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1、(10)申请公布号 CN 102994622 A (43)申请公布日 2013.03.27 CN 102994622 A *CN102994622A* (21)申请号 201110269818.X (22)申请日 2011.09.13 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (71)申请人 广州益善生物技术有限公司 地址 510663 广东省广州市广州科学城揽月 路 80 号广州科技创新基地 B、 C 区五层 (72)发明人 许嘉森 何嘉英 (74)专利代理机构 广州华进联合专利商标代理 有限公司 44224 代理人 万志香 曾旻辉 (54) 发明名称 一。
2、种 MET 基因突变检测特异性引物和液相芯 片 (57) 摘要 本发明公开了一种 MET 基因检测特异性引物 和液相芯片， 该液相芯片主要包括有 ： 每种由 5 端的 tag 序列和 3 端针对目的基因突变位点的 特异性引物序列组成的 ASPE 引物， 所述特异性引 物序列为 ： SEQ ID NO.23以及SEQ ID NO.24 ； SEQ ID NO.25以及SEQ IDNO.26 ； SEQ ID NO.27及SEQ ID NO.28 ； SEQ ID NO.29 及 SEQ ID NO.30 ； SEQ ID NO.31 及 SEQ ID NO.32 ； SEQ ID NO.33 及。
3、 SEQ ID NO.34 ； SEQ ID NO.35及SEQ ID NO.36 ； SEQID NO.37 及 SEQ ID NO.38 ； SEQ ID NO.39 及 SEQ ID NO.40 ； SEQ ID NO.41 及 SEQ IDNO.42 ；和 / 或 针 SEQ ID NO.43 及 SEQ ID NO.44 ； 有 anti-tag 序列包被的微球 ； 扩增引物。本发明所提供的检 测液相芯片的检测结果与测序法的吻合率高达 100， 实现多个突变位点的野生型和突变型并行 检测。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 22 页 序列表 14 页 (19)中华人。
4、民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 22 页 序列表 14 页 1/2 页 2 1. 一种 MET 基因突变检测液相芯片， 其特征是， 包括有 ： (A). 针对 MET 基因不同突变位点分别设计的野生型和突变型的 ASPE 引物 ： 每种 ASPE 引物由 5 端的 tag 序列和 3 端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成， 所述特异 性引物序列为 ： 针对 G504T 位点的 SEQ ID NO.23 以及 SEQ ID NO.24 ； 针对 A1124G 位点的 SEQ ID NO.25 以及 SEQ ID NO.26 ； 针对 C2962T 。
5、位点的 SEQ ID NO.27 及 SEQ ID NO.28 ； 针 对 C3029T 位点的 SEQ ID NO.29 及 SEQ ID NO.30 ； 针对 2942_3082del141 位点的 SEQ ID NO.31 及 SEQ ID NO.32 ； 针对 T3172C 位点的 SEQ ID NO.33 及 SEQ ID NO.34 ； 针对 G3307T 位点的SEQ ID NO.35及SEQID NO.36 ； 针对T3742C位点的SEQ ID NO.37及SEQ ID NO.38 ； 针对 A3743G 位点的 SEQ IDNO.39 及 SEQ ID NO.40 ； 针对。
6、 T3757G 位点的 SEQ ID NO.41 及 SEQ ID NO.42 ； 和 / 或针对 T3803C 位点的 SEQ ID NO.43 及 SEQ ID NO.44 ； 所述 tag 序列 选自 SEQ ID NO.1 SEQ IDNO.22 ； (B).有anti-tag序列包被的、 具有不同颜色编码的微球， 所述anti-tag序列与微球连 接中间还设有间隔臂序列 ； 所述 anti-tag 序列选自 SEQ ID NO.45 SEQ ID NO.66， 且所 述 anti-tag 序列能相应地与 (A) 中所选的 tag 序列互补配对 ； (C). 用于扩增出需要检测的、 具。
