一种肺炎支原体抗原、制备方法以及免疫检测试剂盒.pdf

本发明提供了一种肺炎支原体(MP)抗原，该抗原的抗原片段为MP371或MP661。MP371位点位于MP黏附蛋白P1的N末端371-480aa；MP661位点位于MP黏附蛋白P1的N末端661-772aa。本发明还涉及含有上述任何一种抗原或抗原组合物的试剂盒及其在检测肺炎支原体抗体中的应用。本发明采用提供的肺炎支原体抗原是由密码子优化的基因克隆表达的重组抗原，较MP培养提取的抗原特异性强。本发明提供的试剂盒可以特异性的检测临床样本中的抗MP-IgM抗体，从而实现对肺炎支原体早期感染的鉴别诊断。

权利要求书一种肺炎支原体抗原，其特征在于：所述抗原片段为MP371或MP661，所述MP371抗原为MP黏附蛋白P1的N末端抗原，其位点位于371‑480aa；所述MP661抗原为MP黏附蛋白P1的N末端抗原，其位点位于661‑772aa。
根据权利要求1所述的肺炎支原体抗原，其特征在于：所述MP371抗原结构为SEQ ID NO：3所示，所述MP661抗原结构为SEQ ID NO：4所示。
权利要求1或2所述抗原的密码子优化基因，其特征在于：所述MP371抗原核苷酸序列如列表SEQ ID NO：9所示；所述MP661抗原核苷酸序列如列表SEQ ID NO：10所示。
权利要求1所述抗原或权利要求3所述密码子优化基因在制备检测肺炎支原体的药物中的应用。
权利要求1中所述MP371抗原与MP661抗原在制备检测肺炎支原体药物中的组合应用。
一种肺炎支原体抗原组合物，其特征在于：该组合物中含有权利要求1所述MP371抗原片段和MP661抗原片段。
根据权利要求6所述的组合物，其特征在于：所述MP371抗原C末端与所述MP661抗原N末端连接。
一种检测肺炎支原体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1中所述抗原或权利要求2中所述优化基因或权利要求6中所述组合物。
根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述检测是利用IgM抗体捕获法进行。
权利要求10所述的试剂盒在检测肺炎支原体IgM抗体中的应用。

说明书一种肺炎支原体抗原、制备方法以及免疫检测试剂盒
技术领域
本发明涉及肺炎支原体(MP)黏附蛋白1(P1)密码子优化基因、其抗原、其抗原组合物，还涉及含有该抗原或抗原组合物的试剂盒和应用。
背景技术
肺炎支原体(Mycoplasma pneumonia，MP)感染在临床上引起非典型肺炎和支气管炎，严重者可以导致呼吸道以外的并发症，如急性弥散性脑脊髓炎、血液系统、运动系统损害等，感染对象多为5岁以下的儿童。MP引发的肺炎与其他病原引发的肺炎症状相似，但MP没有细胞壁结构，临床用药主要采用以可渗入细胞内的大环内酯类抗生素，如罗红霉素、红霉素、阿奇霉素等，而对常规肺炎治疗采用的抗生素类药物，如青霉素、头孢等(主要是抑制病原体细胞壁合成类药物)，并不敏感。因此，MP的鉴别诊断对临床合理用药具有很好的指导意义。
目前MP的实验室检测主要有分离培养法、血清学检测、核酸检测。分离培养法是MP检测的金标准法，但由于MP生长缓慢，周期长，且阳性率低，无法作为临床常规检测手段。核酸检测主要针对患者咽拭子、痰液、肺泡灌洗液等样本，经洗涤、离心等处理后获得的模板进行PCR扩增检测，具有时间短、灵敏度特异性高等优点，但对操作人员要求高，且样品易污染，仪器设备昂贵，限制了其进一步应用。
目前临床主要采用日本研制的凝集试验，主要原理是利用明胶粒子和提取的MP抗原结合，对患者血清中MP特异抗体的进行检测。该方法简单实用，但无法区分IgM、IgG抗体。实事上，IgM抗体出现要早于IgG抗体，是MP急性感染的重要标记物。尽管目前存在针对IgM‑ELISA试剂盒，但由于缺少对MP抗原表位的深入研究，试剂盒灵敏度特异性差，难以达到临床检测的标准。
