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1、(10)申请公布号 CN 103146772 A (43)申请公布日 2013.06.12 CN 103146772 A *CN103146772A* (21)申请号 201310050144.3 (22)申请日 2013.02.08 C12P 13/08(2006.01) C12N 15/70(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C12N 15/61(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (71)申请人 宁夏伊品生物科技股份有限公司 地址 750100 宁夏回族自治区银川市永宁县 杨和工业园区宁夏伊品生物科技股份 有限公司 (72)发明人 马吉银 温廷益。
2、 陈金龙 梁勇 刘树文 魏爱英 杨立鹏 孟刚 任瑞 (54) 发明名称 用乌头酸酶表达弱化和 / 或酶活性降低的细 菌发酵生产 L- 赖氨酸的方法 (57) 摘要 本发明提供了发酵生产 L- 赖氨酸的方法， 其 包括改造细菌使其乌头酸酶 A 的表达量和 / 或酶 活性降低但不消失 ； 和， 用改造的细菌发酵生产 L- 赖氨酸。另外， 本发明还提供了由该方法衍生 的方法和应用， 以及可以用在这些方法和应用中 的多核苷酸、 载体和细菌。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 序列表 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书6页。
3、 序列表2页 (10)申请公布号 CN 103146772 A CN 103146772 A *CN103146772A* 1/1 页 2 1. 发酵生产 L- 赖氨酸的方法， 其包括 ： (1) 改造细菌染色体上的野生型的 acnA 基因， 使改造获得的细菌的乌头酸酶 A 的表达 量和 / 或酶活性降低但不消失 ； 和， (2) 用步骤 (1) 改造而得到的细菌发酵生产 L- 赖氨酸。 2. 提高 L- 赖氨酸的发酵量的方法， 其包括 ： (1) 改造细菌染色体上的野生型的 acnA 基因， 使改造获得的细菌的乌头酸酶 A 的表达 量和 / 或酶活性降低但不消失 ； 和， (2) 用步骤 (。
4、1) 改造而得到的细菌发酵产生 L- 赖氨酸。 3. 改造获得的细菌在发酵生产 L- 赖氨酸中的应用， 其中， 所述改造获得是改造细菌染 色体上的野生型的 acnA 基因而获得， 而且使改造获得的细菌的乌头酸酶 A 的表达量和 / 或 酶活性降低但不消失。 4. 改造获得的细菌在提高 L- 赖氨酸的发酵量的应用， 其中， 所述改造获得是改造细菌 染色体上的野生型的 acnA 基因而获得， 而且使改造获得的细菌的乌头酸酶 A 的表达量和 / 或酶活性降低但不消失。 5. 改造细菌的方法， 其包括改造所述细菌染色体上的野生型的 acnA 基因， 使改造获得 的细菌的乌头酸酶 A 的表达量和 / 或。
5、酶活性降低但不消失。 6. 权利要求 1-5 之任一所述的方法或应用， 其中， 所述野生型的 acnA 基因的核苷酸序 列如 SEQ ID No ： 1 所示。 7. 权利要求 1-6 之任一所述的方法或应用， 其中， 所述改造细菌染色体上的野生型的 acnA 基因是， (a) 将所述细菌的野生型的 acnA 基因的起始密码子突变， 优选将所述起始密码子 ATG 突变为 GTG ； 和 / 或， (b) 将所述细菌的野生型的 acnA 基因缺失 1-120 个核苷酸， 优选缺失 1-90 个核苷酸， 最优选缺失 90 个核苷酸， 如在所述野生型的 acnA 基因的终止密码子前缺失 90 个核苷。