7、有相应突变位点的目标序列的引物。 2. 根据权利要求 1 所述的 MET 基因突变检测液相芯片， 其特征是， 所述扩增引物为 ： 针 对 G504T 位点的 SEQ ID NO.67 及 SEQ ID NO.68 ； 针对 A1124G 位点的 SEQ ID NO.69 及 SEQ ID NO.70 ； 针对 C2962T、 C3029T、 2942_3082del141 位点的 SEQ ID NO.71 及 SEQ ID NO.72 ； 针对 T3172C、 G3307T 位点的 SEQ ID NO.73 及 SEQ ID NO.74 ； 和 / 或针对 T3742C、 A3743G、 T3。
8、757G、 T3803C 位点的 SEQ ID NO.75 及 SEQ ID NO.76。 3. 根据权利要求 1 所述的 MET 基因突变检测液相芯片， 其特征是， 所述 ASPE 引物为 ： 针对G504T位点的由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.23组成的序列以及由SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.24组成的序列 ； 针对A1124G位点的由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.25组成的序列以及 由 SEQ ID NO.4 和 SEQ ID NO.26 组成的序列 ； 针对 C2962T 位点的由 SEQ ID NO.5 和 SEQ IDNO.27 组成的序列以。
9、及由 SEQ ID NO.6 和 SEQ ID NO.28 组成的序列 ； 针对 C3029T 位点 的由 SEQ ID NO.7 和 SEQ ID NO.29 组成的序列以及由 SEQ ID NO.8 和 SEQ ID NO.30 组成 的序列 ； 针对2942_3082del141位点的由SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.31组成的序列以及由 SEQ IDNO.10 和 SEQ ID NO.32 组成的序列 ； 针对 T3172C 位点的由 SEQ ID NO.11 和 SEQ ID NO.33 组成的序列以及由 SEQ ID NO.12 和 SEQ ID NO.34 组成的序列。
10、 ； 针对 G3307T 位点的 由 SEQ IDNO.13 和 SEQ ID NO.35 组成的序列以及由 SEQ ID NO.14 和 SEQ ID NO.36 组成 的序列 ； 针对 T3742C 位点的由 SEQ ID NO.15 和 SEQ ID NO.37 组成的序列以及由 SEQ ID NO.16 和 SEQ IDNO.38 组成的序列 ； 针对 A3743G 位点的由 SEQ ID NO.17 和 SEQ ID NO.39 组成的序列以及由 SEQ ID NO.18 和 SEQ ID NO.40 组成的序列 ； 针对 T3757G 位点的由 SEQ ID NO.19 和 SEQ。
11、 IDNO.41 组成的序列以及由 SEQ ID NO.20 和 SEQ ID NO.42 组成的序列 ； 和 / 或针对 T3803C 位点的由 SEQ ID NO.21 和 SEQ ID NO.43 组成的序列以及由 SEQ ID NO.22 和 SEQ ID NO.44 组成的序列。 4. 根据权利要求 1 所述的 MET 基因突变检测液相芯片， 其特征是 ： (A)所述ASPE引物为 ： 针对G504T位点的由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.23组成的序列 以及由 SEQ ID NO.2 和 SEQ ID NO.24 组成的序列 ； 针对 A1124G 位点的由 SEQ I。
12、D NO.3 和 权 利 要 求 书 CN 102994622 A 2 2/2 页 3 SEQ IDNO.25组成的序列以及由SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.26组成的序列 ； 针对C2962T位 点的由 SEQ ID NO.5 和 SEQ ID NO.27 组成的序列以及由 SEQ ID NO.6 和 SEQ ID NO.28 组 成的序列 ； 针对 C3029T 位点的由 SEQ ID NO.7 和 SEQ ID NO.29 组成的序列以及由 SEQ ID NO.8 和 SEQID NO.30 组成的序列 ； 针对 2942_3082del141 位点的由 SEQ ID NO.。
