具有组成型启动子活性的DNA及其应用和巴斯德毕赤酵母表达载体.pdf

本发明公开了一种具有组成型启动子活性的DNA及其应用和巴斯德毕赤酵母表达载体，所述DNA的碱基序列如SEQ No.1所示，该DNA在构建巴斯德毕赤酵母（Pichia Pastoris）表达载体中的应用。本发明所述的DNA具有组成型启动子活性，不需要诱导物即可起始其下游结构基因的转录；在乙醇、甲醇、葡糖糖和甘油四种不同培养基中转录活性变化不大；具有高效转录活性，其起始转录的效率是毕赤酵母GAPDH启动子的4倍以上。本发明构建的巴斯德毕赤酵母表达载体不需要甲醇诱导即可高效表达外源蛋白，其表达外源蛋白EGFP的效率约为GAPDH启动子表达体系的6~8倍、TEF1启动子表达体系的1.5~2倍。

权利要求书一种具有组成型启动子活性的DNA，其碱基序列如SEQ No.1所示。
权利要求1所述DNA在构建巴斯德毕赤酵母（Pichia Pastoris）表达载体中的应用。
根据权利要求2所述的应用，其特征在于，将所述DNA及其下游连接结构基因或调节基因构成的表达盒整合到毕赤酵母的基因组中。
根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述巴斯德毕赤酵母表达载体的构建包括如下步骤：
（1）pPICZαA质粒中不含启动子5’AOX1片段的获得
引物：ZαA‑F（SEQ NO.9）和ZαA‑R（SEQ NO.10）
模板：pPICZαA质粒
DNA聚合酶：PrimeSTAR HS
通过PCR方法扩增pPICZαA质粒中不含启动子5’AOX1的部分，记为DNA片段ZαA；反应条件：98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸3min，循环30次；
（2）DNA片段的连接
a．酶切纯化处理：
用Bgl II，Pst I在37℃对DNA片段GCW14处理3h，并纯化酶切产物；
用BglII，Pst I在37℃对DNA片段ZαA处理3h，并纯化酶切产物；
b．连接：
将碱基序列如SEQ No.1所示的DNA和上述处理后的DNA片段ZαA，在T4 DNA连接酶的作用下进行连接；
（3）用氯化钙进行转化
取步骤（2）所得连接产物加入到大肠杆菌Top10感受态细胞中，用移液器吹打混匀，直接涂布伯莱霉素抗性LB平板，培养16~18h；
（4）提取转化子质粒，即得到巴斯德毕赤酵母表达载体。
一种根据权利要求2或3或4所述应用构建的巴斯德毕赤酵母表达载体。
根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于，该表达载体由碱基序列如SEQ No.1所示所述的DNA、α信号肽、多克隆酶切位点区、c‑myc抗原表位、6×His标签、AOX1转录终止区、伯莱霉素抗性基因表达盒和PUC复制区依次连接构成。

说明书具有组成型启动子活性的DNA及其应用和巴斯德毕赤酵母表达载体
技术领域
本发明涉及DNA序列，具体涉及包含启动子的DNA序列及其应用，以及构建得到的巴斯德毕赤酵母表达载体。
背景技术
基因表达包括转录和翻译两个阶段。转录是指拷贝出一条与DNA链序列完全相同（除了T换成U之外）的RNA单链的过程，是基因表达的核心步骤。转录的基本过程包括模板识别、转录起始、通过启动子及转录的延伸和终止，这一个过程的关键是RNA聚合酶与启动子的相互作用。启动子是一段位于结构基因5’端上游区的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确地相结合并具有转录起始的特异性。启动子的结构影响了它与RNA聚合酶的亲和力，从而影响了基因表达的水平。
巴斯德毕赤酵母表达系统是一种常用的真核蛋白高效表达系统。典型的巴斯德毕赤酵母表达载体载体的启动子为醇氧化酶1（AOX1）基因的启动子，如pPICZα系列、pPIC9K等。当载有外源蛋白的重组载体转化受体后，外源基因整合到受体的染色体中，并在AOX1启动子控制下表达。AOX1启动子是诱导型启动子，其诱导物为甲醇。以PAOX1为启动子的巴斯德毕赤酵母表达系统，PAOX1在甲醇的诱导下起始外源基因的转录，从而实现外源蛋白的高效表达。这种表达系统在发酵过程需要用到易燃易爆且有毒的甲醇，存在一定的危险性，同时也限制了毕赤酵母表达系统在食用级蛋白生产中的应用。近年来，一些毕赤酵母内源的组成型强启动子被陆续发现，比较著名的有GAPDH基因的启动子和TEF1基因的启动子，利用这些启动子开发的毕赤酵母表达系统不需要甲醇的诱导即可表达外源蛋白，但与AOX1启动子的表达系统相比，它们表达外源蛋白的能力仍有相当的差距，因此至今仍未得到广泛的应用。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种具有组成型启动子活性的DNA。
本发明的目的之二是提供上述DNA在构建巴斯德毕赤酵母表达载体中的应用。
本发明的目的之三是提供制得的巴斯德毕赤酵母表达载体。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种具有组成型启动子活性的DNA，其碱基序列如Seq No.1所示。
本发明所述的DNA片段共822个碱基，来源于巴斯德毕赤酵母（Pichia Pastoris），位于chr1‑4_0586基因（Genebank Accession No.XM_002490678）的5’端上游区，包括启动子区和5’端非翻译区，其中5’端非翻译区长度为45个核苷酸。按国际惯例，将转录起始位点规定为+1位（即本发明所述DNA片段的第778个核苷酸），转录起始位点‑42bp和‑101bp处存在类TATA框结构（注：TATA框是大多数酵母基因转录所必须的元件，一般位于‑40~‑120bp处）。
本发明所述DNA可用于构建巴斯德毕赤酵母表达载体，即组成型表达外源蛋白的重组毕赤酵母。
本发明所述DNA可用于构建组成型表达外源蛋白的重组毕赤酵母的方法是，将由所述DNA及其下游连接结构基因或调节基因构成的表达盒整合到毕赤酵母的基因组中，具体步骤如下：
（1）pPICZαA质粒中不含启动子5’AOX1片段的获得
引物：ZαA‑F（SEQ NO.9）和ZαA‑R（SEQ NO.10）
模板：pPICZαA质粒
DNA聚合酶：PrimeSTAR HS