6、酸。 8. 权利要求 1-7 之任一所述的方法或应用， 其中， 所述细菌是埃希氏菌属细菌， 优选是 大肠杆菌。 9. 权利要求 5 所述的方法改造而得到的细菌。 10. 多核苷酸或包含其的载体， 所述多核苷酸选自， (a) 野生型的 acnA 基因的起始密码子突变而获得的多核苷酸， 优选所述突变是将 ATG 突变为 GTG ； 和， (b)野生型的acnA基因缺失1-120个核苷酸而获得的多核苷酸， 优选野生型的acnA基 因缺失 1-90 个核苷酸而获得的多核苷酸， 更优选野生型的 acnA 基因缺失 90 个核苷酸而获 得的多核苷酸， 例如野生型的 acnA 基因的终止密码子前缺失 90 。
7、个核苷酸而获得的多核苷 酸。 权 利 要 求 书 CN 103146772 A 2 1/6 页 3 用乌头酸酶表达弱化和 / 或酶活性降低的细菌发酵生产 L- 赖氨酸的方法 技术领域 0001 本发明属于氨基酸发酵领域， 具体而言， 本发明涉及发酵生产 L- 赖氨酸的方法及 其衍生的方法和应用， 和可以用在这些方法和应用中的多核苷酸、 载体和细菌。 背景技术 0002 通过产 L- 赖氨酸的细菌 ( 如， 埃希氏菌属的大肠杆菌和棒杆菌属的杆状细菌 ) 发 酵来生产 L- 赖氨酸已经得到了产业化应用。这些细菌， 可以是从自然界分离的细菌， 也可 以是通过诱变或基因工程改造获得的细菌， 或者两者兼。
8、而有之。 当前的文献报道中， 通过基 因工程改造的注意力主要集中在 pnt、 dap 及 ppc 等基因上， 未见为了 L- 赖氨酸生产而关注 乌头酸酶 ( 如， 乌头酸酶 A) 及其编码基因。 0003 乌头酸酶是三羧酸循环中的一个酶， 该酶催化两步化学反应， 分别为柠檬酸转化 为乌头酸以及乌头酸转化为异柠檬酸。目前已知在埃希氏菌中， acnA 基因 ( 其核苷酸序列 如 SEQ ID No ： 1 所示 ) 编码乌头酸酶 A， 但是可能是由于其代谢距离最终的 L- 赖氨酸产物 太远， 中间代谢分支太多且复杂， 而在 L- 赖氨酸发酵中一直未引起人们的重视。 0004 本发明人经过长期研究和。
9、实践， 尤其凭借了一些运气， 偶然发现 acnA 基因的改造 能够有助于提高 L- 赖氨酸的产量 ； 然而， 现有技术要么通过增加拷贝和 / 或定点突变导入 表达量和 / 或酶活性提高的有益的酶基因， 要么通过敲除不利的基因以使之酶活性和 / 或 表达量消失， 但是与之不同的是， 本发明人发现， acnA 基因不能简单地提高或敲除， 尤其是 敲除后使得细菌生长困难， 难以实际应用， 因此开发了新的针对 acnA 基因调控的方法， 以 此来提高 L- 赖氨酸的产量， 而且该方法与现有改造的大量高产 L- 赖氨酸的细菌的染色体 改造位点没有冲突， 可以叠加提高的效果， 从而在实践上可用于细菌发酵生。
10、产 L- 赖氨酸。 发明内容 0005 本发明要解决的技术问题在于提供新的发酵生产 L- 赖氨酸的方法及其相关的方 法， 包括相对于未改造细菌提高 L- 赖氨酸的发酵生产量的方法， 改造的细菌在发酵生产 L- 赖氨酸中的应用， 改造的细菌在相对于未改造细菌提高 L- 赖氨酸的发酵生产量的应用， 和 / 或， 改造细菌的方法等。另外， 本发明还提供了可以用于上述方法中的多核苷酸、 载体 和 / 或细菌等。 0006 具体而言， 在第一方面， 本发明提供了发酵生产 L- 赖氨酸的方法， 其包括 ： 0007 (1) 改造细菌染色体上的野生型的 acnA 基因， 使改造获得的细菌的乌头酸酶 A 的 。
11、表达量和 / 或酶活性降低但不消失 ； 和， 0008 (2) 用步骤 (1) 改造而得到的细菌发酵生产 L- 赖氨酸。 0009 在本文中， 术语 “改造” 指的是是相应被改造的对象发生变化， 从而达到一定的效 果。改造位于染色体上的基因的手段包括但是不限于， 诱变、 定点突变、 和 / 或同源重组， 优 选是后两者。这些技术手段广泛记载于分子生物学和微生物学文献中， 有许多甚至已经商 说 明 书 CN 103146772 A 3 2/6 页 4 品化了。在本发明的具体实施方式中， 根据同源重组的原理， 采用 Addgene 公司商品化的 pKOV 质粒系统来进行改造， 将未改造细菌染色体上。