13、9 和 SEQ ID NO.31 组成的序列以及由 SEQ ID NO.10 和 SEQ ID NO.32 组成的序列 ； 针对 T3172C 位点的 由 SEQ ID NO.11 和 SEQ ID NO.33 组成的序列以及由 SEQ ID NO.12 和 SEQ ID NO.34 组成 的序列 ； 针对 G3307T 位点的由 SEQ ID NO.13 和 SEQ ID NO.35 组成的序列以及由 SEQ ID NO.14 和 SEQ ID NO.36 组成的序列 ； 针对 T3742C 位点的由 SEQ ID NO.15 和 SEQ ID NO.37 组成的序列以及由 SEQ IDNO。
14、.16 和 SEQ ID NO.38 组成的序列 ； 针对 A3743G 位点的由 SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.39组成的序列以及由SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.40组成的序列 ； 针对 T3757G 位点的由 SEQ IDNO.19 和 SEQ ID NO.41 组成的序列以及由 SEQ ID NO.20 和 SEQ ID NO.42组成的序列 ； 和/或针对T3803C位点的由SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.43组 成的序列以及由 SEQ ID NO.22 和 SEQID NO.44 组成的序列 ； (B) 有 anti-tag 序列包被的、。
15、 具有不同颜色编码的微球， 所述 anti-tag 序列与微球连 接中间还设有间隔臂序列 ； 所述 anti-tag 序列选自 SEQ ID NO.45 SEQ ID NO.66， 且所 述 anti-tag 序列能相应地与 (A) 中所选的 tag 序列互补配对 ； (C) 所述扩增引物为 ： 针对 G504T 位点的 SEQ ID NO.67 及 SEQ ID NO.68 ； 针对 A1124G 位点的SEQ ID NO.69及SEQ ID NO.70 ； 针对C2962T、 C3029T、 2942_3082del141位点的SEQ ID NO.71 及 SEQ ID NO.72 ； 针。
16、对 T3172C、 G3307T 位点的 SEQ ID NO.73 及 SEQ ID NO.74 ； 和 / 或针对 T3742C、 A3743G、 T3757G、 T3803C 位点的 SEQ ID NO.75 及 SEQ ID NO.76。 5.根据权利要求1-4任一项所述的MET基因突变检测液相芯片， 其特征是， 所述间隔臂 为 5-10 个 T。 6. 用于 MET 基因突变检测液的特异性引物， 其特征是， 所述特异性引物序列为针对 G504T 位点的 SEQ ID NO.23 以及 SEQ ID NO.24 ； 针对 A1124G 位点的 SEQ ID NO.25 以及 SEQ ID。
17、NO.26 ； 针对C2962T位点的SEQ ID NO.27及SEQ ID NO.28 ； 针对C3029T位点的SEQ ID NO.29及SEQ ID NO.30 ； 针对2942_3082del141位点的SEQ ID NO.31及SEQ ID NO.32 ； 针对 T3172C 位点的 SEQ ID NO.33 及 SEQ ID NO.34 ； 针对 G3307T 位点的 SEQ ID NO.35 及 SEQ ID NO.36 ； 针对T3742C位点的SEQ ID NO.37及SEQ ID NO.38 ； 针对A3743G位点的SEQ ID NO.39 及 SEQID NO.40 ；。
18、 针对 T3757G 位点的 SEQ ID NO.41 及 SEQ ID NO.42 ； 和 / 或针 对 T3803C 位点的 SEQID NO.43 及 SEQ ID NO.44。 权 利 要 求 书 CN 102994622 A 3 1/22 页 4 一种 MET 基因突变检测特异性引物和液相芯片 技术领域 0001 本发明属于分子生物学领域， 涉及医学和生物技术， 具体的是涉及一种 MET 基因 突变检测特异性引物和液相芯片。 背景技术 0002 C-met 位于人类 7 号染色体长臂 (7q31)， 大小约 110kb， 包括 21 个外显子， 启动子 区域有许多调控序列。 c-me。
