人工创制植物雄性不育的方法.pdf

本发明公开了一种人工创制植物雄性不育的方法，创新之处在于，它是一种通过反义RNA技术抑制植物花药内源HSP70基因的表达，进而干扰转基因植株花药的正常发育，获得雄性不育转基因植株的方法。具体来说，它是将由花药特异性表达的Osg6B启动子驱动的HSP70基因的反义RNA表达载体转入到禾本科植物中，抑制花药内源HSP70基因的表达，进而干扰转基因植株花药的正常发育，获得雄性不育转基因植株的方法。本方法获得的转基因植株可以达到雄性完全不育。

权利要求书
1、  一种人工创制植物雄性不育的方法，其特征在于，它是将由花药特异性表达的Osg6B启动子驱动的HSP70基因的反义RNA表达载体转入到禾本科植物中，抑制花药内源HSP70基因的表达，进而干扰转基因植株花药的正常发育，获得雄性不育转基因植株的方法。

2、  根据权利要求1所述的人工创制植物雄性不育方法，包括表达载体的构建、禾本科植物的遗传转化和转基因植株花粉育性的检测，其特征在于，所述表达载体的构建包括：
(1)植物花药特异性启动子Osg6B的克隆——根据SEQ ID NO：1所示的序列设计具有SEQ ID NO：2所示序列的上游引物和具有SEQ ID NO：3所示序列的下游引物，以日本晴基因组DNA为模板PCR扩增，得到具有SEQ ID NO：4所示序列的目标片段；
(2)HSP70反义片段的选择——选择靶位点位于HSP70基因5’翻译起始密码子区，HSP70反义片段具有SEQ ID NO：5所示的序列；
(3)载体构建——根据HSP70反义片段合成具有SEQ ID NO：6所示序列的反义链和具有SEQ ID NO：7所示序列的正义链，构建成能够表达HSP70反义片段的表达载体。

3、  根据权利要求1或2所述的人工创制植物雄性不育方法，其特征在于，所述禾本科植物为小麦。

说明书人工创制植物雄性不育的方法
技术领域
本发明涉及一种人工创制植物雄性不育的方法。具体地说涉及一种通过将由花药特异性表达的Osg6B启动子驱动的HSP70基因的反义RNA表达载体转入到禾本科粮食作物中去，抑制内源HSP70基因的表达，进而干扰转基因植株花药的正常发育而实现雄性不育的方法，这种方法可为植物杂种优势利用奠定基础。
背景技术
植物雄性不育是植物杂种优势利用的基础，通常获得植物雄性不育的途径主要是通过在自然资源中或通过诱变的方式筛选出雄性不育的突变体，或者通过与近缘物种进行远缘杂交、再反复回交获得，这两种方法都存在获得不育材料难度大和周期长等缺点。随着植物分子生物学和发育生物学的发展，人们可以通过基因工程的方式在植物的花药(花粉)中表达细胞毒素或通过人工抑制花药(花粉)发育过程中的关键基因的功能来阻断雄配子的正常发育，进而获得雄性不育的植株。
目前，通过基因工程获得雄性不育植物的方法主要有三种方式(张爱民，肖兴国，聂秀玲.中国的植物转基因雄性不育研究[J].中国科学基金.2000，3：132-136.)。第一种是Mariani方法(Mariani C，de Beuckeleer M，Truettner J，et al.Inductionof male sterility in plants by a chimaeric ribonuclease gene[J].Nature.1990，347(6295)：737-741.)，即在花药绒毡层中特异性表达Barnase基因破坏绒毡层结构，从而导致花粉发育的败育。在我国，利用该方法也已在多种植物上获得了成功，如烟草(罗玉英，刘玉乐，李胜国，et al.TA29-Barnase嵌合基因导入对烟草花药绒毡层及花粉发育的影响[J].Acta Botanica Sinica.1997，10：894-898.)、油菜(周雪荣，彭仁旺，方荣祥，et al.表达核糖核酸酶基因的雄性不育油菜的获得[J].遗传学报.1997，6：531-536.)、番茄(张宏，王波，薛爱群，et al.雄性不育嵌合基因的构建及番茄转化研究[J].遗传.1998，3：5-7.)和小麦(傅荣昭，曹光诚，马江生，et al.用基因枪法将人工雄性不育基因导入小麦的研究初报[J].遗传学报.1997，4：358-361.)等。但是有报道(李胜国，刘玉乐，朱锋，et al.基因工程雄性不育烟草的获得[J].植物学报.1995，37(8)：659-660.；李胜国，刘玉乐，朱峰，et al.基因工程雄性不育烟草及其温度敏感性，Acta Botanica Sinica，1997，3：231-235)称TA29-Barnase的转基因烟草的育性受温度的影响，预示着启动子TA29的活性可能受温度影响。