MP基因组为双链环状DNA，全长816394bp，编码上百种蛋白。黏附是MP致病和感染的先决条件，引发这一过程的是MP顶端的“黏附蛋白复合体”介导，其中黏附蛋白P1除了在MP感染和致病过程中发挥重要的作用外，还是重要的免疫原。刺激机体产生强烈的免疫应答、具有很好的免疫原和抗原性，是诊断抗原研究的重要靶点。P1蛋白由1627个氨基酸组成，相对分子量约为176.8kD。Chaudhry针对P1抗原表位的研究显示：位于C末端的1160‑1521aa具有较好的免疫反应性，能与72.7％(24/33)的阳性血清发生反应，与32份阴性血清的特异性为100％；而位于N末端的60‑180aa并没有抗原活性。针对P1蛋白C末端的抗原表位进行生物信息学预测，筛选并表达了1154‑1521aa区段抗原，灵敏度和特异性分别为55.6％(20/36)和100％(45/45)，但对P1蛋白N端及中间部位的抗原表位情况并不清楚。
不同于其他病原体，MP采用不同于独特的偏性密码子系统，通用的终止密码子UGA在MP中编码色氨酸，如果直接采用MP的野生基因能造成蛋白翻译的中断，限制了重组MP抗原的研制。目前重组MP抗原的克隆表达通常规避UGA，获得的多为不含色氨酸的片段抗原，缺少对抗原表位有效的预测和筛选，或是直接采用灭活的全菌体提取抗原，直接影响后期MP检测试剂的研制。
发明内容
为了获得具有诊断意义的重组MP抗原，本发明针对MP黏附蛋白P1的报道较少的90‑1099aa抗原区间进行生物信息学表位预测，获得其中可能与患者血清发生免疫反应的抗原片段的氨基酸序列。
为了克服野生MP基因密码子偏性的问题，本发明采用大肠杆菌优势密码子反向翻译上述抗原的氨基酸序列，获得由大肠杆菌优势密码子组成的全新MP抗原基因，其基因序列如序列表中序列1‑6所示，并采用退火延伸PCR技术获得改造后的MP基因。
采用基因重组技术对上述MP基因进行克隆表达，获得高表达的MP抗原，以此重组抗原为基础建立IgM捕获法MP‑ELISA检测试剂，并评价其MP检测中的诊断意义。
本发明的目的是提供肺炎支原体P1黏附蛋白90‑1099aa区间抗原表位的位置。本发明另一目的提供有大肠杆菌优势密码子组成的上述抗原表位基因本发明提供了在上述基因基础获得的MP重组抗原及其抗原组合物。本发明还提供了在上述抗原及其组合物基础上建立的肺炎支原体P1‑IgM抗体检测试剂盒，该试剂盒实现了在肺炎支原体感染早期进行准确检验的目的。
具体地，本发明提供一种肺炎支原体抗原，其特征在于：所述抗原片段为MP371或MP661，所述MP371抗原为MP黏附蛋白P1的N末端抗原，其位点位于371‑480aa；所述MP661抗原为MP黏附蛋白P1的N末端抗原，其位点位于661‑772aa。
进一步，所述MP371抗原结构为SEQID NO：3所示，所述MP661抗原结构为SEQ ID NO：4所示。
本发明提供一种肺炎支原体抗原的密码子优化基因，所述MP371抗原核苷酸序列如列表SEQ ID NO：9所示；所述MP661抗原核苷酸序列如列表SEQ IDNO：10所示。
本发明还提供了一种上述密码子优化基因在制备检测肺炎支原体的药物中的应用，以及所述MP371抗原与MP661抗原在制备检测肺炎支原体药物中的组合应用。
本发明还提供一种肺炎支原体抗原组合物，该组合物中含有上述MP371抗原片段和MP661抗原片段。
进一步，所述MP371抗原C末端与所述MP661抗原N末端连接。
本发明还提供一种检测肺炎支原体的试剂盒，所述试剂盒上述任一种优化基因或上述的组合物。
进一步，所述检测是利用IgM抗体捕获法进行。
本发明还提供一种上述试剂盒在检测肺炎支原体IgM抗体中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下特点：
1.发明是建立对肺炎支原体P1(90‑1099aa)区间抗原表位分析的基础上：P1是MP介导黏附和感染的重要蛋白，也是能引起机体免疫反应的重要抗原，但目前针对P1表位的研究多集中在其C末端，其他区域(90‑1099aa)的抗原表位分布情况并不清楚。本研究采用生物信息学对上述区间表位及其活性进行系统分析，并利用MP肝炎血清验证筛选抗原的活性，从而获其中具有诊断意义的新抗原表位。
