苷酸、 糖和共价核苷间 ( 骨架 ) 键合组成的寡核苷酸， 以及具有非天然 存在部分 ( 其功能类似 ) 的寡核苷酸。由于期望的性质 ( 例如提高的细胞摄取、 提高的对 靶核酸的亲和力、 核酸酶存在下的增大的稳定性 )， 这些经修饰或取代的寡核苷酸通常相对 于天然形式为人所期望。
根据本发明， 寡核苷酸或″反义化合物″包括反义寡核苷酸 ( 例如 RNA、 DNA、 它们 的模拟物、 嵌合体、 类似物或同系物 )、 核酶、 外部引导序列 (EGS) 寡核苷酸、 siRNA 化合物、 单或双链 RNA 干扰 (RNAi) 化合物例如 siRNA 化合物、 saRNA、 aRNA 和其它杂交至靶核酸的 至少一部分并调节其功能的寡聚化合物。因此， 它们可以是 DNA、 RNA、 DNA 样、 RNA 样、 或它 们的混合物、 或可以是这些中的一种或多种的模拟物。这些化合物可以是单链、 双链、 环状 或发夹寡聚化合物， 并可以包含例如内部或末端膨胀、 错配或环的结构元素。 反义化合物通 常线性制备， 但可以被连接或者制备成环状和 / 或分枝状。反义化合物可以包括构建体， 例如两条链杂交形成整体或部分双链的化合物， 或者单链， 该单链具有足够自身互补性以 允许杂交和形成整体或部分双链的化合物。所述两条链可以内部连接而留下自由的 3′或 5′末端， 或可以连接而形成连续的发夹结构或环。发夹结构可以在 5′或 3′末端包含产 生单链特征延伸的突出端。双链化合物可任选在末端包含突出端。进一步的修饰可以包含 缀合基团， 所述缀合基团依附于末端、 选定的核苷酸位置、 糖位置之一或依附于核甘间键合
之一。或者， 两条链可以通过非核酸部分或连接基团连接。当仅由一条链形成时， dsRNA 可 以采取自身向后折回形成双链体的自身互补的发夹型分子的形式。因此， dsRNA 可以整体 或部分是双链。基因表达的具体调节可通过 dsRNA 发夹在转基因细胞系中的稳定表达实现 (Hammond 等 (1991)Nat.Rev.genet.， 2， 110-119 ； Matzke 等 (2001)Curr.Opin.genet.Dev.， 11， 221-227 ； Sharp， (2001)Genes Dev.， 15， 485-490)。 当由两条链， 或单链 ( 它采取自身向 后折回形成双链体的自身互补的发夹型分子的形式 ) 形成时， 这两条链 ( 或单链的形成双 链体的区域 ) 是以华生 - 克里克形式碱基配对的互补 RNA 链。
一旦引入系统， 本发明的化合物可以引发一种或多种酶或结构蛋白的作用， 导致 对靶核酸的切割或其它修饰， 或者可以通过基于占有 (occupancy-based) 的机制而工作。 总体上， 核酸 ( 包括寡核苷酸 ) 可以描述为″ DNA 样″ ( 即一般具有一个或多个 2′ - 脱氧 糖， 和一般为 T 而非 U 碱基 ) 或″ RNA 样″ ( 即一般具有一个或多个 2′ - 羟基或 2′ - 修 饰的糖， 和一般为 U 而非 T 碱基 )。核酸螺旋可以采用不止一种结构类型， 最常见的是 A 和 B 型。据信， 一般具有 B 型样结构的寡核苷酸是″ DNA 样″的， 而那些具有 A 型样结构的寡 核苷酸则是″ RNA 样″的。在某些 ( 嵌合 ) 实施方案中， 反义化合物可以包含 A 和 B 型区 域两者。
根据本发明的反义化合物能包含长度大约 5 到大约 80 个核苷酸 ( 即大约 5 到大 约 80 个连接的核苷 ) 的反义部分。这指的是反义化合物的反义链或部分的长度。换句话 说， 本发明的单链反义化合物包含 5 到大约 80 个核苷酸， 而本发明的双链反义化合物 ( 例 如 dsRNA) 包含长度是 5 到大约 80 个核苷酸的有义和反义链或部分。本领域普通技术人员 将理解这包含长度为 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 51、 52、 53、 54、 55、 56、 57、 58、 59、 60、 61、 62、 63、 64、 65、 66、 67、 68、 69、 70、 71、 72、 73、 74、 75、 76、 77、 78、 79 或 80 个核苷酸， 或它们之间的任何范围的反义部分。
在一个实施方案中， 本发明的反义化合物具有长度是 10 到 50 个核苷酸的反义部 分。本领域普通技术人员将理解这使寡核苷酸具体化为具有长度是 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49 或 50 个核苷酸， 或它们之间的任何范围的反义部分。 在某些 实施方案中， 寡核苷酸长度是 15 个核苷酸。
在一个实施方案中， 本发明的反义或寡核苷酸化合物具有长度是 12 或 13 到 30 个 核苷酸的反义部分。本领域普通技术人员将理解这使反义化合物具体化为具有长度是 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29 或 30 个核苷酸， 或它们之间的 任何范围的反义部分。
在另一个优选的实施方案中， 本发明的寡聚化合物也包含变体， 其中该化合物内 一个或多个核苷酸位置上存在不同的碱基。 例如， 如果第一个核苷酸是腺苷， 可产生在此位 置含有胸苷、 鸟苷或胞苷的变体。这可以在反义或 dsRNA 化合物的任何位置完成。这些化 合物然后使用本文描述的方法来测试， 以测定它们抑制靶核酸表达的能力。
在某些实施方案中， 反义化合物和靶之间的同源性、 序列同一性或互补性是大约 40 ％到大约 60 ％。在某些实施方案中， 同源性、 序列同一性或互补性是大约 60 ％到大约 70％。在某些实施方案中， 同源性、 序列同一性或互补性是大约 70％到大约 80％。在某些实施方案中， 同源性、 序列同一性或互补性是大约 80％到大约 90％。在某些实施方案中， 同 源性、 序列同一性或互补性是大约 90％、 大约 92％、 大约 94％、 大约 95％、 大约 96％、 大约 97％、 大约 98％、 大约 99％或大约 100％。
在另一个优选的实施方案中， 反义寡核苷酸 ( 例如 SEQ ID NO ： 4-9 展示的核酸分 子 ) 包含一种或多种取代或修饰。在一个实施方案中， 核苷酸被锁定核酸 (LNA) 取代。
在另一个优选的实施方案中， 寡核苷酸靶向与 VEGF 相关的编码和 / 或非编码序列 以及 SEQ ID NO ： 1-3 所展示的序列的核酸分子有义和 / 或反义的一个或多个区域。寡核苷 酸也靶向 SEQ ID NO ： 1-3 的重叠区域。
本发明的某些优选寡核苷酸是嵌合寡核苷酸。在本发明的上下文中，″嵌合寡 核苷酸″或″嵌合体″是包含两个或更多个化学不同区域 ( 每个由至少一个核苷酸组成 ) 的寡核苷酸。这些寡核苷酸通常包含至少一个修饰的核苷酸的区域 ( 它赋予一种或多种有 益性质 ( 例如增大的核酸酶抗性、 增大的进入细胞的摄取、 增大的对靶的结合亲和力 ))， 和 是酶 ( 它能切割 RNA:DNA 或 RNA:RNA 杂交体 ) 的底物的区域。举例来说， RNase H 是切割 RNA:DNA 双链体的 RNA 链的细胞内切核酸酶。因此， RNase H 的激活导致 RNA 靶的切割， 从 而极大提高基因表达的反义调节的效率。因此， 和杂交至相同靶区域的硫代磷酸酯脱氧寡 核苷酸相比， 在使用嵌合寡核苷酸时用较短的寡核苷酸经常可以获得可比的结果。 RNA 靶的 切割通常可由凝胶电泳检测， 必要时由本领域已知的关联核酸杂交技术检测。在一个优选 的实施方案中， 嵌合寡核苷酸包含至少一个经修饰以增大靶结合亲和力的区域， 且通常包 含充当 RNAseH 的底物的区域。寡核苷酸与其靶 ( 在这种情况下为编码 ras 的核酸 ) 的亲 和力通常通过测量寡核苷酸 / 靶配对的 Tm 而测定， Tm 是寡核苷酸和靶分离时的温度， 分离 由分光光度法检测。Tm 越高， 寡核苷酸与靶的亲和力越大。
本发明的嵌合反义化合物可作为上述两种或更多种寡核苷酸、 修饰的寡核苷酸、 寡核苷和 / 或寡核苷酸模拟物的复合结构而形成。这样的化合物在本领域也已被称为杂合 物或间合物 (gapmer)。教导制备这种杂合物结构的代表性的美国专利包括但不限于美国 专 利 号 5,013,830、 5,149,797、 5,220,007、 5,256,775、 5,366,878、 5,403,711、 5,491,133、 5,565,350、 5,623,065、 5,652,355、 5,652,356 和 5,700,922， 通过引用将每一项并入本文。