第二种方法是变通的Mariani方法，主要是通过采用与TA29不同的启动子来构建表达载体(这种方法在下列文献中有所涉及：de Block M，Debrouwer D，Moens T.Thedevelopment of a nuclear male sterility system in wheat.Expression of the barnasegene under the control of tapetum specific promoters[J].Theoretical and AppliedGenetics.1997，95(1)：125-131；凌定厚，陶利珍，马镇荣，et al.以基因枪介导获转ps1-barnase基因的工程雄性不育水稻植株[J].遗传学报.1998，5：433-442；刘大文，王守才，谢友菊，et al.转Zm13-Barnase基因玉米的获得及其花粉育性研究[J].植物学报.2000，6：611-615；等)。但此种方法仍然没有完全脱离Mariani方法的影响。
第三种方法就是采用反义RNA技术或其他相关技术，干扰花药(花粉)发育过程中正常的基因表达从而导致雄性不育的产生。应用此技术的难点是要找到一个能够影响花药或花粉发育的关键基因和一个能够将该基因的功能完全沉默掉的技术手段。van der Meer等将类黄酮合成酶的反义RNA转化矮牵牛，阻断其内源类黄酮的生物合成，获得了雄性不育植株(Van MI，Stam M E，Van T A，et al.Antisense inhibition of flavonoid biosynthesisin petunia anthers results in male sterility.[J].Plant Cell.1992，4(3)：253-262.)。但也有研究表明，在拟南芥中，类黄酮合成酶基因的突变导致突变体的类黄酮含量降低，可是突变体的花粉育性并没有受到影响，表明类黄酮并非是所有植物花粉发育过程中所必须的物质(Burbulis I E，Iacobucci M，Shirley B W.A Null Mutation inthe First Enzyme of Flavonoid Biosynthesis Does Not Affect Male Fertility inArabidopsis[J]..Plant Cell.1996，8(6)：1013-1025.)，这就限制了利用该途径创造植物雄性不育的应用范围。Yui等将甜菜的丙酮酸脱氢酶基因的编码区反义基因片段(+620-+926，长300bp)在TA29启动子的驱动下转化烟草，获得了育性程度不同的转基因植株(Yui R，Iketani S，Mikami T，et al.Antisense inhibition of mitochondrial pyruvatedehydrogenase Elalpha subunit in anther tapetum causes male sterility.[J].PlantJ.2003，34(1)：57-66.)。
花药发育过程中，所涉及到的基因成千上万，采用反义RNA技术及其他相关技术，可以比较容易找到目标基因。比如，李艳红等将反义肌动蛋基因与花药特异性启动子TA29连接，构建成嵌合基因，转化小麦并获得了完全雄性不育植株(李艳红，肖兴国，赵广荣，et al.将新的人工雄性不育基因导入小麦栽培品种的研究初报[J].农业生物技术学报.1999，3：255-258.)，但是由于TA29启动子活性有可能受温度的影响，因而该技术在生产上具有一定的风险性。