通过PCR方法扩增pPICZαA质粒中不含启动子5’AOX1的部分，记为DNA片段ZαA；反应条件：98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸3min，循环30次；
（2）DNA片段的连接
a．酶切纯化处理：
用Bgl II，Pst I在37℃对DNA片段GCW14处理3h，并纯化酶切产物；
用Bgl II，Pst I在37℃对DNA片段ZαA处理3h，并纯化酶切产物；
b．连接：
将碱基序列如SEQ No.1所示的DNA和上述处理后的DNA片段ZαA，在T4DNA连接酶的作用下进行连接；
（3）用氯化钙进行转化
取步骤（2）所得连接产物加入到大肠杆菌Top10感受态细胞中，用移液器吹打混匀，直接涂布伯莱霉素抗性LB平板，培养16~18h；
（4）提取转化子质粒，即得到巴斯德毕赤酵母表达载体。该表达载体由碱基序列如SEQ No.1所示所述的DNA、α信号肽、多克隆酶切位点区、c‑myc抗原表位、6×His标签、AOX1转录终止区、伯莱霉素抗性基因表达盒和PUC复制区依次连接构成。
本发明的表达载体以所述的DNA（碱基序列如SEQ No.1）为启动子。根据本领域的常识可知，作为一个完整的表达载体，上述表达载体除了含有本发明所述DNA，还应至少包括多克隆酶切位点、转录终止区和真核生物的筛选标记（如伯莱霉素抗性标记，His4基因筛选标记等）。为了方便克隆，所述载体还可以含有可在原核生物中复制的必要元件，如大肠杆菌的PUC origin。
在上述表达载体的多克隆酶切位点中插入外源蛋白基因，然后利用本发明所述DNA中的Cal I或Bstp I限制性内切酶酶切位点进行线性化，最后转化毕赤酵母，即可获得本发明所述的组成型表达外源蛋白的重组毕赤酵母。如果上述表达载体是含有His4筛选标记，也可以利用His4基因中的Sal I酶切位点进行线性化后转化组氨酸营养缺陷型毕赤酵母，如GS115，获得本发明所述的组成型表达外源蛋白的重组毕赤酵母。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
（1）本发明所述的DNA（其碱基序列如Seq No.1）具有组成型启动子活性，不需要诱导物即可起始其下游结构基因的转录；在乙醇、甲醇、葡糖糖和甘油四种不同培养基中转录活性变化不大；具有高效转录活性，其起始转录的效率是毕赤酵母GAPDH启动子的4倍以上。
（2）本发明所述的重组毕赤酵母不需要甲醇诱导即可高效表达外源蛋白，其表达外源蛋白EGFP的效率约为GAPDH启动子表达体系的6~8倍、TEF1启动子表达体系的1.5~2倍。尽管在本发明所提供的例子中，本发明所述重组毕赤酵母表达EGFP的效率为AOX1启动子表达体系的2/3，但本发明所述的重组毕赤酵母不需要甲醇诱导，在甘油碳源和葡萄糖碳源中均可实现外源蛋白的高效表达。
附图说明
图1是chr1‑4_0586和GAPDH在不同碳源培养基mRNA表达量比较柱形图，其中□表示GAPDH，其中■表示chr1‑4_0586。
图2是本发明所示载体pPGCW14ZαA的结构示意图。
图3是鉴定表达载体pPGCW14αA的PCR产物的1%琼脂糖凝胶电泳图，其中1是250bp DNA ladder（Takara），2是PCR产物。
图4是X33/pGCW14ZαA‑EGFP的菌落PCR鉴定结果，其中1是200bp ladder DNA Marker（Takara），2是X33/pGCW 14ZαA‑EGFP。
图5是SDS PAGE结果，其中1是10‑230kDa蛋白质分子量Marker（美国New England Biolabs公司），2是X33的培养液上清，3是X33/pGCW14ZαA‑EGFP培养液上清。
图6是Dot blot结果，其中1是X33/pGCW14ZαA‑EGFP培养液上清，2是X33的培养液上清。
图7是重组菌在BMGY培养基中的菌体生长随时间变化的曲线图，其中◆表示X33/pGAPZαA‑EGFP，■表示X33/pGCW14ZαA‑EGFP，▲表示X33/pTEFZαA‑EGFP，●表示X33。
图8是重组菌在BMGY培养基中的EGFP的表达量随时间变化的曲线图，其中◆表示X33/pGAPZαA‑EGFP，■表示X33/pGCW14ZαA‑EGFP，▲表示X33/pTEFZαA‑EGFP，●表示X33。
图9是重组菌在BMDY培养基中的菌体生长随时间变化的曲线图，其中◆表示X33/pGAPZαA‑EGFP，■表示X33/pGCW14ZαA‑EGFP，▲表示X33/pTEFZαA‑EGFP，●表示X33。
图10是重组菌在BMDY培养基中的EGFP的表达量随时间变化的曲线图，其中◆表示X33/pGAPZαA‑EGFP，■表示X33/pGCW14ZαA‑EGFP，▲表示X33/pTEFZαA‑EGFP，●表示X33。
图11是重组菌在BMMY培养基中的菌体生长随时间变化的曲线图，其中◆表示X33/pGAPZαA‑EGFP，■表示X33/pGCW14ZαA‑EGFP，▲表示X33/pTEFZαA‑EGFP，●表示X33，表示X33/pPICZαA‑EGFP。
图12是重组菌在BMMY培养基中的EGFP的表达量随时间变化的曲线图，其中◆表示X33/pGAPZαA‑EGFP，■表示X33/pGCW14ZαA‑EGFP，▲表示X33/pTEFZαA‑EGFP，●表示X33，表示X33/pPICZαA‑EGFP。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步具体详细描述，但本发明的实施方式不限于此，对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。
术语解释
AE缓冲液：50mM醋酸钠，10mM EDTA的水溶液，pH值5.2。
TATA框：TATA框是大多数酵母基因转录所必须的元件，一般位于‑40～‑120bp处。
BMMY：1%酵母提取物，2%蛋白胨，1.34%YNB(amino free)，10mL/100mL1M磷酸盐缓冲液，1%甲醇。
BMGY：1%酵母提取物，2%蛋白胨，1.34%YNB(amino free)，10mL/100mL1M磷酸盐缓冲液，1%甘油。
BMDY：1%酵母提取物，2%蛋白胨，1.34%YNB(amino free)，10mL/100mL1M磷酸盐缓冲液，2%葡萄糖。