在另一个优选的实施方案中， 经修饰的寡核苷酸的区域包含至少一个在糖的 2′ 位置修饰的核苷酸， 最优选 2′ -O 烷基、 2′ -O- 烷基 -O- 烷基或 2’ - 氟代修饰的核苷酸。 在其它优选的实施方案中， RNA 修饰包括在嘧啶核糖、 脱碱基残基或在 RNA 3′末端的倒置 碱基 (inverted base) 上的 2′ - 氟代、 2′ - 氨基和 2′ O- 甲基修饰。通常将这样的修饰 并入寡核苷酸， 且已显示这些寡核苷酸比 2′ - 脱氧寡核苷酸对给定的靶具有更高的 Tm( 即 更高的靶结合亲和力 )。这种增大的亲和力的效果极大地提高基因表达的 RNAi 寡核苷酸 抑制。RNAse H 是切割 RNA:DNA 双链体的 RNA 链的细胞内切核酸酶， 因此该酶的激活导致 RNA 靶的切割， 因此能极大地提高 RNAi 抑制的效率。RNA 靶的切割通常可由凝胶电泳证实。 在另一个优选的实施方案中， 嵌合寡核苷酸也被修饰以提高核酸酶抗性。细胞包含多种可 以降解核酸的内切或外切核酸酶。 已显示许多核苷酸和核苷修饰使将它们并入的寡核苷酸 比天然寡脱氧核苷酸对核酸酶降解的抗性更大。 核酸酶抗性通常通过用细胞提取物或分离 的核酸酶溶液培养寡核苷酸， 并测量 ( 通常通过凝胶电泳测量 ) 随时间剩余的完整寡核苷 酸的程度而进行测量。 经过修饰以提高它们的核酸酶抗性的寡核苷酸比未修饰的寡核苷酸完整存活更长的时间。已表明多种寡核苷酸修饰提高或赋予核酸酶抗性。目前更优选包含 至少一个硫代磷酸酯修饰的寡核苷酸。在某些情况下， 提高靶结合亲和力的寡核苷酸修饰 也能独立地提高核酸酶抗性。某些期望的修饰可见于 De Mesmaeker 等 (1995)Acc.Chem. Res.， 28 ： 366-374。
本发明展望的某些优选寡核苷酸的具体实例包括那些包含修饰的骨架 ( 例 如硫代磷酸酯、 磷酸三酯、 甲基膦酸酯、 短链烷基或环烷基糖间键合或短链杂原子或杂 环糖间键合 ) 的寡核苷酸。最优选有硫代磷酸酯骨架和那些有杂原子骨架 ( 特别是 CH2--NH--O--CH2、 CH， --N(CH3)--O--CH2[ 称 为 亚 甲 基 ( 甲 基 亚 氨 基 ) 或 MMI 骨 架 ]、 CH2--O--N(CH3)--CH2、 CH2-N(CH3)--N(CH3)--CH2 和 O--N(CH3)--CH2--CH2 骨 架 ) 的 寡 核苷酸， 其中天然磷酸二酯骨架表示为 O--P--O-CH， 。也优选被 De Mesmaeker 等 (1995) Acc.Chem.Res.28 ： 366-374 公开的酰胺骨架。还优选具有吗啉代骨架结构的寡核苷酸 (Summerton 和 Weller， 美国专利号 5,034,506)。在其它优选的实施方案中， 例如寡核苷酸 的肽核酸 (PNA) 骨架、 磷酸二酯骨架被聚酰胺骨架取代， 核苷酸被直接或间接地结合于聚 酰胺骨架上的氮杂氮原子 (Nielsen 等 (1991)Science 254， 1497)。 寡核苷酸也可以包含一 种或多种取代的糖部分。优选的寡核苷酸在 2′位置包含下列之一 ： OH、 SH、 SCH3、 F、 OCN、 OCH3 OCH3、 OCH3 O(CH2)n CH3、 O(CH2)n NH2 或 O(CH2)n CH3( 其中 n 是从 1 到大约 10) ； C1 到 C10 低级烷基、 烷氧基烷氧基、 取代的低级烷基、 烷芳基或芳烷基 ； Cl ； Br ； CN ； CF3 ； OCF3 ； O-、 S- 或 N- 烷基 ； O-、 S- 或 N- 烯基 ； SOCH3 ； SO2 CH3 ； ONO2 ； NO2 ； N3 ； NH2 ； 杂环烷基 ； 杂环烷芳基 ； 氨基烷基氨基 ； 聚烷基氨基 ； 取代的甲硅烷基 ； RNA 切割基团 ； 报道基团 ； 插入 基团 ； 改进寡核苷酸药物动力学性质的基团 ； 或改进寡核苷酸药效学性质的基团和其它具 有类似性质的取代基。优选的修饰包括 2′ - 甲氧基乙氧基 [2′ -O-CH2 CH2OCH3， 也称为 2′ -O-(2- 甲氧基乙基 )](Martin 等 (1995)Helv.Chim.Acta， 78， 486)。 其它优选的修饰包 括 2′ - 甲氧基 (2′ -O--CH3)， 2′ - 丙氧基 (2′ -OCH2 CH2CH3) 和 2′ - 氟代 (2′ -F)。 类似的修饰也可以在寡核苷酸的其它位置上进行， 特别是在 3′末端核苷酸上的糖的 3′ 位置和 5′末端核苷酸上的 5′位置。寡核苷酸也可以有糖模拟物， 例如环丁基代替戊呋喃 糖 (pentofuranosyl) 基团。
寡核苷酸也可另外地或可选地包括核碱基 ( 本领域经常简称为″碱基″ ) 修饰 或取代。本文所用的″未修饰″或″天然″核苷酸包括腺嘌呤 (A)、 鸟嘌呤 (G)、 胸腺嘧啶 (T)、 胞嘧啶 (C) 和尿嘧啶 (U)。修饰的核苷酸包括在天然核酸中仅仅少见或临时见到的 核苷酸， 例如次黄嘌呤、 6- 甲基腺嘌呤、 5- 甲基嘧啶， 特别是 5- 甲基胞嘧啶 ( 也称为 5- 甲 基 -2′脱氧胞嘧啶， 在本领域中常称为 5-Me-C)、 5- 羟甲基胞嘧啶 (HMC)、 糖基 HMC 和龙胆 二糖基 (gentobiosyl)HMC 和合成核苷酸例如 2- 氨基腺嘌呤、 2-( 甲氨基 ) 腺嘌呤、 2-( 咪 唑基烷基 ) 腺嘌呤、 2-( 氨基烷基氨基 ) 腺嘌呤或其它杂取代的烷基腺嘌呤、 2- 硫尿嘧啶、 2- 硫胸腺嘧啶、 5- 嗅尿嘧啶、 5- 羟甲基尿嘧啶、 8- 氮杂鸟嘌呤、 7- 脱氮鸟嘌呤、 N6(6- 氨基 己基 ) 腺嘌呤和 2， 6- 二氨基嘌呤 (Kornberg， A.， DNA Replication， W.H.Freeman & Co.， San Francisco， 1980， pp75-77 ； Gebeyehu， G.， (1987) 等 Nucl.Acids Res.15 ： 4513)。可 包括本领域已知的″通用″碱基， 例如肌苷。已显示 5-Me-C 取代增大核酸双链体的稳定性 0.6-1.2℃ (Sanghvi， Y.S.， in Crooke， S.T. 和 Lebleu， B.， eds.， Antisense Research and Applications， CRC Press， Boca Raton， 1993， pp.276-278)， 且是目前优选的碱基取代。本发明寡核苷酸的另一种修饰包括将一个或多个部分或缀合物 ( 它们提高寡核 苷酸的活性或细胞摄取 ) 化学连接到寡核苷酸。这样的部分包括但不限于脂部分例如胆 固醇部分、 胆固醇基部分 (Letsinger 等 (1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86， 6553)、 胆酸 (Manoharan 等 (1994)Bioorg.Med.Chem.Let.4， 1053)、 硫醚， 例如己基 -S- 三苯甲基硫醇 (Manoharan 等 (1992)Ann.N.Y.Acad.Sci.660， 306 ； Manoharan 等 (1993)Bioorg.Med.Chem. Let.3， 2765)、 硫代胆固醇 (Oberhauser 等 (1992)Nucl.Acids Res.20， 533)、 脂肪族链， 例 如十二烷二醇或十一烷基残基 (Saison-Behmoaras 等 EMBO J.1991， 10， 111 ； Kabanov 等 (1990)FEBS Lett.259， 327 ； Svinarchuk 等 (1993)Biochimie 75， 49)、 磷脂， 例如二 - 十六 烷基 -rac- 甘油或三乙基铵 1， 2- 二 -O- 十六烷基 -rac- 甘油基 -3-H- 膦酸酯 (Manoharan 等 (1995)Tetrahedron Lett.36， 3651 ； Shea 等 (1990)Nucl.Acids Res.18， 3777)、 多胺或 聚乙二醇链 (Manoharan 等 (1995)Nucleosides & Nucleotides， 14， 969) 或金刚烷乙酸 (Manoharan 等 (1995)Tetrahedron Lett.36， 3651)。本领域已知包含亲脂部分的寡核苷酸 和制备这样的寡核苷酸的方法， 例如美国专利号 5,138,045、 5,218,105 和 5,459,255。
不必对给定的寡核苷酸的所有位点进行一致的修饰， 实际上上述不止一种修饰可 以并入单一寡核苷酸甚至寡核苷酸内的单一核苷内。 本发明也包括是上文定义的嵌合寡核 苷酸的寡核苷酸。
在另一个实施方案中， 本发明的核酸分子缀合了另一部分， 其包括但不限于脱碱 基核苷酸、 聚醚、 多胺、 聚酰胺、 肽、 糖、 脂或聚烃化合物。本领域技术人员将认识到这些分 子能在糖、 碱基或磷酸酯基团的几个位置上连接到一个或多个任意的包含核酸分子的核苷 酸。
根据本发明使用的寡核苷酸可以通过公知的固相合成技术方便和常规地制备。 几 个供货商出售用于这种合成的设备， 包括 Applied Biosystems。也可采用任何其它用于这 种合成的装置， 本领域普通技术人员熟知寡核苷酸的实际合成。也公知使用相似技术制备 其它寡核苷酸， 例如硫代磷酸酯和烷基化衍生物。也公知使用类似技术和市售的修饰的阿 米迪特 (amidite) 和可控孔度玻璃 (CPG) 产品 ( 例如生物素、 荧光素、 吖啶或补骨脂素修饰 的阿米迪特和 / 或 CPG(Glen Research， Sterling VA 有售 ))， 以合成荧光标记的、 生物素 化的或其它修饰的寡核苷酸， 例如胆固醇修饰的寡核苷酸。