HSP70热激蛋白是一种重要的“分子伴侣”蛋白，它是由核基因编码的，在进化上非常保守，不同生物的HSP70热激蛋白基因序列具有很高的同源性(J P Hendrick A F H.Molecular Chaperone Functions of Heat-Shock Proteins[J].Annual Review ofBiochemistry.1993，62：349-384；Boorstein W R，Ziegelhoffer T，Craig E A.Molecularevolution of the HSP70 multigene family[J].Journal of Molecular Evolution.1994，38(1)：1-17.)。HSP70蛋白广泛参与有机体的保护功能，参与细胞新合成蛋白多肽链的正确折叠、组装和定向运输(Bukau B，Weissman J，Horwich A.Molecular Chaperones andProtein Quality Control[J].Cell.2006，125(3)：443-451.)，并且具有帮助降解细胞内异常蛋白质等功能(Parsell D A And Lindquist S.The Function of Heat-ShockProteins in Stress Tolerance：Degradation and Reactivation of Damaged Proteins[J].Annual Review of Genetics.1993，27：437-496.)。目前，又有HSP70热激蛋白的一项新的功能被发现，那就是它参与了动植物雄性配子的发育过程。在动物上，Dix D J等(DixD J，Allen J W，Collins B W，et al.Targeted gene disruption of Hsp70-2 resultsin failed meiosis，germ cell apoptosis，and male infertility[J].Proceedings ofthe National Academy of Sciences.1996，93(8)：3264-3268.)将插入失活的HSP70基因经重组后导入雄性小鼠中，使该小鼠丧失了生殖能力。
在植物上，陈建南等(陈建南，付鸿仪，阙强，et al.HSP_(70)基因表达对高粱育性的影响(英文)[J].Developmental and Reproductive Biology.1998，2：51-62.)在对高梁雄性不育的研究过程中发现热激蛋白HSP70的有无与雄性不育紧密相关。以上的研究成果预示着HSP70基因可以作为一个创造植物雄性不育的良好的靶标基因。为了直接探索HSP70热激蛋白基因表达与植物花粉育性变化的关系。陈建南等(陈建南，傅鸿仪，秦环英，et al.HSP_(70)反义RNA对高粱花粉的正常形成的影响[J].科学通报，1997，18：1993-1997.)将人工合成的HSP70基因的反义基因核苷酸片段通过幼穗底部注射的方法导入高梁3197B正常可育品系，造成了该品系花粉的部分败育，这就表明HSP70基因的确是一个良好的靶标基因。但由于是利用体外注射的方式，因此该方法存在着反义片段难以到达作用位点和败育性状无法稳定遗传的缺点。而通过构建反义基因表达载体、实施转基因的方式却可以克服上述缺点，能够获得稳定遗传雄性不育性状的转基因植株，直接为农业生产服务。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种人工创制植物雄性不育的方法。
这种人工创制植物雄性不育的方法，创新之处在于，它是一种通过反义RNA技术抑制植物花药内源HSP70基因的表达，进而干扰转基因植株花药的正常发育，获得雄性不育转基因植株的方法。具体来说，它是将由花药特异性表达的Osg6B启动子驱动的HSP70基因的反义RNA表达载体转入到禾本科植物中，抑制花药内源HSP70基因的表达，进而干扰转基因植株花药的正常发育，获得雄性不育转基因植株的方法。
前述人工创制植物雄性不育方法，包括表达载体的构建、禾本科植物的遗传转化和转基因植株花粉育性的检测，其特征在于，所述表达载体的构建包括：
