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1、(10)申请公布号 CN 102993296 A (43)申请公布日 2013.03.27 CN 102993296 A *CN102993296A* (21)申请号 201110272178.8 (22)申请日 2011.09.14 C07K 14/79(2006.01) C07K 1/22(2006.01) C12N 15/12(2006.01) C12N 15/63(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (71)申请人 广州格拉姆生物科技有限公司 地址 510000 广东省广州市萝岗区科学城科 汇发展中心 ( 自编 A-5 栋 60。
2、2 房 ) (72)发明人 夏新界 李圣翔 (54) 发明名称 牛乳铁蛋白肽及其制备方法 (57) 摘要 本发明涉及牛乳铁蛋白肽及其制备方法， 牛乳铁蛋白肽 (Bovine Lactoferricin， 简写为 Lfcin B)是经胃蛋白酶从牛乳铁蛋白(bLF)N-端 (17 41) 水解的 25 个氨基酸残基， 分子量约为 3.1kd ； 其制备方法包括 ： 1) 重组表达载体的构 建 ； 2) 诱导表达融合蛋白 ； 3) 蛋白质的分离与纯 化。本发明的有益效果为 ： Lfcin B 是所有 Lfcin 中活性最高的， 抑菌效果是牛乳铁蛋白 400 倍， 能 在胃肠道中发挥更重要的作用。 (。
3、51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 1 页 1/1 页 2 1. 一种牛乳铁蛋白肽， 其特征在于， 该牛乳铁蛋白肽的核苷酸序列为 ： GCT CCA AGA AAG AAC GTT AGA TGG TGT ACT ATT TCT CAA CCA GAA TGG TTT AAG TGT AGA AGA TGG CAA TGG AGA ATG AAG AAG TTG GGT GCT CCA TCT ATT ACT TGT GTT AGA AGA GCT TT。
4、C GCT TTG GAA TGT ATT AGA GCT ATT GCT GAG AAG AAG GCT GAT GCT GTT ACT TTG GAT GGT GGT ATG GTT TTC GAA GCT GGT AGA GAT CCA TAC AAG TTG AGA CCA GTT GCT GCT GAA ATT TAC GGT ACT AAG GAA TCT CCA CAA ACT CAT TAC TAC GCT GTT GCT GTT GTT AAG AAG GGT TCT AAC TTT CAA TTG GAT CAA TTG CAA GGT AGA AAG TCT TGT CA。
5、T ACT GGT TTG GGT AGA TT 该牛乳铁蛋白肽的氨基酸序列为 ： aprknvrwct isqpewfkcr rwqwrmkklg apsitcvrra faleciraia ekkadavtld ggmvfeagrdpyklrpvaae iygtkespqt hyyavavvkk gsnfqldqlq grkschtglgr。 2. 根据权利要求 1 所述的牛乳铁蛋白肽， 其特征在于， 所述牛乳铁蛋白肽核苷酸序列 的活性中心为 ： TTT AAG TGT AGA AGA TGG CAA TGG AGA ATG AAG AAG TTG GGT GCT CCA TCT ATT 。
6、ACT TGT GTT AGA AGA GCT TTC 该牛乳铁蛋白肽氨基酸序列的活性中心为 ： fkcrrwqwrm kklgapsitc vrraf。 3. 权利要求 1 或 2 所述的牛乳铁蛋白肽的制备方法， 其特征在于， 包括以下步骤 ： 1) 重组表达载体的构建 ； 2) 诱导表达融合蛋白 ； 3) 蛋白质的分离与纯化。 4. 根据权利要求 3 所述的牛乳铁蛋白肽的制备方法， 其特征在于 ： 所述步骤 1) 包括 ： 牛乳铁蛋白肽基因的合成 ； 牛乳铁蛋白肽基因的克隆 ； 构建重组表达载体。 5. 根据权利要求 4 所述的牛乳铁蛋白肽的制备方法， 其特征在于 ： 所述步骤 2) 包括。