根据本发明， 使用修饰例如使用 LNA 单体以提高作用的潜能、 特异性和持续时间 并拓宽寡核苷酸的给药路线， 包括当前的化学， 例如 MOE、 ANA、 FANA、 PS 等 (Uhlman 等 (2000) Current Opinions in Drug Discovery & Development Vol.3 No 2)。这可通过由 LNA 单 体取代当前寡核苷酸中的某些单体实现。LNA 修饰的寡核苷酸的大小可以与母体化合物相 似或可以更大或优选更小。优选这样的 LNA 修饰的寡核苷酸包含小于大约 70％、 更优选小 于大约 60％， 最优选小于大约 50％ LNA 单体， 它们的大小在大约 5 和 25 个核苷酸之间， 更 优选在大约 12 和 20 个核苷酸之间。
优选的修饰的寡核苷酸骨架包括但不限于硫代磷酸酯、 手性硫代磷酸酯、 二硫代 磷酸酯、 磷酸三酯、 氨基烷基磷酸三酯、 甲基和其它烷基膦酸酯， 包括 3′烯基膦酸酯和手性 膦酸酯、 亚膦酸酯、 氨基磷酸酯， 包含 3′ - 氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯、 硫羰基 氨基磷酸酯、 硫羰基烷基膦酸酯、 硫羰基烷基磷酸三酯和具有正常 3′ -5′键合的硼烷磷 酸酯、 这些的 2′ -5′连接的类似物和那些具有倒置极性 (inverted polarity) 的， 其中相邻核苷单元对 3′ -5′和 5′ -3′连接或 2′ -5′和 5′ -2′连接。也包括各种盐、 混合 盐和游离酸形式。
教导制备上述含磷键合的代表性的美国专利包括但不限于美国专利号 3,687,808 、 4,469,863 、 4,476,301 、 5,023,243 、 5,177,196 、 5,188,897 、 5,264,423 、 5,276,019 、 5,278,302 、 5,286,717 、 5,321,131 、 5,399,676 、 5,405,939 、 5,453,496 、 5,455,233 、 5,466,677 、 5,476,925 、 5,519,126 、 5,536,821 、 5,541,306 、 5,550,111 、 5,563,253、 5,571,799、 5,587,361 和 5,625,050， 通过引用将每一项并入本文。
优选的修饰的寡核苷酸骨架 ( 其中不包括磷原子 ) 具有由以下形成的骨架 ： 短链 烷基或环烷基核苷间键合、 混合的杂原子和烷基或环烷基核苷间键合或一种或多种短链杂 原子或杂环核苷间键合。这些包括具有以下的那些 ： 吗啉代键合 ( 部分由核苷的糖部分形 成 )、 硅氧烷骨架、 硫化物、 亚砜和砜骨架、 甲酰乙酰基 (Formacetyl) 和硫代甲酰乙酰基骨 架、 亚甲基甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基骨架、 含烯骨架、 氨基磺酸酯骨架、 亚甲基亚氨基 和亚甲基肼基骨架、 磺酸酯和磺酰胺骨架、 酰胺骨架和其它具有混合的 N、 O、 S 和 CH2 组分部 分的骨架。
教导制备上述寡核苷的代表性的美国专利包括但不限于美国专利号 5,034,506、 5,166,315 、 5,185,444 、 5,214,134 、 5,216,141 、 5,235,033 、 5,264,562 、 5,264,564 、 5,405,938 、 5,434,257 、 5,466,677 、 5,470,967 、 5,489,677 、 5,541,307 、 5,561,225 、 5,596,086 、 5,602,240 、 5,610,289 、 5,602,240 、 5,608,046 、 5,610,289 、 5,618,704 、 5,623,070、 5,663,312、 5,633,360、 5,677,437 和 5,677,439， 通过引用将每一项并入本文。
在其它优选的寡核苷酸模拟物中， 核苷酸单元的糖和核苷间键合 ( 即骨架 ) 被新 的基团取代。碱基单元被保留用于与合适的核酸靶化合物杂交。一种这样的寡聚化合物 ( 已显示具有优良杂交性质的寡核苷酸模拟物 ) 称为肽核酸 (PNA)。在 PNA 化合物中， 寡核 苷酸的糖骨架被含酰胺的骨架 ( 特别是氨基乙基甘氨酸骨架 ) 取代。核碱基被保留并直接 或间接结合骨架酰胺部分的氮杂氮原子。教导制备 PNA 化合物的代表性美国专利包括但不 限于美国专利号 5,539,082、 5,714,331 和 5,719,262， 通过引用将每一项并入本文。PNA 化 合物的其它教导可见于 Nielsen 等 (1991)Science 254， 1497-1500。
在本发明的另一个优选实施方案中， 寡核苷酸具有硫代磷酸酯骨架和寡核苷具有 杂原子骨架， 特别是 CH2-NH-O-CH2-、 称为亚甲基 ( 甲基亚氨基 ) 或 MMI 骨架的 -CH2-N(CH3 )-O-CH2-、 -CH2-O-N(CH3)-CH2-、 -CH2N(CH3)-N(CH3)CH2- 和 -O-N(CH3)-CH2-CH2-， 其中天 然磷酸二酯骨架表示成上面引用的美国专利号 5,489,677 的 -O-P-O-CH2-， 和上面引用的 美国专利号 5,602,240 的酰胺骨架。也优选上面引用的美国专利号 5,034,506 的具有吗啉 代骨架结构的寡核苷酸。
修饰的寡核苷酸也可含有一种或多种取代的糖部分。优选的寡核苷酸在 2 ′位 置包含以下之一 ： OH ； F； O-、 S-、 或 N- 烷基 ； O-、 S-、 或 N- 烯基 ； O-、 S- 或 N- 炔基 ； 或O烷 基 -O- 烷基， 其中烷基、 烯基和炔基可以是取代或未取代的 C 到 CO 烷基或 C2 到 CO 烯基和炔 基 (C to CO alkyl or C2 to CO alkenyl and alkynyl)。尤其优选的是 O(CH2)n OmCH3、 O(CH2)n， OCH3、 O(CH2)nNH2、 O(CH2)nCH3、 O(CH2)nONH2 和 O(CH2nON(CH2)nCH3)2， 其中 n 和 m 可以是 1 到大约 10。其它优选的寡核苷酸在 2′位置包含以下之一 ： C 到 CO、 低级烷基、 取代的低级烷基、 烷芳基、 芳烷基、 O- 烷芳基或 O- 芳烷基、 SH、 SCH3、 OCN、 Cl、 Br、 CN、 CF3、OCF3、 SOCH3、 SO2CH3、 ONO2、 NO2、 N3、 NH2、 杂环烷基、 杂环烷芳基、 氨基烷基氨基、 聚烷基氨 基、 取代的甲硅烷基、 RNA 切割基团、 报道基团、 插入基团、 改进寡核苷酸药物动力学性质的 基团、 或改进寡核苷酸药效学性质的基团和其它具有相似性质的取代基。优选的修饰包括 2 ′ - 甲氧基乙氧基 (2 ′ -O-CH2CH2OCH3， 也称为 2 ′ -O-(2- 甲氧基乙基 ) 或 2 ′ -MOE) (Martin 等 (1995)Helv.Chim.Acta， 78， 486-504)， 即烷氧基烷氧基基团。其它优选的修饰 包含 2′ - 二甲基氨基氧基乙氧基 ( 即 O(CH2)2ON(CH3)2 基团， 也称为 2′ -DMAOE， 如本文 以下实施例所述， 和 2′ - 二甲基氨基乙氧基乙氧基 ( 本领域也称为 2′ -O- 二甲基氨基乙 氧基乙基或 2′ -DMAEOE)， 即 2′ -O-CH2-O-CH2-N(CH2)2。
其 它 优 选 的 修 饰 包 括 2 ′ - 甲 氧 基 (2 ′ -OCH3)、 2′-氨基丙氧基 (2′ -OCH2CH2CH2NH2) 和 2′ - 氟代 (2′ -F)。类似的修饰也可以在寡核苷酸的其它位置 上进行， 特别是在 3′末端核苷酸上的糖的 3′位置或 2′ -5′连接的寡核苷酸中和 5′末 端核苷酸的 5′位置。寡核苷酸也可以具有糖模拟物例如环丁基部分取代戊呋喃糖基糖。 教导制备这种修饰的糖结构的美国专利包括但不限于美国专利号 4,981,957、 5,118,800、 5,319,080 、 5,359,044 、 5,393,878 、 5,446,137 、 5,466,786 、 5,514,785 、 5,519,134 、 5,567,811 、 5,576,427 、 5,591,722 、 5,597,909 、 5,610,300 、 5,627,053 、 5,639,873 、 5,646,265、 5,658,873、 5,670,633 和 5,700,920， 通过引用将每一项并入本文。
