说明书具有解盐促生与生物防治功能的重组枯草芽孢杆菌
技术领域
本发明涉及基因工程及生物防治领域，具体地说，涉及一种具有解盐促生与生物防治功能的重组枯草芽孢杆菌。
背景技术
近年来，由新疆地区长期滴灌而产生的次生盐渍化现象越来越严重。盐渍化土壤面积已占耕地面积的约30%，严重制约和影响了该地区棉花的产量和棉花产业的可持续发展。因棉种质量，环境条件和管理措施不当造成的棉花苗期病害直接威胁棉花的产量。现有应对次生盐渍化土壤和棉花苗期病害的措施具有种种弊端，而且收效不甚显著。近年发展起来的生物学防治方法，因其效果较显著和对环境友好等优点逐渐受到人们的重视。例如，从植物根围促生菌（Plantgrowth‑promoting rhizobacteria，简称PGPR）与植物互作的角度入手，分离出能够显著提高棉花在盐胁迫下的发芽率，促进棉花根长和干重的增加，分泌植物生长素和溶磷等作用的PGPR解盐促生菌：植生拉乌尔菌（Raoultella planticola）RS‑2、产酸克雷伯氏菌（Klebsiellaoxytoca）RS‑5、阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）RS‑35和具有生物防治功能的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SL‑13。
PGPR在促进植物生长、提高植物抗逆性和富集重金属离子改良环境等方面具有重要作用。其中一类具有ACC脱氨酶活性的PGPR菌在降低植物体内乙烯的含量，减缓植物衰老，提高植物抗逆性等方面发挥着关键作用。以上筛选到的三株PGPR菌：植生拉乌尔菌RS‑2、产酸克雷伯氏菌RS‑5和阴沟肠杆菌RS‑35均具有ACC脱氨酶活性，能很好的缓解次生盐渍化对棉花种子发芽和苗期发育的影响。筛选到的枯草芽孢杆菌SL‑13对棉花苗期病害具有一定的防治作用。前期的研 究中，通过组合这两类菌制备了既具有解盐促生功能，又具有苗期生防作用的生物菌剂，在田间试验也取得了较好的效果，但需要多批次大规模的菌体培养，费时费力，不利于节约成本。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有解盐促生与生物防治功能的重组枯草芽孢杆菌。
为了实现本发明目的，本发明的一种具有解盐促生与生物防治功能的重组枯草芽孢杆菌，其为基因组中整合有ACC脱氨酶基因的枯草芽孢杆菌SL‑13。
本发明还提供构建上述重组菌的方法：将来自产酸克雷伯氏菌RS‑5中的ACC脱氨酶基因构建到大肠杆菌‑枯草芽孢杆菌穿梭表达载体，如pHCMC04上，并将其转入枯草芽孢杆菌SL‑13中。例如，可以通过电击法将构建好的表达载体转入枯草芽孢杆菌SL‑13的感受态细胞中。
本发明还提供所述重组枯草芽孢杆菌在促进植物生长、提高植物抗逆性以及改良根系周围土壤环境方面的应用。例如，所述植物为棉花等。
本发明还提供一种复合微生物菌剂，其有效成分为所述具有解盐促生与生物防治功能的重组枯草芽孢杆菌，以及其它不发生相互拮抗作用的促生菌或具有生物防治功能的微生物。
本发明进一步提供一种微生物复合肥，包括上述复合微生物菌剂和氮磷钾肥。任选其它可在作物肥料中使用的添加剂。
本发明获得的具有解盐促生作用和生物防治功能的双效菌株，在盐浓度为0.7%的胁迫条件下，进行重组菌的功能分析。用重组菌发酵液浸泡棉花种子进行发芽实验，结果表明，用重组菌处理后的棉种发芽率比对照提高了10.1%；对棉苗立枯病的抑菌实验表明，与野生枯草芽孢杆菌SL‑13相比，重组菌仍具有较强的对棉苗立枯病的防治效 果。