12、的野生型的 acnA 基因， 改造成能够使改 造获得的细菌的乌头酸酶 A 的表达量和 / 或酶活性降低但不消失的新的 acnA 基因。因此， 在本文文中， 优选改造是通过同源重组进行的改造。 0010 本发明人经过长期研究发现， 使得 acnA 基因所编码的乌头酸酶 A 的表达量消失， 或使得 acnA 基因所编码的乌头酸酶 A 的酶活性消失， 都将造成细菌本身生长困难， 甚至无 法生长 / 繁殖。因此， 本发明的 “改造” 要相对于未改造的细菌， 使改造获得的细菌的乌头 酸酶 A 的表达量和 / 或酶活性降低但不消失， 优选使改造获得的细菌的乌头酸酶 A 的表达 量和 / 或酶活性降低 20。
13、 95， 更优选降低 50 90， 如降低 65、 70或 80。 0011 相应地， 本发明还提供了其他应用或方法。例如， 在第二方面， 本发明提供了提高 L- 赖氨酸的发酵量的方法， 其包括 ： 0012 (1) 改造细菌染色体上的野生型的 acnA 基因， 使改造获得的细菌的乌头酸酶 A 的 表达量和 / 或酶活性降低但不消失 ； 和， 0013 (2) 用步骤 (1) 改造而得到的细菌发酵产生 L- 赖氨酸。 0014 L- 赖氨酸作为细菌的重要代谢产物， 大多数细菌或多或少都能够发酵产生一定量 的 L- 赖氨酸。尽管低产 L- 赖氨酸的细菌不适合有经济效益地生产 L- 赖氨酸， 但是。
14、通过本 发明的方法， 仍旧能提高 L- 赖氨酸的发酵量， 仍旧可以供对经济效益不敏感的地方使用。 当然， 在本文中， 优选细菌是高产 L- 赖氨酸的细菌。通过本发明的方法， 可以进一步提高其 产量。另外， 在本发明的方法或应用中， 除了改造细菌染色体上的野生型的 acnA 基因以外， 可以不再进行其他改造。例如， 尤其对于高产 L- 赖氨酸的细菌来说， 仅仅改造细菌染色体 上的野生型的 acnA 基因。 0015 又如， 在第三方面， 本发明提供了改造获得的细菌在发酵生产 L- 赖氨酸中的应 用， 其中， 所述改造获得是改造细菌染色体上的野生型的 acnA 基因而获得， 而且使改造获 得的细菌。
15、的乌头酸酶 A 的表达量和 / 或酶活性降低但不消失。 0016 改造获得的细菌可以单独应用于发酵生产 L- 赖氨酸中， 也可以和其他产 L- 赖氨 酸的细菌混合发酵生产 L- 赖氨酸， 或者以其他方式应用于发酵生产 L- 赖氨酸中。在本文 中， 如无特别限定 ( 如未以 “改造获得” 来限定 )， 术语 “细菌” 是未改造或改造前的细菌， 其 染色体的 acnA 基因座位上的基因是野生型的 acnA 基因。 0017 还如， 在第四方面， 本发明提供了改造获得的细菌在提高 L- 赖氨酸的发酵生产量 的应用， 其中， 所述改造获得是改造细菌染色体上的野生型的 acnA 基因而获得， 而且使改 。
16、造获得的细菌的乌头酸酶 A 的表达量和 / 或酶活性降低但不消失。 0018 在本文中， 细菌优选是埃希氏菌属细菌， 更优选是大肠杆菌， 如大肠杆菌 K-12 菌 株的后续菌株， 包括 W3110 衍生的菌株。由于现有技术几乎没有在 L- 赖氨酸生产 / 发酵中 关注过细菌的 acnA 基因， 改造的染色体的基因大多集中于 pnt、 dap 及 ppc 等基因位点上， 因此现有技术中的细菌 ( 尤其是埃希氏菌属细菌， 如大肠杆菌 ) 没有被报道不带有野生型 的 acnA 基因。在本发明的具体实施方式中， 无论高产还是低产 L- 赖氨酸的细菌， 只要带有 野生型的 acnA 基因， 通过本发明的。
17、方法进行改造， 就能使得 L- 赖氨酸的发酵量得到提高。 0019 更本质地， 在第五方面， 本发明提供了改造细菌的方法， 其包括改造所述细菌染色 体上的野生型的 acnA 基因， 使改造获得的细菌的乌头酸酶 A 的表达量和 / 或酶活性降低但 说 明 书 CN 103146772 A 4 3/6 页 5 不消失。 0020 本发明第五方面的方法改造而获得的细菌能够用于发酵生产或产生 L- 赖氨酸。 因此， 在第六方面， 本发明提供了本发明第五方面的方法改造而获得的细菌。 0021 埃希氏菌属细菌 ( 如， 大肠杆菌 ) 中绝大多数的野生型的 acnA 基因的核苷酸序列 如 SEQ ID No。
