一种用精液蛋白基因检测昆虫卵孵化率的方法.pdf

本发明公开了一种用精液蛋白基因检测昆虫卵孵化率的方法。本发明提供了用于检测取食不同物质的昆虫种群的精液蛋白CSSFP066编码基因表达量的物质在检测取食不同物质的昆虫种群卵孵化率中的应用；所述精液蛋白CSSFP066的氨基酸序列为序列表中的序列2。本发明的实验证明，本发明所提供的检测方法可以用于检测昆虫卵孵化率，特别是不同营养源的蠋蝽的卵孵化率，用本发明的检测方法检测昆虫的卵孵化率仅需2-3天。而用传统的生物学方法需要30-60天左右。本发明的检测方法涉及的材料来源广，易购买，操作简单，省时，省力，适合于在昆虫商品检验检测中推广应用。

权利要求书用于检测精液蛋白CSSFP066编码基因表达量的物质在检测昆虫卵孵化率中的应用；
所述精液蛋白CSSFP066的氨基酸序列为序列表中的序列2。
根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述昆虫为昆虫个体或昆虫种群；
所述精液蛋白CSSFP066编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列1或序列表中的序列1自5’末端第1‑312位核苷酸；
所述昆虫具体为蠋蝽。
根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述用于检测精液蛋白CSSFP066编码基因表达量的物质为如下1）‑3）中任意一种：
1）引物对A：所述引物对由引物1和引物2组成；所述引物1的核苷酸序列为序列表中序列3；所述引物2的核苷酸序列为序列表中序列4；
2）含有所述引物对A的RT‑PCR试剂；
3）含有所述引物对A或所述RT‑PCR试剂的试剂盒。
根据权利要求3所述的应用，其特征在于：
所述RT‑PCR试剂由水、RT‑PCR扩增缓冲液、镁离子、dNTPs、所述的引物对A、荧光染料和Taq酶组成；
所述引物对A中的各条引物在所述RT‑PCR试剂中的终浓度具体为0.2‑1μM，所述引物对A中的各条引物在所述RT‑PCR试剂中的终浓度进一步具体为0.25uM；
所述试剂盒还包括内参引物对B，所述内参引物对B由引物3和引物4组成；所述引物3的核苷酸序列为序列表中的序列6；所述引物4的核苷酸序列为序列表中的序列7。
一种检测昆虫卵孵化率的方法，包括如下步骤：用权利要求3或4应用中所述的引物对A或所述的RT‑PCR试剂或所述的试剂盒对待测的昆虫A和B进行RT‑PCR扩增；
若所述昆虫A的精液蛋白CSSFP066基因的表达量高于所述昆虫B，则所述昆虫A的卵孵化率高于所述昆虫B。
根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述昆虫为昆虫个体或昆虫种群；
所述RT‑PCR扩增的模板为昆虫的cDNA；
所述昆虫具体为蠋蝽。