BMEY：1%酵母提取物，2%蛋白胨，1.34%YNB(amino free)，10mL/100mL1M磷酸盐缓冲液，1%乙醇。
PCR:即聚合酶链反应，一种在体外扩增DNA片段的重要技术。当存在模板DNA、底物、上下游引物和耐热的DNA聚合酶时，经过多次“变性‑复性‑延伸反应”的循环过程，将量模板DNA扩增至几百万倍。
RT‑PCR：将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术，首先经反转录酶的作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。
伯莱霉素抗性LB平板：0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，0.5%氯化钠和2%琼脂；灭菌后冷却至60℃，每100mL培养基加伯莱霉素（Invitrogen,Zeocin）25uL，混匀后倒入培养皿中即可。
伯莱霉素抗性YPD平板：1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖和2%琼脂；灭菌后冷却至60℃，每100mL培养基加伯莱霉素（Invitrogen,Zeocin）100uL，混匀后倒入培养皿中即可。
拷贝数：某基因在某一生物的基因组中的个数.单拷贝就是该基因在该生物基因组中只有一个。
实施例1
一、DNA片段的克隆
1、提取巴斯德毕赤酵母GS115的基因组DNA
采用OMEGA公司的酵母基因组DNA提取试剂盒提取巴斯德毕赤酵母GS115的基因组DNA，详细方法见试剂盒说明书。
2、从巴斯德毕赤酵母GS115的基因组DNA中克隆本发明所述DNA片段（SEQ NO.1）
引物：引物PGCW14‑F（SEQ NO.2）和PGCW14‑R（SEQ NO.3）。
模板：巴斯德毕赤酵母GS115的基因组DNA。
DNA聚合酶：PrimeSTAR HS(Takara)
反应体系：基因组DNA 10ng，10μM PGCW14‑F和10μM PGCW14‑R各0.2μM，Premix PrimeSTAR HS 25μL，ddH2O补足50μL。
反应条件：98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸1min，循环30次。
结果：通过PCR方法扩增得到GS115基因组DNA chr1‑4_0586基因5’端上游822bp的DNA片段。引物PGCW14‑F和PGCW14‑R的5’端分别设有Pst I和BglII酶切位点，扩增所得的DNA片段全长842bp，记为5’GCW14（SEQ NO.1），其中5’端引入了Pst I酶切位点，3’端了引入BglII，以便连接到载体中。
二、DNA片段的结构分析：
1、热酚法提取GS115总RNA
（1）在1.5mL离心管中加入400μLAE缓冲液，50μL 10%SDS和600μL酚：氯仿(1:1)。
（2）室温10000gx2min离心菌体，去上清，加入步骤（1）中的混合液，剧烈振荡重悬菌体。
（3）65℃恒温振荡15‑25min，冰浴5min。
（4）室温12000gx7min离心，取400μL上清至装有1mL无水乙醇和40μL3M NaAc(pH5.2)的1.5mL离心管中，上下颠倒混匀，置‑20℃沉淀30min以上。
（5）室温12000gx10min离心，去上清，加入1mL 75%乙醇洗涤沉淀。
（6）室温12000gx5min离心，去上清，室温晾干3min，加入50‑100μLDEPC水溶解沉淀。
（7）测定RNA浓度，取0.5‑1μg电泳。
2、mRNA的纯化：用德国MN公司的mRNAkit纯化，详细方法见试剂盒说明书。
3、反转录合成5’Race ready first strand cDNA：采用Clontech公司的SMARTerTM RACE cDNA Amplifcation Kit，并按其提供的产品说明书进行操作。
（1）在离心管（Tube 1）中加入：

（2）在另一离心管（Tube 2）中加入：

（3）72℃孵育3min，冷却至42℃保持2min，14000g×10s；
（4）在Tube 2中加入1μl SMARTer IIA oligo；
（5）配制Master Mix，按顺序依次加入：

（6）将5.25μl的Master Mix加入到步骤（2）的预变性RNA中，轻轻混匀，离心；
（7）42℃90min，70℃10min；
（8）加入250μl水稀释反应产物，得到5’Race ready first strand cDNA。
4、5’RACE PCR
（1）配制Master Mix：

（2）5’RACE PCR
反应体系：

反应条件：
20cycles(PolyA RNA)：
94°C，30sec；
68°C，30sec；
72°C，3min；
（3）1.5%琼脂糖凝胶电泳；
（4）测序：5’RACE PCR产物纯化后送往上海美吉生物医药有限公司测序；
5、结果：测序结果显示，转录起始于翻译起始密码子上游45bp处，mRNA第一个核苷酸为腺嘌呤（A），与酿酒酵母大多数基因相同；GCW14存在5’UTR，长度为45bp；转录起始位点‑42bp和‑101bp处存在类TATA框结构，可能只有一个起作用，也可能是两个串联起作用。
三、DNA片段转录活性分析
1）方法
（1）挑取YPD平板GS115单菌落，接种至5mLYPD培养基中培养过液，然后分别接种到50mL BMMY，BMGY，BMDY和BMEY中（初始OD600均约为0.1），并培养24小时取样，测OD600，并将样品存于‑80℃冰箱，用于mRNA的测定；
（2）从‑80℃冰箱取出样品，采用热酚法提取总RNA；
（3）除去总RNA样品中的DNA，并用荧光定量PCR方法(Premix Ex TaqTM II)检测DNA是否完全除去，出峰循环数高于30个循环认为DNA已完全除净；
（4）RT‑PCR方法(Premix Ex TaqTM II)检测上述样品中chr1‑4_0586基因对GAPDH的mRNA相对表达量，RT‑PCR所用到的引物如表1所示：
表1RT引物列表

2）结果
P．Pastoris chr1‑4_0586基因在甲醇、乙醇、葡萄糖和甘油四种碳源中培养均表现出高的转录水平，其相对表达量（RQ）均为GAPDH启动子的4倍左右（详见表2和图1），提示该基因的启动子为高效的组成型启动子。