寡核苷酸也可以包括核碱基 ( 本领域经常简称为″碱基″ ) 修饰或取代。本文 所用的″未修饰″或″天然″核苷酸包含嘌呤碱基腺嘌呤 (A) 和鸟嘌呤 (G)， 和嘧啶碱基 胸腺嘧啶 (T)、 胞嘧啶 (C) 和尿嘧啶 (U)。修饰的核苷酸包括其它合成和天然核苷酸， 例如 5- 甲基胞嘧啶 (5-me-C)， 5- 羟甲基胞嘧啶， 黄嘌呤， 次黄嘌呤， 2- 氨基腺嘌呤， 腺嘌呤和鸟 嘌呤的 6- 甲基和其它烷基衍生物， 腺嘌呤和鸟嘌呤的 2- 丙基和其它烷基衍生物， 2- 硫尿 嘧啶， 2- 硫胸腺嘧啶和 2- 硫胞嘧啶， 5- 卤素尿嘧啶和胞嘧啶， 5- 丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶， 6- 氮杂尿嘧啶、 胞嘧啶和胸腺嘧啶， 5- 尿嘧啶 ( 假尿嘧啶 )， 4- 硫尿嘧啶， 8- 卤素、 8- 氨基、 8- 硫醇、 8- 硫代烷基、 8- 羟基和其它 8- 取代的腺嘌呤和鸟嘌呤， 5- 卤素特别是 5- 溴、 5- 三 氟甲基和其它 5- 取代的尿嘧啶和胞嘧啶， 7- 甲基奎宁和 7- 甲基腺嘌呤， 8- 氮杂鸟嘌呤和 8- 氮杂腺嘌呤， 7- 脱氮鸟嘌呤和 7- 脱氮腺嘌呤和 3- 脱氮鸟嘌呤和 3- 脱氮腺嘌呤。
另 外， 核 苷 酸 包 括 那 些 公 开 于 美 国 专 利 号 3,687,808、 那 些 公 开 于 ′ The Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering ′， 858-859 页， Kroschwitz， J.I. 编辑 John Wiley & Sons， 1990、 那些公开于 Englisch 等′ Angewandle Chemie， International Edition ′， 1991， 30， 613 页 和 那 些 公 开 于 Sanghvi， Y.S.， 15 章，′ Antisense Research and Applications′， 289-302 页， Crooke， S.T. 和 Lebleu， B.ea.， CRC Press， 1993 中的核苷酸。这些核苷酸中特定的一些对增大本发明的寡聚化合 物的结合亲和力特别有用。这些包括 5- 取代的嘧啶、 6- 氮杂嘧啶和 N-2、 N-6 和 0-6 取代 的嘌呤， 包括 2- 氨基丙基腺嘌呤、 5- 丙炔基尿嘧啶和 5- 丙炔基胞嘧啶。已显示 5- 甲基 胞嘧啶取代增大核酸双链体稳定性 0.6-1.2 ℃ (Sanghvi， Y.S.， Crooke， S.T. 和 Lebleu， B.， 编 辑 ′ Antisense Research and Applications ′， CRC Press， Boca Raton， 1993， pp.276-278)， 且为目前优选的碱基取代， 当结合 2′ -O 甲氧基乙基糖修饰时， 它更被特别 优选。
教导制备上述修饰的核苷酸和其它修饰的核苷酸的代表性美国专利包括但不限于美国专利号 3,687,808、 以及 4,845,205、 5,130,302、 5,134,066、 5,175,273、 5,367,066、 5,432,272 、 5,457,187 、 5,459,255 、 5,484,908 、 5,502,177 、 5,525,711 、 5,552,540 、 5,587,469、 5,596,091、 5,614,617、 5,750,692 和 5,681,941， 通过引用将每一项并入本文。
本发明寡核苷酸的另一种修饰包括将一个或多个部分或缀合物 ( 它们提高寡核 苷酸的活性、 细胞分布或细胞摄取 ) 化学连接到寡核苷酸。
这样的部分包括但不限于脂部分例如胆固醇部分 (Letsinger 等 (1989)Proc. Natl.Acad.Sci.USA 86， 6553-6556)、 胆酸 (Manoharan 等 (1994)Bioorg.Med.Chem.Let.4， 1053-1060)、 硫 醚， 例 如 己 基 -S- 三 苯 甲 基 硫 醇 (Manoharan 等 (1992)Ann.N.Y.Acad. Sci.660， 306-309 ； Manoharan 等 (1993)Bioorg.Med.Chem.Let.3， 2765-2770)、 硫代胆固醇 (Oberhauser 等 (1992)Nucl.Acids Res.20， 533-538)、 脂肪族链， 例如十二烷二醇或十一烷 基残基 (Kabanov 等 (1990)FEBS Lett.259， 327-330 ； Svinarchuk 等 (1993)Biochimie 75， 49-54)、 磷脂， 例如二 - 十六烷基 -rac- 甘油或三乙基铵 1， 2- 二 -O- 十六烷基 -rac- 甘油 基 -3-H- 磷酸酯 (Manoharan 等 (1995)Tetrahedron Lett.36， 3651-3654 ； Shea 等 (1990) Nucl.Acids Res.18， 3777-3783)、 多胺或聚乙二醇链 (Manoharan 等 (1995)Nucleosides & Nucleotides， 14， 969-973) 或金刚烷乙酸 (Manoharan 等 (1995)Tetrahedron Lett.36， 3651-3654)、 棕榈基部分 (Mishra 等 (1995)Biochim.Biophys.Acta， 1264， 229-237) 或十八 烷基胺或己基氨基 - 羰基 - 叔羟胆固醇部分 (Crooke 等 (1996)J.Pharmacol.Exp.Ther.， 277， 923-937)。
教导制备这些寡核苷酸缀合物的代表性美国专利包括但不限于美国专利 号 4,828,979 、 4,948,882 、 5,218,105 、 5,525,465 、 5,541,313 、 5,545,730 、 5,552,538 、 5,578,717 、 5,580,731 、 5,580,731 、 5,591,584 、 5,109,124 、 5,118,802 、 5,138,045 、 5,414,077 、 5,486,603 、 5,512,439 、 5,578,718 、 5,608,046 、 4,587,044 、 4,605,735 、 4,667,025 、 4,762,779 、 4,789,737 、 4,824,941 、 4,835,263 、 4,876,335 、 4,904,582 、 4,958,013 、 5,082,830 、 5,112,963 、 5,214,136 、 5,082,830 、 5,112,963 、 5,214,136 、 5,245,022 、 5,254,469 、 5,258,506 、 5,262,536 、 5,272,250 、 5,292,873 、 5,317,098 、 5,371,241 、 5,391,723 、 5,416,203 、 5,451,463 、 5,510,475 、 5,512,667 、 5,514,785 、 5,565,552 、 5,567 ,810 、 5,574,142 、 5,585,481 、 5,587,371 、 5,595,726 、 5,597,696 、 5,599,923、 5,599,928 和 5,688,941， 通过引用将每一项并入本文。
药物发现 ： 本发明的化合物也可用于药物发现和靶确认的领域。本发明包括在 药物发现努力中使用本文鉴别的化合物和优选靶片段， 进而阐述存在于血管内皮生长因子 (VEGF) 多核苷酸和疾病状态、 显型或症状之间的关系。这些方法包括检测或调节血管内皮 生长因子 (VEGF) 多核苷酸， 包括使样品、 组织、 细胞或生物接触本发明的化合物， 测量血管 内皮生长因子 (VEGF) 多核苷酸的核酸或蛋白水平和 / 或在治疗后某时间的相关表型或化 学终点， 以及任选地将测量的值和未处理样品或用本发明其它化合物处理的样品比较。这 些方法也可以与其它实验平行进行或联合进行， 进而测定未知基因对于靶确认过程的功能 或者测定特定基因产品作为治疗或预防特定疾病、 症状或表型的靶的有效性。
评价基因表达的上调或抑制 ：
将外源核酸转入宿主细胞或生物体可以通过直接检测细胞或生物体中该核酸的 存在来评价。 这种检测可用本领域已知的几种方法实现。 例如， 外源核酸的存在可通过 DNA印迹法 (Southern blot) 或通过聚合酶链式反应 (PCR) 技术 ( 它使用特异性放大和核酸有 关的核苷酸序列的引物 ) 而检测。外源核酸的表达也可以使用包括基因表达分析的常规方 法来测量。例如， 从外源核酸产生的 mRNA 可以使用 DNA 印迹法和反转录 PCR(RT-PCR) 检测 和定量。