说明书一种用精液蛋白基因检测昆虫卵孵化率的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用精液蛋白基因检测昆虫卵孵化率的方法。
背景技术
害虫生物防治在农林业可持续发展中发挥着不可替代的重要作用。天敌昆虫的大量生产更是生物防治中最基础也是最重要的环节。捕食性天敌昆虫蠋蝽（Armachinensis）可以控制来自鳞翅目、鞘翅目、半翅目、同翅目、膜翅目等多种农林害虫，尤其是它还可以控制重大外来入侵害虫马铃薯甲虫和美国白蛾，因此蠋蝽是一种应用前景很好的天敌昆虫商品。
作为商品，大量减少生产成本是人们追求利润最大化的一个途径。在天敌昆虫蠋蝽生产中就可以应用不同的食物来生产蠋蝽，例如，不同的昆虫猎物、含昆虫成分的人工饲料和不含昆虫成分的人工饲料，进而减少生产成本。但是应用不同的食物生产出来的蠋蝽的生物学特性参差不齐，有些释放后能达到很好的控制害虫的作用，有的则在释放后效果不显著。由于不同食物饲喂的蠋蝽在表型上很难区分，因此这些天敌昆虫在释放前是很难评估它们的生物学特性的。
蠋蝽成虫的卵孵化率是评价天敌昆虫生物学特性的一个很重要的指标。有较高卵孵化率的蠋蝽种群繁殖快，倍增时间短，可以在短期内迅速控制住害虫。这可以大大减少防治害虫的成本，增加利润率。相反，卵孵化率较低的蠋蝽由于卵孵化少、繁殖慢，倍增时间延长，因此控制住害虫的时间会相对滞后，这就大大增加了防治成本，减少了利润。目前，对于不同食物来源或不同商家的商品蠋蝽卵孵化率的检测方法仍旧是在产卵期或人为规定的时间内测试其卵孵化率的多少，这种方法费时费力费钱。因此需要一种快速检测天敌昆虫商品生物学特性‑卵孵化率的方法。
昆虫体内，精液蛋白(seminal fluid protein CSSFP066)产生于雄虫附腺中，它可以刺激精子的储存、延迟精子的替代和竞争、显著地增加雄虫的适切性。
发明内容
本发明的一个目的是提供用于检测精液蛋白CSSFP066编码基因表达量的物质用途。
本发明提供的用于检测精液蛋白CSSFP066编码基因表达量的物质在检测昆虫卵孵化率中的应用；
所述精液蛋白CSSFP066的氨基酸序列为序列表中的序列2。
上述应用中，所述昆虫为昆虫个体或昆虫种群；
所述昆虫种群具体为取食不同物质昆虫种群；所述取食不同物质昆虫种群进一步具体为取食人工饲料的昆虫种群或取食猎物的昆虫种群；
所述精液蛋白CSSFP066编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列1或序列表中的序列1自5’末端第1‑312位核苷酸。
所述昆虫具体为蠋蝽。
上述人工饲料按照如下方法制备：生猪肝60g、大豆粉10g、水100ml、鸡蛋20ml、干酪素2g、蔗糖8g、VC0.2g、氯化胆碱0.4g、泛酸钙8mg、叶酸0.1mg、烟酰胺0.2mg、庆大霉素3.9mg；具体饲喂方法见实施例2；
上述猎物为柞蚕（Antheraea pernyi）蛹；具体饲喂方法见实施例2。
上述应用中，所述用于检测精液蛋白CSSFP066编码基因表达量的物质为如下1）‑3）中任意一种：
1）引物对A：所述引物对由引物1和引物2组成；所述引物1的核苷酸序列为序列表中序列3；所述引物2的核苷酸序列为序列表中序列4；
2）含有所述引物对A的RT‑PCR试剂；
3）含有所述引物对A或所述RT‑PCR试剂的试剂盒。
上述应用中，所述RT‑PCR试剂由水、RT‑PCR扩增缓冲液、镁离子、dNTPs、所述的引物对A、荧光染料和Taq酶组成；
所述引物对A中的各条引物在所述RT‑PCR试剂中的终浓度具体为0.2‑1μM，所述引物对A中的各条引物在所述RT‑PCR试剂中的终浓度进一步具体为0.25μM；
所述试剂盒还包括内参引物对B，所述内参引物对B由引物3和引物4组成；所述引物3的核苷酸序列为序列表中的序列6；所述引物4的核苷酸序列为序列表中的序列7。
本发明的另一个目的是提供一种检测昆虫卵孵化率的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：用所述的引物对A或所述的RT‑PCR试剂或所述的试剂盒对待测的昆虫A和B进行RT‑PCR扩增；
若所述昆虫A的精液蛋白CSSFP066基因的表达量高于所述昆虫B，则所述昆虫A卵孵化率高于所述昆虫B。
上述方法中，所述昆虫为昆虫个体或昆虫种群；所述RT‑PCR扩增的模板为昆虫的cDNA；
所述昆虫具体为蠋蝽。
在本发明的实施例中，所述昆虫A为取食猎物的昆虫种群；所述昆虫B为取食人工饲料的昆虫种群。
