耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA疫苗重组蛋白抗原FNBA1的纯化方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102993278 A (43)申请公布日 2013.03.27 CN 102993278 A *CN102993278A* (21)申请号 201210378843.6 (22)申请日 2012.09.29 C07K 14/31(2006.01) C07K 1/36(2006.01) C07K 1/30(2006.01) C07K 1/22(2006.01) C07K 1/18(2006.01) C07K 1/16(2006.01) C12N 15/31(2006.01) C12N 15/63(2006.01) (71)申请人 重庆原伦生物科技有限公司 地址 401。

2、121 重庆市北部新区高新园黄山大 道 5 号水星南翼厂房 4 楼 1 号 申请人 中国人民解放军第三军医大学 (72)发明人 章金勇 邹全明 郭鹰 冯强 樊绍文 卢陆 董衍东 敬海明 顾江 (74)专利代理机构 重庆志合专利事务所 50210 代理人 胡荣珲 (54) 发明名称 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (MRSA) 疫苗重 组蛋白抗原 FnbA1 的纯化方法 (57) 摘要 本发明公开了一种耐甲氧西林金黄色葡萄球 菌 (MRSA) 疫苗重组蛋白抗原 FnbA1 的纯化方法。 FnbA1 为采用生物信息学方法， 从 MRSA 的纤连蛋 白结合蛋白 A 中预测出的活性片段， 经大肠杆菌 基因工。

3、程菌表达获得。其纯化步骤为 ： 对高密度 发酵的 FnbA1 重组表达菌按照高压破菌、 离心， 硫 酸铵分步沉淀， GST 亲和层析、 PP 酶酶切， 离子交 换层析、 疏水层析和脱盐的顺序组合进行纯化。 本 发明提供的纯化方法简捷、 容易放大、 重复性好， 所获目标蛋白纯度高， 动物试验证明纯化的抗原 可有效刺激机体产生较高的体液免疫应答和良好 的免疫保护作用。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 8 页 序列表 5 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 8 页 序列表 5 页 附图 3 页 1/2 页 2 。

4、1.一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)疫苗重组蛋白抗原FnbA1的纯化方法， 其特 征在于， 包含步骤 ： 收集制备的所述抗原 ； 按照高压破菌、 离心， 硫酸铵分步沉淀， GST 亲和 层析、 PP 酶酶切， 离子交换层析、 疏水层析和脱盐的顺序组合对制备的抗原进行纯化。 2. 如权利要求 1 所述的纯化方法， 其特征在于 ： 1) 高压破菌 ： 将收集的菌体以 pH 为 7.0-7.5 的 10-20mM PBS 缓冲液混匀悬浮， 预冷后 采用高压匀浆破菌， 高速离心， 收集上清 ； 2) 硫酸铵分步沉淀 ： 4搅拌条件下， 上清中缓慢加入终浓度为 30的硫酸铵， 搅拌半 小时以上，。

5、 10000-15000g 高速离心 20 分钟以上， 收集上清， 上清中继续缓慢加入终浓度为 40的硫酸铵， 搅拌半小时以上， 10000-15000g 高速离心 20 分钟以上， 收集沉淀 ； 3) 沉淀复溶 ： 称量沉淀湿重， 按重量体积比为 1 3-10 比例加入 pH 为 7.0-7.5 的 10-20mM 的 PBS 缓冲液， 搅拌混匀 10-15 分钟， 10000-15000g 高速离心 20 分钟以上， 收集上 清 ； 4)GST 亲和纯化 ： 选择 GST 亲和层析填料进行初步纯化， 使用 PBSpH7.0-7.5 的条件对 目标蛋白进行纯化， Prescission Pr。

6、otease 酶进行酶切洗脱 ； 5) 离子交换层析纯化 ： 步骤 4) 收集的样品， pH 调至 9.0， 使用 pH 为 9.0， 10 50Tris， 0 0.1M NaCl 的 Tris 缓冲液平衡层析系统及离子交换层析柱， 然后采用 pH 为 9.0， 10 50Tris， 0.5 1M NaCl 的 buffer 梯度洗脱 ； 6)疏水层析纯化 ： 将步骤5)纯化获得的样品， 按11的比例与pH为7.5的20mM PB， 3M(NH4)2SO4混合， 采用缓冲液 pH 为 7.5 的 10mMPB， 1.5M(NH4)2SO4平衡层析系统和疏水层析 柱后上样， 采用 pH 为 7.。