18、 ： 1 所示， 而且本发明的具体实施方式也证实了在多种染色体上带有如 SEQ ID No ： 1 所示的野生型的 acnA 基因的细菌上实施本发明的改造， 都能提高 L- 赖氨酸的发酵 量。所以优选在本文中， 所述野生型的 acnA 基因的核苷酸序列如 SEQ ID No ： 1 所示。 0022 经过本发明人研究和证实， 更优选地， 在本文中， 所述改造细菌染色体上的野生型 的acnA基因是将所述细菌的野生型的acnA基因的起始密码子突变。 例如， 将野生型的acnA 基因的起始密码子ATG突变， 如将如SEQ ID No ： 1所示的野生型的acnA基因的起始密码子 ATG 突变为 GT。
19、G。 0023 也经过本发明人研究和证实， 更优选地， 在本文中， 所述改造细菌染色体上的野生 型的 acnA 基因是将所述细菌的野生型的 acnA 基因缺失 1-120 个核苷酸， 优选缺失 1-90 个 核苷酸， 最优选缺失 90 个核苷酸， 如在所述野生型的 acnA 基因的终止密码子前缺失 90 个 核苷酸。在本发明的具体实施方式中， 在如 SEQ ID No ： 1 所示的野生型的 acnA 基因的终止 密码子前缺失 90 个核苷酸。 0024 另外， 本发明还提供了可以用于上述方法中的多核苷酸和 / 或载体等物质。例如， 在第七方面， 本发明提供了多核苷酸， 所述多核苷酸选自， 0。
20、025 (a) 野生型的 acnA 基因 ( 优选其核苷酸序列如 SEQ ID No ： 1 所示 ) 的起始密码 子突变而获得的多核苷酸， 优选所述突变是将 ATG 突变为 GTG ； 和， 0026 (b)野生型的acnA基因(优选其核苷酸序列如SEQ ID No ： 1所示)缺失1-120个 核苷酸而获得的多核苷酸， 优选野生型的acnA基因缺失1-90个核苷酸而获得的多核苷酸， 更优选野生型的 acnA 基因缺失 90 个核苷酸而获得的多核苷酸， 例如野生型的 acnA 基因的 终止密码子前缺失 90 个核苷酸而获得的多核苷酸。 0027 又如， 在第八方面， 本发明提供了载体， 其包。
21、含本发明第七方面的多核苷酸。 0028 本发明的有益效果在于， 开辟并且实践证明了新的提高 L- 赖氨酸的发酵量的方 式， 对于高产和低产L-赖氨酸的细菌都适用， 而且与现有改造的大量高产L-赖氨酸的细菌 的染色体改造位点没有冲突， 观察到了可以叠加提高产量的效果， 从而在实践上可用于细 菌发酵生产 L- 赖氨酸， 便于推广应用。 0029 为了便于理解， 以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指 出的是， 这些描述仅仅是示例性的描述， 并不构成对本发明范围的限制。 依据本说明书的论 述， 本发明的许多变化、 改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。 0030 另外， 本发明。
22、引用了公开文献， 这些文献是为了更清楚地描述本发明， 它们的全文 内容均纳入本文进行参考， 就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。 具体实施方式 0031 以下通过实施例进一步说明本发明的内容。如未特别指明， 实施例中所用的技术 手段为本领域技术人员所熟知的常规手段和市售的常用仪器、 试剂， 可参见 分子克隆实验 指南 ( 第 3 版 ) ( 科学出版社 )、微生物学实验 ( 第 4 版 ) ( 高等教育出版社 ) 以及相 说 明 书 CN 103146772 A 5 4/6 页 6 应仪器和试剂的厂商说明书等参考。 0032 构建实施例 1 替换 acnA 的起始密码子 ATG 为 G。
23、TG 0033 以抽提的野生型大肠杆菌E.coli K12W3110菌株(可购自日本技术评价研究所生 物资源中心 (NITE Biological Resource Center， NBRC) 基因组染色体为模板， 以引物 P1 和 P2、 P3 和 P4 分别进行 PCR 扩增， 获得长度分别为 510bp 和 620bp 的两条 DNA 片段 ( 分 别命名为 Up1 和 Down1 片段 )。其中， PCR 按如下方式进行 ： 94变性 30s( 秒 )， 52退火 30s( 秒 )， 以及 72延伸 30s( 秒 )(30 个循环 )。其中， 引物序列如下 ： 0034 P1 ： 5 。
