活的减毒的细小病毒.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102985108 A (43)申请公布日 2013.03.20 CN 102985108 A *CN102985108A* (21)申请号 201180034991.X (22)申请日 2011.07.18 10169872.8 2010.07.16 EP 61/365684 2010.07.19 US A61K 39/23(2006.01) C07K 14/015(2006.01) C12N 7/04(2006.01) (71)申请人 英特维特国际股份有限公司 地址 荷兰博克斯梅尔 (72)发明人 N. 施皮贝 (74)专利代理机构 中国专利代理(香港)有限公 司。

2、 72001 代理人 刘健 万雪松 (54) 发明名称 活的减毒的细小病毒 (57) 摘要 本发明涉及活的减毒的细小病毒， 它们的用 途， 包含这种活的减毒的细小病毒的疫苗以及它 们的生产方法。 (30)优先权数据 (85)PCT申请进入国家阶段日 2013.01.16 (86)PCT申请的申请数据 PCT/EP2011/062203 2011.07.18 (87)PCT申请的公布数据 WO2012/007589 EN 2012.01.19 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 11 页 附图 6 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页。

3、 说明书 11 页 附图 6 页 1/2 页 2 1.活的减毒的细小病毒(PV)， 特征在于其包含编码在衣壳蛋白的219位氨基酸处除了 异亮氨酸以外的氨基酸和/或在衣壳蛋白的386位氨基酸处除了谷氨酰胺以外的氨基酸的 衣壳基因， 条件是， 所述活的减毒的细小病毒不包含 SEQ ID NO:1 所示的序列。 2. 权利要求 1 的活的减毒的细小病毒， 特征在于其包含编码在衣壳蛋白的 219 位氨基 酸处除了异亮氨酸以外的氨基酸和在衣壳蛋白的 386 位氨基酸处除了谷氨酰胺以外的氨 基酸的衣壳基因。 3. 权利要求 1 或 2 的活的减毒的细小病毒 (PV)， 特征在于其包含编码在衣壳蛋白的 21。

4、9 位氨基酸处的缬氨酸和 / 或在衣壳蛋白的 386 位氨基酸处的赖氨酸的衣壳基因。 4. 权利要求 1-3 中任一项的活的减毒的细小病毒， 其特征在于所述细小病毒是重组细 小病毒， 其中所述细小病毒的非衣壳区域的一部分的 DNA 片段被源自第二细小病毒的非衣 壳区域的一部分的同源 DNA 片段所替代， 其中所述第二细小病毒的所述同源 DNA 片段携带 减毒突变。 5. 权利要求 4 的活的减毒的细小病毒， 其特征在于所述第二细小病毒的所述同源 DNA 片段在非结构区中从 2061 位至 2070 位的区域中携带减毒突变。 6. 权利要求 1-5 中任一项的活的减毒的细小病毒， 其特征在于所述。

5、细小病毒是犬细小 病毒或猫细小病毒。 7. 权利要求 1-6 中任一项的活的减毒的细小病毒， 其特征在于所述细小病毒编码 CPV 血清型 2a、 2b 或 2c 的衣壳蛋白或猫细小病毒的衣壳蛋白。 8. 用于保护动物免于细小病毒感染的疫苗， 其特征在于所述疫苗包含权利要求 1-7 中 任一项的活的减毒的细小病毒和药学上可接受的载体。 9. 用于保护动物免于病原体的组合疫苗， 其特征在于所述组合疫苗包含权利要求 8 的 疫苗和对动物致病的病毒或微生物的额外的抗原或编码所述病毒或微生物的免疫原性蛋 白的遗传信息。 10. 权利要求 9 的组合疫苗， 其特征在于所述对动物致病的病毒或微生物选自 犬埃。

6、立克体 (Ehrlichiacanis)、 吉氏巴贝斯虫 (Babesiagibsoni)、vogeli、rossi、 杜 氏利什曼原虫 - 复合体 (Leishmania donovani-complex)、 犬腺病毒、 犬冠状病毒、 犬 distempervirus、 犬钩端螺旋体血清型肾脏钩端螺旋体 (Leptospira interrogans serovar canicola)、 黄疸出血钩端螺旋体 (icterohaemorrhagiae)、pomona、 流感伤寒 型钩端螺旋体 (grippotyphosa)、bratislava、 犬肝炎病毒、 犬副流感病毒、 狂犬病毒、 犬 。

