老年大鼠脑血管内皮细胞原代培养方法.pdf

本发明涉及老年大鼠脑血管内皮细胞原代培养方法，步骤如下：（1）取出老年大鼠脑组织的灰质部分，制得样品组织；（2）置于胎牛血清的分离液的培养皿中经吹打分散和生物酶消化后，制得分散细胞；（3）离心，制得毛细血管；（4）将毛细血管重悬于分离液中，经消化后，制得毛细血管悬液；（5）离心后，沉淀重悬于分离液中，经Percoll浓度梯度离心，制得脑血管内皮细胞；（6）置于培养液中，经培养后，经消化传代或冻存即可。本发明采用低浓度胰酶或含1mM EDTA的PBS消化细胞，使细胞可传代3次而仍保持脑血管内皮细胞的特性；并且经冻存复苏后仍可保持脑血管内皮细胞的纯度和特性；因此，可节省大量的时间和金钱。

权利要求书一种老年大鼠脑血管内皮细胞原代培养方法，其特征在于，步骤如下：
（1）将20～22月龄的老年大鼠断头后，剥去大鼠头部皮肤，然后把大鼠头浸泡在0℃的含2%（体积百分数）胎牛血清的分离液中5～10分钟，取出，取出脑组织，取灰质部分，制得样品组织；
（2）把样品组织置于5ml冰冷的含8%（体积百分数）胎牛血清的分离液的培养皿中剪成样品组织小块，补加8%（体积百分数）胎牛血清的分离液至25ml，经吹打分散和生物酶消化后，制得分散细胞；
（3）向步骤（2）制得的分散细胞补加10ml8%（体积百分数）胎牛血清的分离液，混匀后第一次离心；移去上清，加20ml含20%（体积百分数）牛血清白蛋白的DMEM培养基，吹打混匀后，第二次离心，取最下层的沉淀，制得毛细血管；
（4）将步骤（3）制得的毛细血管重悬于1ml的分离液中，再加入7.9ml的分离液，经生物酶消化后，制得毛细血管悬液；
（5）将步骤（4）制得的毛细血管悬液，经第三次离心后，移去上清，沉淀重悬于2ml的分离液中，然后轻轻地把悬液置于Percoll浓度梯度离心液的顶部；在4℃，1000g离心10分钟，分为六层，取第三层悬浊液即为脑血管内皮细胞；
（6）将步骤（5）制得的脑血管内皮细胞溶于1ml的内皮细胞培养液中，于在10cm的培养板或6孔板中培养，正常条件下培养1天，然后用1×PBS缓冲液洗除去死亡的细胞，用含3～4μM/ml嘌呤霉素的内皮细胞培养液纯化2～3天后，更换为正常的脑血管内皮细胞培养液培养7～10天，用0.01%（重量百分数）胰酶或含1mM EDTA的PBS消化传代或冻存即可。
所述培养板或6孔板制备方法如下：先用1×Collagen IV铺板30分钟，然后再用1×Fibronectin铺板30分钟。
如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤（1）中分离液为在DMEM培养基的基础上，每百毫升加入如下组分：
1ml青霉素‑链霉素溶液；100μl硫骏庆大霉素。
如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤（1）中取出脑组织，取灰质部分按如下步骤操作：切开两个大脑半球，分别把两个脑半球在消毒的普通滤纸上滚动一周，然后去除脑干和白质部分，保留灰质部分。
如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤（2）中生物酶消化按如下步骤操作：
将吹打分散的样品组织小块加入2.5ml的胶原酶和250μl的DNA酶溶液，在36℃的水浴摇床中100rpm/min消化90分钟；然后吹打分散后，继续消化30分钟。
如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤（3）中的第一次离心为在4℃，600g离心8分钟；第二次离心为在4℃，1000g离心20分钟。
如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤（4）中的经生物酶消化按如下步骤操作：
