一种高产乙酰氨基葡萄糖的枯草芽孢杆菌工程菌及其应用.pdf

本发明公开了一种高产乙酰氨基葡萄糖的枯草芽孢杆菌工程菌及其应用，以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis168）作为出发菌株，在同源重组敲除乙酰氨基葡萄糖转运蛋白编码基因（nagP）的基础上，进一步敲除乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶编码基因（nagA）和乙酰氨基葡萄糖脱氨基酶编码基因（nagB），从而阻断了宿主菌中乙酰氨基葡萄糖降解途径。在已敲除nagA及nagB的宿主菌中，过量表达来源于酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae S288C）的氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因（GNA1），加强乙酰氨基葡萄糖合成途径，得到了产乙酰氨基葡萄糖重组枯草芽孢杆菌，产量达到1.23g/L，为进一步代谢工程改造枯草芽孢杆菌生产氨基葡萄糖奠定了基础。

权利要求书一种高产乙酰氨基葡萄糖的枯草芽孢杆菌工程菌，其特征是将酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）S288C中氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因GNA1克隆到枯草芽孢杆菌，同时敲除该枯草芽孢杆菌乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶编码基因nagA、乙酰氨基葡萄糖脱氨基酶编码基因nagB及乙酰氨基葡萄糖转运蛋白编码基因nagP构建而成的枯草芽孢杆菌工程菌。
根据权利要求1所述枯草芽孢杆菌工程菌，其特征在于，所述氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因如NCBI‑Gene ID:850529所示；乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶编码基因如NCBI‑Gene ID:936621所示；乙酰氨基葡萄糖脱氨基酶编码基因nagB如NCBI‑Gene ID:936619所示；乙酰氨基葡萄糖转运蛋白编码基因nagP如NCBI‑Gene ID:938807所示。
根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌工程菌，其特征在于，将氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因连接到表达载体pP43NMK上。
根据权利要求1‑3任一所述的枯草芽孢杆菌工程菌，其特征在于所述枯草芽孢杆菌为Bacillus subtilis168。
权利要求1所述枯草芽孢杆菌工程菌的构建方法，其特征在于包括如下步骤：
1）构建乙酰氨基葡萄糖转运蛋白编码基因nagP敲除框，通过同源重组将敲除框中的博来霉素抗性基因zeo替代枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）168基因组中酰氨基葡萄糖脱乙酰酶编码基因nagP；
2）构建乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶编码基因nagA和乙酰氨基葡萄糖脱氨基酶编码基因nagB敲除框，通过同源重组将敲除框中的博来霉素抗性基因zeo替代枯草芽孢杆菌基因组中乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶编码基因nagA和乙酰氨基葡萄糖脱氨基酶编码基因nagB；
3）克隆酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）S288C的氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因GNA1，连接到质粒pP43NMK上，将重组质粒转化已敲除乙酰氨基葡萄糖转运蛋白编码基因nagP、乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶编码基因nagA和乙酰氨基葡萄糖脱氨基酶编码基因nagB的枯草芽孢杆菌，得到产乙酰氨基葡萄糖枯草芽孢杆菌工程菌。
应用权利要求1‑4任一所述枯草芽孢杆菌工程菌发酵生产乙酰氨基葡萄糖的方法，将37℃C、200rpm下培养12h的重组枯草芽孢杆菌以5%的接种量转入发酵培养基，于37℃C、200rpm条件下发酵30h。

说明书一种高产乙酰氨基葡萄糖的枯草芽孢杆菌工程菌及其应用
技术领域
本发明涉及一种高产乙酰氨基葡萄糖枯草芽孢杆菌工程菌，特别是一种通过同源重组敲除nagA及nagB提高重组枯草芽孢杆菌乙酰氨基葡萄糖产量的方法，属于遗传工程领域。
背景技术
乙酰氨基葡萄糖是生物体内的一种单糖，广泛存在于细菌、酵母、霉菌、植物以及动物体内。在人体中，乙酰氨基葡萄糖是糖胺聚糖二糖单元的合成前体，其对修复和维持软骨及关节组织功能具有重要作用。因此，乙酰氨基葡萄糖被广泛作为药物和营养膳食添加来治疗和修复关节损伤。此外，乙酰氨基葡萄糖在化妆品和制药领域也具有诸多应用。目前，乙酰氨基葡萄糖主要采用酸解虾壳或蟹壳中甲壳素生产，此方法产生的废液对环境污染较为严重，而且得到的产品易引起过敏反应，不适宜海鲜过敏的人群服用。