(1)植物花药特异性启动子Osg6B的克隆——根据SEQ ID NO：1所示的序列设计具有SEQ ID NO：2所示序列的上游引物和具有SEQ ID NO：3所示序列的下游引物，以日本晴基因组DNA为模板PCR扩增，得到具有SEQ ID NO：4所示序列的目标片段；
(2)HSP70反义片段的选择——选择靶位点位于HSP70基因5’翻译起始密码子区，HSP70反义片段具有SEQ ID NO：5所示的序列；
(3)载体构建——根据HSP70反义片段合成具有SEQ ID NO：6所示序列的反义链和具有SEQ ID NO：7所示序列的正义链，构建成能够表达HSP70反义片段的表达载体。
前述人工创制植物雄性不育方法，优选的技术方案是，所述禾本科植物选用小麦。
该方法以植物花药HSP70基因为靶标，通过反义RNA技术来抑制该基因的内源表达进而破坏转基因植株花药的正常发育而获得雄性不育转基因植株。本发明构建了HSP70基因的反义表达载体，并对小麦进行转化，获得了满意的效果，为禾本科粮食作物的基因工程育种研究提供了一个新途径。
本发明选择Osg6B启动子来构建表达载体，通过反义RNA技术来阻断重要禾本科粮食作物花药中内源HSP70基因的正常表达，创造出基因工程雄性不育植株，进而为杂种优势利用奠定基础。Osg6B启动子来源于水稻，到目前为止尚未有该启动子受环境温度影响的报道，并且由于禾本科植物的亲缘关系比较近，因此，Osg6B启动子在其他禾本科粮食作物中的适用性也比较强。所选择的HSP70基因反义片段长度为27bp，位于HSP70基因5’翻译起始密码子区域，可以直接抑制蛋白质翻译的起始，这样就可以更好地实现阻止内源基因翻译的作用。我们的转基因实例表明转基因植株可以达到雄性完全不育。
附图说明
图1为经过诱导分化而成的转反义HSP70基因片段的部分再生植株幼苗。
图2为部分再生植株穗部在开花期的雄性不育外观形态。
图3部分转基因候选植株的PCR鉴定。
图4转基因植株1、2的PCR产物XbaI内切酶酶切产物电泳。
图5部分转基因植株花粉育性观察，其中：
图5(a)未转基因对照植株成熟花粉；
图5(b)1号，转基因植株成熟花粉；
图5(c)2号，转基因植株成熟花粉；
图5(d)3号，转基因植株成熟花粉。
图6是表达载体构建流程示意图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图具体描述本发明的技术方案，但不限于此。
实施例
1、表达载体的构建
1.1水稻花药特异性启动子Osg6B的克隆
根据文献(Tsuchiya and Toriyama et al.，1994)报道的Osg6B序列(SEQ ID NO：1所示的序列，NCBI登录号：D21160)，应用DNASTAR软件设计引物，由北京赛百盛生物技术公司合成扩增引物：6B F-EcoRI 5’ggg gaa ttc ttt ttt tta cac ag3’(SEQ ID NO：2)，6B R-NcoI 5’cca tgg tgg att aga gct tg-3’(SEQ ID NO：3)。以粳稻品种日本晴(Nipponbare)基因组DNA为PCR扩增模板，进行PCR扩增。扩增程序为：94℃ 5min；94℃ 45sec，56℃ 45sec，72℃ 2min，35r；72℃ 5min。(PCR所用的Taq酶购自天根生化科技(北京)有限公司，dNTPs购自Promega公司)。扩增完成后经过琼脂糖凝胶(琼脂糖购自北京拜尔迪生物技术公司)电泳后，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司)回收目标条带并连接到Promega公司pGEM-T克隆载体(购自Promega公司)上，然后转化大肠杆菌DH10B感受态细胞(本实验室保存)，挑取阳性单克隆进行测序验证。测序由北京三博远志生物有限责任公司完成，结果为SEQ ID NO：4所示的序列。
1.2HSP70反义片段的选择
HSP70反义片段位于HSP70基因5’翻译起始密码子区域，长度为27bp的SEQ ID NO：5所示的序列。首先由北京赛百盛生物技术公司合成HSP70反义片段的反义链和正义链两条单链(反义单链为SEQ ID NO：6所示的序列，正义单链为SEQ ID NO：7所示的序列。)然后将两条单链分别溶解为100μmol/L浓度的母液，再将两个母液等体积混合，先94℃变性2min后，再缓慢冷却到室温，获得HSP70反义基因片段的双链，经酶切后连接到载体上。为了后续操作方便，在反义单链和正义单链的两端分别加内切酶NcoI和BamHI的酶切位点。