7、肝簇虫 (Hepatozoon canis)、 伯氏疏螺旋体 (Borrelia burgdorferi)、 波氏支气管败 血 (Bordetella bronchiseptica)、 猫疱疹病毒、 猫杯状病毒、 猫白细胞减少症 (feline panleucopenia) 和猫衣原体 (Chlamydophila felis)。 11. 用于制备权利要求 8 的疫苗或权利要求 9 或 10 的组合疫苗的方法， 其特征在于所 述方法包括混合权利要求 1-7 中任一项的活的减毒的细小病毒和药学上可接受的载体。 12. 权利要求 1-7 中任一项的活的减毒的细小病毒， 其用作药物。 13. 权利要。

8、求 1-7 中任一项的活的减毒的细小病毒， 其用于细小病毒感染的治疗中。 14. 用于制备权利要求 1-7 中任一项的细小病毒突变体的方法， 其特征在于所述方法 包括通过重组 DNA 技术将在 219 位氨基酸处编码异亮氨酸的密码子和 / 或在 386 位氨基酸 处编码谷氨酰胺的密码子改变为在 219 位氨基酸处编码除了异亮氨酸以外的氨基酸的密 权 利 要 求 书 CN 102985108 A 2 2/2 页 3 码子和 / 或在 386 位氨基酸处编码除了谷氨酰胺以外的氨基酸的密码子的步骤。 15. 用于制备权利要求 1-7 中任一项的细小病毒突变体的方法， 其特征在于所述方法 包括编码至少。

9、部分细小病毒衣壳蛋白的 DNA 片段， 所述 DNA 片段在 219 位氨基酸处具有编 码异亮氨酸的密码子和 / 或在 386 位氨基酸处具有编码谷氨酰胺的密码子， 被编码细小病 毒衣壳蛋白的相同部分的 DNA 片段所替代， 所述 DNA 片段现在在 219 位氨基酸处具有编码 除了异亮氨酸以外的氨基酸的密码子和/或在386位氨基酸处具有编码除了谷氨酰胺以外 的氨基酸的密码子。 权 利 要 求 书 CN 102985108 A 3 1/11 页 4 活的减毒的细小病毒 0001 本发明涉及活的减毒的细小病毒， 它们的用途， 包含这种活的减毒的细小病毒的 疫苗以及它们的生产方法。 0002 细小。

10、病毒属于单链 DNA 病毒科。在各种动物如猫、 狗和猪中， 细小病毒可引起疾 病。因为病毒需要活跃分裂的细胞以便复制， 感染的组织的类型随动物的年龄而变化。在 任何年龄都可以影响胃肠道和淋巴系统， 导致呕吐、 腹泻和免疫抑制， 但是在子宫内或在小 于两周龄时被感染的猫中仅看到小脑发育不全， 在 3 周和 8 周龄之间被感染的小狗中看到 心肌疾病。 0003 犬细小病毒 (CPV) 是在小狗中尤其致命的疾病， 约 80致死， 在非常年幼的小 狗中引起胃肠道损伤和脱水以及心脏综合症。它是通过与被感染的狗的粪便接触而传播 的。症状包括嗜睡、 严重腹泻、 发烧、 呕吐、 食欲不振和脱水。猪细小病毒在猪。

11、中引起被称为 SMEDI 的生殖疾病， 其代表为死胎、 木乃伊化、 胚胎死亡和不孕。猫泛白细胞减少症， 通常被 称为猫瘟热， 是一种影响猫的病毒感染， 由犬细小病毒的近亲猫细小病毒 (FPV) 引起。猫泛 白细胞减少症在小猫中常见， 并引起发烧、 低白细胞数、 腹泻和死亡。小于两周的猫胎儿和 小猫的感染引起小脑发育不全。水貂肠炎病毒在对猫泛白细胞减少症的作用中是相似的， 除了它不会引起小脑发育不全。不同的细小病毒在水貂和其它鼬科动物中引起阿留申病 (Aleutian Disease)， 其特征在于淋巴结病、 脾肿大、 肾小球性肾炎、 贫血和死亡。 细小病毒 的最准确的诊断方法是通过 ELISA。

12、。通常对猫、 狗和猪进行针对细小病毒的免疫。 0004 在DNA水平上， 已知犬、 猫和猪细小病毒具有高度同源的基因组。 犬细小病毒CPV2 是一种在狗中引起急性、 且有时是致命的肠炎的病毒 (Kelly, Aust. Vet. J. 54 ； 593, 1978 ； Appel 等 , Vet. Rec. 105 ； 156-159, 1979)。1977 年左右首先出现的该病毒可能通 过单个衣壳蛋白中少数突变而从在猫中非常密切相关的病毒 ( 即猫泛白细胞减少症病毒 (FPLV)产生的 ； 物种跳跃可能涉及在其它食肉动物(如水貂或浣熊)的中间传递(Truyen 等 , Virology 21。