19、t是一种由c-met原癌基因编码的蛋白产物， 为肝细胞生长因子 受体， 具有酪氨酸激酶活性， 与多种癌基因产物和调节蛋白相关， 参与细胞信息转导、 细胞 骨架重排的调控， 是细胞增殖、 分化和运动的重要因素。目前认为， c-met 与多种癌的发生 和转移密切相关， 研究表明， 许多肿瘤病人在其肿瘤的发生和转移过程中均有 c-met 过度 表达和基因扩增。 0003 目前， 对 MET 基因突变进行检测和分析的方法很少， 主要有直接测序法和 PCR-RFLP 分析法， 其中最常用的方法有 PCR-RFLP 分析法。PCR-RFLP 法是基于基因突变造 成的限制性内切酶识别位点的改变， 如位点丢失。
20、或产生新位点， 通过 PCR 扩增某一特定片 段， 再用限制性内切酶酶切扩增产物， 电泳观察片段的大小， 这种方法用于检测酶切位点改 变的基因突变， 可直接判断基因型， 但该法不能用于没有产生新酶切位点的基因突变检测。 再次， 以上这些方法都存在着检测通量的局限性， 每次只能检测一种突变类型， 不能满足实 际应用的需要。 发明内容 0004 本发明的目的之一是提供 MET 基因突变检测液相芯片。该液相芯片可用于检 测 MET 基因 11 种常见基因型 G504T、 A1124G、 C2962T、 C3029T、 2942_3082del141、 T3172C、 G3307T、 T3742C、 。
21、A3743G、 T3757G 和 T3803C 的野生型和突变型。 0005 实现上述目的的技术方案如下 ： 0006 一种 MET 基因突变检测液相芯片， 包括有 ： 0007 (A). 针对 MET 基因不同突变位点分别设计的野生型和突变型的 ASPE 引物 ： 每种 ASPE 引物由 5 端的 tag 序列和 3 端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成， 所述 特异性引物序列为 ： 针对G504T位点的SEQ ID NO.23以及SEQ ID NO.24 ； 针对A1124G位点 的 SEQ ID NO.25 以及 SEQ ID NO.26 ； 针对 C2962T 位点的 SEQ I。
22、D NO.27 及 SEQ ID NO.28 ； 针对 C3029T 位点的 SEQ ID NO.29 及 SEQ ID NO.30 ； 针对 2942_3082del141 位点的 SEQ ID NO.31 及 SEQ ID NO.32 ； 针对 T3172C 位点的 SEQ ID NO.33 及 SEQ ID NO.34 ； 针对 G3307T 位点的SEQ ID NO.35及SEQID NO.36 ； 针对T3742C位点的SEQ ID NO.37及SEQ ID NO.38 ； 针对 A3743G 位点的 SEQ IDNO.39 及 SEQ ID NO.40 ； 针对 T3757G 位点。
23、的 SEQ ID NO.41 及 SEQ ID NO.42 ； 和 / 或针对 T3803C 位点的 SEQ ID NO.43 及 SEQ ID NO.44 ； 所述 tag 序列 选自 SEQ ID NO.1 SEQ IDNO.22 ； 0008 (B).有anti-tag序列包被的、 具有不同颜色编码的微球， 所述anti-tag序列与微 说 明 书 CN 102994622 A 4 2/22 页 5 球连接中间还设有间隔臂序列 ； 所述 anti-tag 序列选自 SEQ ID NO.45 SEQ ID NO.66， 且所述 anti-tag 序列能相应地与 (A) 中所选的 tag 序。
24、列互补配对 ； 0009 (C). 用于扩增出需要检测的、 具有相应突变位点的目标序列的引物。 0010 优选地， 所述扩增引物为针对 G504T 位点的 SEQ ID NO.67 及 SEQ ID NO.68 ； 针对 A1124G 位点的 SEQ ID NO.69 及 SEQ ID NO.70 ； 针对 C2962T、 C3029T、 2942_3082del141 位 点的 SEQID NO.71 及 SEQ ID NO.72 ； 针对 T3172C、 G3307T 位点的 SEQ ID NO.73 及 SEQ ID NO.74 ； 和/或针对T3742C、 A3743G、 T3757G。