1ml的胶原酶和100μl的DNA酶溶液，混匀后在37℃、100rpm/min的条件下水浴摇床中消化90分钟。
如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤（5）中离心液组分如下：
Percoll8ml+1×PBS 15.2ml+10×PBS(不含钙镁)0.8ml+FBS 0.8ml。
如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤（5）中的第三次离心为在4℃，600g离心5分钟。
如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤（6）中的内皮细胞培养液为在每百毫升DMEM培养基的基础上加入如下组分：
20ml血浆来源的血清，100μl青霉素‑链霉素溶液，1.0ml L‑谷氨酰胺，100μl硫骏庆大霉素，1.0ml肝素，150μl碱性纤维生子因子，1.0ml内皮细胞生长补充因子，300μl维生素C，100‑150μl血管内皮生长因子，100‑150μl胰岛素样生长因子‑1，100‑150μl内皮生子因子。

说明书老年大鼠脑血管内皮细胞原代培养方法
技术领域
本发明涉及老年大鼠脑血管内皮细胞原代培养方法，属于生物技术技术领域。
背景技术
现有的大鼠脑血管内皮细胞原代培养，取材来源均为新生鼠（<10天，35～50g），幼年鼠（<3weeks，80～100g）或2‑3月年轻成年鼠（200g～300g），而且培养的脑血管内皮细胞只能传代一次，不能冻存，利用大鼠脑血管内皮原代培养细胞作为实验材料导致消耗时间长和成本高的缺点，如：Bowman PD,Betz AL,Ar D,Wolinsky JS,Penney JB,Shivers RR,Goldstein GW.1981.Primary Culture of Capillary Endothelium From Rat Brain.IN VITRO.17(4),353‑362。
老年大鼠（19～22月，900g～1200g）脑血管内皮细胞培养成功的先例至今未见报道；现有的取材对象和培养技术不能满足体外建立老年血脑屏障模型，研究老年血脑屏障的生理特性，以及老年神经系统疾病与血脑屏障相关的退行性病变的要求。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种老年大鼠脑血管内皮细胞原代培养方法。
本发明技术方案如下：
一种老年大鼠脑血管内皮细胞原代培养方法，步骤如下：
（1）将20～22月龄的老年大鼠断头后，剥去大鼠头部皮肤，然后把大鼠头浸泡在0℃的含2%（体积百分数）胎牛血清（FBS）的分离液中5～10分钟，取出，取出脑组织，取灰质部分，制得样品组织；
（2）把样品组织置于5ml冰冷的含8%（体积百分数）FBS的分离液的培养皿中剪成样品组织小块，补加8%（体积百分数）FBS的分离液至25ml，经吹打分散和生物酶消化后，制得分散细胞；
（3）向步骤（2）制得的分散细胞补加10ml8%（体积百分数）FBS的分离液，混匀后第一次离心；移去上清，加20ml含20%（体积百分数）BSA（牛血清白蛋白，购自Sigma公司，商品号a3059）的DMEM培养基，吹打混匀后，第二次离心，取最下层的沉淀，制得毛细血管；
（4）将步骤（3）制得的毛细血管重悬于1ml的分离液中，再加入7.9ml的分离液，经生物酶消化后，制得毛细血管悬液；
（5）将步骤（4）制得的毛细血管悬液，经第三次离心后，移去上清，沉淀重悬于2ml的分离液中，然后轻轻地把悬液置于Percoll浓度梯度离心液的顶部；在4℃，1000g离心10分钟，分为六层，取第三层悬浊液即为脑血管内皮细胞；