表2RT‑PCR结果

实施例2
以实施例1的DNA片段为启动子的表达载体pPGCW14ZαA的构建
为了更好地理解本发明所述的表达载体，下面将提供一种具体的表达载体，该表达载体由商业化的毕赤酵母表达载体pPICZαA（购自Invitrogen公司）改造而来，即将pPICZαA的启动子5’AOX用本发明所述DNA替换，其质粒图谱如图2所示，详细信息如下：
A、功能片段：
（1）5‘GCW14启动子区（5‘GCW14promoter region）：1‑834；
（2）α信号肽（α‑factor signal sequence）：835‑1101
（3）c‑myc抗原表位（c‑myc epitope）：1169‑1198
（4）6×His标签（6×His tag）：1214‑1231
（5）AOX1转录终止区（AOX1transcription ternmination region）：1235‑1576
（6）TEF1启动子（TEF1promoter）：1577‑1987
（7）EM7启动子（EM7promoter）1989‑2056
（8）伯莱霉素抗性基因开放阅读框（sh ble ORF）：2057‑2431
（9）CYC1转录终止区（CYC1 transcription ternmination region）：2432‑2749
（10）PUC复制区（PUC origin）：2760‑3478
B、酶切位点：
（1）启动子：Pst I，Bln I（2，830）
（2）多克隆酶切位点：EcoR I，Pml I,Sfi I,BsmB I,Asp718I,Xho I,Sac II,Not I，Xba I（1103‑1166）
（3）线性化酶切位点：Cla I（558，30℃），BstP I（393，65℃）。
以下是表达载体pPGCW14ZαA的构建方法：
1、实验材料：
（1）pPICZαA质粒：购自Invitrogen公司（美国）；
（2）大肠杆菌Top10；
（3）限制性DNA内切酶：Bgl II、Pst I、10×H Buffer，购自Takara公司（日本）。
2、pPICZαA质粒中不含启动子5’AOX1片段的获得
引物：ZαA‑F（SEQ NO.9）和ZαA‑R（SEQ NO.10）。
模板：pPICZαA质粒，购自Invitrogen公司。
DNA聚合酶：PrimeSTAR HS (Takara)
反应体系：巴斯德毕赤酵母基因组DNA 10ng，10μM ZαA‑F和ZαA‑R各0.2μM，Premix PrimeSTAR HS 25μL，ddH2O补足50μL。
反应条件：98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸3min，循环30次。
结果：通过PCR方法扩增pPICZαA质粒中不含启动子5’AOX1的部分（2672bp），引物ZαA‑F和ZαA‑R的5’端分别设有Bgl II和Pst I酶切位点，扩增所得的DNA片段全长2692bp，其中5’端引入了Bgl II酶切位点，3’端了引入Pst I，记为ZαA。
3、将实施例1所得的DNA片段GCW14和上述DNA片段ZαA连接
（1）酶切：
a．DNA片段5’GCW14 1μg，Bgl II 2.5μL，Pst I 2.5μL，10×H Buffer 5μL，ddH2O补足50μL；37℃反应3h。
b．DNA片段ZαA 1μg，Bgl II 2.5μL，Pst I 2.5μL，10×H Buffer 5μL，ddH2O补足50μL；37℃反应3h。
（2）纯化酶切产物：采用E.Z.N.A.Cycle Pure Kit纯化酶切产物
（3）连接：
DNA片段5’GCW140.3pmoL，DNA片段ZαA 0.03pmoL，2×T4DNA连接酶缓冲液10μL，T4DNA连接酶1μL，ddH2O补足20μL。16℃反应过夜。
（4）转化：采用氯化钙转化法
取步骤（3）所得连接产物10μL加入到100μL大肠杆菌Top10感受态细胞中，用移液器吹打混匀，直接涂布伯莱霉素抗性LB平板，培养16~18h。
（5）提取转化子质粒：采用E.Z.N.A.Plasmid Mini Kit I提取。
（6）PCR鉴定：
引物：PGCW14‑F（SEQ NO.2），PGCW14‑R（SEQ NO.3）。
模板：转化子质粒。
DNA聚合酶：PrimeSTAR HS(Takara)
反应体系：转化子质粒10ng，10μM PGCW14‑F和10μM PGCW14‑R各0.2μM，Premix PrimeSTAR HS 25μL，ddH2O补足50μL。
反应条件：98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸1min，循环30次。
反应结束后取5μL进行1%琼脂糖凝胶电泳，结果如图3所示，PCR产物大小在750~1000bp之间，与例1所述DNA片段5’GCW14大小相符。将所得PCR产物纯化后送往上海美吉生物医药科技有限公司测序，测序结果显示所得PCR产物的碱基序列与SEQ NO.1一致，提示以本发明所述DNA片段为启动子的表达载体pPGCW14ZαA构建成功。
实施例3
构建重组表达载体pPGCW14ZαA‑EGFP
1、实验材料
（1）本发明所述载体pPGCW14ZαA：按实施例2方法制备；
（2）EGFP：增强型绿色荧光蛋白，其基因如Seq No.11所示。
（3）大肠杆菌Top10。
2、重组表达载体pPGCW14ZαA‑EGFP的构建
（1）PCR方法获得EGFP基因
引物：E‑F（Seq No.12）和E‑R（Seq No.13）。
模板：pEGFPN1（购自clonetech公司），从质粒pEGFPN1（购自clonetech公司）中扩增EGFP基因片段，并在基因的5’端和3’端分别加上EcoR I和XbaI的酶切位点。
DNA聚合酶：Premix PrimeSTAR HS(Takara)
反应体系：质粒pEGFPN1 10ng，10μM E‑F和E‑RμM各0.2μM，Premix PrimeSTAR HS25μL，ddH2O补足50μL。
反应条件：98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸3.5min，循环30次。
