一种共表达FAEA和XYN11A的酵母系统.pdf

摘要
申请专利号：	CN201210562444.5	申请日：	2012.12.24
公开号：	CN102994542A	公开日：	2013.03.27
当前法律状态：	撤回	有效性：	无权
法律详情：	发明专利申请公布后的视为撤回IPC(主分类):C12N 15/81申请公布日:20130327\|\|\|公开
IPC分类号：	C12N15/81; C12N15/66; C12N9/42; C12N9/18; C12R1/84(2006.01)N; C12R1/66(2006.01)N	主分类号：	C12N15/81
申请人：	江南大学
发明人：	邬敏辰; 龚燕燕; 殷欣; 曾妍; 李剑芳
地址：	214122 江苏省无锡市蠡湖大道1800号
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内容摘要

本发明提供了一种新型的共表达源自宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001阿魏酸酯酶A基因和β-1，4-木聚糖酶基因的工程菌GS115/faeA-xyn11A的构建方法。所构建成的毕赤酵母共表达系统可用于的阿魏酸酯酶和β-1，4-木聚糖酶的工业化生产。所制备的两种酶具有底物亲和力强、催化效率高的特性，具有较大的工业化生产潜力和经济价值。

权利要求书

权利要求书一种共表达源自宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001的阿魏酸酯酶A成熟肽基因(faeA)和β‑1，4‑木聚糖酶基因(xyn11A)的毕赤酵母新表达系统。
共表达faeA和xyn11A的毕赤酵母系统的构建和表达方法：
(1)GS115/faeA的构建、表达及活性测定：用Sac I对pPICZαA‑faeA进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转化GS115感受态细胞，用Zeocin筛选得到高拷贝的毕赤酵母重组子GS115/faeA；按照手册上的标准流程进行诱导表达，该工程菌用1.0％甲醇诱导72h，以阿魏酸甲酯为底物，高效液相法分析阿魏酸的释放量，测得发酵液中重组阿魏酸酯酶的酶活性达7.04U/mL；
(2)工程菌GS115/faeA‑xyn11A的构建：用Sal I对pPIC9k‑xyn11A进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转化GS115/faeA感受态细胞，用G418筛选得到高拷贝的毕赤酵母重组子GS115/faeA‑xyn11A；按照手册上的标准流程进行诱导表达，该工程菌用1.0％甲醇诱导72h，DNS法测得发酵液中重组木聚糖酶活性达600U/mL，重组阿魏酸酯酶活性仍为7.04U/mL；SDS‑PAGE电泳显示重组木聚糖酶和甘露聚糖酶分子量分别为20.7kDa和36.0kDa。