2.发明是建立利用密码子优化技术获得的肺炎支原体重组抗原的基础上：目前肺炎支原体检测试剂共采用两类抗原，一类是从灭活的MP全菌体中提取的抗原，含有多种膜抗原成分，灵敏度高，但特异性差，且病原灭活过程中生物安全性差；另一类是通过常规基因工程技术获得肺炎支原体重组抗原，由于野生型的肺炎支原体采用的是偏性密码子，按此方法获得重组抗原均在色氨酸处中断，难以获得完整抗原，致使抗原灵敏度低；本发明利用密码子优化技术，获得不含有偏性密码子的MP优化基因，实现MP完整抗原的重组表达，克服目前常用抗原的缺陷。
3.本发明是在IgM捕获法基础上实现对EV71的临床诊断：目前报道的MP抗原由于受到提取方式、表达量及后续抗原标记过程的限制，均是采用MP抗原包被，抗IgM抗体标记辣根酶显色的间接ELISA检测技术，本研究将利用抗μ链单抗包被酶联板，以辣根酶标记重组VP1抗原，建立IgM捕获法MP‑ELISA检测技术，与间接ELISA技术相比，具有较高的特异性。
附图说明
图1为MP‑P1抗原表位的预测；
图2为MP‑P1主要抗原表位的基因的获得。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
为实现上述目的，本发明根据肺炎支原体P1氨基酸序列，采用生物信息学技术预测P1(90‑1099aa)区间抗原表位的位置及相应序列；采用大肠杆菌优势密码子反向翻译成核苷酸序列；采用退火延伸PCR技术，获得改造后的P1抗原表位基因，基因工程表达后，大量纯化制备重组P1表位抗原，并进行辣根酶标记，制备酶标二抗；采用IgM捕获法实现对EV71‑IgM的临床检测。
本发明是通过以下技术方案得以实现的：
利用生物信息学BIOSUN软件的表位预测功能，预测P1(90‑1099aa)区间主要抗原表位及相应的氨基酸序列(如序列表中1‑6)，并采用大肠杆菌优势密码子反向翻译成核苷酸序列(如序列表中的7‑12)。
为了获得上述基因，本发明对每种P1抗原表位基因设计4对引物，分4次进行退火延伸PCR；为了便于基因克隆到表达载体，在连接臂的两端引入BamHI和EcoRI两个酶切位点，以适合表达载体pGEX‑4T‑2。双酶切后插入载体pGEX‑4T‑2中，构建相应的表达质粒。测序法证明各基因片段已获正确地插入。
含有上述P1抗原表位基因的表达质粒转化E.coliBL21后，通过IPTG诱导，取全菌液进行SDS‑PAGE鉴定，证明该质粒均已获得了高效的表达，再经镍柱及凝胶过滤纯化，可获得电泳纯的P1抗原纯品。采用碘化钠法进行辣根酶标记，制备酶标抗原复合物。采用IgM捕获法对肺炎支原体患者血清中IgM进行检测，并评价其检测的灵敏度和特异性。
实验结果证明，本发明所提供的MP93，MP236，MP371，MP661，MP874，MP987在20份肺炎支原体病患者中检出率分别为15％、30％、65％、55％、80％、20％；50份健康人血清中特异性为100％、80％、100％、100％、30％、90％，其中本发明获得的MP371和MP661抗原具有MP特异性的免疫学活性，两者联合使用的灵敏度为80％，特异性位100％，在诊断试剂研究中具有一定的应用价值。
下面具体本发明涉及的四个方面。
1、MP‑P1抗原表位的预测
利用生物信息学BIOSUN软件的表位预测功能，预测P1(90‑1099aa)区间主要抗原表位分别位于93‑199aa、236‑346aa、371‑480aa、661‑772aa、874‑987aa、987‑1099aa，如图1所示，分别命名为MP93，MP236，MP371，MP661，MP874，MP987，相应的氨基酸序列见序列表中的1‑6。
2、MP‑P1主要抗原表位基因的密码子优化及获得
通过生物信息学软件，采用大肠杆菌优势密码子将上述6种抗原的氨基酸序列反向翻译成核苷酸序列，改造后的6种基因序列如序列表中序列7‑12所示。
考虑到目前国内基因引物合成的正确率，本发明将每种基因设计F1、R1、F2、R2、F3、R3、F4、R4共8条引物分别予以合成，每条引物末端具16个核苷酸的匹配序列，每段合成的引物序列如序列表中的13‑60所示。