从外源核酸表达 RNA 也可以通过测量酶活性或报道蛋白活性来检测。例如， 反义 调节活性可以间接地按照靶核酸表达的减小或增大 ( 它作为外源核酸产生效应子 RNA 的 指示 ) 而测量。基于序列保守性 (conservation)， 引物可被设计和用于放大靶基因的编码 区域。最初， 来自每个基因的最高度表达的编码区可用来建立模型对照基因， 但也可以使 用任何编码或非编码区。每个对照基因通过在报道编码区和其多聚 (A) 信号之间插入每 个编码区而装配。这些质粒将产生在基因的上游部分具有报道基因和在 3′非编码区具有 潜在 RNAi 靶的 mRNA。通过调节报道基因将使单个反义寡核苷酸的有效性得到试验。在本 发明方法中有用的报道基因包括乙酰羟酸合酶 (AHAS)、 碱性磷酸酶 (AP)、 β 半乳糖苷酶 (LacZ)、 β- 葡萄糖透明质酸酶 (GUS)、 氯霉素乙酰转移酶 (CAT)、 绿色荧光蛋白 (GFP)、 红色 荧光蛋白 (RFP)、 黄色荧光蛋白 (YFP)、 青色荧光蛋白 (CFP)、 辣根过氧化物酶 (HRP)、 萤光素 酶 (Luc)、 胭脂氨酸合成酶 (NOS)、 章鱼碱合成酶 (OCS) 和它们的衍生物。可用多种可选标 记， 它们赋予针对氨苄青霉素、 博来霉素、 氯霉素、 庆大霉素、 潮霉素、 卡那霉素、 林可霉素、 氨甲喋呤、 膦丝菌素、 嘌呤霉素和四环素的抗性。 测定报道基因的调节的方法在本领域是公 知的， 且包括但不限于荧光法 ( 例如荧光光谱法、 荧光激活细胞分选术 (FACS)、 荧光显微镜 术 )、 抗生素抗性测定。
试剂盒、 研究试剂、 诊断和治疗
本发明的化合物可以用于诊断、 治疗和预防， 以及作为研究试剂和试剂盒的组件。 另外， 能以精密的特异性抑制基因表达的反义寡核苷酸， 经常被本领域普通技术人员用于 阐释特定基因的功能或用于区分生物路径的各种成员之间的功能。
对于用于试剂盒和诊断以及各种生物系统， 本发明的化合物 ( 单独或联合其它化 合物或治疗 ) 可用作有差别的和 / 或组合的分析中的工具， 以阐释细胞和组织内表达的基 因的一部分或整个互补的表达模式。
本文所用的术语″生物系统″或″系统″定义为表达， 或使之有能力表达血管内 皮生长因子 (VEGF) 基因的产物的任何生物体、 细胞、 细胞培养物或组织。这些包括但不限 于人、 转基因动物、 细胞、 细胞培养物、 组织、 异种移植物、 移植物和它们的组合。
作为一个非限制性的实例， 比较用一种或多种反义化合物处理的细胞或组织和未 用反义化合物处理的对照细胞或组织的表达模式， 并分析产生的模式的不同基因表达水 平， 它们与被检测基因的例如疾病关联、 信号通路、 细胞定位、 表达水平、 大小、 结构或功能 相关。 这些分析可以在经刺激或未经刺激的细胞上和在存在或不存在影响表达模式的其它 化合物时进行。
本领域已知的基因表达分析的方法的实例包括 DNA 阵列或微阵列 (Brazma 和 Vilo， (2000)FEBS Lett.， 480， 17-24 ； Celis 等 (2000)FEBS Lett.， 480， 2-16)、 SAGE( 基因 表达的连续分析 )(Madden 等 (2000)Drug Discov.Today， 5， 415-425)、 READS( 消化的 cDNA 的限制性酶放大 )(Prashar 和 Weissman， (1999)Methods Enzymol.， 303， 258-72)、 TOGA( 全 基因表达分析 )(Sutcliffe 等 (2000)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.， 97， 1976-81)、 蛋白质阵列和蛋白组学 (Celis 等 (2000)FEBS Lett.， 480， 2-16 ； Jungblut 等， Electrophoresis， 1999， 20， 2100-10)、 表达的序列标签 (EST) 测序 (Celis 等， FEBS Lett.， 2000， 480， 2-16 ； Larsson 等， J.Biotechnol.， 2000， 80， 143-57)、 消减式 RNA 指纹法 (SuRF)(Fuchs 等， (2000) Anal.Biochem.286， 91-98 ； Larson 等， (2000)Cytometry 41， 203-208)、 消减式克隆、 差异 展示 (DD)(Jurecic 和 Belmont， (2000)Curr.Opin.Microbiol.3， 316-21)、 比较基因组杂 交 (Carulli 等， (1998)J.Cell Biochem.Suppl.， 31， 286-96)、 FISH( 荧 光 原 位 杂 交 ) 技 术 (Going 和 Gusterson， (1999)Eur.J.Cancer， 35， 1895-904) 和质谱法 (To， Comb.(2000) Chem.High Throughput Screen， 3， 235-41)。
本发明的化合物可用于研究和诊断， 因为这些化合物杂交至编码血管内皮生长因 子 (VEGF) 的核酸。例如， 寡核苷酸 ( 它们在本文公开的使它们成为有效的血管内皮生长因 子 (VEGF) 调节剂的效率和条件下杂交 ) 在有利于基因放大或检测的条件下分别是有效的 引物或探针。这些引物和探针可用于需要核酸分子 ( 它们编码血管内皮生长因子 (VEGF)) 的特异性检测的方法中， 和用于所述核酸分子的放大 ( 用于检测或用于进一步研究血管内 皮生长因子 (VEGF)) 中。本发明的反义寡核苷酸 ( 特别是引物和探针 ) 和编码血管内皮生 长因子 (VEGF) 的核酸的杂交可通过本领域已知的方法检测。这样的方法可以包括将酶缀 合到寡核苷酸、 放射标记寡核苷酸或任何其它适合的检测方法。也可以制备将这样的检测 方法用于检测样品中的血管内皮生长因子 (VEGF) 水平的试剂盒。
为了治疗用途， 本领域技术人员也利用反义的特异性和灵敏性。已将反义化合物 用作治疗动物 ( 包括人 ) 的疾病状态的治疗部分。反义寡核苷酸药物已经安全和有效地给 予人， 目前也在进行许多临床试验。 因此已确定寡核苷酸可以是有用的治疗手段， 所述治疗 手段可经设置用于治疗细胞、 组织和动物 ( 尤其是人 ) 的治疗方案。
对于治疗， 通过给予根据本发明的反义化合物来治疗疑似具有疾病或病症 ( 其可 通过调节血管内皮生长因子 (VEGF) 多核苷酸的表达来治疗 ) 的动物 ( 优选为人 )。例如， 在一个非限制性实施方案中， 方法包括将治疗有效量的血管内皮生长因子 (VEGF) 调节剂 给予需要治疗的动物的步骤。本发明的血管内皮生长因子 (VEGF) 调节剂有效地调节血管 内皮生长因子 (VEGF) 的活性或调节血管内皮生长因子 (VEGF) 蛋白的表达。在一个实施方 案中， 相对于对照， 动物中血管内皮生长因子 (VEGF) 的活性或表达被抑制大约 10％。优选 动物中血管内皮生长因子 (VEGF) 的活性或表达被抑制大约 30％。更优选动物中血管内皮 生长因子 (VEGF) 的活性或表达被抑制 50％或更多。因此， 相对于对照， 寡聚化合物调节血 管内皮生长因子 (VEGF)mRNA 的表达至少 10％、 至少 50％、 至少 25％、 至少 30％、 至少 40％、 至少 50％、 至少 60％、 至少 70％、 至少 75％、 至少 80％、 至少 85％、 至少 90％、 至少 95％、 至 少 98％、 至少 99％或 100％。
在一个实施方案中， 相对于对照， 动物中血管内皮生长因子 (VEGF) 的活性或表达 增大了大约 10％。优选动物中血管内皮生长因子 (VEGF) 的活性或表达增大了大约 30％。 更优选动物中血管内皮生长因子 (VEGF) 的活性或表达增大了大约 50％或更多。因此， 相 对于对照， 寡聚化合物调节血管内皮生长因子 (VEGF)mRNA 的表达至少 10％、 至少 50％、 至 少 25％、 至少 30％、 至少 40％、 至少 50％、 至少 60％、 至少 70％、 至少 75％、 至少 80％、 至少 85％、 至少 90％、 至少 95％、 至少 98％、 至少 99％或 100％。
例如， 血管内皮生长因子 (VEGF) 的表述的减少可以在血清、 血液、 脂肪组织、 肝脏或动物的任何其它体液、 组织或器官中测量。 优选被分析的所述液体、 组织或器官中所含的 细胞含有编码血管内皮生长因子 (VEGF) 肽和 / 或血管内皮生长因子 (VEGF) 蛋白自身的核 酸分子。
通过添加有效量的化合物到适合的药学可接受的稀释剂或载体中， 本发明的化合 物可用于药学组合物。本发明的化合物和方法的用途也可用于预防。
缀合物
