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1、(10)申请公布号 CN 102994472 A (43)申请公布日 2013.03.27 CN 102994472 A *CN102994472A* (21)申请号 201210543900.1 (22)申请日 2012.12.17 C12N 9/20(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (71)申请人 福建农林大学 地址 350002 福建省福州市仓山区建新镇金 山学区 (72)发明人 邱君志 林瑞珠 苏礼超 涂洁 宋飞飞 邱云锋 李小霞 郭庆丰 何肖云 毛丽慧 (74)专利代理机构 福州元创专利商标代理有限 公司 35100 代理人 蔡学俊 (54) 发明名称 一种。
2、绿僵菌发酵生产脂肪酶的培养基及方法 (57) 摘要 本发明涉及真菌的发酵培养基及工艺。更 具体地， 本发明涉及一种绿僵菌发酵生产脂 肪酶的培养基及方法。所述培养基的原料配 方 为 ： 橄 榄 油 0.25-2w%， 蛋 白 胨 0.05-0.4w%， ZnCl20.0125-0.1mol/L， 叶酸 0.005-0.04w%， pH5.0-6.5， 其余为水。该方法通过将发酵种子液 接种于培养基， 100mL 的三角瓶装液量为 50mL， 接 种量10%， 于25， 转速 150r/min下培养。 本发明 的发酵方法有发酵周期短 ； 条件温和， 易于控制 ； 提供的用于绿僵菌发酵生产脂肪酶的培。
3、养基， 具 有脂肪酶产率高， 脂肪酶活力高等优点。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 7 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 7 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 一种绿僵菌发酵生产脂肪酶的培养基， 其特征在于， 所述培养基的原料配方为 ： 橄 榄油 0.25-2 w%， 蛋白胨 0.05-0.4 w%， ZnCl2 0.0125-0.1 mol L， 叶酸 0.005-0.04 w%， pH5.0-6.5， 其余为水。 2. 一种绿僵菌发酵产脂肪酶的方法， 其特征在于， 所述方法包含以下步骤 ： （。
4、a） 将绿僵菌接种种子培养基， 制得发酵种子液 ； （b） 将步骤 （a） 中制得的发酵种子液接种于权利要求 1 所述的培养基， 250mL 的三角瓶 装液量为 50mL， 接种量 10%， 于 25， 转速 150 r/min 下培养。 3. 如权利 2 所述绿僵菌发酵产脂肪酶的方法， 其特征在于， 所述种子培养基的原料配 方为 ： 按重量分数计， 马铃薯 20%， 蔗糖 2%， 余量为水。 权 利 要 求 书 CN 102994472 A 2 1/7 页 3 一种绿僵菌发酵生产脂肪酶的培养基及方法 技术领域 0001 本发明涉及真菌的发酵培养基及工艺。更具体地， 本发明涉及一种绿僵菌 (M。
5、etarhizium anisopliae) 发酵生产脂肪酶的培养基及方法。 背景技术 0002 脂肪酶 (Lipase， E.C.3.1.1.3， 甘油三酯水解酶 )， 可在油水界面催化甘油三酯形 成甘油二酯、 甘油单酯或甘油及游离脂肪酸脂肪酶是一类分解和合成脂肪的酶。脂肪酶不 仅可以催化酯水解反应还可以催化酯合成反应和转酯反应。 微生物脂肪酶比动物脂肪酶酶 解作用的 pH 和温度范围更宽， 便于工业化生产获得高纯度酶制剂 I21。脂酶在微生物界分 布很广， 据不完全统计， 目前已有 65 个属的微生物能够产生脂肪酶 。随着对微生物脂肪酶 研究的深入， 已发现多种具有不同的酶学性质和底物特异。