7、5 的 10mM PB 梯度洗脱， 去除痕量非目标蛋白等杂质， 分离纯化目标 蛋白。 7) 脱盐 ： 采用 PBS 平衡脱盐柱， 将步骤 6) 纯化获得的样品通过脱盐柱置换缓冲液。 3. 如权利要求 2 所述的纯化方法， 其特征在于， 步骤 1) 采用生产或中试纯化中的 60-80MPa 高压匀浆破菌技术， 高速离心获取破菌上清。 4.如权利要求2所述的纯化方法， 其特征在于， 步骤2)和步骤3)硫酸铵分步沉淀再复 溶。 5. 如权利要求 2 所述的纯化方法， 其特征在于， 步骤 4) 所述的 GST 亲和纯化所使用的 填料为 GST-Sepharose 4B、 GST-Sepharose 6。

8、B、 GST-Sepharose FastFlow、 GST-Sepharose HP 之一。 6. 如权利要求 5 所述的纯化方法， 其特征在于， 步骤 4) 所使用的 Prescission Protease 酶带有 GST 标签， 以利于去除 Prescission Protease 酶。 7. 如权利要求 2 所述的纯化方法， 其特征在于， 步骤 5) 所使用的离子交换层析填料为 Q HP、 RESOURCE Q、 Q FF、 Adhere 之一。 8.如权利要求2所述的纯化方法， 其特征在于， 步骤6)所述的疏水层析柱为phenyl或 butyl。 9.如权利要求1至8任一项所述的纯。

9、化方法， 其特征在于， 所述抗原是通过以下步骤制 备的 ： 1)设计正向引物和反向引物通过PCR扩增或全基因合成以获得编码FnBA1蛋白活性片 段的核酸序列 ； 权 利 要 求 书 CN 102993278 A 2 2/2 页 3 2) 将步骤 1) 所获得的核酸序列克隆至表达载体构建重组载体， 然后将该重组载体转 化至宿主菌 ； 3) 诱导转化后的宿主菌表达重组蛋白。 权 利 要 求 书 CN 102993278 A 3 1/8 页 4 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (MRSA) 疫苗重组蛋白抗原 FnbA1 的纯化方法 技术领域 0001 本发明属于生物技术制药领域， 涉及一种耐甲氧西林金黄色。

10、葡萄球菌 (MRSA) 疫 苗重组蛋白抗原 FnbA1 的纯化方法。 背景技术 0002 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (methicillin-resistant Staphylococcusaureus， MRSA) 局部感染经久不愈， 全身感染死亡率高达 20。自 1961 年被首次发现， 目前已成为 全球 ICU 病房、 烧伤、 战创伤等感染率最高的病原菌之一。MRSA 因其传播途径广泛， 易暴发 流行， 又由于其致病性强， 呈多重耐药而成为临床上治疗的难点及重要的生物战剂， 被称为 “超级细菌” ， 当前 MRSA 已与乙型肝炎、 AIDS 被列为世界三大最难解决的感染性疾病， 并位 居。

11、首位。万古霉素被认为是治疗 MRSA 的最后一道防线， 但 2002 年以来耐万古霉素的 MRSA 相继被分离出来， 使 MRSA 即将面临无抗生素可治的严峻挑战。 0003 目前， 在我国各大医院， 由于抗生素的滥用， MRSA 的分离检出率逐年上升， 已由 1978 年的 5发展到 2009 年的 79， 且菌群的毒力基因改变明显， 并且耐万古霉素的金葡 菌也呈蔓延趋势。基于这种严峻形势， 我国已将 MRSA 列为 21 世纪可能对国人卫生健康有 重大影响的 12 种病原微生物之一。2010 年 “中国 MRSA 院内感染诊治策略新进展” 会议资 料显示， 我国内地医院院内感染发生率约为 。

12、8， 全国每年因医院感染造成的直接损失超过 150 亿元。因此， 加强对 MRSA 感染的防治研究已迫在眉睫， 研制安全、 有效的新型 MRSA 疫 苗将对有效控制 MRSA 耐药性蔓 延和临床 MRSA 广泛感染具有重大应用价值。美国研发的 MRSA 疫苗已进入 III 期临床试验， 研发具有自主知识产权、 高效、 安全、 经济的 MRSA 疫苗对 有效控制 MRSA 耐药性蔓延和临床 MRSA 广泛感染， 提升我国的国际竞争力具有重要意义。 0004 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌抗原组分复杂， 且含量较低， 直接从全菌中分离纯化 出保护性抗原的难度较大， 方法繁琐， 不利于疫苗的产业化制备。 。