24、-CGCGGATCCGGAGTCGTCACCATTATGCC-3 ( 下划线表明 BamHI 酶切位点 ) 0035 P2 ： 5 -TCTCGTAGGGTTGACGACACAGCTCCTCCTTAATGACAGG-3 ( 下划线表明点突变 ) 0036 P3 ： 5 -CCTGTCATTAAGGAGGAGCTGTGTCGTCAACCCTACGAGA-3 ( 下划线表明点突变 ) 0037 P4 ： 5 -ATTGCGGCCGCCCATTCACCGTCCTGCAAT-3 ( 下划线表明 NotI 酶切位点 ) 0038 将上述两条D N A片段经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后， 再以上述两条D N 。
25、A片段混 合为模板， 以P1和P4为引物， 通过Overlap PCR扩增长约1200bp的片段(命名为Up-Down1 片段 )。其中， PCR 按如下方式进行 ： 94变性 30s( 秒 )， 52退火 30s( 秒 )， 以及 72延 伸 60s( 秒 )(30 个循环 )。 0039 将琼脂糖凝胶电泳分离纯化后的 Up-Down1 和 pKOV 质粒 ( 可购自 Addgene 公 司 ) 分别用 BamHI/NotI 双酶切， 经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后连接， 获得用于导入的载体 pKOV-Up-Down1， 并将载体 pKOV-Up-Down1 送测序公司进行测序鉴定， 表明其含有。
26、正确点突 变 (A-G) 的 acnA 基因片段， 保存备用。 0040 将 构 建 好 的 pKOV-Up-Down1 质 粒 分 别 电 转 化 入 低 产 L- 赖 氨 酸 的 E.coli NRRLB-12185 菌株 ( 可购自美国农业菌种保藏中心 (Agricultural Research Service Culture Collection ； NRRL) ； 其构建方法可参见 US4346170A) 和高产 L- 赖氨酸的 E.coli K12W31103 菌株 ( 可购自中科院微生物研究所， 其为经 E.coli K12W3110 诱变突变得到 的赖氨酸生产工程菌 )( 经。
27、测序确认这两个菌株染色体上均保留有野生型的 acnA 基因 ( 即 Genbank等录号U00096.2中的1333855至1336530位)及其上下游元件)， 于30、 100rpm， 在 LB 培养基中复苏 2h 后， 根据 Addgene 公司的 pKOV 质粒的商品指南， 挑选出同源重组阳 性的单克隆， 经测序确认其染色体上的野生型acnA基因的起始密码子由ATG突变为GTG， 分 别得到 acnA 起始密码子突变的 ( 低 / 高产 L- 赖氨酸 ) 大肠杆菌。经检测， 获得的两个菌 株的乌头酸酶表达量下降了约 75 85 ( 在不同培养基中略有差异 )。 0041 构建实施例 2a。
28、cnA 基因序列突变降低乌头酸酶活性 0042 缺失终止密码子前 90bp 碱基以降低乌头酸酶活性。具体而言， 以抽提的野生型大 肠杆菌 E.coli K12W3110 基因组染色体为模板， 以引物 P5 和 P6、 P7 和 P8 分别进行 PCR 扩 增， 获得长度分别为 752bp 和 657bp 的两条 DNA 片段 (Up3 和 Down3 片段 )。其中， PCR 按 如下方式进行 ： 94变性 30s( 秒 )， 52退火 30s( 秒 )， 以及 72延伸 30s( 秒 )(30 个循 环 )。其中， 引物序列如下 ： 0043 P5 ： 5 -CGCGGATCCCGTCACA。