6、性的微生物脂肪酶， 其在水解、 酯 化、 转酯及酯类手性合成等反应中都表现出较好的应用前景。 0003 就微生物脂肪酶而言， 由于脂肪酶的结构及性质的多样性、 酶的来源不足等问题， 脂肪酶的研究进展及工业应用与蛋白酶、 淀粉酶相比要慢得多， 窄得多。 发明内容 0004 本发明的目的在于提供一种绿僵菌发酵生产脂肪酶的培养基及方法， 该培养基发 酵生产的脂肪酶活力高， 发酵方法的条件温和， 易于控制， 有利于工业化生产。 0005 本发明首先提供了一种绿僵菌发酵生产脂肪酶的培养基， 所述培养基的原料含有 橄榄油 50.0 g L， K2 HPO4 1.0 g L， CaCl2 0.1 g L， 。
7、NaCl 0.5 g L， Mg2SO47H2O 0.1 g L， (NH4)2SO4 1.0 g L， 葡萄糖 10.0 g L。 0006 其次， 本发明还提供了一种绿僵菌发酵产脂肪酶的方法， 所述方法包含以下步 骤 ： （a） 将绿僵菌接种种子培养基， 制得发酵种子液 ； （b） 将步骤 （a） 中制得的发酵种子液按接种于权利要求 1 或 2 所述的培养基， 100mL 的 三角瓶装液量为 50mL， 接种量 10%， 于 25， 转速 150 r/min 下培养。 0007 所述种子培养基的原料含有 ： 按培养基重量计， 马铃薯 20%， 蔗糖 2%， 。 0008 本发明采用的绿僵菌。
8、为绿僵菌 MaYTTR-04( 何学友等， 金龟子绿僵菌 MaYTTR-04 菌株 对松墨天牛成虫的致病力， 昆虫学报 , 2008 年 1 月 )。 0009 采用本发明优化后的培养基， 发酵周期 72h， 发酵产生结果绿僵菌 MaYTTR-04 产脂 肪酶为 30U/mL 以上。 0010 本发明的发酵方法有发酵周期短 ； 条件温和， 易于控制 ； 提供的用于绿僵菌发酵 生产脂肪酶的培养基， 具有脂肪酶活力高 （30U/mL） 等优点。 附图说明 说 明 书 CN 102994472 A 3 2/7 页 4 0011 图 1 为对硝基苯酚标准曲线。 具体实施方式 0012 本发明用下列实施。
9、例来进一步说明本发明， 但本发明的保护范围并不限于下列实 施例。 0013 实施例 1 单因素实验确定培养基最优成分 （1） 种子培养基配制 ： 马铃薯 200.0 g L， 蔗糖 20.0 g L， 其余为水， 分装于 250mL 的三角瓶， 每个三角瓶含 100mL。0.1MPa， 灭菌 20min。使用前可加入抗生素对培养基杀菌 预处理。 0014 （2） 发酵种子的制作 ： 将绿僵菌 MaYTTR-04 接种于马铃薯琼脂培养基上， 于 25 下培养 7d， 待其产孢子， 即活化 ； 将活化后的菌株用接种针将孢子粉接种至种子培养基， 25， 转速 150 r/min 下培养 48h， 即。
10、为发酵液。 0015 （3） 酶液的制备 ： 取步骤 （2） 下的发酵液在 4下， 5000 r/min 离心， 5min， 得上清 液即为粗酶液待用。按酶活性测定在波长 410nm 处的吸光值。换算成酶活单位 U/mL。 0016 （4） 脂肪酶酶活测定 ： 在 pH 8.0、 50 条件下， 每 min 水解 p-NPP 释放 1 mol 对 硝基苯酚 （p-nitrophenol） 所需的酶量为 1 个脂肪酶活力单位 （U） 。 0017 方法 ： 溶液 A ： 150 mg p-NPP 溶于 50 mL 异丙醇 ； 溶液 B ： 500 mL pH 8.0 的 Tris-HCl 缓冲液。
11、中加入 2.22 g Triton X-100 和 0.56 g 阿拉伯胶。 0018 取 2 个试管 （分别是对照管和样品管） ， 各加溶液 B 2.85 mL 和底物溶液 A 0.1 mL （缓慢混合， 该溶液至少可稳定 2 h） 。50 水浴中预热 5 min， 然后在对照管中加入已灭活 的酶液 0.05 mL， 样品管中加入酶液 0.05 mL， 立即混匀计时。在水浴中准确反应 10 min 时 马上测定 410 nm 下酶水解产生的 p-nitrophenol 的吸光度值 （OD410值） 。酶活计算公式 ： A （A1 A0K C0） V1N （V2t） A样品酶活 （u/mL） 。