为了方便描述所述制备方法，为相应基因序列命名，SEQ ID NO：13至20分别命名为MP93F4、MP93F3、MP93F2、MP93F1、MP93R1、MP93R2、MP93R3、MP93R4；SEQ ID NO：21至28分别命名为MP236F4、MP236F3、MP236F2、MP236F1、MP236R1、MP236R2、MP236R3、MP236R4；SEQ ID NO：29至36分别命名为MP371F4、MP371F3、MP371F2、MP371F1、MP371R1、MP371R2、MP371R3、MP371R4；SEQ ID NO：37至44分别命名为MP661F4、MP661F3、MP661F2、MP661F1、MP661R1、MP661R2、MP661R3、MP661R4；SEQ ID NO：45至52分别命名为MP874F4、MP874F3、MP874F2、MP874F1、MP874R1、MP874R2、MP874R3、MP874R4；SEQ ID NO：52至60分别命名为MP987F4、MP987F3、MP987F2、MP987F1、MP987R1、MP987R2、MP987R3、MP987R4。
所述方法如下：
合成上述基因共需要3轮退火延伸PCR反应，第一轮PCR反应体系为百泰克公司2×PCR反应液25μl、双蒸水23μl、XF1及XR1引物各1μl，期中X代表MP93、MP236、MP371、MP661、MP874、MP987，PCR反应条件为94℃1分钟后，94℃1分钟，55℃1分钟，72℃1分，5个循环；后续第n轮PCR反应体系为百泰克公司2×PCR反应液25μl、双蒸水22μl、XFn及XRn引物各1μl，n‑1轮PCR产物1μl，n代表2，3，4；反应条件为PCR反应条件为94℃3分钟后，94℃1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，30个循环后再72℃延伸5分钟，即获得MP93、MP236、MP371、MP661、MP874、MP987六种基因，如图2所示。
3、MP‑P1抗原表位基因的克隆、表达及标记
1.MP‑P1主要抗原表位基因抗原表达质粒的构建
1.1PCR产物及表达载体pGEX‑4T‑2双酶切
取以上6种基因产物及pGEX‑4T‑2表达载体各30μl分别放于Eeppendorf离心管中，各加入10×buffer(D)4μl、BamHI(10u/μl)和EcoRI(12u/μl)各1μl，加灭菌蒸馏水至40μl，置37℃水浴酶切过夜。
酶切产物的琼脂糖凝胶电泳纯化和回收：PCR产物及载体pGEX‑4T‑2经双酶切后，用1.2％琼脂糖凝胶进行纯化，具体方法按《分子克隆》(科学出版社，第二版)的方法进行。纯化基因再用上海华舜生物工程有限公司生产的小量胶回收试剂盒回收：即在紫外灯下分别切下含质粒和目的基因的琼脂糖，放于Eeppendorf离心管中，各加入S1液，置55℃水浴10分钟使胶溶解，加入等量异丙醇，混匀，55℃温浴1分钟，然后分别移入吸附柱后，按试剂盒说明书进行纯化。
1.2.连接：于灭菌Eeppendorf离心管中加入上述酶切后的载体及目的基因各1μl、10×T4DNA Ligasebuffer1μl、T4DNA Li gase(12u/ul)1μl，加灭菌蒸馏水至10μl，置16℃过夜。
1.3转化：在超净工作台中，用无菌吸头取100μl感受态细胞(感受态细胞按《分子克隆》(科学出版社，第二版)的方法进行)悬液于Eppendorf中，加入上述连接物5μl，轻轻旋转混匀，冰浴30分。立即转移到42℃水浴中放置2分钟，每管加入0.5ml LB培养基(不加抗生素)，30℃水浴摇床培养60分钟后，各取0.2ml分别涂于LB琼脂培养基平皿上(含抗生素)，室温晾干后，置37℃恒温箱倒置培养过夜。挑选数个菌落，分别接种于LB中(5ml/管)，培养过夜，次日各取0.1ml转移到LB中(2ml/管)，32℃培养3小时，1mM IPTG诱导培养8h，收菌，用SDS‑PAGE鉴定，选择目的基因获得高表达菌株，并测序鉴定。
2.抗原的表达与纯化