7、 ： 含牛乳铁蛋白肽基因的工程菌的获得 ； 诱导表达融合蛋白。 6. 根据权利要求 5 所述的牛乳铁蛋白肽的制备方法， 其特征在于 ： 所述步骤 3) 包括 ： 融合蛋白的分离 ； 融合蛋白的浓缩 ； 融合蛋白的纯化 ； 牛乳铁蛋白肽的保存。 权 利 要 求 书 CN 102993296 A 2 1/5 页 3 牛乳铁蛋白肽及其制备方法 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域， 具体涉及牛乳铁蛋白肽及其制备方法。 背景技术 0002 抗生素作为抗菌和促生长添加剂在动物饲料中使用已经有很长的历史， 但随着人 们认识水平的提高， 抗生素在动物饲料中的广泛使用暴露出越来越多的负面作用， 其中最 。
8、为严重的， 一是能造成畜禽产品中的药物残留， 直接影响消费者的身体健康 ； 二是严重影响 动物消化道的微生态平衡， 造成一些病原菌耐药性的发生， 使得针对由这些病原菌所引起 的感染的预防和治疗变得非常困难。 目前， 细菌抗药性问题普遍存在， 而且耐药菌株的数量 也显著增加， 一些原来威胁人类生命的疾病， 比如肺结核等， 重又开始大范围发生。丹麦是 最早禁止在饲料中使用抗生素的国家， 从 1994 年开始， 逐步减少抗生素在饲料中的使用。 2003 年， 世界卫生组织 (WHO) 建议按照丹麦的模式逐步减少抗生素的使用。2006 年， 欧盟 已经全面禁止抗生素在动物饲料中的使用。虽然我国还没有立。
9、法阻止抗生素作为饲料添 加剂的使用， 也在逐步减少使用量。但是， 目前我国仍有 20 余种抗生素在动物饲料中使用。 随着我国加入 WTO， 抗生素的使用已经严重影响了我国畜牧业产品在国际市场上的竞争力。 因此， 开发新型抗生素替代品对我国畜牧业的安全、 健康、 和谐发展越来越重要。 0003 抗菌肽 (antibacterial peptides) 是指存在于生物体内具有抵抗外界病原微 生物侵害、 消除体内突变细胞的一类小分子多肽， 它是动物免疫防御系统的一个重要组 成部分。抗菌肽是由生物特定基因编码， 具有广谱抗菌活性， 尤其对耐药菌株有明显的 杀灭作用， 且不破坏生物体细胞， 无免疫原性。。
10、抗菌肽可大致分为以下几类 ： 杀菌肽类 (cecropins)、 富含脯氨酸残基的蛙皮素 (magainin)、 富含甘氨酸的蜂毒素 (melittin)、 富 含胱氨酸残基的防御素 (defensin) 和富含脯氨酸和精氨酸的 cathelicidin 族抗菌肽类。 抗菌肽具有高效抗细菌、 真菌、 病毒， 甚至抗肿瘤活性， 在农业和临床治疗上都有广阔的应 用前景， 是最具开发前景的抗生素替代品 发明内容 0004 本发明的目的是提供一种牛乳铁蛋白肽(Bovine Lactoferricin， 简写为LfcinB) 及其制备方法， Lfcin B 是所有 Lfcin 中活性最高的， 抑菌效果是。
11、牛乳铁蛋白 400 倍， 能在 胃肠道中发挥更重要的作用。 0005 本发明的目的是通过以下技术方案来实现 ： 0006 牛乳铁蛋白肽的核苷酸序列为 ： 0007 GCT CCA AGA AAG AAC GTT AGA TGG TGT ACT ATT TCT CAA CCA GAA 0008 TGG TTT AAG TGT AGA AGA TGG CAA TGG AGA ATG AAG AAG TTG GGT 0009 GCT CCA TCT ATT ACT TGT GTT AGA AGA GCT TTC GCT TTG GAA TGT 0010 ATT AGA GCT ATT GCT GAG。
12、 AAG AAG GCT GAT CCT GTT ACT TTG GAT 0011 GGT GGT ATG GTT TTC GAA GCT GGT AGA GAT CCA TAC AAG TTG AGA 说 明 书 CN 102993296 A 3 2/5 页 4 0012 CCA GTT GCT GCT GAA ATT TAC GGT ACT AAG GAA TCT CCA CAA ACT 0013 CAT TAC TAC GCT GTT GCT GTT GTT AAG AAG GGT TCT AAC TTT CAA 0014 TTG GAT CAA TTG CAA GGT AGA AAG 。