13、5, 186-189, 1996)。 0005 早在 1979 年， 出现了 CPV2 的第一种变异体， 被称为 CPV2a， 随后很快在 1984 年出 现了 CPV2b(Parrish 等 , Science 230, 1046-1048, 1985, 和 J. Virol. 65 ； 6544-6552, 1991)。 0006 最初的 2 型病毒现在已经从野外 (field) 消失， 被 2a 和 2b 型所替代， 尽管这两种 类型的相对比例在国与国间有变化(前面的Truyen等 ； Chinchkar等, Arch. Virol. 151, 1881-1887, 2006 ； Per。

14、eira 等 , Infect. Genet. Evol. 3, 399-409, 2007)。在衣壳蛋 白 (VP2) 中的氨基酸变化， 其特征为从 2 至 2a 以及至 2b 的转变， 是非常有限的。在 87(Met 至 Leu)、 300 (Ala 至 Gly)、 305 (Asp 至 Tyr) 和 555 (Val 至 Ile) 位的替换发生在 2 至 2a 的进化中， 在 426(Asn 至 Asp) 和 555(Ile 至 Val) 的替换发生在从 2a 出现 2b 中 ( 前面的 Parrish 等 ； Truyen 等 , J. Virol. 69, 4702-4710, 19。

15、95)。最近， 报道了在 555 位缺乏 Val至Ile替换的2a株(Wang等, Virus Genes 31, 171-174, 2005 ； Martella等, Virus Genes 33, 11-13, 2006)。似乎单一的氨基酸改变可以区分 CPV2a 和 CPV2b VP2 序列。 0007 新近， 在意大利出现了病毒株， 其中 426 位的氨基酸 (2a 中为 Asn， 2b 中为 Asp) 说 明 书 CN 102985108 A 4 2/11 页 5 已经变为谷氨酸 (Glu) 残基 (Buonavoglia 等 , J. Gen. Virol. 82, 3021-30。

16、25, 2001 ； Martella 等 , J. Clin. Microbiol. 42, 1333-1336, 2004)。这些被称为 CPV2c 病毒 的 Glu 426 变异体是在意大利和其他欧洲国家传播的 （circulating） 并与其它 CPV 类型 共存 (Decaro 等 , J. Vet. Med. B. Infect. Dis. Vet. Public Health 53, 468-472, 2006)， 并且也已经在地理上多样的国家如越南和苏格兰分离得到 (Nakamura 等 , Arch Virol.149, 2261-2269, 2004, Spibey 等 。

17、, Vet.Microbiol 128, 48-55, 2008)， 这些事 实表明它们在至少一定比例的狗群体中具有优势。 0008 犬细小病毒的相对快速进化已经导致猫宿主范围的丢失以及然后重新获得 ( 前 面的Truyen等, 1996)， 这种重新获得的在猫中复制的能力可以很好地解释2a、 2b和2c变 异体对最初的 2 型病毒的替代。在二十世纪七十年代末期和二十世纪八十年代早期， 由于 刺激交叉保护的共享抗原， 活的和灭活的FPL疫苗用于保护狗免于CPV疾病， 然而它们提供 的保护水平较差， 免疫持续时间较短。这些疫苗被活的减毒 CPV 疫苗所替代， 其提供了良好 的保护和更长的免疫持续。

18、时间。目前活的减毒疫苗来自 CPV2b 分离物或最初的 2 型病毒。 由于 2 型病毒已经在该野外中被 2a、 2b 以及现在的 2c 病毒完全替代， 已经考虑到对于减 毒的 2 型疫苗提供的保护水平 (Pratelli 等 , Clin. Diag. Lab. Immunol. 8, 612-615, 2001 ； Truyen, Vet. Microbiol. 69, 47-50, 1999)。 0009 然而， 基于现有的单克隆抗体的研究， 与以前的变异体相比， 每种新的抗原变异 体已经失去至少一个中和表位 (Strassheim 等 , Virology 198, 175-184, 1。

19、994 ； 前面的 Pereira 等 )。以前已经表明， 即使用针对各种抗原类型产生的血清在体外进行的交叉中和 研究的确显示出显著差异 ( 前面的 Pratelli 等 )， 活的减毒的 CPV2 疫苗能够保护狗免于 2a 和 2b 野外攻击 (Greenwood 等 , Vet. Record. 136, 63-67, 1995)。 0010 最近显示， 活的减毒的 2 型疫苗 (Nobivac-Intervet) 能够保护狗免于用最近的 CPV 变异体 CPV2c 的攻击 (Spibey 等 , Vet.Microbiol 128, 48-55, 2008)。 0011 尽管如此， 在疫。