说明书

说明书一种共表达faeA和xyn11A的酵母系统
技术领域
本发明涉及一种共表达源自宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001的阿魏酸酯酶A成熟肽基因(faeA)和β‑1，4‑木聚糖酶基因(xyn11A)的毕赤酵母新表达系统，属于生物工程技术领域。
背景技术
半纤维素是自然界的第二大类多糖聚合物，作为木质素和纤维素中间的连接物，广泛存在于植物细胞壁。半纤维素的降解产物具有广泛的应用价值，因此，如何充分利用丰富的半纤维素资源成为研究的热点。已有报道表明，阿魏酸酯酶可以和其它的半纤维素酶(如木聚糖酶)协同作用使微生物对植物细胞壁中半纤维素进行最大程度的降解。阿魏酸酯酶(E.C.3.1.1.73，ferulic acid esterase，FAE)又称肉桂酸酯酶，是羧酸水解酶的一个亚类，属于胞外酶，能水解阿魏酸甲酯、低聚糖阿魏酸酯和多糖阿魏酸酯中的酯键，将阿魏酸游离出来。自1991年Faulds等首次分离出阿魏酸酯酶以来，已有超过30种阿魏酸酯酶被纯化，其主要生物功能是水解植物细胞壁中多糖与阿魏酸连结的酯键，释放出游离的单体阿魏酸或阿魏酸二聚体。β‑1，4‑内切木聚糖酶(EC 3.2.1.8，endo‑β‑1，4‑xylanase)是一类能够专一降解木聚糖为低聚木糖和木糖的一组酶的总称，主要从主链内部作用于木糖苷键，是木聚糖降解过程中最重要的酶之一。能够产生木聚糖酶的微生物有很多，包括丝状真菌、细菌、放线菌等。两种酶均广泛应用于食品、医药、饲料、造纸和印染等领域。
在食品工业中可利用阿魏酸酯酶打断阿魏酸与细胞壁材料如麸皮、秸秆中多糖的交联，高效降解多糖并获得反式阿魏酸，它和阿拉伯木聚糖酶联合作用的水解产物低聚糖(主要是低聚木糖)、阿魏酸都是重要的功能性食品基料，戊糖可用于酒精发酵、生产木糖醇等。在饲料工业中，利用阿魏酸酯酶处理植物性的原材料，可以将阿魏酸从植物细胞壁的结构中游离出来，从而破坏细胞壁的骨架结构，使得木质素、半纤维素及纤维素之间的连接被部分打破，结构变得比处理前疏松，变得疏松的原料更容易被牲畜消化吸收利用，可以提高饲料的利用效率。
早期对于阿魏酸酯酶和β‑1，4‑内切木聚糖酶的研究多集中在产酶菌株的选育、发酵条件的优化、酶的分离纯化、酶的理化性质、酶的复合诱变、酶的水解机理等方面。随着分子生物学研究的不断深入与完善，越来越多的工作集中于酶的基因克隆和高效表达方面，如：构建和筛选优良的高效基因工程菌株；基于酶结构与功能的关系，通过定点诱变改变酶活性位点，从而实现催化功能的改变，以拓宽其应用范围等。不同来源的两种酶基因已经被克隆，并在大肠杆菌、酿酒酵母、毕氏酵母等表达系统中进行了表达。然而在毕赤酵母系统中进行共表达的研究尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是构建一种新型的共表达阿魏酸酯酶A和β‑1，4‑木聚糖酶基因的毕赤酵母工程菌。
本发明的技术方案：
所设计到的pPICZαA‑faeA和pPIC9k‑xyn11A均为本实验室构建和保藏。
所述的重组FaeA和重组Xyn11A活性的测定方法：
以阿魏酸甲酯(MFA)为底物，高效液相(HPLC)分析阿魏酸的释放量。具体操作按为：移取900μL MFA(1mM，pH 6.0)于2mL EP管中，45℃保温10min，加入100μL适当稀释的酶液，反应10min后加入400μL冰乙酸终止反应，立即混匀进行高效液相分析。以先在酶溶液中加入400μL冰乙酸，再加底物溶液为对照。色谱条件：以甲醇、1％乙酸一步梯度洗脱，在10min内，甲醇浓度由50％上升至80％，流速1mL/min，柱温30℃，检测波长320nm，上样量20μL。根据峰面积，从标准曲线查出相应的阿魏酸量，从而计算酶活。酶活单位定义：在测定条件下(45℃、pH 6.0)每分钟产生1μmol阿魏酸所需的酶量为一个酶活单位(U)。
于25mL具塞试管A和B中，各加入质量浓度为0.5％的底物溶液2.4mL，50℃预热10min，在A管中加入0.1mL适当稀释的酶液，50℃反应10min；立即各加入2.5mL 3′，5′‑二硝基水杨酸(DNS)试剂，在B管中再补加0.1mL酶液，A和B管均煮沸7min；冷却后各加去离子水5mL，摇匀；540nm处以B管为空白对照测定A管吸光度值，并从标准曲线上查出相应的木糖含量并折算成酶活性单位。重组Xyn11A活性测定底物为用pH 4.6、柠檬酸‑Na2HPO4缓冲液配制的桦木木聚糖(Sigma，USA)溶液。酶活性单位定义：在本测定条件下，以每分钟产生1μmol还原糖所需的酶量定义为1个木聚糖酶活性单位(IU)。
所述的重组工程菌的构建方法：
(1)GS115/faeA的构建、表达及活性测定：用Sac I对pPICZαA‑faeA进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转化GS115感受态细胞，用Zeocin筛选得到高拷贝的毕赤酵母重组子GS115/faeA；按照手册上的标准流程进行诱导表达，以阿魏酸甲酯为底物，高效液相法分析阿魏酸的释放量，测得发酵液中重组阿魏酸酯酶的酶活性。
(2)工程菌GS115/faeA‑xyn11A的构建：用Sal I对pPIC9k‑xyn11A进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转化GS115/faeA感受态细胞，用G418筛选得到高拷贝的毕赤酵母重组子GS115/faeA‑xyn11A；按照手册上的标准流程进行诱导表达，分别用HPLC法和DNS法测定重组阿魏酸酯酶和重组木聚糖酶的酶活性。
本发明的有益效果：本发明提供了一种新型的共表达阿魏酸酯酶基因和β‑1，4‑木聚糖酶基因的工程菌GS115/faeA‑xyn11A的构建方法。本发明不仅实现了对双质粒体系在共表达的应用进行了有益探索，而且实现了目标酶的共同生产，降低了产物的制备成本，为进一步工业化生产复合酶奠定了基础。
具体实施方式
以下结合具体实施例，进一步阐述本发明的操作方法。但是这些实施例仅用于详细说明本发明，而不用于限制本发明的范围。
实施例1工程菌GS115/faeA的构建、表达及产物活性测定：
用Sac I对pPICZαA‑faeA进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转化GS115感受态细胞，用Zeocin筛选得到高拷贝的毕赤酵母重组子GS115/man5A。该工程菌用1.0％甲醇诱导72h，以阿魏酸甲酯为底物，HPLC分析阿魏酸释放量，测定发酵液中重组阿魏酸酯酶活性达7.04U/mL。SDS‑PAGE电泳显示重组甘露聚糖酶分子量为36.0kDa。
实施例2工程菌GS115/faeA‑xyn11A的构建、表达及产物活性测定：
用Sal I对pPIC9k‑xyn11A进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转化GS115/faeA感受态细胞，用G418筛选得到高拷贝的毕赤酵母重组子GS115/man5A‑xyn11A。该工程菌用1.0％甲醇诱导72h，DNS法测得发酵液中重组木聚糖酶活性达600IU/mL，重组阿魏酸酯酶活性仍为7.04U/mL。SDS‑PAGE电泳显示重组木聚糖酶和阿魏酸酯酶分子量分别为20.7kDa和36.0kDa。