（2）EGFP的PCR产物纯化：使用E.Z.N.A.Cycle Pure Kit纯化PCR产物。
（3）酶切：
EcoR I和Xba I双酶切EGFP的PCR产物，用E.Z.N.A.Cycle Pure Kit纯化双酶切产物；
EcoR I和Xba I双酶切质粒pPGCW14ZαA，用E.Z.N.A.Gel Extraction Kit回收大小约为3.5Kb的DNA片段。
（4）连接：
将步骤（3）所得的两个双酶切片段用T4DNA连接酶连接4℃过夜。
（5）转化：
将步骤（4）所得连接产物用氯化钙转化法转化到大肠杆菌Top10中，涂布伯莱霉素抗性LB平板，37℃培养16‑18h。
（6）鉴定：
挑取伯莱霉素抗性LB平板上的阳性转化子，用无菌水重悬，使用Kod FX（TOYOBO公司）进行菌落PCR鉴定是否为含pPGCW14ZαA‑EGFP的转化菌。
反应体系：菌液1μL，5’GCW14上游引物引物PGCW14‑F（Seq No.2）和EGFP下游引物E‑R（SeqNo.13）各0.2μM，Kod FX 2.5U，2×Kod FX buffer5μL，dNTP(10mM)2μL，无菌水补足10μl。
反应条件：95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min；循环反应30次。
结果：1%琼脂糖凝胶电泳显示PCR产物大小约为1800bp，与目的产物大小1829bp相符，说明pPGCW14ZαA‑EGFP构建成功。
实施例4
构建表达外源蛋白EGFP的重组毕赤酵母X33/pPGCW14ZαA‑EGFP
1、实验材料
宿主菌：巴斯德毕赤酵母X33
重组质粒：pPGCW14ZαA‑EGFP
2、重组毕赤酵母X33/pPGCW14ZαA‑EGFP的构建
1）提取质粒pPGCW 14ZαA‑EGFP：使用E.Z.N.A.Plasmid Mini Kit I提取。
2）质粒线性化：使用BstP I（Takara）单酶切。
反应体系：pPGCW14ZαA‑EGFP 1μg，BstP I 2.5μL，10×H Buffer 5μL，ddH2O补足50μL。
反应条件：65℃反应8h。
3）酶切产物纯化：使用E.Z.N.A.Cycle Pure Kit纯化步骤（2）的酶切产物。
4）转化毕赤酵母X33：
（1）接种巴斯德毕赤酵母到50mL YPD培养基中，30℃摇菌过夜（约24～28h）培养到OD值为0.8～1.0（约108 Cells/mL）；培养基里有流沙样的菌体在流动；
（2）收获细胞，用25mL无菌水洗涤一次，室温下1500g离心10min；
（3）重悬细胞于1ml 100mM LiCl溶液中，将悬液转入1.5mL离心管；
（4）离心机最大速度离心15秒沉淀菌体，重悬菌体于400μL 100mM LiCl溶液中；
（5）按50μL/管分装，立即进行转化；
（6）煮沸1ml鲑鱼精DNA 5min，迅速冰浴以制备单链担体DNA；
（7）将步骤（5）感受态酵母菌离心，以Tips去除残余的LiCl溶液；
（8）对于每一个转化，按以下顺序加入：

（9）剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体完全分布均匀（约1min）；
（10）30℃水浴孵育30min；
（11）42℃水浴热休克20min;
（12）6000rpm离心收集酵母菌体；
（13）重悬酵母于1ml YPD培养基，30℃摇床孵育4h；
（14）取100ul菌液铺伯莱霉素抗性YPD平板，于30℃培养3天。
5）转化子鉴定
在伯莱霉素抗性YPD平板上挑取单菌落，用无菌水重悬，使用Kod FX（TOYOBO公司）进行菌落PCR鉴定是否为目的转化菌。
反应体系：菌液1μL，5’GCW14上游引物引物PGCW14‑F（Seq No.2）和EGFP下游引物E‑R（Seq No.13）各0.2μM，Kod FX 2.5U，2×Kod FX buffer5μL，dNTP(10mM)2μL，无菌水补足10μl。
反应条件：95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min；循环反应30次。
结果：1%琼脂糖凝胶电泳显示PCR产物大小约为1800bp（图4），与目的产物大小1829bp相符，说明重组毕赤酵母X33/pPGCW14ZαA‑EGFP构建成功。
（3）重组毕赤酵母X33/pPGCW14ZαA‑EGFP表达外源蛋白EGFP
从伯莱霉素抗性YPD平板上挑取单菌落，接种于YPD液体培养基中，同时接种毕赤酵母X33作为阴性对照。30℃、250rpm培养24h，取1mL菌液，10000rpm离心5min，取上清用于测荧光值、蛋白电泳和DOT Blot。
测荧光强度：取50μL上清，用Refolding Buffer稀释至1mL；取150μL于96孔酶标板中，每个样品设3个平行，同时以Refolding Buffer作为空白（Blk），在多功能酶标仪中测定相对荧光值（RFU），其中，吸收波长为470nm，发射波长为510nm。测得荧光强度用RFU表示。
RFU=(3个平行样的平均荧光值‑空白的荧光值)×20
测得阴性对照X33的培养液上清RFU为460，X33/pPGCW14ZαA‑EGFP的培养液上清RFU为59972，提示X33/pPGCW14ZαA‑EGFP经24h液体培养后表达了大量的荧光蛋白EGFP。
蛋白电泳：取20μL上清进行SDS PAGE。结果如图5所示，X33/pPGCW14ZαA‑EGFP的培养液上清在约25~30Kda之间有明显的条带，说明X33/pPGCW14ZαA‑EGFP成功表达了EGFP。
Dot Blot：取5μL上清点于硝酸纤维素膜（NC膜），吹干；TBS‑T清洗NC膜两次后，5%BSA封闭2h；TBS‑T清洗NC膜，用1:2000稀释的anti‑GFP HRP‑DirecT抗体（日本MBL公司）孵育30min；TBS‑T清洗NC膜3×5min，滤纸吸干NC膜表面的液体；在ECL试剂中浸泡1min，滤纸吸干NC膜表面的液体，然后覆上胶片，在暗室中曝光，显影。结果如图6所示。X33/pPGCW14ZαA‑EGFP的培养液上清出现了明显的斑点，说明X33/pPGCW14ZαA‑EGFP成功表达了EGFP。
实施例5
重组毕赤酵母X33/pPGCW14ZαA‑EGFP的发酵实验