（6）将步骤（5）制得的脑血管内皮细胞溶于1ml的内皮细胞培养液中，于在10cm的培养板或6孔板中培养，正常条件下培养1天，然后用1×PBS缓冲液洗除去死亡的细胞，用含3～4μM/ml嘌呤霉素的内皮细胞培养液纯化2～3天后，更换为正常的脑血管内皮细胞培养液培养7～10天，用0.01%（重量百分数）胰酶(Typsin)或含1mM EDTA的PBS消化传代或冻存即可。
所述培养板或6孔板制备方法如下：先用1×Collagen IV铺板30分钟，然后再用1×Fibronectin铺板30分钟。
根据本发明优选的，所述步骤（1）中分离液为在DMEM培养基的基础上，每百毫升加入如下组分：
1ml青霉素‑链霉素溶液；100μl硫骏庆大霉素。
根据本发明优选的，所述步骤（1）中取出脑组织，取灰质部分按如下步骤操作：切开两个大脑半球，分别把两个脑半球在消毒的普通滤纸上滚动一周，然后去除脑干和白质部分，保留灰质部分。
根据本发明优选的，所述步骤（2）中的样品组织小块体积为1‑2mm3。
根据本发明优选的，所述步骤（2）中生物酶消化按如下步骤操作：
将吹打分散的样品组织小块加入2.5ml的胶原酶和250μl的DNA酶溶液，在36℃的水浴摇床中100rpm/min消化90分钟；然后吹打分散后，继续消化30分钟。
根据本发明优选的，所述步骤（3）中的第一次离心为在4℃，600g离心8分钟；第二次离心为在4℃，1000g离心20分钟。
根据本发明优选的，所述步骤（4）中的经生物酶消化按如下步骤操作：
1ml的胶原酶和100μl的DNA酶溶液，混匀后在37℃、100rpm/min的条件下水浴摇床中消化90分钟。
根据本发明优选的，所述步骤（5）中用长的腰椎穿刺针取第三层液体。
根据本发明优选的，所述步骤（5）中离心液组分如下：
Percoll 8ml+1×PBS 15.2ml+10×PBS(不含钙镁)0.8ml+FBS 0.8ml。
根据本发明优选的，所述步骤（5）中的第三次离心为在4℃，600g离心5分钟。
根据本发明优选的，所述步骤（6）中的内皮细胞培养液为在每百毫升DMEM培养基的基础上加入如下组分：
20ml血浆来源的血清，100μl青霉素‑链霉素溶液，1.0ml L‑谷氨酰胺，100μl硫骏庆大霉素，1.0ml肝素，150μl碱性纤维生子因子，1.0ml内皮细胞生长补充因子，300μl维生素C，100‑150μl血管内皮生长因子，100‑150μl胰岛素样生长因子‑1，100‑150μl内皮生子因子。
上述试剂如无特殊说明，均为本领域常用市售产品。
有益效果
1、本发明采用Collagen Type IV和Fibronectin双铺板法，细胞生长状态比单铺板好，尤其是对老年大鼠脑血管内皮细胞的生长更为重要。
2、本发明采用加入了8%FBS的分离液，与传统的分离液DMEM或PBS不同，FBS的加入保护了脑血管内皮细胞，可使后期的培养，脑血管内皮细胞存活率增高。
3、本发明采用低浓度0.01%的胰酶（通常为0.25%胰酶）或含1mM EDTA的PBS消化细胞，用此方法细胞可传代3次而仍保持脑血管内皮细胞的特性。
4、本发明制得的老年大鼠脑血管内皮细胞，可至少冻存复苏一次，仍可保持脑血管内皮细胞的纯度和特性；因此，可大量培养一次，大批冻存，以节省大量的时间和金钱。
5、本发明可传代的老年大鼠脑血管内皮细胞原代培养方法的成功建立，不仅为实验研究节约了大量的时间和资金，而且还为体外模拟老年性血脑屏障模型，研究老年性神经系统疾病，特别是研究老年性脑中风血脑屏障破坏的分子机制提供了更真实，更方便的实验模型。
6、本发明所述内皮细胞培养液采用PDS（血浆来源的血清）代替了传统培养液中的FBS（胎牛血清）或小牛血清(BCS)或马血清(HS)，使脑血管内皮细胞纯度增加30%；主要原因是由于FDS中不含PDGF（血小板源性生长因子），而PDGF有利于混入脑血管内皮细胞中的平滑肌细胞，纤维细胞和胶质细胞的分裂和增殖；用PDS消除了这一影响。
7、本发明在内皮细胞培养液中加入了维生素C和嘌呤霉素，这使脑血管内皮细胞生长更快更纯。