12、A1样品的吸光度值 （OD410值） A0对照的吸光度值 （OD410 值校准为 0） Kp-nitrophenol 标准曲线的斜率， C0p-nitrophenol 标准曲线的截距 N稀释倍数 V1反应液的体积 （3 mL） V2酶液的体积 （0.05 mL） t反应时间 （10 min） 。 0019 （5） 标准曲线的制作 ：（底物缓冲液指 pH7.5 磷酸缓冲液， A+B） 在波长 410 nm 处测定吸光值。以 OD410值为横坐标， p-nitrophenol 含量为纵坐标绘制 说 明 书 CN 102994472 A 4 3/7 页 5 标准曲线。经统计处理得到的线性回归方程， 。
13、y=45.592x， R2=0.9940， 结果见图 1。 0020 （6） 不同碳源、 氮源、 金属离子、 维生素对产脂肪酶的影响 （a） 碳源对酶产量的影响， 在含有橄榄油 50.0 g L， K2 HPO4 1.0 g L， CaCl2 0.1 g L， NaCl 0.5 g L， Mg2SO47H2O 0.1 g L， (NH4)2SO4 1.0 g L， 的培养基中分别添 加 10.0 g L 葡萄糖、 麦芽糖、 果糖、 甘露醇、 - 乳糖、 D- 半乳糖、 橄榄油、 可溶性淀粉， 以 不加任何碳源为对照。0.1MPa， 灭菌 20min（下同） ， 接入相同的绿僵菌菌液， 在 25。
14、、 150r/ min 的摇床中培养 72h 检测酶活性， 结果见表 1。 0021 （b） 氮源对酶产量的影响， 在含有橄榄油 50.0 g L， K2 HPO4 1.0 g L， CaCl2 0.1 g L， NaCl 0.5 g L， Mg2SO47H2O 0.1 g L， ， 葡萄糖 10.0 g L 的培养基中分 别添加 1.0 g L 的酵母粉、 蛋白胨、 甘氨酸、（NH4） 2HPO4、 (NH4)2SO4、 NH4NO3、 尿素、 胰蛋白 胨， 以不加任何氮源为对照。灭菌， 接入相同的绿僵菌菌液， 在 25、 150r/min 的摇床中培 养 72h 检测酶活性， 结果见表 2。
15、。 0022 （c） 金属离子对产酶的影响， 在含有橄榄油 50.0 g L、 (NH4)2SO4 1.0 g L， 葡 萄糖 10.0 g L 的培养基分别添加 0.02496mol/L（以 6（a） 中含有的金属离子按其浓度 换算得来） NaCl、 MgCl26H2O、 CaCl2、 MnCl24H2O、 KCl、 BaCl22H2O、 ZnCl2、 CuCl22H2O， 以 不加任何金属离子为对照。灭菌， 接入相同的绿僵菌菌液， 在 25、 150r/min 的摇床中培养 72h 检测酶活性， 结果见表 3。 0023 （d） 维生素对酶产量的影响， 在含有橄榄油 50.0 g L， K。
16、2 HPO4 1.0 g L， CaCl2 0.1 g L， NaCl 0.5 g L， Mg2SO47H2O 0.1 g L， (NH4)2SO4 1.0 g L， 葡萄糖 10.0 g L 的培养基中分别添加 0.01% 硫胺素 VB1、 核黄素 VB2、 吡哆醇类 VB6、 烟酸、 叶酸、 抗坏血 酸VC、 VB5、 复合VB， 以不加任何维生素为对照。 灭菌， 接入相同的绿僵菌菌液， 在25、 150r/ min 的摇床中培养 72h 检测酶活性， 结果见表 4。 0024 表 1 不同碳源对酶产量的影响 表 2 不同氮源对酶产量的影响 说 明 书 CN 102994472 A 5 4。