本发明的实验证明，本发明所提供的检测方法可以通过检测精液蛋白CSSFP066基因表达量来检测不同种群的昆虫卵孵化率，特别是不同营养源的蠋蝽的卵孵化率。实验证明，用本发明的检测方法检测昆虫的卵孵化率仅需2‑3天。而用传统的生物学方法需要30‑60天左右。本发明的检测方法涉及的材料来源广，易购买，操作简单，省时，省力，适合于在昆虫商品检验检测中推广应用。
附图说明
图1为蠋蝽beta‑actin内参扩增曲线
图2为蠋蝽beta‑actin内参融解曲线
图3为蠋蝽精液蛋白CSSFP066基因扩增曲线
图4为蠋蝽精液蛋白CSSFP066基因融解曲线
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、检测昆虫卵孵化率的精液蛋白CSSFP066及其编码基因的发现和专用引物的设计
研究发现，精液蛋白基因是一种检测昆虫卵孵化率的很好的分子标记，因此本发明通过检测蠋蝽的精液蛋白(seminal fluid protein CSSFP066)编码基因的表达来检测蠋蝽的卵孵化率。
蠋蝽的精液蛋白CSSFP066编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列1或序列表中的序列1自5’末端第1‑312位核苷酸，该蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。
根据蠋蝽的精液蛋白CSSFP066编码基因设计用于扩增该编码基因的引物如下：
上游引物：TCACCAGTCCTTGCTTCGAC（序列3）；
下游引物：TGCACTCGTAGGGATTTTGTC（序列4）。
实施例2、精液蛋白CSSFP066或编码基因或专用引物在检测蠋蝽卵孵化率中的应用
下述实验中采用的蠋蝽（Arma chinensis，记载在Taxonomic and bionomic notes onArma chinensis(Fallou)(Hemiptera:Pentatomidae:Asopinae，Zootaxa，3382:41‑52,2012，公众可从中国农业科学院植物保护研究所获得)根据取食物质的不同分为两组，每组50只：
取食人工饲料组蠋蝽：饲喂人工饲料的蠋蝽（27±1°C,16:8(L:D)，75±5%RH）每天每头成虫饲喂160μl人工饲料，一直到蠋蝽自然死亡；
取食猎物组蠋蝽：饲喂猎物的蠋蝽（27±1°C,16:8(L:D)，75±5%RH）每对成虫饲喂一头猎物，每隔7‑15天根据猎物被取食情况更换一次猎物，一直到蠋蝽自然死亡；
人工饲料为生猪肝60g、大豆粉10g、水100ml、鸡蛋20ml、干酪素2g、蔗糖8g、VC0.2g、氯化胆碱0.4g、泛酸钙8mg、叶酸0.1mg、烟酰胺0.2mg、庆大霉素3.9mg；
猎物为柞蚕（Antheraea pernyi）蛹（可商购）。
一、蠋蝽cDNA的获得
1、蠋蝽RNA抽提
步骤如下：
将各组蠋蝽样品移入加入适量液氮的研钵中，快速、用力研磨成匀浆，移至1.5ml离心管中。
加1000μlTri zol到1.5ml离心管中,静置5分钟。
加200μl氯仿，旋涡振荡10秒，静置5分钟，放入离心机中，12,000g4℃离心15分钟。
将上清液转移至新的1.5ml离心管中，加入等体积的异丙醇，振荡混匀，‑20℃放置1小时，室温静置10分钟。
放入离心机中，12,000g，4℃离心10分钟。
弃上清液，将异丙醇除尽，加入1ml75%的无水乙醇，12,000g，4℃离心5分钟。
弃上清液，待沉淀干燥后加入DEPC处理水，‑80℃保存，得到RNA。
2、反转录
采用SuperscriptШReverse Transcriptasekit试剂盒(Invitrogen18080044)进行反转录：
a)取一灭菌的无RNA酶的eppendorf管,每个样本加入如下表1所示的组分得到mix1；
表1为反转录加入组分1
组分体积来源Up to5μg total RNA5μl Primer(50μM oligio(dt)0.5μlInvitrogenRandom primer0.5μlInvitrogen10mM dNTP Mix1μlInvitrogenDEPC‑treated water5μl Total12μl 
b)把mix165℃温浴5分钟，然后立即放冰上1分钟；
c)在mix1里加入如下表2所示的成分，得到mix2共20μl体系；
表2为反转录加入组分2