8、本发明在内皮细胞培养液中还加入了血管内皮生长因子，胰岛素样生长因子‑1，内皮生子因子，这些因子可使脑血管内皮细胞生长得更快更健康，尤其是对老年大鼠脑血管内皮细胞的生长更为重要。
附图说明
图1、本发明制得的老年大鼠脑血管内皮细胞经原代培养传3代与传统方法制备的老年大鼠脑血管内皮细胞原代培养传3代的存活率的柱状比较图；
图2、本发明制得的老年大鼠脑血管内皮细胞经冻存复苏后与传统方法制备的老年大鼠脑血管内皮细胞经冻存复苏后的存活率的柱状比较图；
图3：本发明制得的老年大鼠脑血管内皮细胞与传统方法制备的老年大鼠脑血管内皮细胞细胞纯度的柱状比较图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。
原料来源：
19‑22月的老年大鼠购自北京维通利华实验动物技术中心；
配制老年大鼠脑血管内皮细胞培养基各种试剂的来源：
DMEM培养基，购自Gibico公司，商品号11995‑065；
血浆来源的血清（PDS，Plasma‑Derived Serum），购自Bioquote公司，商品号BT‑214‑10；
青霉素‑链霉素溶液，购自sigma公司，商品号p0718；
L‑谷氨酰胺，购自Sigma公司，商品号G7513；
硫骏庆大霉素，购自sigma公司，商品号G1397；
肝素，购自Sigma公司，商品号H3149；
碱性纤维生子因子（bFGF），购自Sigma公司，商品号F9786；
内皮细胞生长补充因子（ECGS），购自Sigma公司，商品号E2759；
维生素C，购自Sigma公司，商品号c1768；
血管内皮生长因子（VEGF），购自Lonza公司，商品号cc4176；
胰岛素样生长因子‑1（IGF‑1）购自Lonza公司，商品号cc4176；
内皮生子因子（EGF）购自Lonza公司，商品号cc4176；
嘌呤霉素（Puromycin），购自Sigma公司，商品号p8833。
各种酶及其他相关试剂的来源：
胎牛血清(FBS)购自Invitrogen公司，商品号10437‑028；
胶原酶（Collagenase）购自Invitrogen公司，商品号17101；
DNA酶（DNase）购自Sigma‑Aldrich公司，商品号D4263；
胰酶（Typsin）购自Sigma‑Aldrich公司，商品号T3053；
牛血清白蛋白（BSA）购自Sigma‑Aldrich公司，商品号a3059；
胶原IV（Collagen IV）购自Sigma‑Aldrich公司，商品号C5533：
纤连蛋白（Fibronectin）购自Sigma‑Aldrich公司，商品号F1141；
Percoll购自Sigma‑Aldrich公司，商品号4937；
腰椎穿刺针(Lumbar puncture needle)购自BD公司，商品号405182。
实施例1
一种老年大鼠脑血管内皮细胞原代培养方法，步骤如下：
（1）将20月龄的老年大鼠断头后，剥去大鼠头部皮肤，然后把大鼠头浸泡在0℃的含2%（体积百分数）胎牛血清（FBS）分离液中5分钟，取出，切开两个大脑半球，分别把两个脑半球在消毒的普通滤纸上滚动一周，然后去除脑干和白质部分，保留灰质部分，制得样品组织；
分离液为在DMEM培养基的基础上，每百毫升加入如下组分：1ml青霉素‑链霉素溶液；100μl硫骏庆大霉素；
（2）把样品组织置于5ml冰冷的含8%（体积百分数）FBS分离液的培养皿中剪成1～2mm3的样品组织小块，补加8%（体积百分数）FBS分离液至25ml，经吹打分散，然后将吹打分散的样品组织小块加入2.5ml的胶原酶和250μl的DNA酶溶液，在36℃的水浴摇床中100rpm/min消化90分钟；然后吹打分散后，继续消化30分钟，制得分散细胞；
（3）向步骤（2）制得的分散细胞补加10ml 8%（体积百分数）FBS的分离液，混匀后在4℃，600g离心8分钟；移去上清，加20ml含20%（体积百分数）BSA的DMEM培养基，吹打混匀后，4℃，1000g离心20分钟；取最下层的沉淀，制得毛细血管；