20、苗领域中存在着诱导动物、 尤其是猫、 狗和猪中足够水平的免疫以 免于感染和具有高度减毒行为的细小病毒的疫苗相组合的需求。 高水平的减毒与安全性是 同义的， 尤其在年幼和年老的动物中。 0012 本发明的一个目的是提供减毒的同时仍然免疫原性的新的活细小病毒。 这种病毒 提供了用于安全的疫苗的基础。 0013 在这个方面， 本发明的一个实施方案涉及活的减毒的细小病毒 （PV） ， 其包括在衣 壳蛋白的 219 位氨基酸处除了异亮氨酸以外的氨基酸和 / 或在衣壳蛋白的 386 位氨基酸处 除了谷氨酰胺以外的氨基酸 （条件是， PV 不是犬细小病毒疫苗 Nobivac Parvo C 中存在的 CPV。

21、。在这种 CPV （犬细小病毒疫苗 Nobivac Parvo C 的 CPV） 中包含的序列如 SEQ ID NO:1 中所示。 0014 令人惊讶地发现， 在衣壳基因的219和386位氨基酸这两个位点， 在病毒的减毒中 起着重要作用。直到现在， 假设衣壳区域之外的氨基酸主要参与病毒的毒力 / 减毒。 0015 在犬和猫细小病毒中， 无论血清型， 衣壳蛋白的 219 位氨基酸处的异亮氨酸和衣 壳蛋白的 386 位氨基酸处的谷氨酰胺的位置是相同的。这意味着， 本发明可以至少普遍地 适用于猫细小病毒和犬细小病毒。本发明也可以应用于例如猪细小病毒， 所述猪细小病毒 具有衣壳蛋白的 219 位氨基酸。

22、处的异亮氨酸和衣壳蛋白的 386 位氨基酸处的谷氨酰胺。 说 明 书 CN 102985108 A 5 3/11 页 6 0016 具体而言， 从本发明排除要求保护的是， 犬细小病毒疫苗 Nobivac Parvo C(Intervet Schering-Plough Animal Health)中存在的CPV， 其包含如SEQ ID NO:1所示 的序列。 0017 因此， 本发明的第一个实施方案涉及活的减毒的细小病毒 （PV） ， 其包括编码在衣 壳蛋白的 219 位氨基酸处除了异亮氨酸以外的氨基酸和 / 或在衣壳蛋白的 386 位氨基酸处 除了谷氨酰胺以外的氨基酸的衣壳基因， 条件是， 。

23、PV 不包含 SEQ ID NO:1 所示的序列。 0018 仅仅是为了表示 219 位氨基酸处的异亮氨酸和 386 位氨基酸处的谷氨酰胺的位 置， 下面显示了在大多数CPV和FPV毒株中发现的序列背景的例子中这两个氨基酸 （以粗体 字符表示） 。 0019 根据被用作根据本发明的一个或两个氨基酸的取代的起始材料的毒株， 可能在 219位或386位的单一氨基酸取代不足以， 例如使病毒在非常年幼的动物中是安全的。 如果 需要进一步的减毒， 优选在 219 和 386 位的两个氨基酸的取代。 0020 因此， 本实施方案的优选形式涉及本发明的活的减毒的细小病毒 （PV） ， 其包括编 码在衣壳蛋白。

24、的219位氨基酸处除了异亮氨酸以外的氨基酸和在衣壳蛋白的386位氨基酸 处除了谷氨酰胺以外的氨基酸的衣壳基因。 0021 本实施方案的更优选形式涉及活的减毒的细小病毒 （PV） ， 其包括编码在衣壳蛋白 的 219 位氨基酸处的缬氨酸和 / 或在衣壳蛋白的 386 位氨基酸处的赖氨酸的衣壳基因。 0022 本实施方案的甚至更优选形式涉及活的减毒的细小病毒 （PV） ， 其包括编码在衣壳 蛋白的 219 位氨基酸处的缬氨酸和在衣壳蛋白的 386 位氨基酸处的赖氨酸的衣壳基因。 0023 如果优选仍进一步减毒， 使用已经具有另一个减毒突变的细小病毒作为用于引入 本发明的氨基酸取代的起始材料可能是有。

25、吸引力的。 0024 优选地， 这种减毒突变位于衣壳区域之外。这允许用在细小病毒毒株的同源非衣 壳区域(所述细小病毒毒株在该区域携带减毒)替代本发明的病毒的非衣壳区域的一部分 的 DNA 片段。在非衣壳区域的一部分中携带减毒的细小病毒是， 商业上可获得的犬细小病 毒疫苗 Nobivac Parvo C (Intervet Schering-Plough Animal Health)。 0025 这样一种方法的优势是， 这种病毒可以具有更高的减毒水平。 因此， 本实施方案的 仍然甚至更优选的形式涉及本发明的活的减毒的细小病毒， 其中所述细小病毒是重组细小 病毒， 其中所述细小病毒的非衣壳区域的一。