2.1表达菌株的培养：取‑70℃保存的表达菌株20μl接种于LB培养基中(100ml LB/500ml三角瓶)，30℃空气摇床培养过夜，次日按5％的比例转种于LB培养基(同上)，30℃空气摇床培养约3小时，当OD600值达到0.7时，加入1mM IPTG，诱导培养8h，将菌液合并，6000rpm离心20分钟，弃上清，收集沉淀部分。
2.2提取包涵体：将沉淀称湿重，用10倍体积的20mmol/L pH8.0TE缓冲液将沉淀悬起，加入溶菌酶(1mg/ml悬液)，在室温下磁力搅拌10分钟。在冰浴中超声波破碎菌，每次超30秒钟，间隔30秒钟，共超10次。8℃，1,2000rpm，离心20分钟，弃上清，沉淀用1mol/L NaCl(用TE配制)洗一次，再用TE洗2次，收集沉淀。沉淀用8M脲(用PH8.0TE配制)溶解，加1％β‑巯基乙醇。再于20℃，1,2000rpm，离心10分钟，去沉淀取上清。
2.3纯化：将上述溶解的包涵体溶液过镍离子柱，用吸附缓冲液(pH8.0，20mmol/L TE含6mol/L脲，0.1％β‑巯基乙醇，5mM咪唑，0.25M NaCl)平衡清洗上样后，用洗脱缓冲液(pH8.0，20mmol/L TE含6mol/L脲，0.1％β‑巯基乙醇，200mM咪唑)洗脱，收集第一洗脱峰。再过Sephardex G‑50凝胶过滤柱，缓冲液采用pH8.0，20mmol/L TE含0.1％SDS，收集第一洗脱峰。洗脱抗原采用SDS‑PAGE进行纯化鉴定。
3.辣根酶(HRP)标记MP‑P1表位抗原
取HRP5mg溶于0.2mol/L PH5.6醋酸盐缓冲液0.5ml；加入新鲜配制的0.1mol/L Na IO40.25ml；混匀。(此时溶液颜色应由黄棕色变为墨绿色)
4℃30min；加入2.5％己二醇0.5ml，混匀。室温置30min。(此时溶液应恢复为黄色)
加入待标记抗体5～10mg，用1.0mol/L PH9.5CBS调PH至9.0，混匀。4℃过夜；加入NaHB40.1ml(0.5mg)，混匀。
4℃2小时后对0.01mol/L PH7.4PBS透析，4℃过夜。加入适量中性甘油后小量分装。
4、基于重组P1表位抗原的MP‑IgM抗体检测(捕获法)技术的建立及其应用
1.基于重组MP‑P1表位抗原建立MP‑IgM抗体检测(捕获法)技术
抗IgM‑μ链单抗包被酶联板(PBS稀释到2μg/ml)，每孔100μl，4℃过夜后弃液，蒸馏水冲洗3次，拍干，每孔加入1％BSA100μl，室温2h，弃液。每孔加入100μl样品稀液后，分别加入10μl的待测样本血清，37℃30min，弃液，用洗涤液洗板5次后弃液，拍干，加入辣根过氧化物酶标记的MP‑P1抗原(1∶1000)100μl，37℃温浴20min，弃液洗板5次拍干。加TMB显色液：A和B液各50μl，37℃避光显色10min，每孔加入终止液50μl，用酶标仪读取450nm吸光值OD。OD＞0.1判断为阳性。
2.MP‑IgM抗体检测(捕获法)技术的临床检测
本发明所提供的MP93，MP236，MP371，MP661，MP874，MP987在40份肺炎支原体病患者中检出率分别为17.5％(7/40)、32.5％(13/40)、65％(26/40)、55％(22/40)、77.5％(31/40)、17.5％(7/40)；50份健康人血清中特异性为100％(50/50)、80％(40/50)、100％(50/50)、100％(50/50)、30％(15/50)、90％(45/50)，其中本发明获得的MP371和MP661抗原具有MP特异性的免疫学活性，两者联合使用的特异性100％(50/50)，灵敏度为85％(34/40)，显著高于单个抗原使用(X2＝8.628；P＜0.05)；冷凝集法(赛乐迪亚‑麦可II)检测的灵敏度和特异性分别为75％(15/20)和98％(49/50)，两种检测方法具有很好的一致性(kappa＝0.800；P＜0.01)在诊断试剂研究中具有一定的应用价值。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。