（4）将步骤（3）制得的毛细血管重悬于1ml的分离液中，再加入7.9ml的分离液，1ml的胶原酶和100μl的DNA酶溶液，混匀后在37℃水浴摇床中（100rpm/min）消化90分钟，制得毛细血管悬液；
（5）将步骤（4）制得的毛细血管悬液在4℃，600g离心5分钟；移去上清，沉淀重悬于2ml的分离液中，然后轻轻地把悬液置于Percoll浓度梯度离心液的顶部；4℃，1000g离心10分钟，分为六层（第一层：透明的分离液；第二层：透明的Percoll但在靠分离液处有些浮渣；第三层：消化好的脑血管内皮细胞层；第四层：透明的Percoll；第五层：红细胞层；第六层：Percoll晶体），用长的腰椎穿刺针取第三层悬浊液，第三层悬浊液体即为脑血管内皮细胞；
（6）将步骤（5）制得的脑血管内皮细胞溶于1ml的内皮细胞培养液中，然后转移到10cm的培养板或6孔板中，正常条件下培养1天，然后用1×PBS缓冲液洗两次除去死亡的细胞，用含3μM/ml嘌呤霉素的内皮细胞培养液纯化2天后，更换为正常的脑血管内皮细胞培养液培养7天，用0.01%胰酶(Typsin)消化传代或冻存即可；
所述内皮细胞培养液为在每百毫升DMEM培养基的基础上加入如下组分：
20ml血浆来源的血清，100μl青霉素‑链霉素溶液，1.0ml L‑谷氨酰胺，100μl硫骏庆大霉素，1.0ml肝素，150μl碱性纤维生子因子，1.0ml内皮细胞生长补充因子，300μl维生素C，100μl血管内皮生长因子，100μl胰岛素样生长因子‑1，100μl内皮生子因子；
所述培养板或6孔板制备方法如下：先用1×Collagen IV铺板30分钟，然后再用1×Fibronectin铺板30分钟。
实施例2
一种老年大鼠脑血管内皮细胞原代培养方法，步骤如下：
（1）将22月龄的老年大鼠断头后，剥去大鼠头部皮肤，然后把大鼠头浸泡在0℃的含2%（体积百分数）胎牛血清（FBS）分离液中10分钟，取出，切开两个大脑半球，分别把两个脑半球在消毒的普通滤纸上滚动一周，然后去除脑干和白质部分，保留灰质部分，制得样品组织；
分离液为在DMEM培养基的基础上，每百毫升加入如下组分：1ml青霉素‑链霉素溶液；100μl硫骏庆大霉素；
（2）把样品组织置于5ml冰冷的含8%（体积百分数）FBS分离液的培养皿中剪成1～2mm3的样品组织小块，补加8%（体积百分数）FBS分离液至25ml，经吹打分散，然后将吹打分散的样品组织小块加入2.5ml的胶原酶和250μl的DNA酶溶液，在36℃的水浴摇床中100rpm/min消化90分钟；然后吹打分散后，继续消化30分钟，制得分散细胞；
（3）向步骤（2）制得的分散细胞补加10ml 8%（体积百分数）FBS的分离液，混匀后在4℃，600g离心8分钟；移去上清，加20ml含20%（体积百分数）BSA的DMEM培养基，吹打混匀后，4℃，1000g离心20分钟；取最下层的沉淀，制得毛细血管细胞；
（4）将步骤（3）制得的毛细血管细胞重悬于1ml的分离液中，再加入7.9ml的分离液，1ml的胶原酶和100μl的DNA酶溶液，混匀后在37℃水浴摇床中（100rpm/min）消化90分钟，制得毛细血管悬液；
（5）将步骤（4）制得的毛细血管悬液在4℃，600g离心5分钟；移去上清，沉淀重悬于2ml的分离液中，然后轻轻地把悬液置于Percoll浓度梯度离心液的顶部；4℃，1000g离心10分钟，分为六层（第一层：透明的分离液；第二层：透明的Percoll但在靠分离液处有些浮渣；第三层：消化好的脑血管内皮细胞层；第四层：透明的Percoll；第五层：红细胞层；第六层：Percoll晶体），用长的腰椎穿刺针取第三层液体，第三层液体即为脑血管内皮细胞；