29、CGATCCGATACCT-3 ( 下划线表明 BamHI 酶切位点 ) 0044 P6 ： 5 -CGGCAAGCAAATAGTTGTTATACGACTTCCTGGCTACCAT-3 ( 下划线表明点突变 ) 0045 P7 ： 5 -ATGGTAGCCAGGAAGTCGTATAACAACTATTTGCTTGCCG-3 ( 下划线表明点突变 ) 0046 P8 ： 5 -ATTGCGGCCGCCATGGGGCGATTTCCTGATG-3 ( 下划线表明 NotI 酶切位点 ) 说 明 书 CN 103146772 A 6 5/6 页 7 0047 将上述两条D N A片段经琼脂糖凝胶电泳分离。
30、纯化后， 再以上述两条D N A片段混 合为模板， 以P5和P8为引物， 通过Overlap PCR扩增长约1400bp的片段(命名为Up-Down2 片段 )。其中， PCR 按如下方式进行 ： 94变性 30s( 秒 )， 52退火 30s( 秒 )， 以及 72延 伸 60s( 秒 )(30 个循环 )。 0048 将琼脂糖凝胶电泳分离纯化后的 Up-Down2 和 pKOV 质粒 ( 可购自 Addgene 公 司 ) 分别用 BamHI/NotI 双酶切， 经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后连接， 获得用于导入的载体 pKOV-Up-Down2， 并将载体 pKOV-Up-Down2 送测序。
31、公司进行测序鉴定， 表明其含有终止密码 子前 90bp 碱基缺失的 acnA 基因片段， 保存备用。 0049 根据 Addgene 公司的 pKOV 质粒的商品指南， 将构建好的 pKOV-Up-Down2 质粒分 别电转化入低产 L- 赖氨酸的 E.coli NRRL B-12185 菌株 ( 可购自美国农业菌种保藏中 心 (Agricultural Research Service Culture Collection ； NRRL) ； 其构建方法可参见 US4346170A)和高产L-赖氨酸的E.coli K12W31103菌株(可购自中科院微生物研究所， 其为经 E.coli K1。
32、2W3110 诱变突变得到的赖氨酸生产工程菌 )( 经测序确认这两个菌株染 色体上均保留有野生型的 acnA 基因及其上下游元件 )， 挑选出同源重组阳性的单克隆， 经 测序确认其染色体上的野生型 acnA 基因的终止密码子前 90bp 碱基缺失， 分别得到 acnA 酶 活性降低的 ( 低 / 高产 L- 赖氨酸 ) 大肠杆菌。经检测， 获得的两个菌株的乌头酸酶酶活性 下降了约 60 80 ( 在不同培养基中略有差异 )。 0050 效果实施例赖氨酸发酵实验 0051 将 E.coli K12W31103 菌株、 E.coli NRRL B-12185 菌株以及实施例 1 和 2 的菌 株分。
33、别接种在 25mL 表 1 所述的种子培养基中， 于 37、 220rpm 培养 9h。然后取 1mL 种子培 养基的培养物接种在 25mL 表 1 所述的发酵培养基中， 于 37、 220rpm 培养培养 48h。当培 养完成时， 通过 HPLC 测定 L- 赖氨酸的产生。 0052 表 1 培养基配方 0053 说 明 书 CN 103146772 A 7 6/6 页 8 0054 0055 结果， E.coli K12W31103菌株以及实施例1和2的高产L-赖氨酸的菌株的L-赖 氨酸产量分别为10.2g/L、 16.1g/L和12.5g/L ； E.coli NRRL B-12185菌株以及实施例1和 2 的低产 L- 赖氨酸的菌株的 L- 赖氨酸产量分别为 1.5g/L、 2.1g/L 和 1.8g/L， 可见， 无论对 于高产还是低产 L- 赖氨酸的原始菌株， acnA 基因的起始密码子突变或其酶活性降低的大 肠杆菌都有助于 L- 赖氨酸产量的提高。 说 明 书 CN 103146772 A 8 1/2 页 9 0001 0002 序 列 表 CN 103146772 A 9 2/2 页 10 序 列 表 CN 103146772 A 10 。