13、利用基因工程技术将菌体 有效的保护性抗原进行克隆表达使 MRSA 疫苗研制的可行性大大提高。金黄色葡萄球菌表 面的粘附素是一类能够介导细菌粘附于寄主细胞表面进而引发疾病的膜蛋白， 其中纤连蛋 白结合蛋白 A(FnbA) 是重要的粘附素之一， 编码基因具有高度保守性， 是 MRSA 疫苗重要的 候选抗原。它能够介导金黄色葡萄球菌结合于细胞表面的纤连蛋白， 使细菌黏附于寄主细 胞表面， 促进细菌对寄主组织的入侵， 目前分离到的大多数金黄色葡萄球菌都能够与细胞 外基质上的纤连蛋白特异性的结合。 0005 申请人采用生物信息学的方法从 FnbA 中预测出了一段活性片段 FnbA1， 通过克隆 表达并纯。

14、化后， 动物试验证明可有效刺激机体产生较高的体液免疫应答和良好的免疫保护 作用。FnbA1 具有序列表 1 所述的核苷酸序列和序列表 2 所述的氨基酸序列。 发明内容 0006 本发明旨在针对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌重组蛋白抗原 (FnbA1) 制备中的抗 说 明 书 CN 102993278 A 4 2/8 页 5 原蛋白纯化， ， 提供一种工艺简捷、 所获得目标蛋白纯度高、 回收率较好的纯化工艺和方法。 0007 为实现上述目的， 本发明采用如下的技术方案。 0008 一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌疫苗重组蛋白抗原的纯化方法， 包含步骤 ： 0009 收集发酵的表达 FnbA1 的工程菌后，。

15、 按照高压破菌、 离心， 硫酸铵分步沉淀， GST 亲 和层析、 PP 酶切， 离子交换层析、 凝胶过滤层析技术的顺序组合对制备的抗原进行纯化。 0010 步骤具体为 ： 0011 1) 高压破菌 ： 将收集的抗原的菌体以 pH 为 7.0-7.5 的 10-20mM PBS 缓冲液混匀 悬浮， 预冷后采用高压匀浆破菌， 高速离心， 收集上清 ； 0012 2) 硫酸铵分步沉淀 ： 4搅拌条件下， 上清中缓慢加入终浓度为 30的硫酸铵， 搅 拌半小时以上， 10000-15000g 高速离心 20 分钟以上， 收集上清， 上清中继续缓慢加入终浓 度为 40的硫酸铵， 搅拌半小时以上， 1000。

16、0-15000g 高速离心 20 分钟以上， 收集沉淀 ； 0013 3) 沉淀复溶 ： 称量沉淀湿重， 按重量体积比为 1 10 比例加入 pH 为 7.0-7.5 的 10-20mM 的 PBS 缓冲液， 搅拌混匀 10-15 分钟， 10000-15000g 高速离心 20 分钟以上， 收集上 清 ； 0014 4)GST 亲和纯化 ： 选择 GST 亲和层析填料进行初步纯化， 使用 PBSpH7.0-7.5 的条 件下对目标蛋白进行纯化， Prescission Protease 酶进行酶切洗脱 ； 0015 5) 离子交换层析纯化 ： 步骤 4) 收集的样品， pH 调至 9.0， 。

17、使用 pH 为 9.0、 10 50Tris、 00.1MNaCl的Tris缓冲液平衡层析系统及离子交换层析柱， 然后采用pH为9.0、 10 50Tris0.5 1MNaCl 的 buffer 梯度洗脱 ； 0016 6)疏水层析纯化 ： 将步骤5)纯化获得的样品， 按11的比例与pH为7.5的20mM PB， 3M(NH4)2SO4混合， 采用缓冲液 pH 为 7.5 的 10mMPB， 1.5M(NH4)2SO4平衡层析系统和疏水 层析柱后上样， 采用 pH 为 7.5 的 10mM PB 梯度洗脱， 去除痕量非目标蛋白等杂质， 分离纯化 目标蛋白。 0017 7) 脱盐 ： 采用 PB。

18、S 平衡脱盐柱， 将步骤 6) 纯化获得的样品通过脱盐柱置换缓冲 液。 0018 优选地， 步骤1)采用生产或中试纯化中的60-80MPa高压匀浆破菌技术， 高速离心 获取破菌上清。 0019 优选地， 步骤 2) 和步骤 3) 硫酸铵分步沉淀再复溶。 0020 优 选 地， 步 骤 4) 所 述 的 GST 亲 和 纯 化 所 使 用 的 填 料 为 GST-Sepharose4B、 GST-Sepharose 6B、 GST-Sepharose FastFlow、 GST-Sepharose HP 之一。 0021 优选地， 步骤 4) 所使用的 Prescission Protease 。