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1、(10)申请公布号 CN 102994542 A (43)申请公布日 2013.03.27 CN 102994542 A *CN102994542A* (21)申请号 201210562444.5 (22)申请日 2012.12.24 C12N 15/81(2006.01) C12N 15/66(2006.01) C12N 9/42(2006.01) C12N 9/18(2006.01) C12R 1/84(2006.01) C12R 1/66(2006.01) (71)申请人江南大学地址 214122 江苏省无锡市蠡湖大道 1800 号 (72)发明人邬敏辰龚燕燕殷欣曾妍李剑芳。

2、 (54) 发明名称一种共表达 faeA 和 xyn11A 的酵母系统 (57) 摘要本发明提供了一种新型的共表达源自宇佐美曲霉 (Aspergillus usamii)E001 阿魏酸酯酶 A 基因和 -1， 4- 木聚糖酶基因的工程菌 GS115/ faeA-xyn11A 的构建方法。所构建成的毕赤酵母共表达系统可用于的阿魏酸酯酶和 -1， 4- 木聚糖酶的工业化生产。所制备的两种酶具有底物亲和力强、催化效率高的特性，具有较大的工业化生产潜力和经济价值。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页说明书 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请。

3、权利要求书 1 页说明书 3 页 1/1 页 2 1. 一种共表达源自宇佐美曲霉 (Aspergillus usamii)E001 的阿魏酸酯酶 A 成熟肽基因 (faeA) 和 -1， 4- 木聚糖酶基因 (xyn11A) 的毕赤酵母新表达系统。 2. 共表达 faeA 和 xyn11A 的毕赤酵母系统的构建和表达方法： (1)GS115/faeA的构建、表达及活性测定：用Sac I对pPICZA-faeA进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转化GS115感受态细胞，用Zeocin筛选得到高拷贝的毕赤酵母重组子 GS115/faeA ；按照手册上的标准流程进行诱导表。

4、达，该工程菌用 1.0甲醇诱导 72h，以阿魏酸甲酯为底物，高效液相法分析阿魏酸的释放量，测得发酵液中重组阿魏酸酯酶的酶活性达 7.04U/mL ； (2) 工程菌 GS115/faeA-xyn11A 的构建：用 Sal I 对 pPIC9k-xyn11A 进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转化 GS115/faeA 感受态细胞，用 G418 筛选得到高拷贝的毕赤酵母重组子 GS115/faeA-xyn11A ；按照手册上的标准流程进行诱导表达，该工程菌用 1.0 甲醇诱导 72h， DNS 法测得发酵液中重组木聚糖酶活性达 600U/mL，重组阿魏酸酯酶活性。