1、实验材料
（1）以本发明所述片段为启动子的重组毕赤酵母X33/pPGCW14ZαA‑EGFP；
（2）含GAPDH启动子的重组毕赤酵母X33/pPGAPZαA‑EGFP；
含TEF启动子的重组毕赤酵母X33/pPTEFZαA‑EGFP；
（3）野生型巴斯德毕赤酵母X33。
2、实验方法
1）重组毕赤酵母的构建
（1）X33/pPGCW14ZαA‑EGFP：见实施例4。
（2）pPICZαA‑EGFP：将EGFP基因插入到pPICZαA中EcoR I和Xba I酶切位点中，即可得到pPICZαA‑EGFP重组质粒。
（3）X33/pPGAPZαA‑EGFP和X33/pPTEFZαA‑EGFP：
①pPGAPZαA‑EGFP和pPTEFZαA‑EGFP质粒的构建：先从GS115基因组DNA中扩增得到5’GAPDH（SEQ NO.14）和5’TEF(SEQ NO.15)；然后将pPICZαA‑EGFP中的5’AOX分别替换为5’GAPDH和5’TEF。扩增5’GAPDH和5’TEF的引物如表3所示。
表3引物信息列表

②pPGAPZαA‑EGFP和pPTEFZαA‑EGFP转酵母：pPGAPZαA‑EGFP和pPTEFZαA‑EGFP质粒分别用Bln I和SnaB I单酶切，然后转野生型巴斯德毕赤酵母X33，最后用伯莱霉素抗性YPD平板筛选阳性转化子。
2）重组酵母中外源基因的拷贝数鉴定以及单拷贝重组酵母的筛选
提取重组酵母的基因组DNA，以GAPDH为对照，进行荧光定量PCR反应(Premix Ex TaqTM II)。反应条件：94℃5min；94℃30s，60℃，34s，30cycle。所用引物如表4所示。X33/pPGCW14ZαA‑EGFP、X33/pPGAPZαA‑EGFP和X33/pPTEFZαA‑EGFP的拷贝数鉴定结果如表5所示，表明所选转化子均为EGFP单拷贝重组菌。
表4RT引物信息列表

表5重组酵母的EGFP拷贝数

3）重组酵母在不同碳源培养基中的发酵
（1）在BMGY中的发酵
①从平板中挑取单菌落，接种于YPD培养基中，30℃，250rpm培养过夜；
②测得OD6000=6~10时，取适量菌液，离心，弃净上清，沉淀物用无菌水洗涤一次，然后转接于25mL BMGY培养基，使初始OD600约为1，30℃，250rpm发酵96h，每隔24h取样，于第48h补加甘油补料500μL1。测样品荧光强度和OD600。
注1：由甘油和1M K2HPO4混合制成，甘油和1M K2HPO4各占50%（v/v），115℃高压灭菌20min。
（2）在BMDY中的发酵
①从平板中挑取单菌落，接种于YPD培养基中，30℃，250rpm培养过夜；
②测OD600，取适量菌液，离心，弃净上清，沉淀物用无菌水洗涤一次，然后转接于25mL BMDY培养基，使初始OD600约为1，30℃，250rpm发酵96h，每隔24h取样，于第24h和48h补加葡糖糖补料500μL2。测样品荧光强度和OD600。
注2：葡萄糖和1M K2HPO4混合制成，甘油和1M K2HPO4各占50%（v/v），115℃高压灭菌20min。
（3）在BMMY中的发酵
①从平板中挑取单菌落，接种于YPD培养基中，30℃，250rpm培养过夜；
②测得OD600=6~10时，取适量菌液，离心，弃净上清，沉淀物用无菌水洗涤一次，然后转接于25mL BMMY培养基，使初始OD600约为1，30℃，250rpm发酵96h，每隔24h取样，并补加甲醇250μL。测样品荧光强度RFU和OD600。荧光强度检测方法如下：取50μL上清，用Refolding Buffer稀释至1mL；取150μL于96孔酶标板中，每个样品设3个平行，同时以Refolding Buffer作为空白（Blk），在多功能酶标仪中测定相对荧光值（RFU），其中，吸收波长为470nm，发射波长为510nm。测得荧光强度用RFU表示。
（4）发酵结果
重组菌和野生菌X33在以甘油为唯一碳源的BMGY培养基中的生长情况基本一致（如图7所示），说明外源蛋白的克隆及其表达对毕赤酵母X33的生长影响不大。重组菌在BMGY中的发酵结果如图8所示，发酵96h后，阴性对照X33几乎检测不到荧光，各重组菌的EGFP表达量依次为：X33/pGCW14ZαA‑EGFP＞X33/pTEFZαA‑EGFP＞X33/pGAPZαA‑EGFP，其中X33/pGCW14ZαA‑EGFP的EGFP表达量是X33/pGAPZαA‑EGFP的8倍左右。
重组菌和野生菌X33在以葡萄糖为唯一碳源的BMDY培养基中的生长情况基本一致（如图9所示），说明外源蛋白的克隆及其表达对毕赤酵母X33的生长影响不大。重组菌在BMGY中的发酵结果如图10所示，发酵96h后，阴性对照X33几乎检测不到荧光，各重组菌的EGFP表达量依次为：X33/pGCW14ZαA‑EGFP＞X33/pTEFZαA‑EGFP＞X33/pGAPZαA‑EGFP，其中X33/pGCW14ZαA‑EGFP的EGFP表达量是X33/pGAPZαA‑EGFP的7倍左右。
重组菌和野生菌X33在以甲醇为唯一碳源的BMMY培养基中的生长情况基本一致（如图11所示），说明外源蛋白的克隆及其表达对毕赤酵母X33的生长影响不大。重组菌在BMGY中的发酵结果如图12所示，发酵96h后，阴性对照X33几乎检测不到荧光，各重组菌的EGFP表达量依次为：X33/pGCW14ZαA‑EGFP＞X33/pTEFZαA‑EGFP＞X33/pGAPZαA‑EGFP，其中X33/pGCW14ZαA‑EGFP的EGFP表达量是X33/pGAPZαA‑EGFP的8倍左右，是X33/pPICZαA‑EGFP的2/3。
由此可见，本发明所示启动子起始转录的效率很高，是一种组成型强启动子，比已报道的组成型强启动子PGAPDH和PTEF1高出2~6倍，并与诱导型强启动子PAOX1接近。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>华南理工大学
<120>具有组成型启动子活性的DNA及其应用和巴斯德毕赤酵母表达载体
<160>21
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>822
<212>DNA
<213>巴斯德毕赤酵母（Pichia Pastoris）
<400>1