本发明寡核苷酸的另一种修饰包括将一个或多个部分或缀合物 ( 它们提高寡核 苷酸的活性、 细胞分布或细胞摄取 ) 化学连接到寡核苷酸。这些部分或缀合物可以包括共 价连接到官能团 ( 例如初级或次级羟基 ) 的缀合基团。本发明的缀合基团包括插入基团、 报道分子、 多胺、 聚酰胺、 聚乙二醇、 聚醚、 提高寡聚体药效性质的基团和提高寡聚体药物动 力学性质的基团。典型的缀合基团包括胆固醇、 脂质、 磷脂、 生物素、 吩嗪、 叶酸酯、 菲啶、 蒽 醌、 吖啶、 荧光素、 罗丹明、 香豆素和染料。在本发明的上下文中， 提高药效学性质的基团包 括改进摄取、 提高降解抗性和 / 或增强和靶核酸的序列特异性杂交的基团。在本发明的上 下文中， 提高药物动力学性质的基团包括改进本发明化合物的摄取、 分布、 代谢或排泄的基 团。代表性的缀合基团公开于 1992 年 10 月 23 号提出的国际专利申请号 PCT/US92/09196， 和美国专利号 6,287,860， 通过引用将它们并入本文。 缀合物部分包括但不限于脂质部分例 如胆固醇部分、 胆酸、 硫醚， 例如己基 -5- 三苯甲基硫醇、 硫代胆固醇、 脂肪族链， 例如十二 烷二醇或十一烷基残基、 磷脂， 例如二 - 十六烷基 -rac- 甘油或三乙基铵 1， 2- 二 -O- 十六 烷基 -rac- 甘油基 -3-H 膦酸酯、 多胺或聚乙二醇链、 或金刚烷乙酸、 棕榈基部分、 或十八烷 基胺或己基氨基 - 羰基 - 羟胆固醇部分。本发明的寡核苷酸也可以缀合到活性药物物质， 例如阿司匹林、 华法林、 保泰松、 布洛芬、 舒洛芬、 芬布芬、 酮洛芬、 (S)-(+)- 普拉洛芬、 卡洛 芬、 丹磺酰肌氨酸、 2， 3， 5- 三碘苯甲酸、 氟芬那酸、 亚叶酸、 苯并噻二嗪、 氯噻嗪、 二氮杂卓 (diazepine)、 吲哚美辛、 巴比妥酸盐、 头孢菌素、 磺胺药、 抗糖尿病药、 抗菌药或抗生素。
教导制备这些寡核苷酸缀合物的代表性的美国专利包括但不限于美国专利 号： 4,828,979 、 4,948,882、 5,218,105 、 5,525,465 、 5,541,313 、 5,545,730 、 5,552,538、 5,578,717 、 5,580,731 、 5,580,731 、 5,591,584 、 5,109,124 、 5,118,802 、 5,138,045 、 5,414,077 、 5,486,603 、 5,512,439 、 5,578,718 、 5,608,046 、 4,587,044 、 4,605,735 、 4,667,025 、 4,762,779 、 4,789,737 、 4,824,941 、 4,835,263 、 4,876,335 、 4,904,582 、 4,958,013 、 5,082,830 、 5,112,963 、 5,214,136 、 5,082,830 、 5,112,963 、 5,214,136 、 5,245,022 、 5,254,469 、 5,258,506 、 5,262,536 、 5,272,250 、 5,292,873 、 5,317,098 、 5,371,241 、 5,391,723 、 5,416,203 、 5,451,463 、 5,510,475 、 5,512,667 、 5,514,785 、 5,565,552 、 5,567,810 、 5,574,142 、 5,585,481 、 5,587,371 、 5,595,726 、 5,597,696 、 5,599,923、 5,599,928 和 5,688,941。
制剂
本发明的化合物也可以和其它分子、 分子结构或化合物的混合物混合、 制成胶囊、 缀合或关联， 成为例如脂质体、 靶向受体的分子、 口服、 直肠、 局部或其它制剂， 以协助摄取、 分布和 / 或吸收。 教导制备这种协助摄取、 分布和 / 或吸收的制剂的代表性美国专利包括但 不限于美国专利号 5,108,921、 5,354,844、 5,416,016、 5,459,127、 5,521,291、 5,543,165、 5,547,932 、 5,583,020 、 5,591,721 、 4,426,330 、 4,534,899 、 5,013,556 、 5,108,921 、5,213,804 、 5,227,170 、 5,264,221 、 5,356,633 、 5,395,619 、 5,416,016 、 5,417,978 、 5,462,854 、 5,469,854 、 5,512,295 、 5,527,528 、 5,534,259 、 5,543,152 、 5,556,948 、 5,580,575 和 5,595,756， 通过引用将每一项并入本文。
虽然， 为了调节靶表达和 / 或功能， 反义寡核苷酸不需要在载体的环境中给药， 但 本发明的实施方案涉及用于反义寡核苷酸的表达的表达载体构建体， 包含启动子、 杂交启 动子基因序列并具有强组成启动子活性， 或在期望的情形下能被诱导的启动子活性。
在一个实施方案中， 发明实施包括用合适的核酸递送系统给予前述反义寡核苷酸 的至少一种。在一个实施方案中， 该系统包含可操作地连接到多核苷酸的非病毒载体。这 样的非病毒载体的实例包括只有寡核苷酸 ( 例如 SEQ ID NO ： 4-9 中的任一种或多种 ) 或者 寡核苷酸联合合适的蛋白、 多糖或脂质制剂。
另外合适的核酸递送系统包括病毒载体， 通常是来自腺病毒、 腺病毒相关的病毒 (AAV)、 依赖辅助的腺病毒 (helper-dependent adenovirus)、 逆转录病毒或日本脂质体的 血细胞凝集素病毒 (hemagglutinatin virus)(HVJ) 复合物的至少一种的序列。优选病毒 载体包含可操作地连接到多核苷酸的强真核启动子， 例如巨细胞病毒 (CMV) 启动子。
另外优选的载体包括病毒载体、 融合蛋白和化学缀合物。逆转录病毒载体包括莫 洛尼鼠白血病病毒和基于 HIV 的病毒。一个优选的基于 HIV 的病毒载体包含至少两个载 体， 其中 gag 和 pol 基因来自 HIV 基因组， env 基因来自另一个病毒。优选 DNA 病毒载体。 这些载体包括诸如正痘 (orthopox) 或禽痘 (avipox) 载体的痘载体、 诸如单纯疱疹 I 病毒 (HSV) 载体的疱疹病毒载体 [Geller， A.I. 等 (1995)J.Neurochem， 64 ： 487 ； Lim， F. 等， 于 DNA Cloning ： Mammalian Systems， D.Glover， Ed.(Oxford Univ.Press， Oxford England) (1995) ； Geller， A.I. 等 (1993)Proc Natl.Acad.Sci. ： U.S.A. ： 90 7603 ； Geller， A.I. 等 (1990)Proc Natl.Acad.Sci USA ： 87 ： 1149]、 腺病毒载体 (LeGal LaSalle 等， Science， 259 ： 988(1993) ； Davidson 等， (1993)Nat.Genet.3 ： 219 ； Yang 等 (1995)J.Virol.69 ： 2004) 和腺 关联病毒载体 (Kaplitt， M.G. 等 (1994)Nat.Genet.8 ： 148)。
本发明的反义化合物包括任何药学可接受的盐、 酯、 或这样的酯的盐、 或任何其它 化合物， 其在给予包括人的动物时能 ( 直接或间接 ) 提供生物活性代谢物或其剩余物。
术语″药学可接受的盐″指本发明化合物的生理和药学可接受的盐， 即保留母体 化合物的期望的生物活性， 且不使其具有不期望的毒性效果的盐。 对于寡核苷酸， 优选的药 学可接受的盐的实例和它们的用途进一步描述于美国专利号 6,287,860， 通过引用将其并 入本文。
本发明也包括包含本发明的反义化合物的药学组合物和制剂。 本发明的药学组合 物可根据期望的是局部还是全身治疗以及待治疗的部位而用多种方式给药。 给药可以是局 部给药 ( 包括眼部给药和向粘膜给药 ( 包括阴道和直肠递送 ))、 肺部给药 ( 例如通过吸入 或吹入粉末或气雾剂 ( 包括通过喷雾器 )、 气管内、 鼻内、 表皮和经皮给药 )、 口服或胃肠外 给药。胃肠外给药包括静脉内、 动脉内、 皮下、 腹膜内或肌内注射或注入、 或颅内 ( 例如鞘膜 内或心室内 ) 给药。据信具有至少一个 2′ -O- 甲氧基乙基修饰的寡核苷酸对于口服给药 特别有用。用于局部给药的药学组合物和制剂可以包括经皮贴剂、 药膏、 洗剂、 乳剂、 凝胶 剂、 滴剂、 栓剂、 喷雾剂、 液体和粉末。常规药学载体、 水性、 粉末或油性基底、 增稠剂等可以 是必需或期望的。经涂布的避孕套、 手套等也可以是有用的。本发明的药学制剂 ( 其可以便利地以单元剂量形式存在 ) 可根据药学工业公知的 常规技术制备。这样的技术包括使活性成分和药学载体或赋形剂关联的步骤。一般而言， 制剂通过使活性成分和液体载体或精细分开的固体载体或这两者均匀地和密切地相关联， 然后在必要时使产物成型， 而制备。
本发明的组合物可以配制成任意的许多可能剂型， 例如但不限于片剂、 胶囊、 凝胶 胶囊、 液体糖浆剂、 软凝胶、 栓剂和灌肠剂。 本发明的组合物也可以配制成水性、 非水性或混 合介质中的悬浮液。水性悬浮液可以进一步包含增大悬浮液粘度的物质， 例如羧甲基纤维 素钠、 山梨糖醇和 / 或葡聚糖。悬浮液也可以包含稳定剂。
本发明的药学组合物包括但不限于溶液、 乳剂、 泡沫和含脂质体的制剂。 本发明的 药学组合物和制剂可以包含一种或多种渗透促进剂、 载体、 赋形剂或其它活性或非活性成 分。