1.3载体构建
载体构建过程所用的内切酶和连接酶均购自美国NEB公司，酶切条件均为37℃酶切过夜。酶切后走琼脂糖凝胶电泳，然后用回收试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)回收目标片段，接着进行下一步的连接实验。连接时注意使插入片段和载体片段的摩尔比在3～10∶1的范围内，16℃连接过夜。第二天将连接产物用热激法转化DH10B感受态细胞、铺平板、37℃倒置培养过夜，第三天提取质粒DNA进行酶切鉴定或进行下一步操作直至整个表达载体构建完成。
2、小麦的遗传转化
实验方法参照梁辉的小麦转基因方案(梁辉.转雪花莲凝集素基因小麦抗蚜性及建立高效小麦转化体系的研究[D].博士学位论文，华中农业大学，2005.)。基因枪及耗材均为BioRad公司产品，其他药品如无说明，均为国产分析纯级别试剂。
2.1转化受体材料的获得
采集NC221小麦新品系授粉后12～14d的未成熟种子，剥离幼胚，挑选直径在1.0mm左右的幼胚作为转基因受体。所采集的未成熟种子用70％酒精浸泡1～1.5min，再用5％次氯酸钠浸泡20min，无菌水冲洗3遍后在无菌条件下剥离幼胚，幼胚盾片面向上放于附加2mg/L 2，4-D的MB固体培养基上进行预培养，每皿约50粒幼胚，25℃暗培养3~4d。
2.2幼胚转化和离体培养
采用基因枪(PDS-1000/He，BioRad公司)法转化幼胚。轰击前4~6h，将幼胚从预培养培养基中转入附加0.5mol/L甘露醇的高渗培养基中进行高渗预处理。幼胚紧密但不重叠地平放于培养皿的中心(直径3cm)，25℃暗培养，轰击后16~18h将小麦幼胚由高渗培养基中转移至无选择压力的恢复培养基。小麦幼胚恢复培养采用附加2mg/L 2，4-D的MS固体培养基，一般于25℃暗培养恢复9~11d。将经过恢复培养的材料转入附加有卡那霉素(Kan)的筛选培养基中，25℃暗培养，诱导幼胚愈伤组织用附加80mg/L Kan和2mg/L 2，4-D的MS固体培养基，大约需15~17d。以后将抗性愈伤组织转入分化培养基中光照培养(3000lux，10h光照，25℃)，幼胚愈伤组织分化用附加80mg/L Kan、1mg/L Zeatin和1mg/L IAA的1/2MS固体培养基。待分化出的芽长长至2~3cm时，将抗性幼苗转至生根培养基中诱导生根，幼苗壮根培养用附加80mg/L Kan的无激素的1/2MS固体培养基，如图1。根系完整的幼苗经壮苗培养后，移栽至土壤中，置于4℃冰箱进行20d的春化处理。春化处理完毕后，移到温室中进行培养。最后共得到7株阳性候选植株，如图2。
金粉微粒的制备过程是，称取直径1.0μm的40mg金粉于1.5mL的离心管中。加入1mL无水乙醇，涡旋振荡1~2min，10000r/min离心1min，去上清，以上步骤重复3次。加入1mL无菌水充分混匀后离心，去上清，金粉重悬于1mL无菌超纯水中，-20℃保存。金粉悬液终浓度40mg/mL。DNA-金粉微弹的制备过程是，取上述金粉悬液25μL(用前涡旋混匀)，依次逐滴加入10μL质粒DNA(0.5μg/μL)，25μL 2.5mol/L的CaCl2.2H2O溶液(经高压灭菌)和10μL 0.1mol/L的亚精胺溶液(经过滤灭菌，分装成小份，-20℃贮存，保存期不超过6个月)，振荡3min，冰浴静置15min后，10000r/min离心10sec，去上清。加入300μL无水乙醇，稍振荡后，10000r/min离心10sec，弃上清，重新悬浮于60μL无水乙醇中。可供6枪之用(10μL/枪)。