25、、 T3803C位点的SEQ ID NO.75及SEQ ID NO.76。 0011 优选地， 所述 ASPE 引物为 ： 针对 G504T 位点的由 SEQ ID NO.1 和 SEQ ID NO.23 组 成的序列以及由 SEQ ID NO.2 和 SEQ ID NO.24 组成的序列 ； 针对 A1124G 位点的由 SEQ ID NO.3 和 SEQ ID NO.25 组成的序列以及由 SEQ ID NO.4 和 SEQ ID NO.26 组成的序列 ； 针 对 C2962T 位点的由 SEQ ID NO.5 和 SEQ ID NO.27 组成的序列以及由 SEQ ID NO.6 和 。
26、SEQ ID NO.28 组成的序列 ； 针对 C3029T 位点的由 SEQ ID NO.7 和 SEQ ID NO.29 组成的序列以 及由 SEQ ID NO.8 和 SEQ ID NO.30 组成的序列 ； 针对 2942_3082del141 位点的由 SEQ ID NO.9 和 SEQ ID NO.31 组成的序列以及由 SEQ ID NO.10 和 SEQ ID NO.32 组成的序列 ； 针 对T3172C位点的由SEQ IDNO.11和SEQ ID NO.33组成的序列以及由SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.34 组成的序列 ； 针对 G3307T 位点的由 SE。
27、Q ID NO.13 和 SEQ ID NO.35 组成的序列 以及由 SEQ ID NO.14 和 SEQ IDNO.36 组成的序列 ； 针对 T3742C 位点的由 SEQ ID NO.15 和 SEQ ID NO.37组成的序列以及由SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.38组成的序列 ； 针对A3743G 位点的由SEQ ID NO.17和SEQ IDNO.39组成的序列以及由SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.40 组成的序列 ； 针对 T3757G 位点的由 SEQ ID NO.19 和 SEQ ID NO.41 组成的序列以及由 SEQ ID NO.20 和 。
28、SEQ ID NO.42 组成的序列 ； 和 / 或针对 T3803C 位点的由 SEQ ID NO.21 和 SEQ ID NO.43 组成的序列以及由 SEQ IDNO.22 和 SEQ ID NO.44 组成的序列。 0012 本发明的另一目的是提供用于 MET 基因突变检测的特异性引物。 0013 实现上述目的的技术方案如下 ： 0014 用于 MET 基因突变检测液的特异性引物， 其为 ： 针对 G504T 位点的 SEQ ID NO.23 以及SEQ ID NO.24 ； 针对A1124G位点的SEQ ID NO.25以及SEQ ID NO.26 ； 针对C2962T位 点的 SE。
29、Q ID NO.27 及 SEQ ID NO.28 ； 针对 C3029T 位点的 SEQ ID NO.29 及 SEQ ID NO.30 ； 针对 2942_3082del141 位点的 SEQ ID NO.31 及 SEQ ID NO.32 ； 针对 T3172C 位点的 SEQ ID NO.33及SEQ ID NO.34 ； 针对G3307T位点的SEQ ID NO.35及SEQ ID NO.36 ； 针对T3742C位 点的 SEQ ID NO.37 及 SEQ ID NO.38 ； 针对 A3743G 位点的 SEQ ID NO.39 及 SEQ ID NO.40 ； 针对 T375。
30、7G 位点的 SEQ ID NO.41 及 SEQ ID NO.42 ； 和 / 或针对 T3803C 位点的 SEQ ID NO.43 及 SEQID NO.44。 0015 本发明的主要优点在于 ： 0016 1. 本发明所提供的检测方法与测序法的吻合率高达 100。且检测所需要的时间 远远低于常用的测序技术， 特别符合实际应用需要。所制备的 MET 基因突变检测液相芯片 具有非常好的信号-噪声比， 并且所设计的探针以及anti-tag序列之间基本上不存在交叉 反应， tag 标签序列、 anti-tag 标签序列的选取以及 tag 标签序列与具体 ASPE 引物的结合， 能够避免交叉反应。