附图说明
图1为本发明ACC脱氨酶基因PCR电泳图；其中，M:DL2000DNAmarker；1和2:PCR扩增产物。(DNA Marker由上至下依次为：2000bp,1000bp,750bp,500bp,250bp,100bp)
图2为本发明穿梭质粒pHCMC04电泳图；其中，M：DNA marker1kb；1：质粒pHCMC04；2：SmaI单酶切后的pHCMC04质粒。(DNAMarker由上至下依次为：10000bp,8000bp,7000bp,6000bp,5000bp,4000bp,3000bp,2000bp,1000bp)
图3为本发明双酶切ACC脱氨酶基因和质粒pHCMC04的电泳图；其中，M：DNA marker 1kb；1：SpeI和SmaI双酶切后ACC脱氨酶基因；2：SpeI和SmaI双酶切后的PHCMC04质粒。(DNA Marker由上至下依次为：10000bp,8000bp,7000bp,6000bp,5000bp,4000bp,3000bp,2000bp,1000bp)
图4为本发明ACC脱氨酶基因穿梭表达载体构建过程示意图。
图5为本发明重组质粒的鉴定PCR电泳图；其中，M：DNA markerDL2000；1：以pMD18‑Koacds质粒为模板；2：以菌落为模板。(DNAMarker由上至下依次为：2000bp,1000bp,750bp,500bp,250bp,100bp)
图6为本发明重组质粒双酶切电泳图；其中，M：DNA Marker 1kb；1：SpeI和SmaI双酶切后的重组菌质粒。(DNAMarker由上至下依次为：10000bp,8000bp,7000bp,6000bp,5000bp,4000bp,3000bp,2000bp,1000bp)
图7为本发明电转化后菌落PCR产物电泳图；其中，M：DNAmarker DL2000；CK：阳性对照；1‑10：以菌落为模板。(DNA Marker由上至下依次为：2000bp,1000bp,750bp,500bp,250bp,100bp)
图8为本发明电转化后重组子双酶切电泳图；其中，M：DNAmarker 1kb；1：重组质粒；2：SacI和SphI双酶切后的质粒。(DNAMarker 的大小由上至下依次为：10000bp,8000bp,7000bp,6000bp,5000bp,4000bp,3000bp,2000bp,1000bp)
图9为本发明重组枯草芽孢杆菌SL‑13对立枯丝核病菌的抑菌效果；其中，CK：LB培养基对照；1：RS‑5菌液；2：重组枯草芽孢杆菌SL‑13；3：野生枯草芽孢杆菌SL‑13。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（New York:Gold Spring Harbor Laboratory Press,1989）。所用原料均为市售商品。
实施例1具有解盐促生与生物防治功能的重组枯草芽孢杆菌SL‑13的构建
1.构建ACC脱氨酶基因穿梭表达载体
1.1ACC脱氨酶基因的获得
通过在NCBI网站上搜索已经报道的ACC脱氨酶基因序列，进行序列比对后，在保守序列处设计引物，以产酸克雷伯氏菌RS‑5的基因组DNA为模板进行PCR扩增，并对扩增产物进行测序。序列已提交GenBank，登录号为FJ357241。
1.2ACC脱氨酶基因及其序列验证
扩增产物ACC脱氨酶基因大小为1017bp。从琼脂糖凝胶电泳结果可以看出，扩增片段大小在1000bp左右，与预期结果相符（图1）。
1.3穿梭质粒pHCMC04的提取与酶切验证