26、部分的 DNA 片段被源自第二细小病毒的非衣壳 区域的一部分的同源 DNA 片段所替代， 其中所述第二细小病毒的同源 DNA 片段携带减毒的 突变。 0026 来自第二细小病毒的同源DNA片段是具有与本发明的细小病毒的DNA片段相同功 能的 DNA 片段， 但是不同于该 DNA 片段， 因为其携带导致病毒的减毒行为的突变。仅仅作为 一个例子， 如果 DNA 片段在两个特定的限制性位点之间的 DNA 片段中包括减毒突变并且这 两个限制性位点也存在于不具有该突变的病毒中的相同位置， 那么携带该突变的限制性片 段被认为与来自不具有该突变的病毒的相同片段是同源的。 0027 本实施方案的高度优选形式涉。

27、及本发明的活的减毒的细小病毒， 其中所述第二细 小病毒的同源的 DNA 片段在非结构区中从 2061 位至 2070 位的区域中携带减毒突变。 说 明 书 CN 102985108 A 6 4/11 页 7 0028 可以理解的是， 本发明的活的减毒的细小病毒， 无论是否额外存在任何进一步的 减毒， 如， 例如， 减毒的非衣壳区域， 可以从所有细小病毒 ( 在所述细小病毒中， 可以在衣壳 蛋白中进行本发明的异亮氨酸 /X1 和 / 或谷氨酰胺 /X2 转换 ) 获得， 因此至少可以从 CPV 和FPV的所有目前测序的成员获得。 （X1和X2分别是除了异亮氨酸和谷氨酰胺以外的氨基 酸） 。 00。

28、29 也可以理解的是， 本发明包括包含 FPV- 衣壳和 CPV- 非衣壳骨架的杂合病毒以及 包含 CPV- 衣壳和 FPV- 非衣壳骨架的杂合病毒。 0030 当开发疫苗用于保护动物， 更具体地保护宠物免于细小病毒感染时， 用于这种疫 苗中的优选的细小病毒是犬细小病毒或猫细小病毒。 0031 因此， 本实施方案的甚至更优选的形式涉及本发明的活的减毒的细小病毒， 其中 所述细小病毒是犬细小病毒或猫细小病毒。 0032 特别地， 当疫苗分别特别针对保护狗和猫免于CPV和FPV时， 本发明的病毒的衣壳 基因优选编码 CPV 血清型 2a， 2b 或 2c 的衣壳蛋白或猫细小病毒的衣壳蛋白。 003。

29、3 如上所述， 细小病毒的非衣壳部分可以是 CPV 或 FPV 来源的。 0034 因此， 本实施方案的甚至进一步优选的形式涉及， 本发明的活的减毒的 CPV， 其中 所述细小病毒编码 CPV 血清型 2a， 2b 或 2c 的衣壳蛋白或猫细小病毒的衣壳蛋白。 0035 本发明的另一个实施方案涉及用于保护动物免于细小病毒感染的疫苗， 其中这种 疫苗包括本发明的活的减毒的细小病毒和药学上可接受的载体。 0036 在许多情况下， 取决于减毒的水平和病毒的复制特征， 用于疫苗中的本发明的合 适量的细小病毒在 103109 TCID50的范围内。在许多情况下， 低于 103 TCID50的感染剂量 的。

30、病毒被认为太低， 因为对于病毒复制到足以触发免疫系统的高水平需要太多时间。如果 仅仅出于商业的原因， 超过 109 TCID50的量是没有吸引力的。 0037 非常合适的剂量是 105108 TCID50的范围内， 甚至更好地 106108 TCID50的范围 内。 0038 药学上可接受的载体是本领域中公知的。仅仅作为例子， 这种载体可以和无菌水 或缓冲溶液如 PBS 一样简单。 0039 可以以若干方式施用本发明的疫苗。由于疫苗包括活的减毒的病毒， 许多施用方 式， 如口服的， 鼻内的， I.M. 和皮下施用是可行的。优选的施用途径是皮下施用。 0040 易受细小病毒感染的动物， 如猫和狗。

31、经常同时接种疫苗以免受若干其它疾病。因 此， 组合本发明的疫苗和对狗和猫致病的病毒或微生物的额外的抗原或编码所述抗原的遗 传信息是可行的。 0041 因此， 本发明的另一个实施方案涉及包含本发明的疫苗和对动物致病的病毒或微 生物的额外的抗原或编码所述病毒或微生物的免疫原性多肽的遗传信息组合疫苗。 0042 病毒或微生物的额外抗原可以是整个病毒或微生物 （以活的减毒的形式或灭活的 形式） 或该病毒或微生物的能够诱导保护性免疫应答的免疫原性的多肽或另一种免疫原性 部分， 如， 例如，（脂质 -） 多糖。 0043 优选地， 对动物致病的病毒或微生物选自犬埃立克体 (Ehrlichiacanis)，。