13、TCT TGT CAT ACT GGT TTG GGT 0015 AGA TT 0016 其中牛乳铁蛋白肽核苷酸序列的活性中心为 ： 0017 TTT AAG TGT AGA AGA TGG CAA TGG AGA ATG AAG AAG TTG GGT GCT 0018 CCA TCT ATT ACT TGT GTT AGA AGA GCT TTC 0019 该牛乳铁蛋白肽的氨基酸序列为 ： 0020 aprknvrwct isqpewfkcr rwqwrmkklg apsitcvrra faleciraia ekkadavtld ggmvfeagrdpyklrpvaae iygtkespq。
14、t hyyavavvkk gsnfqldqlq grkschtglgr 0021 其中牛乳铁蛋白肽氨基酸序列的活性部分为 ： 0022 fkcrrwqwrm kklgapsitc vrraf。 0023 该序列共由 365 个碱基组成， 其中， 5 端信号肽包括 48 个碱基， 3 端融合蛋白部 分包括 240 个碱基， 活性中心由 75 个碱基 ( 从第 49 位到第 123 位 ) 组成， 编码具有序列 表中的氨基酸序列的 Bovine Lactoferricin 蛋白， 编码区中， A 占 28.1 (102 个 )， C 占 14.3 (52 个 )， G 占 26.2 (95 个 )。
15、， T 占 31.4 (114 个 )， A+T 占 59.5 (216 个 )， C+G 占 40.5 (147 个 )。 0024 牛乳铁蛋白肽的制备方法包括以下步骤 ： 0025 1、 重组表达载体的构建 0026 1.1、 牛乳铁蛋白肽基因的合成 ； 0027 人工合成牛乳铁蛋白的前 1 121 氨基酸序列。 0028 1.2、 牛乳铁蛋白肽基因的克隆 ； 0029 人工合成一对引物， 并在其 5 端分别加上 BamH I 和 Xho I 酶切位点。上游引物 及下游引物如下 ： 0030 Blf-F ： 5 -TATCGGATCCGCTCCAAGAAAGAACGTT-3， 0031 B。
16、lf-R ： 5 -GGTGCTCGAGTTATCTACCCAAACCAGTATG-3。 0032 1.3、 构建重组表达载体。 0033 2、 诱导表达融合蛋白 0034 2.1、 含牛乳铁蛋白肽基因的工程菌的获得 ； 0035 2.2、 诱导表达融合蛋白。 0036 3、 蛋白质的分离与纯化 0037 3.1、 融合蛋白的分离 ； 0038 3.2、 融合蛋白的浓缩 ； 0039 3.3、 融合蛋白的纯化 ； 0040 3.4、 牛乳铁蛋白肽的保存。 0041 本发明的有益效果为 ： 0042 1、 在水溶液中呈亲水脂的两个反向 折叠结构， 具有耐热、 在消化道不易被降 解、 无抗原性的特。
17、征， 能调节免疫作用， 具有广谱抗菌作用， 不干扰肠道有益菌等特性 ； 0043 2、 其对许多G+和G-均有抗菌作用， 如大肠杆菌、 肠炎沙门氏菌、 绿脓杆菌、 金黄色 说 明 书 CN 102993296 A 4 3/5 页 5 葡萄球菌、 产气荚膜梭菌等， 但不作用于双歧杆菌等对人体有益细菌、 同时还能刺激细胞的 生长、 参与免疫调节 ； 0044 3、 由于其特殊的功能作用， 作为饲料添加剂以食品防腐剂的开发研究， 已经受到 国内外研究机构和制造商的重视， 成为研究热点。 具体实施方式 0045 实施例基因工程生产牛乳铁蛋白肽 0046 1、 重组表达载体的构建 0047 1.1、 B。
18、ovine Lactoferricin I 基因的合成 0048 人工合成牛乳铁蛋白的前1121氨基酸序列 ： (下划线部分为牛乳铁蛋白肽(共 363bp， 121 个氨基酸 ) 0049 GCT CCA AGA AAG AAC GTT AGA TGG TGT ACT ATT TCT CAA CCA GAA 0050 TGG TTT AAG TGT AGA AGA TGG CAA TGG AGA ATG AAG AAG TTG GGT 0051 GCT CCA TCT ATT ACT TGT GTT AGA AGA GCT TTC GCT TTG GAA TGT 0052 ATT AGA GC。