乳剂通常是一种液体以直径通常超过 0.1μm 的液滴的形式分散于另一种的非均 相体系。除了分散的相和活性药物 ( 其可以作为水相或油相中的溶液存在或者自身作为单 独的相存在 )， 乳剂可以包含另外的组分。 本发明的实施方案包括微乳剂。 乳剂及其用途在 本领域是公知的， 并进一步描述于美国专利号 6,287,860。
本发明的制剂包括脂质体制剂。 本文所用的术语″脂质体″意指由排列成球形双 层的两亲的脂质组成的囊泡。脂质体是单层或多层囊泡， 其具有由亲脂材料形成的膜和包 含待递送组合物的水性内部。阳离子脂质体是带正电的脂质体， 据信它们与带负电的 DNA 分子互相作用形成稳定的复合体。据信对 pH 敏感或带负电的脂质体捕获 DNA 而不是与它 复合。阳离子和非阳离子脂质体都已被用于向细胞递送 DNA。
脂质体也包括″立体稳定的″脂质体， 本文所用的该术语指包含一种或多种专门 脂质的脂质体。当并入脂质体时， 这些专门脂质得到相对于没有这些专门脂质的脂质体具 有提高的循环寿命的脂质体。立体稳定的脂质体的实例是以下那些， 其中脂质体中形成囊 泡的脂质部分的一部分包含一种或多种糖脂， 或者衍生自一种或多种亲水聚合物， 例如聚 乙二醇 (PEG) 部分。脂质体和它们的用途进一步描述于美国专利号 6,287,860。
本发明的药学制剂和组合物也可以包括表面活性剂。表面活性剂在药品、 制剂 和乳剂中的用途是本领域公知的。表面活性剂和它们的用途进一步描述于美国专利号 6,287,860， 通过引用将其并入本文。
在一个实施方案中， 本发明采用多种渗透促进剂进行核酸 ( 特别是寡核苷酸 ) 的 有效递送。 除了帮助非亲脂性药物扩散穿过细胞膜， 渗透促进剂也提高亲脂药物的渗透性。 渗透促进剂可以分类成属于五个宽泛的类型 ( 即表面活性剂、 脂肪酸、 胆汁盐、 螯合剂和非 螯合非表面活性剂 ) 之一。 渗透促进剂和它们的用途进一步描述于美国专利号 6,287,860， 通过引用将其并入本文。
本领域技术人员将认识到制剂通常根据它们的预期用途， 即给药途径而设计。
优选的用于局部给药的制剂包括那些本发明的寡核苷酸与局部递送剂 ( 例如脂 质、 脂质体、 脂肪酸、 脂肪酸酯、 类固醇、 螯合剂和表面活性剂 ) 混合的制剂。优选的脂质 和脂质体包括中性 ( 例如二油酰基 - 磷脂酰基 DOPE 乙醇胺、 二肉豆蔻酰基磷脂酰基胆碱 DMPC、 二硬脂酰基磷脂酰基胆碱 )、 阴性 ( 例如二肉豆蔻酰基磷脂酰基甘油 DMPG) 和阳离子 性 ( 例如二油酰基四甲基氨基丙基 DOTAP 和二油酰基 - 磷脂酰基乙醇胺 DOTMA)。对于局部或其它给药， 本发明寡核苷酸可被脂质体包裹在内或可与之形成复合 物， 特别是和阳离子性脂质体。 或者， 寡核苷酸可以和脂质复合， 特别是和阳离子性脂质。 优 选的脂肪酸和酯， 它们的药学可接受盐和它们的用途进一步描述于美国专利号 6,287,860。
用于口服给药的组合物和制剂包括粉末或粒料、 微颗粒、 纳颗粒、 在水或非水性介 质中的悬浮液或溶液、 胶囊、 凝胶胶囊、 囊剂、 片剂或小片剂。 可以期望增稠剂、 调味剂、 稀释 剂、 乳化剂、 分散助剂或粘合剂。 优选的口服制剂是那些其中本发明的寡核苷酸与一种或多 种渗透促进剂表面活性和螯合剂联合给药的制剂。优选的表面活性剂包括脂肪酸和 / 或其 酯或其盐、 胆酸和 / 或其盐。优选的胆酸 / 盐和脂肪酸以及它们的用途进一步描述于美国 专利号 6,287,860， 通过引用将其并入本文。还优选渗透促进剂的组合物， 例如脂肪酸 / 盐 联合胆酸 / 盐。特别优选的组合物是月桂酸的钠盐、 癸酸和 UDCA。其它渗透促进剂包括聚 氧乙烯 -9- 月桂基醚、 聚氧乙烯 -20- 鲸蜡基醚。本发明的寡核苷酸可以粒料形式 ( 包括喷 雾的干燥颗粒或复合形成微颗粒或纳颗粒 ) 口服递送。寡核苷酸复合剂和它们的用途进一 步描述于美国专利号 6,287,860， 通过引用将其并入本文。
用于肠道外、 鞘膜内或心室内给药的组合物和制剂可以包括无菌水溶液， 该无菌 水溶液也可以包含缓冲剂、 稀释剂和其它合适添加剂例如但不限于渗透促进剂、 载体化合 物和其它药学可接受的载体或赋形剂。
本发明的某些实施方案提供包含通过一种或多种寡聚化合物和一种或多种通 过非反义机制起作用的其它化学治疗剂的药学组合物。这些化学治疗剂的实例包括 但不限于癌症化学治疗药物例如柔红霉素、 道诺霉素、 更生霉素、 阿霉素、 表柔比星、 伊 达比星、 依索比星、 博来霉素、 马磷酰胺、 异环磷酰胺、 阿糖胞苷、 二氯乙基 - 亚硝基脲 (bischloroethyl-nitrosurea)、 白消安、 丝裂霉素 C、 放线菌素 D、 普卡霉素、 泼尼松、 羟孕 酮、 睾丸酮、 他莫昔芬、 氮烯唑胺、 甲基苄肼、 六甲蜜胺、 五甲蜜胺、 米托蒽醌、 安吖啶、 苯丁 酸氮芥、 甲基环己基亚硝基脲 (methylcyclohexylnitrosurea)、 氮芥、 美法仑、 环磷酰胺、 6- 巯基嘌呤、 6- 硫代鸟嘌呤、 阿糖胞苷、 5- 氮杂胞苷、 羟基脲、 脱氧柯福霉素、 4- 羟基过氧环 磷酰胺、 5- 氟尿嘧啶 (5-FU)、 5- 氟脱氧尿嘧啶 (5-FUdR)、 甲氨蝶呤 (MTX)、 秋水仙碱、 泰素、 长春新碱、 长春碱、 依托泊苷 (VP-16)、 三甲曲沙、 伊立替康、 托泊替康、 吉西他滨、 替尼泊苷、 顺铂和己烯雌酚 (DES)。当与本发明的化合物联用时， 这些化学治疗剂可单独使用 ( 例如 5-FU 和寡核苷酸 )、 依序使用 ( 例如 5-FU 和寡核苷酸用一段时间， 接着用 MTX 和寡核苷酸 ) 或与一种或多种其它这样的化学治疗剂联用 ( 例如 5-FU、 MTX 和寡核苷酸， 或 5-FU、 放射治 疗和寡核苷酸 )。消炎药 ( 包括但不限于非类固醇消炎药和皮质激素 ) 和抗病毒药物 ( 包 括但不限于利巴韦林 (ribivirin)、 阿糖腺苷、 阿昔洛韦和更昔洛韦 ) 也可以结合到本发明 的组合物。反义化合物和其它非反义药物的组合也落在本发明的范围内。两种或更多种相 结合的化合物可以一起使用或依序使用。
在另一个相关的实施方案中， 本发明的组合物可以包含一种或多种靶向第一核酸 的反义化合物 ( 特别是寡核苷酸 ) 和一种或多种靶向第二核酸靶的另外的反义化合物。 例如第一个靶可以是血管内皮生长因子 (VEGF) 的特定反义序列， 且第二个靶可以是来自 另一个核苷酸序列的区域。或者， 本发明的组合物可以包含靶向相同血管内皮生长因子 (VEGF) 核酸靶的不同区域的两种或更多种反义化合物。本文说明了反义化合物的许多实 例， 其它可选自本领域已知的适合的化合物。两种或更多种相结合的化合物可以一起使用或依序使用。
给药 ：
治疗组合物的配方和它们的后续服药 ( 给药 ) 相信是在本领域技术人员的技能之 内。 给药取决于待治疗疾病状态的严重性和反应， 治疗过程可持续几天到几月， 或直到治愈 或实现疾病状态的减轻。最佳给药方案可从患者体内药物累积的测量来计算。普通技术人 员能容易地确定最佳剂量、 给药方法和重复率。最佳剂量可以根据个别寡核苷酸的相对功 效而变化， 且一般可以根据在体外和体内动物模型中发现有效的 EC50 来估算。总体而言， 剂量是从 0.01μg 到 100g 每千克体重， 可以每天、 每周、 每月或每年给药一次或多次， 甚至 每 2 到 20 年给药一次。本领域普通技术人员能根据在体液或组织中测量的药物的停留时 间和浓度容易地估算给药重复率。成功治疗后， 可期望让患者经历持续治疗以防止疾病状 态的复发， 其中寡核苷酸以持续剂量给药， 剂量范围从 0.01μg 到 100g 每千克体重， 每天一 次或多次到每 20 年一次。
尽管上面已经描述了本发明的多个实施方案， 应当理解的是它们仅以实施例的方 式展示， 而非限制。根据本文的公开， 不脱离本发明的精神或范围， 可对公开的实施方案进 行许多改变。因此， 本发明的宽度和范围不应该被任何上述实施方案限制。
本文提到的所有文献都通过引用并入本文。 本申请中引用的所有出版物和专利文 献都出于所有目的通过引用并入本文， 引用的程度和仿佛每篇单独的出版物或专利文献被 单独这样指出一样。通过在本文中引用多种参考文献， 申请人并不承认任何特定参考文献 是他们的发明的 “现有技术” 。本发明的组合物和方法的实施方案在下列实施例中加以说 明。 实施例 以下非限制性实施例用于说明本发明经选择的实施方案。 应理解的是显示的比例 的变化和组分元素的选择对本领域技术人员来说是显而易见的， 且在本发明实施方案的范 围内。
实施例 1 ： 设计对血管内皮生长因子 (VEGF) 多核苷酸的核酸分子反义和或有义链 特异的反义寡核苷酸
如上指明的， 术语″对…特异的寡核苷酸″或″靶向…的寡核苷酸″指具有如下 序列的寡核苷酸， 所述序列 ： (i) 能与靶向的基因的一部分形成稳定的复合体， 或 (ii) 能与 靶向的基因的 mRNA 转录子的一部分形成稳定的双链体。