32、 吉氏 巴贝斯虫 (Babesiagibsoni)，vogeli, rossi， 杜氏利什曼原虫 - 复合体 (Leishmania donovani-complex)， 犬腺病毒， 犬冠状病毒， 犬 distempervirus， 犬钩端螺旋体血清型 说 明 书 CN 102985108 A 7 5/11 页 8 肾脏钩端螺旋体 (Leptospira interrogans serovar canicola)， 黄疸出血钩端螺旋体 (icterohaemorrhagiae)，pomona， 流感伤寒型钩端螺旋体 (grippotyphosa)，bratislava， 犬肝炎病毒， 犬副流感。

33、病毒， 狂犬病毒， 犬肝簇虫 (Hepatozoon canis)， 伯氏疏螺旋体 (Borrelia burgdorferi)， 波氏支气管败血 (Bordetella bronchiseptica)， 猫疱疹病 毒， 猫杯状病毒， 猫白细胞减少症 (feline panleucopenia) 和猫衣原体 (Chlamydophila felis)。 0044 包含活的减毒的病毒的疫苗必须在低温下贮存， 或者它们必须是冷冻干燥的形 式。冷冻干燥的疫苗可以保持在适度的冷却条件下， 或者甚至在室温下。经常， 将疫苗与稳 定剂混合， 例如以保护易于降解的蛋白免于被降解， 以增强的疫苗的寿命， 或以。

34、提高冷冻干 燥效率。 有用的稳定剂是， 尤其SPGA， 碳水化合物， 例如山梨醇， 甘露醇， 海藻糖， 淀粉， 蔗糖， 葡聚糖， 葡萄糖， 蛋白如白蛋白或酪蛋白或其降解产物， 和缓冲液如碱金属磷酸盐。 0045 因此， 优选地， 本发明的 （组合） 疫苗是冷冻干燥的形式。 0046 此外， 疫苗可以悬浮在生理上可接受的稀释剂中。 这种缓冲液可以例如是无菌水， 缓冲液等。 0047 不用说， 用于乳化或稳定病毒的稀释剂和化合物也体现在本发明中。 0048 再次， 本发明的另一个实施方案涉及用于制备本发明的 （组合） 疫苗的方法， 其中 这些方法包括混合本发明的活的减毒的细小病毒和药学上可接受的载。

35、体。 0049 本发明的仍另一个实施方案涉及本发明的活的减毒的细小病毒， 其用作药物。 0050 更具体地， 本实施方案涉及本发明的活的减毒的细小病毒， 其用于治疗细小病毒 感染。 0051 再次， 本发明的另一个实施方案涉及本发明的活的减毒的细小病毒的用途， 其用 于治疗细小病毒感染。 0052 最后， 本发明的另一个实施方案涉及用于制备本发明的细小病毒突变体的方法， 其中这种方法包括用编码至少部分细小病毒衣壳蛋白的 DNA 片段 ( 其在 219 位氨基酸处具 有编码除了异亮氨酸以外的氨基酸的密码子和 / 或在 386 位氨基酸处具有编码除了谷氨 酰胺以外的氨基酸的密码子 ) 替代编码至少。

36、部分细小病毒衣壳蛋白的 DNA 片段 ( 其在 219 位氨基酸处具有编码异亮氨酸的密码子和/或在386位氨基酸处具有编码谷氨酰胺的密码 子 )。 0053 可以使用本领域公知的重组 DNA 技术， 如位点定向诱变， 限制性片段的交换等进 行这种 DNA 的替代。有若干制备 219 异亮氨酸和 X1 或 386 谷氨酰胺和 X2 取代的方法。可 以通过化学合成或 PCR 以及随后的新合成的片段和病毒 DNA 的重组而引入这种变化。 实施例 0054 实施例 1: 犬细小病毒克隆 630att 的产生 起始材料 病毒 说 明 书 CN 102985108 A 8 6/11 页 9 0055 大肠。