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，其产品被FDA认证为“generally regarded as safe”(GRAS)安全级别。因此，运用代谢工程手段构建重组枯草芽孢杆菌是生产食品安全级乙酰氨基葡萄糖的有效途径。然而，乙酰氨基葡萄糖是枯草芽孢杆菌优先利用的碳源物质，当培养基中葡萄糖耗尽后，胞外乙酰氨基葡萄糖被转运到胞内，通过脱氨基、脱乙酰作用，以果糖‑6‑磷酸形式进入细胞糖酵解途径，参与细胞代谢。因此，需要敲除乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶编码基因（nagA）和乙酰氨基葡萄糖脱氨基酶编码基因（nagB），以阻断乙酰氨基葡萄糖的降解，提高乙酰氨基葡萄糖产量。本发明通过同源重组敲除乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶编码基因（nagA）和乙酰氨基葡萄糖脱氨基酶编码基因（nagB），阻断宿主菌降解乙酰氨基葡萄糖途径。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种高产乙酰氨基葡萄糖枯草芽孢杆菌工程菌，是将酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）S288C中氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因GNA1克隆到枯草芽孢杆菌，同时敲除该枯草芽孢杆菌乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶编码基因nagA、乙酰氨基葡萄糖脱氨基酶编码基因nagB及乙酰氨基葡萄糖转运蛋白编码基因nagP构建而成的枯草芽孢杆菌工程菌。
所述氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因如NCBI‑Gene ID:850529所示；乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶编码基因如NCBI‑Gene ID:936621所示；乙酰氨基葡萄糖脱氨基酶编码基因nagB如NCBI‑Gene ID:936619所示；乙酰氨基葡萄糖转运蛋白编码基因nagP如NCBI‑Gene ID:938807所示。
所述氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因通过表达载体pP43NMK进行表达；所述枯草芽孢杆菌为Bacillus subtilis168。
本发明要解决的另一个技术问题是提供一种构建上述枯草芽孢杆菌工程菌的方法，具体方法如下：
敲除乙酰氨基葡萄糖转运蛋白编码基因（nagP），阻断宿主菌从胞外转运乙酰氨基葡萄糖至胞内的途径。在此基础上，进一步敲除在已敲除乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶编码基因（nagA）和乙酰氨基葡萄糖脱氨基酶编码基因（nagB），阻断乙酰氨基葡萄糖降解途径。在已敲除nagP、nagA及nagB的宿主菌内，运用表达载体pP43NMK过量表达酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）S288C中氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因（GNA1），通过代谢工程改造，实现乙酰氨基葡萄糖产量的提高。
重组枯草芽孢杆菌种子培养及发酵：
种子培养基（g/L）：胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl10。
发酵培养基（g/L）：葡萄糖20，胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl10。
培养条件：将37℃C、200rpm下培养12h的种子以5%的接种量转入发酵培养基，于37℃C、200rpm条件下培养30h。
乙酰氨基葡萄糖的测定方法：
高效液相色谱（HPLC）检测法：Agilent1200，RID检测器，NH2柱(250×4.6mm，5μm)，流动相：70%乙腈，流速0.75mL/min，柱温30℃C，进样体积为10μL。
本发明提供的重组枯草芽孢杆菌可提高乙酰氨基葡萄糖在胞外积累，其浓度可达到1.23gL，为进一步代谢工程改造枯草芽孢杆菌生产氨基葡萄糖奠定了基础。本发明提供的重组枯草芽孢杆菌构建方法简单，便于使用，具有很好地应用前景。
具体实施方式
实施例1敲除乙酰氨基葡萄糖转运蛋白编码基因（nagP）
根据NCBI上公布的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis168，购自美国典型微生物保藏中心,ATCC No.27370）乙酰氨基葡萄糖转运蛋白编码基因（nagP）上下游序列，设计敲除框同源臂扩增引物，左臂上下游引物分别为：nagP‑L‑F：5’‑AATGAGATGCCTGTGTCGGAATA‑3’和nagP‑L‑R：
5’‑TCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCATCCACTCTCCAAACGAGTTGATAC‑3’；右臂上下游引物分别为：nagP‑R‑F:
5’‑ACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCCGCGGTCTTAACCGGGTTA‑3’和nagP‑R‑R:
5’‑TACGACAACGCCCAGCTTC‑3’。运用上述引物从枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis168）基因组中扩增nagP敲除框左、右臂。根据NCBI上公布的p7Z6质粒序列（南京农业大学，闫新博士惠赠，NCBI accessionno.EU541492），设计引物，扩增博来霉素抗性基因（zeo），上下游引物分别为：nagP‑Z‑F:
5’‑GTATCAACTCGTTTGGAGAGTGGATAGCGGATAACAATTTCACACAGG‑3’和nagP‑Z‑R:
5’‑TAAAGATAACCCGGTTAAGACCGCGGCCAGGGTTTTCCCAGTCAC‑3’。通过融合PCR方法，将敲除框左、右臂及抗性基因融合为nagP敲除框。通过测序确认nagP敲除框构建成功。
将构建好的敲除框转化枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis168），通过博来霉素抗性平板筛选、菌落PCR验证，确认乙酰氨基葡萄糖转运蛋白编码基因（nagP）敲除成功，得到重组枯草芽孢杆菌的构建BSGN1。
实施例2敲除乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶编码基因（nagA）和乙酰氨基葡萄糖脱氨基酶编码基因（nagB）
将质粒pTSC（南京农业大学，闫新博士惠赠，NCBI accession no.EU864234）转化已敲除nagP重组枯草芽孢杆菌，消除博来霉素抗性。由于乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶编码基因（nagA）和乙酰氨基葡萄糖脱氨基酶编码基因（nagB）在枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis168）基因组同一操纵子内，因此采用一次同源重组即可同时敲除nagA及nagB两个基因。
根据NCBI上公布的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis168）乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶编码基因（nagA）和乙酰氨基葡萄糖脱氨基酶编码基因（nagB）上下游序列，设计敲除框同源臂扩增引物，左臂上下游引物分别为：nagAB‑L‑F：
5’‑CTGTATCAATGATTTTCATGGTCTCTT‑3’，nagAB‑L‑R：
5’‑TCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCTCATTTTCTGTCACGATCGCAA‑3’；右臂上下游引物分别为：nagAB‑R‑F：
5’‑ACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCAAGGAACATGCTGACTTATGAATATCA‑3’，
nagAB‑R‑F：5’‑CAAAAAGGTGGAAACCGATTATT‑3’。运用上述引物从枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis168）基因组中扩增nagA、nagB敲除框中包含的左臂和右臂。根据NCBI上公布的p7Z6质粒序列（NCBI accession no.EU541492），设计引物，扩增博来霉素抗性基因（zeo），上下游引物分别为：nagAB‑Z‑F：
5’‑ACATTGCGATCGTGACAGAAAATGAGAGCGGATAACAATTTCACACAGG‑3’，nagAB‑Z‑R：5’‑ATATTCATAAGTCAGCATGTTCCTTGCCAGGGTTTTCCCAGTCAC‑3’。通过融合PCR方法，将敲除框左、右臂及抗性基因融合为nagA、nagB敲除框。通过测序确认nagA、nagB敲除框构建成功。
将构建好的nagA、nagB敲除框转化枯草芽孢杆菌（BSGN1），通过博来霉素抗性平板筛选，菌落PCR验证，确认乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶编码基因（nagA）和乙酰氨基葡萄糖脱氨基酶编码基因（nagB）敲除，得到重组枯草芽孢杆菌的构建BSGN3。
实施例3构建产乙酰氨基葡萄糖重组枯草芽孢杆菌
根据NCBI上公布的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae S288C，购自美国典型微生物保藏中心，ATCC204508）中氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因（GNA1），设计引物GNA1‑F：
5’‑GGGGTACCATTATAGGTAAGAGAGGAATGTACACATGAGCTTACCCGATGGATTTTATA‑3’，GNA1‑R：5’‑CCCAAGCTTCTATTTTCTAATTTGCATTTCCACG‑3’。使用上述引物从酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae S288C）基因组中扩增氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因（GNA1）。扩增片段经KpnI和HIndIII双酶切后连接至pP43NMK表达载体（美国弗吉尼亚理工大学，张晓舟博士惠赠）。酶切验证并测序，确认重组质粒pP43‑GNA1构建成功。
将构建好的表达载体pP43‑GNA1转化枯草芽孢杆菌BSGN3。采用GNA1‑F及GNA1‑R引物挑选转化子进行菌落PCR，出现480bp条带，验证重组枯草芽孢杆菌构建成功。
实施例4发酵生产乙酰氨基葡萄糖
将37℃C、200rpm下培养12h的种子以5%的接种量转入发酵培养基，于37℃C、200rpm条件下培养30h。发酵30h，发酵上清液中乙酰氨基葡萄糖含量达到1.23gL。通过在已敲除乙酰氨基葡萄糖转运蛋白编码基因（nagP）宿主菌中进一步敲除乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶编码基因（nagA）和乙酰氨基葡萄糖脱氨基酶编码基因（nagB），并且在已敲除nagP、nagA及nagB宿主中过量表达氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因（GNA1），实现了乙酰氨基葡萄糖在重组枯草芽孢杆菌胞外产量的提高。