基因枪轰击过程操作应在无菌条件下进行。使用70％乙醇对基因枪的表面及样品室进行消毒，同时将阻挡网，压力膜(本次实验使用1100psi压力膜)、微弹载体膜及其固定器等均以70％乙醇浸泡10min，置于超净工作台内晾干备用。压力膜固定盖和微弹载体发射装置用70％乙醇表面灭菌并吹干备用。使用固定装置将微弹载体膜安装在固定环上，并确保其边缘与固定环四周紧密接触，吸取10μL充分悬浮的微弹DNA-金粉悬液均匀涂于微弹载体膜中央，室温干燥备用。安装好可裂圆片，微弹载体膜后，将装有受体材料的培养皿放置于样品室支架上，并安放于样品室中的合适位置(射击距离60mm)，关好样品室，打开氦气瓶阀门，使压力稳定在可裂膜的耐受压(1100psi)高200psi的状态。打开基因枪电源开关及真空泵开关，待真空度达到25~27英寸汞柱时，打开真空泵固定阀门并启动轰击开关，使氦气进入压力室，待氦气压力表指示可裂膜最大耐受压时膜会自动破裂，此时应立即松开轰击开关，并将真空开关拧到排气档，待真空度降为零时，即可取出样品。
MB固体培养基基本成分：MS培养基的大量元素和微量元素加B5培养基的有机成分，蔗糖(30g/L)，植物凝胶(Phytagel，2g/L)，pH5.8-6.0。
预培养及恢复培养基：MB培养基基本成分，附加2，4-D(2mg/L)。
高渗培养基；MB培养基基本成分，附加2，4-D(2mg/L，)、甘露醇(0.5mol/L)。
筛选培养基：MB培养基基本成分，附加2，4-D(2mg/L)、Kan(80mg/L)。
分化培养基：1/2MS培养基大量元素，其余成分同MB培养基基本成分，附加IAA(1mg/L)，Zeatin(1mg/L)，Kan(50mg/L)。
生根培养基：1/2MS培养基大量元素，其余成分同MB培养基基本成分，附加蔗糖(80g/L，)、Kan(50mg/L)。
2.3、转基因植株的PCR检测
取温室7株转化阳性候选植株的叶片，CTAB法(十六烷基三甲基溴化铵)提取基因组DNA，采用质粒载体特异引物对转基因候选株进行鉴定。对于反义质粒来说，用特异引物进行扩增，其目的产物长2.2kb。扩增程序为：94℃ 5min；94℃ 45sec，56℃ 45sec，72℃ 2min，35r；72℃ 5min。
图3为部分转基因候选植株的PCR鉴定。从图3可以看出，转反义质粒的转基因候选株中，有3株是转化植株，4株是未转化植株。为了进一步确认PCR的鉴定效果，我们对图3中的1、2号植株的PCR产物进行回收，然后用XbaI内切酶对回收产物进行酶切(XbaI内切酶将2.2kb的PCR扩增产物切割成1.05kb和1.15kb两个片段，同时用反义表达载体质粒的PCR产物作为阳性对照)。
图4是转基因植株1、2的PCR产物XbaI内切酶酶切产物电泳。从图4酶切产物的电泳结果可知，转基因植株的PCR扩增确实是特异性扩增(局限于琼脂糖电泳的分辨率和电泳时间，1.05kb和1.15kb两条带没有分开，因而电泳结果显示为一条带；1号样品由于酶切模板量少而没有条带出现)，这就进一步确定了有三株转基因植株是阳性植株。
3、转基因植株花粉育性的检测
为确定转基因植株中外源基因的表达效果，我们对转基因植株开花后的穗部外观形态和花粉育性进行了观察。在外观形态上，转基因植株开花后，外观形态上均表现为颍壳张开，柱头外露等典型的雄性不育形态。花粉的育性上，采用I2-KI染色法，观察各转基因植株和对照植株(非转基因植株)成熟花粉的育性。具体方法如下：采集各植株的成熟花药，直接使用或先用Carrnoy固定液固定而后储存于4℃冰箱备用。取一枚花药置于载玻片上，加1滴蒸馏水，用镊子将花药捣碎，使花粉粒释放，再加1～2滴I2-KI溶液，盖上盖玻片，在光学显微镜下观察。
图5是部分转基因植株花粉育性观察。从图5可以看出，对照未转基因植株的花粉饱满，染色很深，呈规则的圆形。而转基因植株的花粉空瘪，基本不染色或染色很浅，呈浅黄褐色，形状呈三角形、帽状等不规则形状，表现为典败或圆败。本发明结果表明，通过转化HSP70反义基因来创造小麦雄性不育是可行的。
SEQUENCE LISTING
<110>聊城大学
<120>人工创制植物雄性不育的方法
<130>人工创制植物雄性不育的方法
<160>7
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>3640
<212>DNA
<213>Oryza sativa
<400>1
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