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1、10申请公布号CN102047842A43申请公布日20110511CN102047842ACN102047842A21申请号200910073169922申请日20091110A01H4/0020060171申请人东北农业大学地址150030黑龙江省哈尔滨市香坊区木材街59号72发明人刘宏宇陈磊怀凤涛秦智伟周秀艳54发明名称一种采用西瓜子叶节直接再生植株的方法57摘要本发明公开了一种通过西瓜子叶节离体培养直接再生植株的方法，属于生物技术领域。包括以下步骤1采用西瓜品种傲龙早蜜龙的种子为材料培育无菌苗。2在生长点下34MM处切去下胚轴，纵向切开胚轴，刮除顶芽、然后切除2/3子叶，获得西瓜子叶节。
2、。3将子叶节种于不定芽诱导培养基MS5上，经过14D的培养，出现不定芽；继续培养2025D，即可获得0510CM不定芽。4将不定芽移入伸长培养基中继续培养2530D，不定芽可长到34CM。5将获得的不定芽移入生根培养基，获得再生植株。通过本发明的实施，可以直接获得完整的西瓜再生植株，为西瓜的基因工程提供的培养技术。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书4页CN102047843A1/2页21一种采用西瓜子叶节为外植体直接进行西瓜植株再生的方法，其特征在于，包括以下步骤1无菌苗的培育。挑选成熟饱满的西瓜种子，用1H2O2浸泡78H后，去除种皮，先75的。
3、酒精消毒60S，用无菌水冲洗23次，再用15NACLO消毒15MIN，无菌水冲洗45次，接到萌发培养基上，萌发培养基为08琼脂。接种后，置于282连续黑暗条件下培养3D，再置于培养温度为262，16HR、3000LUX光照条件下培养23D。2子叶节的获得。播种后56D，当无菌苗子叶由黄转呈浅绿色时，在生长点下34MM处切去下胚轴，纵向切开胚轴，刮除顶芽、然后切除2/3子叶，获得西瓜子叶节。3不定芽的诱导。将子叶节接种于不定芽诱导培养基MS5上，在温度为262，16HR、3000LUX光照条件下培养14D后可出现不定芽。不定芽出现后，再经过2025D的培养，即可获得0510CM不定芽。每2周更换。
4、一次培养基。所述的诱导培养基MS5是按照每升MS基本培养基加入30G蔗糖、8G琼脂、50MGAGNO3、10MG6BA和01MGIBA配制而成，并用01M的KOH溶液将PH调整为58。4不定芽的伸长将051CM不定芽移入伸长培养基中继续培养。经过2530D培养后，不定芽可长到34CM。每2周更换一次培养基。所述的伸长培养基是按照每升MS基本培养基加入30G蔗糖、8G琼脂、02MGKT配制而成，并用01M的KOH溶液将PH调整为58。5生根培养。将34CM的不定芽移入生根培养基中。培养1014D即可生根。所述的生根培养基是按照每升MS基本培养基加入30G蔗糖、8G琼脂和05MGNAA配制而成，并。
5、用01M的KOH溶液将PH调整为58。6再生植株的驯化。当再生植株根长至2CM左右时，揭去封口膜，进行驯化，2的后，用镊子将生根苗取出，移栽于灭菌的营养土中，并用透明的塑料薄膜覆盖保湿，放在培养室中。2根据权利要求1所述的西瓜子叶节直接再生植株的方法，其特征是所述无菌苗培育的步骤为挑选成熟饱满的西瓜种子，用1H2O2浸泡78HR后，去除种皮，先75的酒精消毒60，用无菌水冲洗23次，再用15NACLO消毒15MIN，无菌水冲洗45次，接到萌发培养基上，萌发培养基为08琼脂。接种后，置于282连续黑暗条件下培养3D，再置于培养温度为262，16HR、3000LUX光照培养23D。3根据权利要求1。
6、所述的西瓜子叶节直接再生植株的方法，其特征是所述子叶节获得的步骤为播种后56D，当无菌苗子叶由黄转呈浅绿色时，在生长点下34MM处切去下胚轴，纵向切开胚轴，刮除顶芽、然后切除2/3子叶，获得西瓜子叶节。4根据权利要求1所述的西瓜子叶节直接再生植株的方法，其特征是所述不定芽诱导权利要求书CN102047842ACN102047843A2/2页3的步骤为将子叶节接种于不定芽诱导培养基MS5上，在温度为262，16HR、3000LUX光照条件下培养，14D后可出现不定芽。不定芽出现后，再经过2025D的培养，即可获得0510CM不定芽。每2两周更换一次培养基。所述的诱导培养基MS5是按照每升MS基本。