19、T ATT GCT GAG AAG AAG GCT GAT GCT GTT ACT TTG GAT 0053 GGT GGT ATG GTT TT GAA GCT GGT AGA GAT CCA TAC AAG TTG AGA 0054 CCA GTT GCT GCT GAA ATT TAC GGT ACT AAG GAA TCT CCA CAA ACT 0055 CAT TAC TAC GCT GTT GCT GTT GTT AAG AAG GGT TCT AAC TTT CAA 0056 TTG GAT CAA TTG CAA GGT AGA AAG TCT TGT CAT ACT GGT。
20、 TTG GGT 0057 AGA TT 0058 保存于 pUC19/TOP10 中。 0059 1.2、 Bovine Lactoferricin I 基因的克隆 0060 人工合成一对引物， 并在其 5 端分别加上 BamH I 和 Xho I 酶切位点。上游引物 及下游引物如下 ： 0061 Blf-F ： 5 -TATCGGATCCGCTCCAAGAAAGAACGTT-3， 0062 Blf-R ： 5 -GGTGCTCGAGTTATCTACCCAAACCAGTATG-3。 0063 以上述 Blf-F 和 Blf-R 为引物， 以人工合成牛乳铁蛋白的前 1 121 氨基 酸序列为模。
21、板进行 PCR 扩增 ； 扩增体系为 ： 10buffer 2.5L， dNTPmix(10mM)2L， MgCl2(25mM)1.5L， Blf-F primer(10M)1L， Blf-R primer(10M)1L， TaKaRa pfu-Taq(5u)0.25L， 模板 25ng， 用灭菌双蒸水补足至 25.0L ； 扩增程序为 ： 94预变性 5min， 94变性 30s， 58退火 30s， 72延伸 40s， 共 35 个循环， 最后在 72下延伸 10min。 0064 PCR 扩增得到 378bp 的片段， 将得到的 PCR 产物回收， 连接 pMD18-T 克隆载体 ( 购。
22、 自宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司 )， 得到重组载体 pMD18-T-Bovine Lactoferricin I， 然后 将该重组载体转化大肠杆菌， 筛选阳性克隆， 然后对阳性克隆用 BamH I 与 Xho I 双酶切鉴 定， 鉴定正确后送 Invitrogen 公司测序。 0065 1.3、 构建重组表达载体 0066 将上述步骤 1.2 得到的 pMD18-T-Bovine Lactoferricin I 用 BamH I 与 Xho I 双 酶切， 得到的含Bovine Lactoferricin I基因的片段与经同样双酶切的pET30a(+)表达载 体相连接， 得到 pET3。
23、0a(+)-Bovine Lactoferricin I。 说 明 书 CN 102993296 A 5 4/5 页 6 0067 2、 诱导表达融合蛋白 0068 2.1、 含牛乳铁蛋白肽基因的工程菌的获得 0069 1) 用 电 击 法 将 步 骤 1 中 步 骤 1.3 的 重 组 表 达 载 体 pET30a(+)-Bovine Lactoferricin I 转化入大肠杆菌 Rosetta(DE3) 感受态细胞中 ( 购于德国默克公司 )。 0070 其中电击法的步骤如下 ： 取出 -70保存的大肠杆菌 Rosetta(DE3) 感受态细胞， 冰浴融化 ； 取 80ul 的 Rose。
24、tta(DE3) 感受态细胞， 加入已连接好的重组表达载体， 于 0.5ml 冰冷的微量无菌离心管中混匀， 置于冰上 5min( 使感受态细胞与质粒充分接触 )， 然后迅速 将混合液体加入已灭菌的干净的电转化杯中， 轻击液体以确保细菌与 DNA 悬液位于电击杯 底部。擦干电击槽外的冷凝水和雾气， 将电击杯放进电击仪， 按设定的参数， 启动对细胞的 电脉冲。电击完立即快速加入 800ul 的 LB 培养液， 然后吸出液体装入 1.5ml 离心管中， 放 入 37、 150r/min 摇床培养 1.5h。吸取 50ul 的培养菌液铺板 ( 含氨苄青霉素， 其终浓度为 50 100ug/ml ； 含。
25、氯霉素， 其终浓度为 34ug/ml 的 LB 培养平板 )， 37培养过夜 14h( 先正 面放半小时， 让培养液被琼脂完全吸收， 再反面培养过夜 )。 0071 2)阳性转化子的筛选及鉴定 ： 从LB平板上挑取5-8个具氨苄青霉素和氯霉素2种 抗性的单克隆菌落， 接种到含 50-100mg/L 氨苄青霉素和 34mg/L 氯霉素的 3ml LB 液体培养 基中， 250rpm 37振荡培养 14h。取 1-2l 菌液为模板， 以步骤 1 中的 Blf-F 和 Blf-R 为 引物， 进行 PCR 扩增， 鉴定大肠杆菌中是否含有目的基因片段， PCR 扩增反应条件及热循环 设置同步骤 1， 。