19、酶带有 GST 标签， 以利于去除 Prescission Protease 酶。 0022 优选地， 步骤5)所使用的离子交换层析填料为Q HP、 RESOURCE Q、 Q FF、 Adhere之 一。 0023 优选地， 步骤 6) 所述的凝胶层析柱为 Superdex75、 Superdex 200、 Superdex HR 10/30 之一。 0024 本发明所述抗原是通过以下步骤制备的 ： 0025 1)设计正向引物和反向引物通过PCR扩增或全基因合成以获得编码FnBA1蛋白活 性片段的核酸序列 ； 说 明 书 CN 102993278 A 5 3/8 页 6 0026 2) 将步。

20、骤 1) 所获得的核酸序列克隆至表达载体构建重组载体， 然后将该重组载 体转化至宿主菌 ； 0027 3) 诱导转化后的宿主菌表达重组蛋白。 0028 本发明的有益效果是 ： 本发明采用的此纯化方法， 从表达耐甲氧西林金黄色葡萄 球菌 (MRSA) 重组基因工程疫苗候选抗原 ( 本申请中命名为 FnbA1) 的大肠杆菌工程菌中可 以获得纯度大于 98的 FnbA1， 得率 50以上， 整个纯化过程无需额外置换缓冲液。 0029 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌疫苗重组蛋白抗原 FnbA1 为采用生物信息学方法， 从 MRSA 的纤连蛋白结合蛋白 A 中预测出的的活性片段， 经大肠杆菌基因工程菌表达获得。

21、。 0030 通过上述工艺处理不同批次的 FnbA1 作 12 SDS-PAGE， 呈现出单一目标蛋白条 带， 分子量约为 72KD， 纯度在 98以上。蛋白等电点在 pH4.5 左右。不同 FnbA1 肽指纹图 谱各峰峰数均保持一致， 各峰的保留时间均在 10Sec 内波动， 说明肽图谱重现性好。纯化 后的 FnbA1 与氢氧化铝佐剂或磷酸铝佐剂共同注射免疫 BalB/C 小鼠， 发现 FnbA1 加免疫佐 剂组血清中的 IgG 水平显著高于阴性对照组 (PBS 组 )(P 0.01)， 证明使用本发明纯化方 法获得的 FnbA1 可有效刺激机体产生较高的免疫应答。使用 MRSA 标准株 2。

22、52( 购自 ATCC) 感染， 发现 FnbA1 加免疫佐剂组感染率 为 80作用， 且具有良好的重复性， 表明该蛋白片 段具有良好的免疫原性和免疫保护性， 可用作耐甲氧西林葡萄球菌重组基因工程疫苗的候 选抗原。 附图说明 0031 图 1 为 FnbA1 发酵菌体破菌样品 SDS-PAGE。 0032 在图中， 泳道 M 为蛋白分子量 marker， 泳道 1-2 为 FnbA1 破菌上清。 0033 图 2 为硫酸铵沉淀及 GST 亲和层析样品 SDS-PAGE。 0034 在图中， 泳道 M 为蛋白分子量 marker， 泳道 1 为 40硫酸铵沉淀后复溶样本， 泳道 2 为 PP 酶。

23、酶切后第一次洗脱样本， 泳道 3 为 PP 酶酶切后第二次洗脱样本， 泳道 4 为 PP 酶 (Prescission Protease 酶 ) 酶切后第三次洗脱样本。 0035 图 3 为离子交换层析图。 0036 图中分别列出了 280nm 处的紫外吸收值和电导值的变化。 0037 图 4 为离子交换层析样品 SDS-PAGE。 0038 在图中， 泳道 M 为蛋白分子量 marker， 泳道 1-5 为峰 1 样品， 泳道 6 为峰 2 样品， 泳 道 7 为峰 3 样品， 泳道 8 为峰 4 样品。 0039 图 5 为两次疏水层析的层析图。 0040 图中分别列出了 280nm 处的。

24、紫外吸收值和电导值的变化。 0041 图 6 为疏水层析样品 SDS-PAGE。 0042 在图中， 泳道 M 为蛋白分子量 marker， 泳道 1 为离子交换层析样本， 泳道 2-3 为第 二次疏水层析样本， 泳道 4-7 为第一次疏水层析样本。 具体实施方式 0043 下面结合实施例对本发明作详细描述。 0044 实施例一 ： 抗原 FnBA1 的制备 说 明 书 CN 102993278 A 6 4/8 页 7 0045 本实施例所使用的菌株与各种试剂如下 ： 0046 1. 菌株 0047 金黄色葡萄球菌 MRSA-252 国际标准株由美国 ATCC 提供 ； 0048 2. 试剂 。