通过使用自动排列核酸序列和标明同一性或同源性区域的计算机程序， 适合的寡 核苷酸的选择得以促进。这种程序用于比较通过例如搜索数据库 ( 例如 GenBank) 或通过 测序 PCR 产品而获得的核酸序列。比较来自一系列物种的核酸序列允许选择在物种之间展 示出合适同一性程度的核酸序列。在没有被测序的基因的例子中， 进行 DNA 印迹法以测定 目标物种和其它物种的基因之间的同一性程度。本领域公知， 通过在不同的严格程度进行 DNA 印迹法， 可能获得同一性的近似度量。这些程序可以选择寡核苷酸， 所述寡核苷酸展示 出与待控制对象中的靶核酸序列的高互补度， 和与其它物种中的相应核酸序列的较低互补 度。本领域的技术人员将会意识到选择用于本发明的基因的合适区域有相当大的范围。
当反义化合物与靶核酸的结合干扰靶核酸的正常功能而引起功能和 / 或活性的
调节， 且在期望有特异性结合的条件下 ( 即体内试验或治疗处理情况中的生理条件下， 和 在体外试验情况中进行试验的条件下 ) 有足够的互补度以避免反义化合物和非靶核酸序 列的非特异性结合时， 所述反义化合物是″能特异性杂交的″。
本文描述的寡核苷酸的杂交性质可以通过本领域已知的一种或多种体外试验测 定。例如， 本文描述的寡核苷酸的性质可以通过使用熔化曲线试验测定靶天然反义和潜在 药物分子之间的结合强度而获得。
靶天然反义和潜在药物分子 ( 分子 ) 之间的结合强度可以使用任何已经建立的测 量分子内相互作用强度的方法 ( 例如熔化曲线试验 ) 来估算。
熔化曲线试验测定天然反义 / 分子复合体出现从双链到单链构象快速转化时的 温度。该温度被广泛接受为两个分子之间的相互作用强度的可靠度量。
熔化曲线试验能使用和分子的结合位点相应的实际天然反义 RNA 分子或合成 DNA 或 RNA 核苷酸的 cDNA 拷贝进行。 已有多种包含进行该试验的所有必需试剂的试剂盒 ( 例如 Applied Biosystems Inc.MeltDoctor 试剂盒 )。这些试剂盒包括合适的缓冲溶液， 所述缓 冲溶液含有双链 DNA(dsDNA) 结合染料 ( 例如 ABI HRM 染料， SYBR Green， SYTO 等 ) 之一。 dsDNA 染料的性质是它们在自由形式时几乎不发射荧光， 而当结合 dsDNA 时是高荧光性的。
为了进行试验， 以特定制造商的操作步骤规定的浓度将 cDNA 或相应的寡核苷酸 和分子混合。将混合物加热到 95℃以解离所有预先形成的 dsDNA 复合体， 然后缓慢冷却到 室温或试剂盒制造商规定的其它较低温度以使 DNA 分子退火。然后将新形成的复合体缓慢 加热到 95℃， 同时连续收集由反应产生的荧光量数据。荧光强度与反应中存在的 dsDNA 的 量成反比。数据可用与试剂盒兼容的实时 PCR 仪器 ( 例如 ABI 的 StepOne Plus Real Time PCR System 或 LightTyper 仪器， Roche Diagnostics， Lewes， UK) 收集。
用适当的软件 ( 例如 LightTyper(Roche) 或 SDS Dissociation Curve， ABI) 通过 将荧光对温度的负导数 (-d( 荧光 )/dT)， 在 y 轴 ) 相对于温度 (x- 轴 ) 作图而构建熔化峰。 分析数据， 鉴别从 dsDNA 复合体到单链分子快速转变的温度。 该温度称为 Tm， 且与两个分子 之间的相互作用强度成正比。通常 Tm 将超过 40℃。
实施例 2 ： 调节 VEGF 多核苷酸
来 自 ATCC 的 HepG2 细 胞 (cat# HB-8065) 在 37 ℃ 和 5 ％ CO2 下 生 长 于 生 长 培 养 基 (MEM/EBSS(Hyclone cat #SH30024，或 Mediatech cat # MT-10-010-CV)+10 ％ FBS(Mediatech cat# MT35-011-CV)+ 青霉素 / 链霉素 (Mediatech cat# MT30-002-CI))。 实验的前一天， 以 1.5×105/ml 的密度将细胞移植于 6 孔板中， 并于 37℃和 5％ CO2 下培养。 实验当天将 6 孔板中的培养基换成新鲜生长培养基。将所有的反义寡核苷酸稀释到 20μM 的浓度。将 2μl 的该溶液与 400μl 的 Opti-MEM 培养基 (Gibco cat#31985-070) 和 4μl 的 Lipofectamine 2000(Invitrogen cat# 11668019) 在室温下培养 20 分钟， 施用于有 HepG2 细胞的 6 孔板的每个孔。 包含 2μl 的水而不是寡核苷酸溶液的类似混合物用于模拟 转染对照。在 37℃和 5％ CO2 下培养 3-18 小时后， 将培养基换成新鲜生长培养基。加入反 义寡核苷酸 48 小时后， 去掉培养基， 根据制造商的说明书， 使用来自 Promega 的 SV Total RNA Isolation System(cat# Z3105) 或来自 Qiagen 的 RNeasy Total RNA Isolation 试 剂盒 (cat# 74181) 从细胞中提取 RNA。将 600ng 的 RNA 加入反转录反应中， 所述反转录反 应使用来自 Thermo Scientific 的 Verso cDNA 试剂盒 (cat# AB1453B) 或 High CapacitycDNA Reverse Transcription Kit(cat# 4368813) 按制造商的操作步骤的描述而进行。 使 用 ABI Taqman Gene Expression Mix(cat#4369510) 和 ABI 设计的引物 / 探针 (Applied Biosystems Taqman Gene Expression Assay ： Hs00173626_m1， Applied Biosystems Inc.， Foster City CA)， 通过实时 PCR 将来自该反转录反应的 cDNA 用于监测基因表达。 使用下列 PCR 循环 ： 50℃ 2 分钟， 95℃ 10 分钟， 40 个循环的 (95℃ 15 秒， 60℃ 1 分钟 )， 使用 StepOne Plus Real Time PCR Machine(Applied Biosystems)。
根据经处理和经模拟转染的样品之间的 18S 标准化的 dCt 值差异， 计算用反义寡 核苷酸处理后的基因表达的倍数变化。
用于针对 VEGF 天然反义 VEGFA(SEQ ID NO ： 10)( 图 6) 的用户定制设计的 Taqman 试验的引物和探针
靶序列 VEGFA 外显子 1 ： ATGCCAAGTGGTCCCAGGCTGCACC(SEQ ID NO ： 10)
正向引物序列
Vegfas1 ANYf ： GTAGCCTGTCCCCTTCAAGAG(SEQ ID NO ： 11)
Vegfas2 ANYf ： GCGGATAGCCTGGGAGCTA(SEQ ID NO ： 12)
反向引物序列 Vegfas1 ANYR ： CAGACATCCTGAGGTGTGTTCT(SEQ ID NO ： 13)
Vegfas2 ANYR ： TGTTCGGTTGCTGTGACTGT(SEQ ID NO ： 14)
报道染料 (Reporter Dye) ： FAM
Vegfas1 ANYM1 ： ATGCCTGCCAAGCCCA(SEQ ID NO ： 15)
Vegfas2 ANYM1 ： CAGCCAGCCCTCTGC(SEQ ID NO ： 16)
结果 ：
VEGFAas RNA 下调
实时 PCR 结果显示， 用针对 vegfaas 设计的 siRNA 中的一条 (vefaas1_2， P ＝ 0.05) 和可能地用第二条 vefaas1_3(P ＝ 0.1， 图 1A) 处理后 48 小时， HepG2 细胞中的 VEGFA mRNA 的水平显著升高。在相同的样品中， 用 vefaas1_2 或 vefaas1_3 处理后， vegfaas RNA 的水 平显著降低， 但是用 vefaas1_5 处理后保持不变， vefaas1_5 也对 VEGFA mRNA 水平没有影 响 ( 图 1B)。
VEGRas RNA 下调
实时 PCR 结果显示， 用针对 vegRas 设计的 siRNA 中的两条 (vegRas1_2， P ＝ 0.02 和 vegRas1_3， P ＝ 0.06， 图 1C) 处理后 48 小时， HepG2 细胞中的 VEGFA mRNA 的水平显著升 高。vegRas RNA 水平变化的结果待定。
虽然针对一个或多个实施例对本发明进行了说明和描述， 在阅读和理解本说明书 和附图后， 本领域其他技术人员会想到等价变化和修改。 另外， 虽然本发明的特定特征可能 只用几个实施例中的一个进行了公开， 当可能被期望时和对任何给定或特定应用有利时， 这样的特征可以和其它实施例的一个或多个其它特征结合。
本公开的摘要将使读者快速确定技术公开的本质。 应当理解的是不能将它用于解 释或限制权利要求的范围或含义。
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