5、仍为 7.04U/mL ； SDS-PAGE 电泳显示重组木聚糖酶和甘露聚糖酶分子量分别为 20.7kDa 和 36.0kDa。权利要求书 CN 102994542 A 2 1/3 页 3 一种共表达 faeA 和 xyn11A 的酵母系统技术领域 0001 本发明涉及一种共表达源自宇佐美曲霉 (Aspergillus usamii)E001 的阿魏酸酯酶 A 成熟肽基因 (faeA) 和 -1， 4- 木聚糖酶基因 (xyn11A) 的毕赤酵母新表达系统，属于生物工程技术领域。背景技术 0002 半纤维素是自然界的第二大类多糖聚合物，作为木质素和纤维素中间的连接物，广。

6、泛存在于植物细胞壁。半纤维素的降解产物具有广泛的应用价值，因此，如何充分利用丰富的半纤维素资源成为研究的热点。已有报道表明，阿魏酸酯酶可以和其它的半纤维素酶 ( 如木聚糖酶 ) 协同作用使微生物对植物细胞壁中半纤维素进行最大程度的降解。阿魏酸酯酶(E.C.3.1.1.73， ferulic acid esterase， FAE)又称肉桂酸酯酶，是羧酸水解酶的一个亚类，属于胞外酶，能水解阿魏酸甲酯、低聚糖阿魏酸酯和多糖阿魏酸酯中的酯键，将阿魏酸游离出来。自 1991 年 Faulds 等首次分离出阿魏酸酯酶以来，已有超过 30 种阿魏酸酯酶被纯化，其主要生物功能是。

7、水解植物细胞壁中多糖与阿魏酸连结的酯键，释放出游离的单体阿魏酸或阿魏酸二聚体。-1， 4- 内切木聚糖酶 (EC 3.2.1.8， endo-1， 4-xylanase) 是一类能够专一降解木聚糖为低聚木糖和木糖的一组酶的总称，主要从主链内部作用于木糖苷键，是木聚糖降解过程中最重要的酶之一。能够产生木聚糖酶的微生物有很多，包括丝状真菌、细菌、放线菌等。两种酶均广泛应用于食品、医药、饲料、造纸和印染等领域。 0003 在食品工业中可利用阿魏酸酯酶打断阿魏酸与细胞壁材料如麸皮、秸秆中多糖的交联，高效降解多糖并获得反式阿魏酸，它和阿拉伯木聚糖酶联合作用的水解产物低聚。

8、糖 ( 主要是低聚木糖 )、阿魏酸都是重要的功能性食品基料，戊糖可用于酒精发酵、生产木糖醇等。在饲料工业中，利用阿魏酸酯酶处理植物性的原材料，可以将阿魏酸从植物细胞壁的结构中游离出来，从而破坏细胞壁的骨架结构，使得木质素、半纤维素及纤维素之间的连接被部分打破，结构变得比处理前疏松，变得疏松的原料更容易被牲畜消化吸收利用，可以提高饲料的利用效率。 0004 早期对于阿魏酸酯酶和 -1， 4- 内切木聚糖酶的研究多集中在产酶菌株的选育、发酵条件的优化、酶的分离纯化、酶的理化性质、酶的复合诱变、酶的水解机理等方面。随着分子生物学研究的不断深入与完善，越来。

9、越多的工作集中于酶的基因克隆和高效表达方面，如：构建和筛选优良的高效基因工程菌株；基于酶结构与功能的关系，通过定点诱变改变酶活性位点，从而实现催化功能的改变，以拓宽其应用范围等。不同来源的两种酶基因已经被克隆，并在大肠杆菌、酿酒酵母、毕氏酵母等表达系统中进行了表达。然而在毕赤酵母系统中进行共表达的研究尚未见报道。发明内容 0005 本发明的目的是构建一种新型的共表达阿魏酸酯酶A和-1， 4-木聚糖酶基因的毕赤酵母工程菌。说明书 CN 102994542 A 3 2/3 页 4 0006 本发明的技术方案： 0007 所设计到的 pPICZA-faeA。

10、和 pPIC9k-xyn11A 均为本实验室构建和保藏。 0008 所述的重组 FaeA 和重组 Xyn11A 活性的测定方法： 0009 以阿魏酸甲酯 (MFA) 为底物，高效液相 (HPLC) 分析阿魏酸的释放量。具体操作按为：移取 900L MFA(1mM， pH 6.0) 于 2mL EP 管中， 45保温 10min，加入 100L 适当稀释的酶液，反应 10min 后加入 400L 冰乙酸终止反应，立即混匀进行高效液相分析。以先在酶溶液中加入 400L 冰乙酸，再加底物溶液为对照。色谱条件：以甲醇、 1乙酸一步梯度洗脱，在10min内，甲醇浓度由5。