25、0049 质粒 pGEX-6p-2、 大肠杆菌菌株 XL-1blue 为申请人教研室保存， 0050 primeSTAR HS DNA Polymerase、 DNA Marker、 限制性内切酶 BamHI 和 Not I、 蛋白 Marker 为大连 TakaRa 公司产品 ； 0051 质粒提取试剂盒和凝胶回收试剂盒为美国 Omega 公司产品 ； 0052 细菌基因组提取试剂盒、 超薄回收试剂盒以及显色液为天根公司产品 ； 0053 T4DNA Ligase 为 Fermentas 公司产品 ； 0054 谷胱甘肽 - 琼脂糖凝胶 Glutathione Sepharose 4B 为美。

26、国 GE Healthcare 公司 产品。 0055 本实施例的具体步骤如下 ： 0056 ( 一 ) 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌纤连蛋白结合蛋白 A 活性片段 FnBA1 活性片段 的克隆 0057 1. 首先根据 MRSA-252FnBA 蛋白全长基因序列， 应用生物信息软件进行结构分析， 确定需要扩增的 FnBA1 目的基因片段。所述 FnBA1 目的基因片段的核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 1 所示， 其蛋白的的氨基酸序列如 SEQ ID NO ： 2 所示。 0058 2. 根据分析结果， 采用 PCR 方法自 MRSA-252 基因组扩增 FnBA1 目的基因片段， 扩 增步。

27、骤如下 ： 0059 1) 设计 PCR 引物如下， 分别为 SEQ ID NO ： 3-4( 下划线示酶切位点碱基序列 ) 0060 FnBA1-F ： SEQ ID NO ： 3 0061 5 -CGCGGATCCATGGGACAAGATAAAGAAGCTGCA-3 0062 BamH I 0063 FnBA1-R ： SEQ ID NO ： 4 0064 5 -TTTTCCTTTTGCGGCCGCCTATCCATTATCCCATGTTAATGTAT-3 0065 Not I 0066 2)-80冷冻库中取出保存的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 MRSA-252 菌株涂布于 MRSA-252专用。

28、固体培养基上， 于37培养过夜， 再挑取单菌落接种于MRSA-252专液体体培 养基中培养 8 个小时， 参照细菌基因组抽提试剂盒抽提 MRSA 基因组。 0067 3) 以 MRSA-252 全基因组 DNA 为模板 PCR 扩增 FnBA1 基因片段 0068 PCR 体系 ： 0069 模板 (239.2nngl) 2.5l FnBA1-F(50M) 1l FnBA1-R(50M) 1l Taq 酶 2.5l dNTP 2l Buffer 15l 灭菌双蒸水 26l 总体积 50l 说 明 书 CN 102993278 A 7 5/8 页 8 0070 PCR 扩增反应条件 98预变性 。

29、5min， 94变性 30s， 50退火 30s， 72延伸 1min30s， 30 个循环， 72完全延伸 6min。反应完毕后使用 1的琼脂糖凝胶检测 PCR 扩增 结果， PCR 扩增结果示于图 1 中。 0071 4) 使用凝胶回收试剂盒回收 FnBA1PCR 产物。 0072 3.PCR 产物的鉴定与克隆， 步骤如下 ： 0073 1)BamH I 和 Not I 酶切 pGEX-6P-2 质粒和 FnBA1PCR 产物 0074 酶切反应体系 ： 0075 BamH I 3l Not I 3l 10K Buffer 3l 0.1 BSA 6l Product 45l 总体积 60l。

30、 0076 0077 37酶切 2h。 0078 2) 使用超薄回收试剂盒回收 pGEX-6P-2 质粒和经 BamH I 和 Not I 酶切的 PCR 产 物。 0079 3) 连接和转化 0080 通过紫外分光光度计测定 FnBA1 酶切回收产物核酸浓度 ： 21ng/l， pGEX-6P-2 酶 切回收产物核酸浓度 ： 60ng/l。 0081 连接反应体系 ： 0082 soultion I 5l FnBA1 酶切回收产物 4.5l PGEX-6P-2 酶切回收产物 0.5l 总体积 10l 0083 混匀， 16连接 2h。 0084 4) 从 -80冰箱取 3 管大肠杆菌 XL1。