提取穿梭质粒pHCMC04后，用内切酶SmaI进行单酶切验证。琼脂糖凝胶电泳显示，条带大小完全正确，在8000bp左右（图2）。
1.4ACC脱氨酶基因和pHCMC04质粒双酶切
为了使ACC脱氨酶基因与pHCMC04穿梭质粒定向连接，用内切酶SpeI和SmaI进行同步双酶切。进行琼脂糖凝胶电泳结果显示，酶切后基因和质粒大小完全正确，分别为8000bp和1000bp（图3）。
ACC脱氨酶基因穿梭表达载体的构建过程如图4所示。
1.5ACC脱氨酶基因与质粒pHCMC04的连接
对酶切后回收的ACC脱氨酶基因和质粒pHCMC04进行了连接，由于内切酶SmaI切除碱基序列后产生平末端，较难进行连接，因此对连接时间进行了延长，4度条件下连接48小时。连接后直接用氯化钙法转化大肠杆菌DH5α。
1.6ACC脱氨酶基因穿梭表达载体转化大肠杆菌DH5α
为大量获得构建好的穿梭表达载体，首先将连接产物通过化学转化法将其转入大肠杆菌DH5α，通过氨苄青霉素抗性平板筛选重组菌，经扩大培养提取质粒，再通过电击转化法转入枯草芽孢杆菌SL‑13。
1.7重组子的鉴定
1.7.1菌落PCR
转化后，挑取阳性菌落为模板进行PCR，琼脂糖凝胶电泳显示，目标条带与对照一致，大小在1000bp左右（图5）。
1.7.2ACC脱氨酶基因和pHCMC04质粒双酶切
重组质粒双酶切泳结果显示，酶切后出现一个8000bp左右条带和一个1000bp左右条带，与预期结果完全相符。结果表明目标基因已正确插入到穿梭质粒pHCMC04的多克隆位点SpeI和SmaI之间，证明含ACC脱氨酶基因的穿梭表达质粒pHCMC04已构建成功（图6）。
2.ACC脱氨酶基因穿梭表达载体电击转化枯草芽孢杆菌SL‑13
2.1枯草芽孢杆菌SL‑13电击法转化条件的摸索
在进行电转化前，对枯草芽孢杆菌SL‑13的电击转化条件进行了初步摸索，以获得最佳电转化条件和较高的电转化效率。
2.1.1枯草芽孢杆菌SL‑13生长曲线测
一般认为芽胞杆菌的感受态是在细菌生长对数后期产生的。这种生理状态的形成受到感受态信息素的调节，只有当细胞达到一定的数目(一般在对数后期)并且由细胞分泌到培养基中的感受态信息素的浓度达到一定临界值时才能诱导感受态的形成。
从枯草芽孢杆菌SL‑13的生长曲线可以看出，当OD600为0.9，培养时间为4.5小时左右，基本达到对数后期，应收集此时的枯草芽孢杆菌SL‑13制备感受态细胞。
2.1.2质粒浓度和感受态体积
据文献报道，当电击时间低于4ms时，转化效率会急剧下降。感受态体积首先选择了50μl、80μl和150μl三个梯度。在选择了上述梯度进行电击后发现，加入100μl和150μl感受态细胞与加入50μl感受态细胞相比，电击时间较短，大都达不到4ms。因此，最佳感受态体积，选择了80μl体系。质粒的浓度与感受态细胞的比例对于电转化条件比较重要。试验中选择了质粒浓度分别为10ng/μl、20ng/μl、50ng/μl和100ng/μl四个浓度梯度。
2.1.3电场强度
据文献报道，利用高渗透压法进行电转化，每微克DNA可获得1.4×106个转化子，转化效率比正常电击转化提高近5000倍，最佳电转场强为23KV/cm。因此，本实施例中以此电场强度为依据，电转化时分别选用了11KV/cm、13KV/cm、15KV/cm、17KV/cm、19KV/cm、21KV/cm、23KV/cm和25KV/cm。电转化后涂板，37℃过夜恒温培养后发现，当电场强度低于20KV/cm时长出的菌落数目较多，且较易形成菌苔；电场强度为25KV/cm时，菌体大量死亡，活菌数目很少。而当电场强度为21KV/cm和23KV/cm时，电转化后涂板长出的菌落数目较为一致。因此选定了这两个电压梯度。