31、， 实现多个突变位点的并行检测。 0017 2. 本发明通过发明人长期积累的设计经验和大量的实验操作， 从众多的特异性 说 明 书 CN 102994622 A 5 3/22 页 6 引物中选取了最优的组合。本发明设计的 ASPE 引物特异性引物能够灵敏特异地识别目标 检测的突变位点， 准确区分各种型别的基因型 ； 在同一个反应体系中， 不同的特异性引物之 间、 特异性引物与非目标检测的 PCR 扩增产物之间基本上不存在交叉反应， 检测特异性好， 交叉反应率低于 3； 除了能够检测单个位点突变情况， 也能够同时并行检测多个突变位点 的突变情况， 检测效果一致。 0018 3. 本发明的检测方法。
32、步骤简单， 11 种突变位点检测可通过一步 PCR 即可完成 5 条 含有突变位点的目标序列的扩增， 避免了反复多次 PCR 等复杂操作过程中存在的诸多不确 定因素， 因而可大大提高检测准确率， 体现了精确的同时定性、 定量分析特征。 0019 4. 本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高， 检测结果的可重复性差的缺陷， 同时对现有的液相芯片技术进行改进， 使得所制备微球能适用于不同的检测项目， 具有很 强的拓展性。 检测的荧光信号值大大提高， 从而使得检测的灵敏度进一步得到提高， 信噪比 增强， 检测结果更加准确可靠。 具体实施方式 0020 实施例 1MET 基因突变检测液相芯片， 主要包。
33、括有 ： 0021 一、 ASPE 引物 0022 针对MET基因11种常见基因型G504T、 A1124G、 C2962T、 C3029T、 2942_3082del141、 T3172C、 G3307T、 T3742C、 A3743G、 T3757G 和 T3803C 的野生型和突变型， 分别设计特异性引 物序列。ASPE 引物由 “tag 序列 + 特异性引物序列” 组成。ASPE 引物序列如下表所示 ： 0023 表 1MET 基因的 ASPE 引物序列 (tag 序列 + 特异性引物序列 ) 0024 说 明 书 CN 102994622 A 6 4/22 页 7 0025 说 明 。
34、书 CN 102994622 A 7 5/22 页 8 0026 每条ASPE引物包括两个部分， 5 端为针对相应微球上anti-tag序列的特异性tag 序列， 3 端为突变型或野生型特异的引物片段 ( 如上述表 1 所示 )。所有 ASPE 引物由上海 生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用 10mmol/L Tris Buffer 配制成 100pmol/mL 的贮存液。 0027 二、 anti-tag 序列包被的微球 0028 根据所设计的 ASPE 特异性引物片段， 选择 tag 序列， 最大限度地减少各微球的 anti-tag 序列之间以及 tag 与 ASPE。
35、 特异性引物片段可能形成的二级结构， 选择的 22 种微 说 明 书 CN 102994622 A 8 6/22 页 9 球编号与微球上相应的 anti-tag 序列如表 2 所示 ： 0029 表 2 微球编号与微球上相应的 anti-tag 序列 0030 0031 说 明 书 CN 102994622 A 9 7/22 页 10 0032 选择的 22 种微球购自美国 Luminex 公司， 将 anti-tag 序列包被于微球上。 anti-tag 序列与微球之间连接有 5-10 个 T 的间隔臂序列， 即在每个 anti-tag 序列前加 上一段 5-10 个 T 的间隔臂序列， a。
36、nti-tag 序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合 成。将合成的 anti-tag 序列用灭菌 ddH2O 配成 100nmol/ml 的贮存液。所述间隔臂为用 于将 anti-tag 与微球表面间隔开来或是将 anti-tag 置于亲水性环境中的序列。通过在 anti-tag 序列与微球之间设置适当长度的间隔臂序列， 可减少空间位阻， 提高杂交反应的 效率以及杂交反应的特异性。常见的间隔臂序列包括多聚 dT， 即 poly(dT)， 寡聚四聚乙二 醇以及 (CH2)n 间隔臂 (n 3)， 如 (CH2)12、 (CH2)18 等。另外， 如果存在 poly(dA) 干扰， 还可以用 。