31、blue 感受态细胞， 第一管加入 pGEX-6P-2 质 粒， 作阳性对照 ； 第二管加入DNA连接产物 ； 第三管不加外源DNA， 作阴性对照。 冰浴50min， 42金属浴中热击90s， 迅速冰浴2min。 加入600ul LB空白培养基， 混匀， 置于37摇床中 220rp 振摇 1h。 0085 各管以 5000rpm 室温离心 3min.， 弃去 300ul 上清， 再重悬菌体， 取 200l 涂布于 Amp 抗性 LB 平板。平板倒置于 37培养箱中培养 24h。 0086 5)pGEX-6p-2/FnBA1 阳性重组质粒的筛选、 鉴定 0087 阴性对照平板没有菌落出现 ； 阳。

32、性对照平板长满菌落， 说明感受态细胞制作正 确， 结果可信。挑取转化平板上分隔良好的菌落， 接种于 Amp 抗性 LB 培养基中， 37振荡培 养过夜 ； 0088 质粒抽提 ： 参照质粒提取试剂盒说明书进行 ； 0089 质粒 DNA 进行 BamH I 和 Not I 双酶切 ； 0090 双酶切反应体系 ： 0091 说 明 书 CN 102993278 A 8 6/8 页 9 BamH I 0.5l Not I 0.5l 10K Buffer 0.5l 0.1 BSA 1l 重组质粒 8l 总体积 10.5l 0092 37酶切 2h ； 0093 1的琼脂糖凝胶电泳检测双酶切结果， 。

33、结果如图 2， 可见泳道 2 样品为构建成 功的 pGEX-6p-2/FnBA1 重组质粒 ； 0094 pGEX-6p-2/FnBA1 重组质粒送往上海英俊公司测序， 测序结果比对结果示于图 6， 可见重组质粒的目的基因片段的序列是正确的。 0095 ( 二 )MRSA-252FnBA 亚单位活性片段 FnBA1 在原核表达系统 - 大肠杆菌中诱导表 达、 纯化及表达形式的鉴定 0096 1. 目的蛋白诱导表达 0097 1)取双酶切鉴定正确的pGEX-6P-2-FnBA1/XL-1blue菌液100L加入10mLAmp抗 性的 TB 培养基中， 80rpm 37过夜培养， 分别取过夜培养的。

34、菌液 400L 加入 20mLAmp 抗性 的 TB 培养基中 ( 余下的菌液保存在 4冰箱中备用 )， 37培养 2 3h， 转速 200rpm， 二次 活化至 OD600 为 0.8-1.0 时， 加入 IPTG 4L， 使其终浓度为 200M， 再置于摇床诱导表达 30 3h， 25 5h， 16过夜诱导表达。 0098 2) 将诱导表达后的菌液取出， 以 12000rpm 离心 5min， 弃去上清， 加入 1mL lysis buffer 混匀， 超声裂解 3min( 超声 6 次 30s/ 次 )， 再 4 14000rpm 离心 15min， 分离上清和 沉淀。 0099 2. 。

35、处理上清 0100 取 Glutathione Sepharose 4B 20l， 用 PBS 洗涤 3 次后， 将准备好的上清加 入 Glutathione Sepharose 4B 中， 室温结合 1h。在 4下以 14000rpm 离心 3min 后， 使用 PBS-0.25吐温 20 洗涤 2 次， PBS 洗涤一次。向结合后的 Glutathione Sepharose 4B 加 入 20ul 2 蛋白质上样 buffer， 煮沸 5min， 14000rpm 离心 3min。 0101 3. 处理沉淀 0102 在沉淀中加入 500L lysis buffer 重悬菌体， 取 80。

36、uL 重悬菌液加入 20L5 蛋白质上样 buffer， 煮沸 5min， 14000rpm 离心 3min。 0103 4.SDS-PAGE 电泳， 将 5浓缩胶灌入制胶版中， 在加入蒸馏水将胶压平， 室温放置 30min 使其凝固， 将上层的蒸馏水倒干， 再灌入 10分离胶， 立即插上梳子， 室温放置 30min 使其凝固备用。 0104 5. 将处理好的上清和沉淀分别取 10L 上样， 进行 SDS-PAGE 电泳。电压先 80v 电泳 30min， 再调至 180v， 电泳 1 2h 后， 将胶取出， 置于考马斯亮蓝染色液中振荡染色， 再置于脱色液中振荡脱色后， 在呈像系统下观察结果，。