37、杆菌菌株 选择从大肠杆菌遗传储存中心 （美国） 获得的大肠杆菌菌株JC811和菌株DL795(Kramel Biotech UK) 用于完整的感染性克隆的质粒繁殖。 0056 DNA 合成 由 Eurofins MWG GmbH 进行定制的 DNA 合成。合成的 DNA 片段在 pBluescrpt 克隆质 粒中提供。 0057 犬细小病毒克隆 630att 的构建是多步骤过程， 在这里以其分开的步骤进行描述。 0058 1) Nobivac Parvo C 的感染性分子克隆 (p154att) 的构建 （p154att） 用 “Hirt” 制备法的修改方法从被 Nobivac Parvo C。

38、 感染的细胞感染的 A72 细胞获得 复制形式 （RF） 病毒 DNA(Parrish 等 1988, Virology 166, 293-307)。用多种限制性酶消 化病毒 DNA， 并使用常规的克隆方法将基因组装配进 pBluescript。图 1-4 中概述了克隆方 案。 0059 首先用 T4 DNA 聚合酶 “末端填充 (end filled)” CPV 154att 的 RF DNA。然后用 EcoR 和 Spe 消化 DNA。这些酶分别在 1099 和 3459 位切割一次。这种消化产生三个片 段， 以它们的大小顺序标记为 A、 B & C。通过凝胶电泳分开片段， 然后将 Eco。

39、R /Spe 片 段 （片段 A） 克隆进已经通过相同的酶消化而制备的质粒 pBluescript 中 （见图 1） 。 0060 然后将来自 RF DNA 消化的 EcoRI 末端片段 （片段 C） 克隆进用 EcoRI 和 EcoRV 消 化的 pBluescript， 以产生 pCPV C（见图 2） 。 0061 将犬细小病毒 A 和 C 片段一起亚克隆进相同的质粒。用 SpeI 和 EcoRI 消化质粒 pCPV A 和 PCPV C。从 pCPV A 纯化 CPV 插入物， 从 pCPV C 获取载体部分。然后连接产生其 中片段 A 和 C“重新联合” 的质粒 （见图 3） 。 0。

40、062 然后将来自 CPV RF DNA 消化的 SpeI 末端片段 （片段 B） 克隆进 pCPV AC。用 Spe I 和切割导致平末端的酶 HincII 消化质粒 pCPV AC。连接并克隆片段。 （见图 4） 。 0063 产生的质粒被称为 p154att。 0064 通过将质粒DNA转染进A72细胞导致产生感染性病毒而实现验证已经组装完整的 克隆。 0065 进行质粒克隆的 DNA 序列分析 ； 如下面进一步显示， 显示该序列与从感染的细胞 提取的病毒 DNA 测定的序列是相同的。 0066 2). 2/2c 杂合 D9 的构建 从 Nobivac parvo C 感染的细胞和 CP。

41、V2c“Jes” 感染的细胞或者单独从 CPV2c “Jes” 感染的细胞获得病毒 DNA。各自用单一限制性酶消化病毒 DNA 制备物， 以便从每种制备物 产生 2 个 DNA 片段。酶消化进行的方式使得 Nobivac 基因组的左手片段和 “Jes” 基因组的 说 明 书 CN 102985108 A 9 7/11 页 10 右手片段共享 200bp 的重叠序列。分开、 纯化并混合 Nobivac 左末端和 “Jes” 右末端片段 （图 7） 。 0067 用这些重叠的片段转染 A72 和 CrFK 细胞允许通过自然重组产生感染性病毒。通 过有限稀释克隆产生的病毒， 并命名为 2/2c 杂合。

42、 D9。 0068 3). 克隆 630 的构建。 0069 从感染性质粒克隆 p154att 和从 2/2c 杂合 D9 制备的 DNA 开发克隆 630。 0070 限制性酶 PacI 在 561 和 4651 位左右的两个位置 ( 基因组的远左末端和右末端 ) 切割 CPV 基因组。因此， 用 PacI 消化质粒 p154att， 从载体和末端序列分开包含超过 80 的基因组的 4kbp PacI 片段， 并用从 2/2c 杂合 D9 DNA 获得的片段替代。产生的质粒被 称为 p630。这如图 5 中所示。 0071 据预测， 用p630转染A72或CrFK细胞导致感染性病毒的产生， 。

43、该病毒被称为630。 0072 病毒 630 如 2/2c 杂合 D9 保留了低水平的致病性。 0073 4). 克隆 630att 的构建。 0074 当注射进狗时， 630 病毒显示出一些低水平的临床迹象。 0075 化学合成衣壳基因的一部分， 引入在 Nobivac parvo C 中观察到但是在场地毒 株中没有发现的氨基酸变化。然后用该片段替代质粒 p630 中的相同区域以产生质粒 p630att ； 这如图 6 中所示。 0076 合成对应于 CPV 基因组上的 3356 和 4029 位之间的 DNA 序列。确切的 DNA 序列， 这里提供为 SEQ ID NO ： 2， 如下所示。