37、poly(TTG) 作为间隔臂。本发明间隔臂优选为 5-10 个 T， 微球包被的过程如下 ： 0033 分别取 5106个上述编号的羧基化的微球 ( 购自 Luminex 公司 ) 悬浮于 50ul 0.1mol/L 的 MES 溶液中 (pH4.5)， 加入 10ul 合成的 anti-tag 分子 (100nmol/ml)。配 制 10ng/ml 的 EDC(N-(3-Dimethylaminopropyl-N-ethylcarbodiimide)( 购自 Pierce Chemical 公司 ) 工作液。往微球悬液中加入 2.5ul 的 EDC 工作液， 恒温孵育 30 分钟， 再加 。
38、入 2.5ul 的 EDC 工作液， 再恒温孵育 30 分钟。反应结束后， 用 0.02的 Tween-20 洗涤一 次， 再用 0.1的 SDS 液洗涤一次。将洗涤后的包被有 anti-tag 序列的微球重悬于 100ul 的 Tris-EDTA 溶液 10mmol/L Tris(pH8.0)， 1mmol/LEDTA 中， 2-8避光保存。 0034 三、 扩增出含有突变位点的目标序列的引物 0035 针对MET基因11种常见基因型G504T、 A1124G、 C2962T、 C3029T、 2942_3082del141、 T3172C、 G3307T、 T3742C、 A3743G、 。
39、T3757G 和 T3803C， 设计扩增引物对 ( 见表 3)， 扩增出 5 条 含有突变位点的目标序列。 0036 表 3 扩增出具有突变位点的目标序列的引物 0037 0038 说 明 书 CN 102994622 A 10 8/22 页 11 0039 所有引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。 合成后的每条引物分别用 10mmol/LTris Buffer 配制成 100pmol/mL 的贮存液。 0040 实施例 2 运用实施例 1 所述的 MET 基因突变检测液相芯片对样本的检测 0041 所述各种溶液的配方如下 ： 0042 50mM 的 MES 缓冲液 (pH5.0) 。
40、配方 (250ml) ： 0043 0044 2Tm 杂交缓冲液 0045 说 明 书 CN 102994622 A 11 9/22 页 12 0046 过滤后贮存于 4。 0047 ExoSAP-IT 试剂盒购自美国 USB 公司。 0048 生物素标记的 dCTP 购自上海生工生物工程技术服务有限公司。 0049 一、 样本的 DNA 提取 ： 0050 参照 分子克隆 关于 DNA 提取的相关方法， 得到待检测的 DNA。 0051 二、 待测样品的 PCR 扩增 0052 设计 5 对引物， 多重 PCR 一步扩增出 5 条分别含 MET 基因 11 种常见基因型 G504T、 A11。
41、24G、 C2962T、 C3029T、 2942_3082del141、 T3172C、 G3307T、 T3742C、 A3743G、 T3757G 和 T3803C 的目标序列。产物大小分别为 251bp、 229bp、 420bp、 370bp 和 288bp， 引物序列 (SEQ IDNO.67-76) 见上述表 3 所示。 0053 首先配制多重 PCR 引物工作液 ： 分别各取 SEQ ID NO.67-76 的引物贮存液 100ul 于 1.5ml 微量离心管中， 混合均匀即为多重 PCR 引物工作液。多重 PCR 反应体系如下 ： 0054 0055 PCR 扩增程序为 ： 。
42、95 3min ； 94 30s， 56 30s， 72 40s， 30 个循环 ； 72 10min ； 4保存备用。 0056 三、 PCR 产物的酶切处理 0057 1. 取 7.5ul PCR 反应后的产物， 加入 1ul 10SAP 缓冲液、 1ul SAP 酶和 0.5ul Exo-I 酶 ； 0058 2.37孵育 15min， 80孵育 15min， 灭活多余的酶。酶切处理后的产物直接用于 后续的 ASPE 引物延伸反应。 0059 四、 位点特异的引物延伸反应 (ASPE) 0060 利用上述设计的 ASPE 引物进行引物延伸反应， 在反应过程中掺入生物素标记的 dCTP， 。
43、从而使反应后的产物带上多个的生物素标记。 说 明 书 CN 102994622 A 12 10/22 页 13 0061 首先配制混合的 ASPE 引物工作液 ： 分别取待检测基因相应的野生型和突变型 ASPE 引物贮存液 10ul 于 1.5ml 微量离心管中， 加入 10mmol/L Tris Buffer 补至 200ul， 混 合均匀即为 ASPE 混合引物工作液。ASPE 反应的体系如下 ： 0062 0063 反应程序为 ： 96 2min ； 94 30s， 54 1min， 72 2min， 30 个循环 ； 4保存备 用。 0064 五、 杂交反应 0065 1. 根据设计的。