37、 结果示于图 3， PGEX-6P-2-FnBA1/ XL-1blue 在 16、 25、 30均为可溶性蛋白， 且无明显差异。 0105 ( 三 )FnBA1 抗原的制备 0106 1. 放大培养获取蛋白 0107 取保存在 4冰箱中备用的 pGEX-6P-2-FnBA1/XL-1blue 菌液 400L 加入到 20mL 说 明 书 CN 102993278 A 9 7/8 页 10 含Amp抗性的TB培养基中进行一次活化， 200rpm 37培养56h后， 取8mL一次活化的菌 液加入到 400mL 含 Amp 抗性的 TB 培养基中进行二次活化， 37培养 3 4h 至 OD600 为。

38、 1.0 时， 加入 80ul IPTG( 终浓度为 200uM) 置于 16摇床中过夜诱导后， 12000rpm 离心 15min 收集菌体， 再加 20mL lysis buffer 重悬菌体后， 将菌液进行超声裂解 3min(200V)， 收集上 清与 800L 用于结合 GST 融合蛋白的 GlutathioneSepharose 4B 凝胶珠 (beads) 结合处 理 ； 再进行 SDS-PAGE 凝胶电泳。 0108 2. 使用酶切方法， 将目的蛋白和 GST 标签分开， 获取 FnBA1 目的蛋白 0109 向余下约 800L 已结合蛋白的 Glutathione Sephar。

39、ose 4B 中加入 800LPBS 和 120L PreScission protease(PP 酶 )， 室温垂直旋转酶切 5h 后， 离心吸取上清后， 分别 用 800L PBS 洗涤 3 次， 各后取 10L 样品变性处理后， 上样 5L 进行蛋白电泳 ( 方法同 上 )， 在呈相系统下观察结果， 酶切前 GST 融合蛋白分子量在 96kDa 左右， 酶切下来的 FnBA1 蛋白分子量在 72kDa-95kDa 之间， 与预期蛋白分子量大小相符合， 电泳结果示于图 4， 其中 泳道 1 表示酶切前， 含有 GST 标签的融合蛋白 ； 泳道 2 表示酶切后， 由于目的蛋白与结合与 凝胶珠。

40、的GST标签分离， 因此在上清获取的目的蛋白 ； 泳道3表示酶切后， 洗涤Glutathione Sepharose 4B 凝胶珠 (beads) 获取的非特异性结合在 beads 上的目的蛋白 ； 泳道 4 表示酶 切后， 非特异性结合在 beads 上的目的蛋白和特异性结合在 beads 上的酶和 GST 标签。 0110 3.BCA 法测定蛋白含量， 最高浓度为 1.7mg/mL。 0111 实施例二 ： 高压破菌、 离心 0112 将构建的表达可溶性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌重组基因工程疫苗候选抗原 FnbA1 的大肠杆菌工程菌， 通过高密度发酵， 目标蛋白表达率为 18， 4， 100。

41、00g 离心 15-30min 收集菌体备用。 0113 菌体 200-500g 以 PBS(10-20mM， pH7.0-7.5) 缓冲液， 按重量体积比为 1 10 比例 混匀悬浮， 4预冷。 0114 高压匀浆机 ： 使用蒸馏水冲洗高压匀浆机管道， 低温循环系统开启预冷至 1-4 备用。 0115 预冷的悬浮菌液加入高压匀浆机， 压力维持在 60-80Mpa 破菌 3-5 次， 取破菌液涂 片行结晶紫染色， 油镜下每个视野下未破碎菌小于 1-2 个视为破菌完全。 0116 高速离心 ： 破菌后的液体装入离心桶， 4， 10,000-15,000 离心 15-30min， 收集上 清备用。。

42、上清电泳结果如图 1 所示， FnbA1 表达量极高， 可能在 30以上。 0117 实施例三 ： 硫酸铵分步沉淀、 复溶 0118 4搅拌条件下， 上清中缓慢加入终浓度为 30的固体硫酸铵， 搅拌半小时以上， 10000-15000g 高速离心 20 分钟以上， 收集上清。上清中继续缓慢加入终浓度为 40的硫 酸铵， 搅拌半小时以上， 10000-15000g 高速离心 20 分钟以上， 收集沉淀 ； 0119 沉淀复溶 ： 称量沉淀湿重， 按重量体积比为 1 10 比例加入复溶液 (10-20mM， pH7.0-7.5， 0.5 Triton)， 搅拌混匀 10-15 分钟， 10000-。