11、0上升至80，流速1mL/min，柱温30，检测波长320nm，上样量 20L。根据峰面积，从标准曲线查出相应的阿魏酸量，从而计算酶活。酶活单位定义：在测定条件下 (45、 pH 6.0) 每分钟产生 1mol 阿魏酸所需的酶量为一个酶活单位 (U)。 0010 于 25mL 具塞试管 A 和 B 中，各加入质量浓度为 0.5的底物溶液 2.4mL， 50预热 10min，在 A 管中加入 0.1mL 适当稀释的酶液， 50反应 10min ；立即各加入 2.5mL 3， 5 - 二硝基水杨酸 (DNS) 试剂，在 B 管中再补加 0.1mL 酶液， A 和 B 管。

12、均煮沸 7min ；冷却后各加去离子水5mL，摇匀； 540nm处以B管为空白对照测定A管吸光度值，并从标准曲线上查出相应的木糖含量并折算成酶活性单位。重组 Xyn11A 活性测定底物为用 pH 4.6、柠檬酸 -Na2HPO4缓冲液配制的桦木木聚糖 (Sigma， USA) 溶液。酶活性单位定义：在本测定条件下，以每分钟产生 1mol 还原糖所需的酶量定义为 1 个木聚糖酶活性单位 (IU)。 0011 所述的重组工程菌的构建方法： 0012 (1)GS115/faeA的构建、表达及活性测定：用Sac I对pPICZA-faeA进行线性化，按照毕赤酵母表达手。

13、册进行电转化GS115感受态细胞，用Zeocin筛选得到高拷贝的毕赤酵母重组子 GS115/faeA ；按照手册上的标准流程进行诱导表达，以阿魏酸甲酯为底物，高效液相法分析阿魏酸的释放量，测得发酵液中重组阿魏酸酯酶的酶活性。 0013 (2) 工程菌 GS115/faeA-xyn11A 的构建：用 Sal I 对 pPIC9k-xyn11A 进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转化 GS115/faeA 感受态细胞，用 G418 筛选得到高拷贝的毕赤酵母重组子 GS115/faeA-xyn11A ；按照手册上的标准流程进行诱导表达，分别用 HPLC 法和 DNS。

14、法测定重组阿魏酸酯酶和重组木聚糖酶的酶活性。 0014 本发明的有益效果：本发明提供了一种新型的共表达阿魏酸酯酶基因和 -1， 4-木聚糖酶基因的工程菌GS115/faeA-xyn11A的构建方法。本发明不仅实现了对双质粒体系在共表达的应用进行了有益探索，而且实现了目标酶的共同生产，降低了产物的制备成本，为进一步工业化生产复合酶奠定了基础。具体实施方式 0015 以下结合具体实施例，进一步阐述本发明的操作方法。但是这些实施例仅用于详细说明本发明，而不用于限制本发明的范围。 0016 实施例 1 工程菌 GS115/faeA 的构建、表达及产物活性测定： 0017 。

15、用Sac I对pPICZA-faeA进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转化GS115 感受态细胞，用Zeocin筛选得到高拷贝的毕赤酵母重组子GS115/man5A。该工程菌用1.0 甲醇诱导 72h，以阿魏酸甲酯为底物， HPLC 分析阿魏酸释放量，测定发酵液中重组阿魏酸酯说明书 CN 102994542 A 4 3/3 页 5 酶活性达 7.04U/mL。SDS-PAGE 电泳显示重组甘露聚糖酶分子量为 36.0kDa。 0018 实施例 2 工程菌 GS115/faeA-xyn11A 的构建、表达及产物活性测定： 0019 用 Sal I 对 pPIC9k-xyn11A 进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转化 GS115/faeA感受态细胞，用G418筛选得到高拷贝的毕赤酵母重组子GS115/man5A-xyn11A。该工程菌用 1.0甲醇诱导 72h， DNS 法测得发酵液中重组木聚糖酶活性达 600IU/mL，重组阿魏酸酯酶活性仍为 7.04U/mL。SDS-PAGE 电泳显示重组木聚糖酶和阿魏酸酯酶分子量分别为 20.7kDa 和 36.0kDa。说明书 CN 102994542 A 5 。

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