44、 ASPE 引物， 每组选择相应的 22 种包被的微球 ( 如实施例 1 所述 )， 每种微球浓度均为 2.5105个 /ml ； 0066 2. 分别取 1ul 每种编号的微球于 1.5ml 的微量离心管中 ； 0067 3. 微球于 10000g 离心 1-2min ； 0068 4. 弃去上清， 微球重悬于 100ul 的 2Tm 杂交缓冲液中， 涡旋混匀 ； 0069 5. 取 25ul 上述微球悬液于 96 孔滤板相应的孔中， 对照孔加 25ul 的 ddH2O ； 0070 6. 取 5-25ul 的 ASPE 反应液于相应的孔中， 用 ddH2O 补足至 50ul ； 0071 。
45、7. 用锡箔纸包住 96 孔板以避光， 95 60s， 37 15min 孵育杂交 ； 0072 8. 杂交后的微球于 3000g 离心 2-5min ； 0073 9. 去上清， 将微球重悬于 75ul 的 1Tm 杂交缓冲液中 ； 0074 10. 微球于 3000g 离心 2-5min ； 0075 11.将微球重悬于75ul的1Tm杂交缓冲液中， 加入15ul浓度为10ug/ml的链霉 亲和素 - 藻红蛋白 (SA-PE) ； 0076 12.37孵育 15min， 于 Luminex 仪器上检测。 0077 六、 结果检测与数据分析 0078 反应后产物通过 Luminex 系列分析。
46、仪器检测。以突变型荧光值 (MFI) 大于 100 为 cut-off值， 当突变型检测的MFI值大于100时， 判定该样本存在该突变类型， 否则判定该样 本为相应的野生型。 0079 使用本方法检测大量样本的 MET 基因突变， 以测序法检测与液相芯片结果作对 照， 计算本发明所提供的方法检测结果的吻合率。本方法检测 20 份样本的 MET 基因型检测 结果与测序结果吻合率达到 100。可见本发明所提供的 MET 基因突变检测液相芯片能够 说 明 书 CN 102994622 A 13 11/22 页 14 准确地检测出 MET 基因的突变类型， 且结果稳定可靠。 0080 表 4 样本检测。
47、结果 (MFI) 之一 0081 0082 0083 表 5 样本检测结果 (MFI) 之二 0084 说 明 书 CN 102994622 A 14 12/22 页 15 0085 表 6 样本检测结果 (MFI) 之三 0086 说 明 书 CN 102994622 A 15 13/22 页 16 0087 0088 表 7 样本 MET 基因突变类型分析结果 说 明 书 CN 102994622 A 16 14/22 页 17 0089 0090 0091 实施例 3 不同的 ASPE 引物的液相芯片对 MET 基因突变位点的检测 0092 一、 液相芯片制备的设计 (tag 序列及 A。
48、nti-tag 序列的选择 ) 0093 以 MET 基因 G504T 和 C2962T 位点突变检测液相芯片为例， 分别针对 G504T 和 C2962T 的野生型和突变型设计 ASPE 引物 3 端的特异性引物序列， 而 ASPE 引物 5 端的 tag 序列则选自 SEQID NO.1-SEQ ID NO.22， 相应的， 包被于微球上的与对应 tag 序列互补配对 的 anti-tag 序列选自 SEQ ID NO.45-SEQ ID NO.66。具体设计如下表 ( 表 8) 所示。ASPE 引物的合成、 anti-tag 序列包被微球、 扩增引物、 检测方法等如实施例 1 和实施例 。
49、2 所述。 0094 表 8 液相芯片制备的设计 说 明 书 CN 102994622 A 17 15/22 页 18 0095 0096 0097 二、 样品检测 0098 采用上述设计制备的液相芯片， 按实施例 2 所述检测过程和方法对样品 21-40 进 行检测， 检测结果如下 ： 0099 表 9 样本检测结果与基因突变分析 说 明 书 CN 102994622 A 18 16/22 页 19 0100 0101 0102 表 10 样本检测结果与基因突变分析 说 明 书 CN 102994622 A 19 17/22 页 20 0103 0104 0105 由本实施例可见， ASPE 引物选用实施例 1 中 tag 序列与特异性引物序列搭配时。