（6）将步骤（5）制得的脑血管内皮细胞溶于1ml的内皮细胞培养液中，然后转移到10cm的培养板或6孔板中，正常条件下培养1天，然后用1×PBS缓冲液洗两次除去死亡的细胞，用含4μM/ml嘌呤霉素的内皮细胞培养液纯化3天后，更换为正常的脑血管内皮细胞培养液培养7～10天，用0.01%胰酶(Typsin)消化传代或冻存即可；
所述内皮细胞培养液为在每百毫升DMEM培养基的基础上加入如下组分：
20ml血浆来源的血清，100μl青霉素‑链霉素溶液，1.0ml L‑谷氨酰胺，100μl硫骏庆大霉素，1.0ml肝素，150μl碱性纤维生子因子，1.0ml内皮细胞生长补充因子，300μl维生素C，150μl血管内皮生长因子，150μl胰岛素样生长因子‑1，150μl内皮生子因子；
所述培养板或6孔板制备方法如下：先用1×Collagen IV铺板30分钟，然后再用1×Fibronectin铺板30分钟。
对比例
按传统培养方法制备新生鼠，幼年鼠或年轻成年大鼠脑血管内皮细胞，具体步骤如下：
（1）取新生鼠(<10天,35～50g)，幼年鼠(<3weeks,80～100g)或2‑3月年轻成年鼠(200g～300g)的大脑，浸泡在DMEM分离液中。（100ml DMEM分离液：100ml DMEM+1ml青霉素‑链霉素溶液）；
（2）把大脑皮层取出，剪成组织小块，并用玻璃匀浆器进行匀浆。匀浆液在4℃，1000g离心10分钟；取沉淀，把沉淀重悬在含15%右旋糖苷的DMEM中(15%Dextran的DMEM，Dextran的分子量为146,000Da)，4000g离心10分钟；取最下层的沉淀，制得毛细血管；
（3）将步骤（2）制得的毛细血管重悬于含0.05%(重量体积比)分散酶(dispase)的DMEM消化液中，在每分钟100‑125转的摇床上，37℃消化4小时；然后800g，离心5分钟；
（4）将步骤（3）制得的沉淀重悬于含0.1%的胶原酶和0.01%DNA酶的DMEM溶液中，在每分钟100‑125转的摇床上，37℃消化16小时；消化液在700g离心5分钟。
（5）沉淀重悬于分离液中，然后轻轻地把悬液置于Percoll浓度梯度离心液的顶部；在4℃，550g离心10分钟，取第三层悬浊液即为脑血管内皮细胞；
（6）将步骤（5）制得的脑血管内皮细胞溶于内皮细胞培养液中，种植在10cm的培养板或6孔板中培养，正常条件下培养1天，然后用1×PBS缓冲液洗除去死亡的细胞，更换为正常的脑血管内皮细胞培养液培养7～10天，即可应用。
传统脑血管内皮细胞培养液组分如下：
44ml DMEM，44ml Ham’s‑F12，10ml FBS，1.0ml肝素钠，1.0ml内皮细胞生长补充因子。（该配方记载于Tunkel AR et al.Blood‑brain barrier alterations in bacterial meningitis:development of an in vitro model and observations on the effects of lipopolysaccharide.In Vitro Cell Dev Biol.199127A(2):113‑20）。
结果分析
实施例1所述老年大鼠脑血管内皮细胞原代培养方法与传统方法传3代存活率的比较（见图1）

实施例2所述老年大鼠脑血管内皮细胞原代培养方法与传统方法冻存/复苏后存活率的比较（见图2）
                  实施例2         对比例
原始代的存活率     100%
冻存/复苏存活率    (75.3±4.7)%    (24.4±5.9)%
实施例1所述老年大鼠脑血管内皮细胞原代培养方法与传统培养液及方法细胞纯度比较（见图3）
             实施例1        对比例
细胞纯度     (98 ±0.8)%    (70.6±3.2)%
由上述结果可知，本发明所述的老年大鼠脑血管内皮细胞原代培养方法无论在传3代存活率、冻存/复苏后存活率和细胞纯度均较现有技术有大幅提高。