d)25℃处理5分钟；
e)50℃处理60分钟；
f)70℃处理15分钟,立即放置到冰上；
g)得到cDNA，且该cDNA可以在‑20℃保存半年。
二、RT‑PCR扩增
RT‑PCR扩增体系中各组分的体积如下表3所示，采用SYBR(R)Green I NucleicA kit(Invitrogen S7567)：
表3为PCR扩增体系中各组分的体积


PCR反应条件如表4所示：
表4为PCR反应条件
循环循环周期95℃,2分钟 40次循环第一步变性：95℃,10秒 第二步退火：60℃,30秒溶解曲线60℃‑95℃，每5秒增加0.5℃
以蠋蝽beta‑actin(ACTB)作为内参基因（序列5），扩增该内参基因的引物如下：
内参上游引物：TGTCCAAGCAGGAGTACGAC（序列6）；
内参下游引物：GGTTCCTCTTTGGAGTCCGATT（序列7）。
若取食猎物的蠋蝽组中的精液蛋白CSSFP066基因平均表达量高于取食人工饲料的蠋蝽组，则取食猎物的蠋蝽组卵孵化率高于取食人工饲料的蠋蝽组。
结果如图1‑4所示，图1为两组蠋蝽beta‑actin内参扩增曲线；图2为两组蠋蝽beta‑actin内参融解曲线；图3为两组蠋蝽精液蛋白CSSFP066基因扩增曲线；图4为两组蠋蝽精液蛋白CSSFP066基因融解曲线；可以看出，扩增曲线平滑，重复性好；溶解曲线呈单一峰，说明没有非特异性扩增，荧光定量结果准确。
蠋蝽beta‑actin(ACTB)内参基因ct值如表5所示：
表5为各组蠋蝽beta‑actin(ACTB)内参基因ct值

蠋蝽精液蛋白CSSFP066基因定量结果如表6所示：
表6为各组蠋蝽精液蛋白CSSFP066基因定量结果


从上述结果中发现，与取食昆虫猎物的蠋蝽相比，取食人工饲料的蠋蝽的精液蛋白CSSFP066基因的表达量极低，已经检测不到其存在；而在取食昆虫猎物的蠋蝽中可以检测到该精液蛋白基因的存在；这证明，取食昆虫猎物的蠋蝽组的卵孵化率比取食人工饲料的蠋蝽组的卵孵化率高。
通过传统的生物学方法（按照上述两组的方法饲喂，每天记录从卵块孵化的一龄若虫数量来计算卵的孵化率）检测饲料组蠋蝽和猎物组蠋蝽的卵孵化率，取食昆虫猎物的蠋蝽和取食人工饲料的蠋蝽一生中平均卵孵化率分别为96.1%和67.5%；可以看出，该检测结果与用传统生物学方法检测的结果相一致，证明本发明的方法正确。
结果表明，用本发明的检测方法可以快速检测不同营养源的蠋蝽的精液蛋白CSSFP066基因的表达量的变化，以此来判断活体种群的卵孵化率的差异。
因此本发明的检测精液蛋白CSSFP066基因表达的物质可以作为分子标记用于检测取食不同营养源的蠋蝽种群的卵孵化率；而用于扩增精液蛋白CSSFP066基因的引物或者RT‑PCR试剂可以作为检测取食不同营养源的蠋蝽种群的卵孵化率试剂盒的组分；
上述RT‑PCR试剂由超纯水、10×PCR扩增buffer、镁离子、dNTPs、上游引物、SYBR（SYBR Green I荧光染料）、下游引物、Taq酶组成；其中镁离子在RT‑PCR试剂中的终浓度为1.25mM；dNTPs中每一种在RT‑PCR试剂中的终浓度为0.25mM；上游引物和下游引物在在RT‑PCR试剂中的终浓度均为0.25μM；Taq酶在RT‑PCR试剂中的终浓度为0.05u/μl。