43、15000g 高速离心 20 分钟以上， 收 集上清。 复溶后的样品电泳结果如图2泳道1所示， 蛋白经过复溶后纯度达到60左右， 已 经除掉了大量杂蛋白。 0120 实施例四 ： GST 亲和纯化 0121 1. 结合选择 GST 亲和层析填料进行初步纯化， 将实施例二中收集的上清加入用于 说 明 书 CN 102993278 A 10 8/8 页 11 结合 GST 融合蛋白的 Glutathione Sepharose 4B 凝胶珠 (beads) 中， 4结合 3h 以上， 结 合过程采用垂直旋的方法以促进蛋白与 beads 的结合。 0122 2. 酶切将目的蛋白和 GST 标签分开，。

44、 获取 FnBA1 目的蛋白 0123 将上述结合蛋白的 beads 采用复溶液洗涤 3-5 个体积后， 采用 PBS 继续洗涤 3-5 个体积， 除去未与 beads 结合的杂蛋白。然后向 beads 中加入一定体积的 PreScission protease(PP 酶 )， 4垂直旋转酶切 3h 左右后， 用 PBS 洗涤 3 次， 4保存用于后续精细纯 化。同时， 各取 10L 样品变性处理后， 上样 5L 进行 SDS-PAGE 蛋白电泳。电泳结果如图 2 泳道 2-4 所示， 经过 GST 初纯， 目的蛋白的纯度进一步提到， 达到 80左右， 仍有待进一步 的纯化， 除去痕量杂质。 。

45、0124 实施例五 ： 离子交换层析纯化 0125 实施例三收集的样品， 采用 NaOH 将 pH 调至约 9.0， 同时采用 bufferA(10-50mM Tris pH9.0)稀释样品， 使其电导降至8.0mS/cm以下。 同时， 采用buffer A平衡层析系统 及离子交换层析柱 (Q HP、 RESOURCE Q、 QFF、 Adhere 均可 )， 待电导和 UV 指数稳定后上样， 上样结束后采用 bufferA 洗柱至 UV280 不再下降为止， 此时采用 buffer B(10-50mM Tris pH9.0， 0.5-1MNaCl)梯度洗脱并收集各个洗脱样品， 4保存并进行S。

46、DS-PAGE电泳鉴定。 层 析图如图 3 所示， 在离子交换层析过程中， 有少量的蛋白流穿， 由于 UV 吸收值太小， 未取样 电泳， 可能是部分杂蛋白流穿。洗脱过程中共出现 4 个峰， 分别命名为峰 1、 峰 2、 峰 3 和峰 4。结合电泳结果 ( 图 4) 发现， 峰 1 主要为目的蛋白， 纯度达到 90以上， 而且峰的左半部 分纯度明显高于右半部分。峰 2 和峰 3 中虽然目的蛋白仍很多， 但杂蛋白含量明显提高， 在 目的蛋白上方出现大量杂蛋白。峰 4 中杂蛋白更多。由此， 将峰 1 的样品保存在 4备用。 0126 实施例六 ： 疏水层析纯化与脱盐 0127 将实施例四纯化获得的峰。

47、1样品按照11的比例加入buffer C(20mMPB， pH7.5， 3M(NH4)2SO4) 中， 边加边搅拌。采用疏水层析柱 (phenyl 或 butyl) 前先用 buffer D(10mM PB， 1.5M(NH4)2SO4) 平衡层析系统和层析柱， 然后将上述蛋白样品上样， 上样结束后采用 buffer C 洗柱至 UV280 不再下降为止， 此时采用 buffer D(10mM PB， pH7.5) 梯度洗脱并收 集洗脱样品， 并对收集的样品进行 SDS-PAGE 检测。图 5 为两次疏水层析的层析图。图 6 为 两次层析的电泳结果， 结果表明 ： 最后得到的蛋白中基本没有杂带。

48、， 蛋白纯度达到 98以 上。 0128 收集疏水层析的样品后， 采用 PBS 平衡脱盐柱， 然后将样品通过脱盐柱置换缓冲 液， 得到最终的目的蛋白， 即纯化的抗原。 0129 虽然本发明已以较佳实施例披露如上， 然其并非用以限定本发明， 任何所属技术 领域的技术人员， 在不脱离本发明之精神和范围内， 当可作些许之更动与改进， 因此本发明 之保护范围当视权利要求所界定者为准。 说 明 书 CN 102993278 A 11 1/5 页 12 0001 0002 序 列 表 CN 102993278 A 12 2/5 页 13 0003 序 列 表 CN 102993278 A 13 3/5 页 14 0004 序 列 表 CN 102993278 A 14 4/5 页 15 0005 序 列 表 CN 102993278 A 15 5/5 页 16 序 列 表 CN 102993278 A 16 1/3 页 17 图 1 图 2 图 3 说 明 书。