7、培养基加入30G蔗糖、8G琼脂、50MGAGNO3、10MG6BA和01MGIBA配制而成，并用01M的KOH溶液将PH调整为58。权利要求书CN102047842ACN102047843A1/4页4一种采用西瓜子叶节直接再生植株的方法技术领域0001本发明属于生物技术领域。是一种以西瓜子叶节为外植体直接进行西瓜植株再生的方法。技术背景0002西瓜CITRULLUSLANATUS是一种重要的蔬菜作物，其果实汁多味甜，富含番茄素和维生素。据联合国粮农组织FAO2002年统计，西瓜在世界10大果品中居第5位。在春节早熟栽培时，西瓜容易遭受冷害、病害等各种不利因素的影响，导致其产量和品质的降低。随着。
8、人民生活水平的提高，人们对西瓜种类和品质的要求越来越高，希望一年四季不断有高品质、不同品种的西瓜产品上市。通过离体培养、遗传转化和体细胞无性系突变体筛选获得多抗、高品质的西瓜品种已成为重要的育种手段之一。西瓜离体培养已经有几十年的历史，并且从茎尖培养、不定芽诱导和体细胞胚胎发生等各种途径对西瓜离体培养进行了研究。0003国内外研究人员以西瓜的茎尖、幼胚、子叶和胚轴等多种类型的外植体，采用不同浓度的植物生长调节物质的配比，建立了西瓜的器官发生再生系统。不同的外植体再生频率差异较大，其中以子叶的再生频率较高，是进行西瓜植株再生培养最有效的途径和方法。目前，已有很多关于西瓜子叶再生植株的报道，但以西。
9、瓜子叶节为外植体直接诱导不定芽进行西瓜植株再生的方法还未见报道。同时，在组织培养过程中，对种子消毒、器官发生过程中各种培养基的应用还比较混乱，对植株再生频率也产生了很大的影响。无菌苗的获得离不开有效的种子消毒方法，常用的消毒剂有次氯酸钠、过氧化氢和升汞等，在西瓜组织培养中以应用升汞和次氯酸钠居多。在组织培养过程中，尤其重要的是培养基的选择及其激素的添加，这对外植体不定芽的诱导、伸长和生根都有重要的影响，是决定外植体器官发生和植株再生的关键环节。因此，要建立简便、高效的西瓜子叶节直接再生系统，必须在相应培养基中添加必要的生长激素，并确定合理添加浓度。0004为此，我们针对上述问题，提供一种利用西。
10、瓜子叶节直接再生植株的方法，使其建立一个简便、高效的繁殖体系，阵低成本，达到获得优良种苗的目的，也为西瓜转基因研究提供一种新技术手段。0005参考文献00061京欣一号西瓜子叶组织培养的研究王春霞，简志英，刘愚，邹琦园艺学报1996，23440140300072西瓜组织培养的研究与应用任春梅，董延瑜长江蔬菜，2001，12303200083西瓜高频再生系统的研究张志忠，吴著华，吕柳新中国农学通报，2004，20215115300094西瓜子叶组织培养及植株再生的研究常尚连，张立宾，于德花，徐化凌湖北农业科学2009，483533535说明书CN102047842ACN102047843A2/4。
11、页5发明内容0010针对现有技术中存在的不足之处，本发明提供了一种西瓜子叶节直接再生植株的方法。本发明是通过以下技术方案实现的，包括以下步骤00111无菌苗的培育。0012挑选成熟饱满的西瓜品种傲龙早蜜龙的种子，用1H2O2浸泡78HR后，去除种皮，在超净工作台上，先75的酒精消毒60S，用无菌水冲洗23次，再用15NACLO消毒15MIN，无菌水冲洗45次，接到萌发培养基上，萌发培养基为08琼脂。接种后，置于282连续黑暗条件下，培养3D，再置于培养温度为262，16HR、3000LUX光照条件下培养23D。00132子叶节的获得。0014播种后56D，当无菌苗子叶由黄转呈浅绿色时，在生长点。
12、下34MM处切去下胚轴，然后纵向切开胚轴，刮除顶芽、再切除2/3子叶，获得西瓜子叶节。00153不定芽的诱导。0016诱导培养基MS5是按照每升MS基本培养基加入30G蔗糖、8G琼脂、50MGAGNO3、10MG6BA和01MGIBA配制而成，并用01M的KOH溶液将PH调整为58。0017将子叶节子叶的近轴面朝上接种于不定芽诱导培养基MS5上，在温度为262，16HR、3000LUX光照条件下培养，14D后出现不定芽。不定芽出现后，再经过2025D的培养，即可获得0510CM不定芽。每2周更换一次培养基。00184不定芽的伸长0019伸长培养基是按照每升MS基本培养基加入30G蔗糖、8G琼脂。