caggtgaacc cacctaacta tttttaactg ggatccagtg agctcgctgg gtgaaagcca    60
accatctttt gtttcgggga accgtgctcg ccccgtaaag ttaatttttt tttcccgcgc    120
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tcatgtgcta tacaggcaca tggcagcagt cactattttg ctttttaacc ttaaagtcgt    240
tcatcaatca ttaactgacc aatcagattt tttgcatttg ccacttatct aaaaatactt    300
ttgtatctcg cagatacgtt cagtggtttc caggacaaca cccaaaaaaa ggtatcaatg    360
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gttttaagtt gtgggaacag taacaccgcc tagagcttca ggaaaaacca gtacctgtga    480
ccgcaattca ccatgatgca gaatgttaat ttaaacgagt gccaaatcaa gatttcaaca    540
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<210>2
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>2
agtgctgcag caggtgaacc cacctaacta tt                                  32
<210>3
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>3
tcgtagatct ttttgttgtt gagtgaagcg ag                        32
<210>4
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>4
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<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>5
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<210>6
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>6
ccctccaaag tggtgaaa                                        18
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>7
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<210>8
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>8
tggttggtgg aacatcag                                         18
<210>9
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>9
tcgtggtacc atgagatttc cttcaatttt tactg                               35
<210>10
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>10
agtgctgcag gatctcatga ccaaaatccc ttaac                               35
<210>11
<211>720
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Clontech公司商业化载体pEGFPN1
<400>11
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac    60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac    120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc    180
ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag    240
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gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac    600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc    660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtga    720
<210>12
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>12
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<210>13
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>13
agcatctaga cacttgtaca gctcgtccat gc                                  32
<210>14
<211>483
<212>DNA
<213>巴斯德毕赤酵母(Pichia Pastoris)
<400>14