26、结果表明， 该菌株中含有目的基因片段。然后提取该菌株中的质粒， 用 BamH I 与 Xho I 对其进行双酶切检测， 结果表明酶切条带中含有与扩增基因大小一致的条带， 说 明 pET30a(+)-Bovine Lactoferricin I 重组表达载体已成功转入大肠杆菌 Rosetta(DE3) 细胞中。 0072 2.2、 诱导表达融合蛋白 0073 取阳性单克隆菌株接种于 20ml 的 LB 培养液 ( 含氨苄青霉素， 其终浓度为 50 100ug/ml ； 含氯霉素， 其终浓度为 34ug/ml) 中， 37、 250r/min 摇床过夜培养 14 16h。按 1接种菌液于新的 LB。
27、 液体培养基进行表达 ： 即吸取 200ul 菌液， 接种于 20ml 新的 LB 培养 液 ( 含氨苄青霉素， 其终浓度为 50 100ug/ml ； 含氯霉素， 其终浓度为 34ug/ml) 中， 37、 250r/min 摇床培养约 2h， 至 OD600 0.4 0.6 时， 每个样品吸取 1.0ml 于 4保存， 作为初 始样品对照 ； 然后加入IPTG进行诱导表达。 加入IPTG使其终浓度达0.4mg/ml， 然后将培养 液置于 16、 250r/min 摇床培养， 分别于 16-18h 收取菌液于 50ml 离心管中。4， 8000xg， 离心 10min， 弃上清， 加入 1.。
28、0ml 预冷 (4 ) 的 PBS 完全重悬沉淀， 洗涤菌体 ； 4， 8000xg， 离心 10min， 弃上清， 收集菌体细胞， 称湿重 ； 按 1g 5ml 的比例加入纯水重悬沉淀， -80， 冻15min ； 100， 煮5min反复冻煮23次后加入5Loading Buffer， 最大转速离心3min 后， 取上清进行 SDS-PAGE 检测， 蛋白质电泳结果表明含有牛乳铁蛋白肽的融合蛋白在大肠 杆菌 Rosetta(DE3) 中大量表达， 其表达量约占菌体蛋白总量的 35。 0074 3、 蛋白质的分离与纯化 0075 3.1、 融合蛋白的分离 0076 待菌体 37诱导培养 3 。
29、小时后， 4， 8000g 离心收集菌体。用生理盐水洗涤菌 体后， 4， 8000g 离心收集菌体， 称菌体湿重。然后按菌体湿重 1g 10ml 的比例加入裂 解液重悬菌体。超声波破碎细胞， 用 DNase I 和 RNase A 酶处理核酸后， 4， 10000g 离 说 明 书 CN 102993296 A 6 5/5 页 7 心， 收集上清液， 可溶性融合蛋白即存在于上清液中。 0077 3.2、 融合蛋白的浓缩 0078 用0时， 饱和度为65的硫酸铵浓缩上清中融合蛋白， 使其浓缩比为101。 然 后用 Bradford 法测定浓缩液中蛋白质浓度。 0079 3.3、 融合蛋白的纯化 。
30、0080 由于融合蛋白在 N 端含有 His-tag 标签蛋白， 所以第一步用 Ni2+-IMAC 亲和层 析法纯化融合蛋白。所用填料为 Bio-Rad 公司的 IMAC 聚丙烯酰胺介质， 层析柱规格为 1.5mm10cm， 在层析过程中所用填料为10ml， 其动态载量为4mg蛋白/ml填料， 层析最大流 速为 3ml/min。 0081 收集洗脱峰， 然后调节洗脱液的PH值至2.0， 按质量比为3的量在洗脱液中加入 胃蛋白酶 Pepsin 1 10000， 37孵育 1 小时， 使其充分切割标签蛋白还原天然乳铁蛋白 肽， 然后 72热处理 15min， 终止反应， ， 调节反应液 PH 至 7.0。 0082 由于乳铁蛋白肽属于小分子肽， 分子量为 3.1KDa， 而融合标签蛋白的分子量为 10KDa， 故两者分子量的差异采用凝胶过滤层析法分离切割后天然肽片段和融合标签， 收集 洗脱峰， 收集乳铁蛋白肽。 0083 3.4、 乳铁蛋白肽的保存 0084 将洗脱液经透析处理后进行冷冻干燥处理， 收集乳铁蛋白肽冻干粉末， 于 4长期 保存。 说 明 书 CN 102993296 A 7 1/1 页 8 0001 序 列 表 CN 102993296 A 8 。