44、 0077 限制性酶位点 Bgl 和 XcmI 以粗体和下划线显示。 0078 从质粒释放该序列， 这通过用 Bgl 和 XcmI 消化而提供。通过琼脂糖凝胶电泳分 离 DNA 片段， 分离并纯化 672 bp 片段。 0079 用 p630att 转染 A72 或 CrFK 细胞导致感染性病毒 (630att) 的产生， 当该病毒施 用于小狗时没有任何临床症状。 0080 在比较研究中， 比较包含克隆 630 的疫苗和包含克隆 630att 的疫苗。 0081 以 1 ml 中 108.0-108.3 TCID50的克隆 630 对五只 MDA 阴性狗皮下接种疫苗。 0082 这导致所有的狗。

45、中轻度至中度的迹象。在 5 只狗中超过 5 天期间的重量变化平均 为 -6， 从下表如下所示。 说 明 书 CN 102985108 A 10 8/11 页 11 0083 以 1 ml 中 108.0-108.3 TCID50的克隆 630att 对五只 MDA 阴性狗皮下接种疫苗。 0084 在这组中， 可见无临床症状， 无温度升高， 无白血球减少症， 无腹泻或呕吐。此外， 该组中出现显著的体重增加， 从下表如下所示。 0085 因此得出结论， 基于克隆 630att 的疫苗与克隆 630 相比的确表现出减毒， 并具有 优异的安全性特征。 0086 实施例 2: 产生具有在衣壳基因之外的减。

46、毒突变的重组病毒 从商售的 Nobivac Parvo C (Intervet Schering-Plough Animal Health) 获得 154 att 株， Jess 株是 2c 型病毒的野外分离物。 0087 使用包含 5胎牛血清的 M6B8 培养基使病毒生长在贴壁的犬或猫肾细胞 ( 如 A72 & CrFK) 上。用标准 “Hirt” 法的修改方法从被感染的细胞培养物制备复制形式 (RF) DNA(McMaster 等 1981)。 0088 用限制性酶 PstI 消化从 154 att 株制备的 RF DNA， 通过琼脂糖凝胶电泳分开片 段。从凝胶切出 3055 碱基对 (b。

47、p) 条带 ( 对应于 CPV 的左手末端 ) 并用 Qiagen Qiaquick 凝胶提取柱纯化。用限制性酶 XmnI 消化从 CPV Jess 感染的细胞分离的 RF DNA。再次通过 琼脂糖凝胶电泳分离 DNA 片段， 随后用 Qiagen Qiaquick 凝胶提取柱纯化约 2750 bp 条带 ( 对应于包括衣壳序列的 CPV 的右手末端 )。 0089 将来自 154att 和 Jess 的纯化的 3055 bp 和 2750bp 片段合并并转染进培养中的 A72 或 CrFK 细胞。根据厂商说明书， 用 Lipofectamine 2000(Invitrogen) 将约 3g 。

48、的每种 片段进行转染。 0090 转染后， 传代细胞并用血凝 (HA) 分析法监测。在第 4 代时用 HA 检测病毒。使用 标准 DNA 测序方案， 用 RF DNA 或 PCR 片段模板进行杂合病毒的 DNA 序列测定。通过有限稀 释法纯化在贴壁的易感犬或猫细胞上的病毒。 说 明 书 CN 102985108 A 11 9/11 页 12 0091 实施例 3 ： 从克隆的病毒 DNA 构建的重组病毒 从克隆的片段产生重组病毒。将病毒株 154att 的基因组克隆进标准的克隆载体 pBluescript(Stratagene inc.)。为了保持回文末端序列完整， 将质粒在许多重组系统缺 陷。

49、的细菌宿主 DL795 中繁殖。细小病毒基因组的克隆已经在文献中描述， 所需的技术对于 本领域技术人员而言是已知的。 0092 用限制性酶 Pac I 消化获得的 154att 的克隆 (p154att) 而不允许消化完整进行， 即限制性酶消化仅仅是部分的。 然后使消化的片段经受限制性酶Xmn I的消化。 然后通过琼 脂糖凝胶电泳分开消化的 DNA 片段， 从凝胶切出下图中所示的片段， 并用 Qiagen Qiaquick 凝胶提取柱纯化。Xmn I 和右手的 Pac 位点位于细小病毒基因组中的衣壳区域的两侧。 0093 如下用 CPV 的强毒株的衣壳基因替代 154 att 的衣壳基因。图 8 中所示的 Xmn I 位点和右手的Pac I位于衣壳基因的边界之外。 Pac I位点和衣壳基因的末端之间约110bp 序列在 154att 株和强毒的分离物之间差异显著。在 Xmn I 位。