13、、02MGKT配制而成，并用01M的KOH溶液将PH调整为58。0020将051CM不定芽移入伸长培养基中继续培养。经过2530D培养后，不定芽可长到34CM。每2周更换一次培养基。00215生根培养。0022将34CM的不定芽移入生根培养基中。培养1014D即可生根。0023生根培养基是按照每升MS基本培养基加入30G蔗糖、8G琼脂和05MGNAA配制而成，并用01M的KOH溶液将PH调整为58。00246再生植株的驯化。0025当再生植株根长至2CM左右时，揭去封口膜，使无菌苗适应有菌的外界环境，23D后向培养瓶中注入清水，用镊子将生根苗取出，流动水冲洗净根部培养基，移栽于灭菌的营养土中，。
14、并用透明的塑料薄膜覆盖保湿，放在培养室中。2周左右揭去薄膜并进行炼苗，4周后即可与实生苗长势相同。西瓜再生苗在东北农业大学园艺试验站进行种植，结果表明西瓜再生苗与实生苗长势相同。0026本发明在研究过程中，具体考虑了以下几种因素在本发明中所起的作用00271种子处理对西瓜无菌苗的影响0028无菌萌发是植物组织培养中最基础的一环，对发芽率和以后不定芽的分化有着直接的影响。用1H2O2浸泡西瓜种子78H，能明显提高发芽率，而且无菌苗整齐度高，长势好，有利于再生出不定芽见表1。0029表1不同处理方式对西瓜种子萌发的影响说明书CN102047842ACN102047843A3/4页600300031。
15、2不同激素配比对不定芽的诱导和植株再生的影响0032在每升MS基本培养基中加入30G蔗糖、8G琼脂和50MGAGNO3的基础上，添加不同配比的激素，并调节PH到58，制成相应的不定芽诱导培养基。具体见表2。0033表2不同芽诱导培养基的激素配比及诱导效率00340035将西瓜品种傲龙早蜜龙的子叶节接种于不同激素配比的不定芽诱导培养基上，在培养温度为262，16HR、3000LUX光照条件下，诱导不定芽。0036结果表明采用MS5培养基每升MS基本培养基中加入30G蔗糖、8G琼脂及50MGAGNO3基础上，再添加10MG6BA和01MGIBA诱导西瓜不定芽的效果最好，不仅诱导效率高，而且质量好，。
16、因次，确定MS5培养基为不定芽诱导的最适培养基。具体实施方式0037结合本发明的内容提供以下实施例，具体实施如下00381无菌苗的培育。0039挑选成熟饱满的西瓜品种傲龙早蜜龙的种子，用1H2O2浸泡78HR后，去除种皮，在超净工作台上，先75的酒精消毒60S，用无菌水冲洗23次，再用15NACLO消毒15MIN，无菌水冲洗45次，接到萌发培养基上，萌发培养基为08琼脂。接种后，置于282连续黑暗条件下，培养3D，再置于培养温度为262，16HR、3000LUX光照条件下培养23D。00402子叶节的获得。0041播种后56D，当无菌苗子叶由黄转呈浅绿色时，在生长点下34MM处切去下胚轴，然后。
17、纵向切开胚轴，刮除顶芽、再切除2/3子叶，获得西瓜子叶节。00423不定芽的诱导。0043按每升MS基本培养基中加入30G蔗糖、8G琼脂、50MGAGNO3、10MG6BA和01MGIBA配制成不定芽诱导培养基，并用01M的KOH溶液将PH调整为58。0044将子叶节子叶的近轴面朝上接种于不定芽诱导培养基上，在温度为262，说明书CN102047842ACN102047843A4/4页716HR、3000LUX光照条件下培养，14D后出现不定芽。不定芽出现后，再经过2025D的培养，即可获得0510CM不定芽。每2周更换一次培养基。00454不定芽的伸长0046将051CM不定芽移入伸长培养基。
18、按照每升MS基本培养基加入30G蔗糖、8G琼脂、02MGKT配制而成，并用01M的KOH溶液将PH调整为58。中继续培养。经过2530D培养后，不定芽可长到34CM。每2周更换一次培养基。00475生根培养。0048将34CM的不定芽移入生根培养基按照每升MS基本培养基加入30G蔗糖、8G琼脂和05MGNAA配制而成，并用01M的KOH溶液将PH调整为58中。培养1014D即可生根。00496再生植株的驯化。0050当再生植株根长至2CM左右时，揭去封口膜，使无菌苗适应有菌的外界环境，23D后向培养瓶中注入清水，用镊子将生根苗取出，流动水冲洗净根部培养基，移栽于灭菌的营养土中，并用透明的塑料薄膜覆盖保湿，放在培养室中。2周左右揭去薄膜并进行炼苗，4周后即可与实生苗长势相同。西瓜再生苗在东北农业大学园艺试验站进行种植，结果表明西瓜再生苗与实生苗长势相同。说明书CN102047842A。