2.1.4转化后感受态细胞复苏时间的选择
因质粒含有抗生素抗性基因，将质粒电击转入宿主菌体后，细胞较为脆弱，需要用含营养较丰富的复苏培养基复苏。一方面是使细胞恢复电转化前的生理状态，减少菌体死亡量；另一方面，导入宿主菌的质粒上含有抗生素基因，用复苏培养基复苏一段时间，可以使质粒的上的抗性基因得以表达，便于筛选。复苏培养基的成分和复苏时间的长短对转化效率有重要影响。复苏时间分别选择了1个小时、两个小时和三个小时，共三个复苏时间梯度。电转化结果显示结果表明： 复苏时间为3小时时，能够获得较多的转化子。
2.1.5电转化条件的确定
在确定了上述质粒浓度、感受态体积、电场强度和复苏时间这几个主要的影响电击转化的因素后，进行了电击转化。实验最终获得阳性克隆的电击转化条件是：质粒浓度100ng/μl、感受态体积80μl、场强23KV和3小时的复苏时间。
2.2重组质粒的鉴定
2.2.1菌落PCR
电击法转化后取200μl菌液涂板，37℃恒温培养过夜，挑取单菌落进行鉴定。因宿主菌是枯草芽孢杆菌，为革兰氏阳性，细胞壁较厚，故PCR前用牙签挑取少量菌落加入10μl无菌水中稀释后煮沸30分钟，以此为模板进行PCR扩增。PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果显示，3号菌落的条带较亮，且大小正确，推测其为阳性克隆（图7）。
2.2.2重组质粒双酶切
选择内切酶SacI和SphI双酶切重组质粒，琼脂糖凝胶电泳结果显示出现了两个条带，分别在5500bp和3500bp处，与预期结果一致（图8）。
实施例2重组枯草芽孢杆菌SL‑13对棉苗发芽率影响
在0.7%的盐胁迫条件下，用OD600为0.3的重组枯草芽孢杆菌SL‑13（将重组枯草芽胞杆菌SL‑13接种于5mL LB液体培养基中，37℃水浴振荡培养过夜，按1%的接种量转接于30mL LB培养基（含100μg/ml氨苄青霉素）中，200rpm培养2小时，加入0.6mM的IPTG，在37℃下诱导表达5h~8h，4℃保存）、野生枯草芽孢杆菌SL‑13和产酸克雷伯氏菌RS‑5发酵液对棉花种子浸泡处理，进行了棉花种子培养皿发芽实验，其中以LB培养基（CK）作为对照，结果如下图。用重组枯草芽孢杆菌SL‑13处理的棉种发芽率比对照提高了10.1%，也高于产酸克雷伯氏菌RS‑5发酵液及野生型SL‑13处理。结果表明，转入ACC脱氨酶基因的重组枯草芽孢杆菌SL‑13具有促进棉花发芽 和提高棉种耐盐性的作用。（表1）
表1不同菌株处理对棉花发芽率的影响
实施例3重组枯草芽孢杆菌SL‑13对棉苗立枯病的抑制效果
采用平板对峙实验（用打孔器在LB固体培养基上等距离打4个小孔，位置如图9所示，分别向孔内加入等量的重组枯草芽孢杆菌SL‑13诱导后发酵液、野生枯草芽孢杆菌SL‑13和产酸克雷伯氏菌RS‑5的发酵液，以空白LB液体培养基为对照，37℃下培养过夜）检测了重组枯草芽孢杆菌SL‑13、野生枯草芽孢杆菌SL‑13和产酸克雷伯氏菌RS‑5发酵液对棉苗立枯丝核菌的抑菌效果，结果如图9所示。可以看出，重组枯草芽孢杆菌SL‑13与野生枯草芽孢杆菌SL‑13相比，对棉苗立枯丝核菌仍有一定的抑制效果，并未因转入ACC脱氨酶基因而影响生物防治功能，仍保留了较强的对棉苗立枯丝核菌的抑菌能力；产酸克雷伯氏菌RS‑5作为解盐促生菌，对立枯丝核菌病无防治功能。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。