17、/7 页 6 表 3 不同金属离子对酶产量的影响 表 4 不同维生素对酶产量的影响 说 明 书 CN 102994472 A 6 5/7 页 7 从表中可以得出最佳的培养基成分为橄榄油， 蛋白胨， Zn2+， 叶酸， 接下来的正交实验将 以此作为发酵培养基成分。 0025 实施例 2 正交实验确定最优发酵条件 （1） 正交实验确定最佳培养基 从单因素实验确定的培养基的基础上， 改变各成分的溶度， 和 pH 值， 配置不同的培养 基， 方法同实施例1中步骤 （1） 、（2） 。 见表5， 将相同量的接种量 （10%） 菌种接种于装有50mL 培养液的 250mL 三角烧瓶中， 在 25， 转速 。
18、150 r/min 下培养培养 72h。然后按实施例 1 步 骤 （3） 、（4） 测定酶活。选取正交实验最优结果和其产酶量最高的实验组号， 进行验证实验。 为了避免累赘实施例中的培养基配法、 粗酶液的制作、 酶活测定方法均与实施例 1 的方法 相同。 0026 表 5 绿僵菌 MaYTTR-04 脂肪酶五因子四水平 （45） 正交实验设计 表 6 绿僵菌 MaYTTR-04 脂肪酶五因子四水平 （45） 正交实验设计实验结果 说 明 书 CN 102994472 A 7 6/7 页 8 注 : 1 为各因素水平 1 的所有酶活力之和， 2 为各因素水平 2 的所有酶活力之 和， 3 为各因素。
19、水平 3 的所有酶活力之和， 4 为各因素水平 4 的所有酶活力之和， R 为 极差， 酶活力的数字代表 3 次重复的平均值 (mean) 标准差 (S.D)。 0027 表 7 培养基优化验证试验 正交结果分析表明 ： 最佳因素组合是 A1B3C4D3E3， 即橄榄油 0.25g/100mL， 蛋白胨 0.2 g/100mL， Zn2+ 0.1mol/L， 叶酸 0.02 g/100mL， pH6.0( 即橄榄油 0.25%， 蛋白胨 0.2%， Zn2+ 0.1mol/L， 叶酸0.02%， pH6.0)， 且结果与验证试验相符合。 正交实验结果表明较好水平包括 橄榄油 0.25%， 蛋白。
20、胨 0.2%， Zn2+ 0.1mol/L， 叶酸 0.02%， pH6.0， 即 A1B3C4D3E3。表 6 变化因子 的极差值R分别为碳源(125.52)、 氮源(42)、 金属离子(95)、 维生素(56.76)和pH(32.43)， 表明碳源、 氮源、 金属离子、 维生素和 pH 的变化与绿僵菌 MaYTTR-04 产脂肪酶培养基相关， 尤其是碳源的变化对该菌产酶的影响更大。相对而言， pH 的改变对产酶的影响较小。 说 明 书 CN 102994472 A 8 7/7 页 9 0028 实施例 3 真菌产脂肪酶发酵方法 （1） 发酵种子的制备 （A） 菌种和培养基 菌种 ： 绿僵菌。
21、 MaYTTR-04 斜面培养基 ： PDA 培养基 液体种子培养基 ： PBA 培养基。 0029 （B） 种子液制备 将斜面上的纯种绿僵菌 MaYTTR-04 转接到装有 50mL 培养基的 250mL 三角瓶中， 然后在 25， 在往复式震荡摇床转速 150 r/min 下培养 3d， 待菌丝生长健壮， 菌液呈粘稠状时， 说 明种子已经生长好了。 0030 （2） 发酵培养 发酵培养基 ： 按照培养基优化正交实验， 即橄榄油 0.25%， 蛋白胨 0.2%， Zn2+ （ZnCl2） 0.1mol/L， 叶酸 0.02%， pH6.0 配制。 0031 将上一步骤中制备的绿僵菌 MaYTTR-04 发酵种子液， 接种量 10% 接种于 250mL 三 角瓶中， 瓶中装有 50mL 发酵培养液， 摇床温度 ： 25 1， 发酵周期 ： 72h， 发酵产生结果绿僵菌MaYTTR-04产脂肪酶为30U/mL以上， 该实施例表明本发明的摇瓶 实验工艺良好。 说 明 书 CN 102994472 A 9 1/1 页 10 图 1 说 明 书 附 图 CN 102994472 A 10 。