agatcttttt tgtagaaatg tcttggtgtc ctcgtccaat caggtagcca tctctgaaat    60
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aatgctcttc ccagcattac gttgcgggta aaacggaggt cgtgtacccg acctagcagc    300
ccagggatgg aaaagtcccg gccgtcgctg gcaataatag cgggcggacg catgtcatga    360
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ctcctgaccc aaagacttta aatttaattt atttgtccct atttcaatca attgaacaac    480
tat                                                                  483
<210>15
<211>991
<212>DNA
<213>巴斯德毕赤酵母(Pichia Pastoris)
<400>15
caggttgggg agcaaataag tgatgatgtc ccatgaaagt agaaaatggc tagtagaagg    60
caaaaatttg aaattcttag agtcaaatag ttagactcca agttctaatc cacatttggt    120
cagtttcata gcatccagag cttttgccac tggtgaacat atctacccat tgcgatgcaa    180
caagtcactg aaagcctaaa acggagattc ccctatctta cagcctcgtt caaaaaaact    240
gctaccgttt atctgctatg gccgatgtga ggatgcgctc atgcccaaga gtccaacttt    300
atcaaaaact tgacccgtca tacaggctct agatcaagaa gcaaacttaa tctcagcatc    360
tggttacgta actctggcaa ccagtaacac gcttaaggtt tggaacaaca ctaaactacc    420
ttgcggtact accattgaca ctacacatcc ttaattccaa tcctgtctgg cctccttcac    480
cttttaacca tcttgcccat tccaactcgt gtcagattgc gtatcaagtg aaaaaaaaaa    540
attttaaaat ctttaaccca atcaggtaat aactgtcgcc tcttttatct gccgcactgc    600
atgaggtgtc cccttagtgg gaaagagtac tgagccaacc ctggaggaca gcaagggaaa    660
aatacctaca acttgcttca taatggtcgt aaaaacaatc cttgtcggat ataagtgttg    720
tagactgtcc cttatcctct gcgatgttct tcctctcaaa gtttgcgatt tctctctatc    780
agaattgcca tcaagagact caggactaat ttcgcagtcc cacacgcact cgtacatgat    840
tggctgaaat ttccctaaag aatttctttt tcacgaaaat ttttttttac acaagatttt    900
cagcagatat aaaatggaga gcaggacctc cgctgtgact cttctttttt ttcttttatt    960
ctcactacat acattttagt tattcgccaa c                                   991
<210>16
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
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<223>引物
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<210>17
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<212>DNA
<213>人工序列
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<223>引物
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<213>人工序列
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<223>引物
<400>18
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<213>人工序列
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<223>引物
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<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>20
gcagaagaac ggcatcaagg tg                                        22
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<211>23
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<220>
<223>引物
<400>21
cgcttctcgt tggggtcttt gct                                       23