玉米低植酸基因的分子标记及其应用.pdf

上传人:罗明 文档编号:5261285 上传时间:2018-12-30 格式:PDF 页数:12 大小:1.91MB
返回 下载 相关 举报
摘要
申请专利号:

CN201210391319.2

申请日:

2012.10.16

公开号:

CN103060314A

公开日:

2013.04.24

当前法律状态:

授权

有效性:

有权

法律详情:

授权|||实质审查的生效IPC(主分类):C12N 15/11申请日:20121016|||公开

IPC分类号:

C12N15/11; A01H1/04; A01H1/02; C12Q1/68

主分类号:

C12N15/11

申请人:

河北农业大学

发明人:

刘国振; 高庆华; 孟义江; 刘丽娟; 贾盟; 张萃; 窦世娟; 李莉云; 兰金苹; 魏健

地址:

071001 河北省保定市乐凯南大街2596号

优先权:

专利代理机构:

代理人:

PDF下载: PDF下载
内容摘要

本发明公开了属于作物分子标记领域的玉米低植酸基因的两个分子标记,扩增该两个分子标记的引物对分别为IDP7818和IDP7635,其中引物对IDP7818由SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示的核苷酸序列组成;引物对IDP7635由SEQ ID No:3和SEQ ID No:4所示的核苷酸序列组成。本发明还公开了利用低植酸基因的分子标记培育低植酸玉米品种的方法以及检测试剂盒等。本发明玉米低植酸基因的分子标记为对玉米低植酸性状进行辅助选择提供了有效手段,选择结果准确可靠,并且育种周期短、育种效率高;此外,利用分子标记辅助选择方法简单、成本低,适于进行大规模的育种后代选择。

权利要求书

权利要求书玉米低植酸基因的分子标记,其特征在于所述的分子标记为两个,扩增该2个分子标记的引物对分别为IDP7818和IDP7635,其中引物对IDP7818由SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示的核苷酸序列组成,引物对IDP7635由SEQ ID No:3和SEQ ID No:4所示的核苷酸序列组成。
按照权利要求1所述的玉米低植酸基因的分子标记,其特征在于所述的玉米低植酸基因为lpa319。
按照权利要求1所述的玉米低植酸基因的分子标记,其特征在于利用引物对IDP7818进行PCR扩增所得的特异片段大小为410bp。
按照权利要求1所述的玉米低植酸基因的分子标记,其特征在于利用引物对IDP7635进行PCR扩增所得的特异片段大小为230bp。
权利要求1所述的玉米低植酸基因的分子标记在低植酸玉米育种上的应用;所述的低植酸基因是lpa319。
利用权利要求1所述的低植酸基因的分子标记培育低植酸玉米品种的方法,其特征在于包括以具有低植酸基因lpa319的玉米品种为亲本之一,通过回交、杂交或组织培养的方法培育低植酸玉米自交系,主要是在后代中选择同时具有低植酸基因lpa319的两个分子标记、并且农艺性状优良的后代,连续进行4‑5代,即可获得低植酸玉米自交系;其中所述的两个分子标记是在苗期提取的叶片总DNA为模板,然后分别以IDP7818和IDP7635为引物进行PCR扩增而得的大小分别为410bp和230bp的特异片段。
按照权利要求6所述的培育低植酸玉米品种的方法,其特征在于所述的具有低植酸基因lpa319的玉米品种是齐319或带有低植酸基因lpa319的衍生系。
利用权利要求1所述的玉米低植酸基因的分子标记培育低植酸玉米品种的回交育种方法,其特征在于包括以带有低植酸基因lpa319的玉米自交系为非轮回亲本,以另一不带有低植酸基因的农艺性状优良的自交系为轮回亲本进行杂交和回交,在回交后代中选择同时带有低植酸基因lpa319的两个分子标记、并且农艺性状优良的植株;重复回交4‑5次,最后对于同时具有2个分子标记的后代,再自交1次,即可获得低植酸基因lpa319纯合的新的低植酸玉米自交系;所述的两个分子标记是在以苗期提取的叶片总DNA为模板,分别以IDP7818和IDP7635为引物进行PCR扩增而得的大小分别为410bp和230bp的特异片段。
用于扩增权利要求1所述的玉米低植酸基因的分子标记的引物对,其特征在于所述的引物对分别为IDP7818和IDP7635,其中引物对IDP7818由SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示的核苷酸序列组成;引物对IDP7635由SEQID No:3和SEQ ID No:4所示的核苷酸序列组成。
一种玉米低植酸基因分子标记的检测试剂盒,其特征在于包括用于PCR扩增的引物对IDP7818和IDP7635;其中引物对IDP7818由SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示的核苷酸序列组成;引物对IDP7635由SEQ ID No:3和SEQ ID No:4所示的核苷酸序列组成。

说明书

说明书玉米低植酸基因的分子标记及其应用
技术领域
本发明属于作物分子标记领域,具体涉及一种玉米低植酸基因的分子标记,以及该分子标记在玉米低植酸基因辅助选择上的应用。
背景技术
植酸又称肌醇‑6‑磷酸,是玉米、小麦、大麦、水稻和大豆等籽粒中广泛存在的一种有机酸(Stephens L等.Journal of Biological Chemistry.1993.268:4009‑4015),植酸含有12个可解离的氢原子(Johnson LF等.CanadianJournal of Chemistry,1969.47:63‑73),这些位点可与K+、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Zn2+、Ba2+和Fe3+等阳离子结合形成植酸盐(Lott JNA等.Seed Development andGermination.Marcel Dekker,New York,1995,pp.215‑235。Otegui MS等.The Plant Cell,2002.14:1311‑1327)。植酸及植酸盐不能被人和单胃动物吸收利用;植酸摄入体内后还会和其他来源的微量营养元素结合形成植酸盐,造成这些营养元素的生物有效性下降,从而造成微量元素缺乏症。此外,大量的植酸及植酸盐随粪便排出,造成严重环境污染,尤其是水体富营养化。由于土壤中缺乏分解微生物,即使畜禽粪便作有机肥还田仍不能被作物吸收利用。
应用低植酸作物可大大降低动物粪便等排泄物中磷的含量,从而显著减轻由于磷过量排放所引起的环境污染和水体富营养化等问题。在鱼的日粮中用低植酸玉米代替普通玉米,可减少粪磷41%。当磷的含量降到鱼的最低需要量时,用低植酸玉米代替普通玉米效果更明显。因此,降低作物籽粒中的植酸含量有利于提高作物和人畜对磷的利用效率,从而减轻此类污染。植酸是作物籽粒中主要含磷化合物,通常占籽粒干重的1%以上,占全磷含量的65‑85%。在玉米籽粒中,约90%的植酸贮存于盾片层中,糊粉层所含植酸约占总量的10%。植酸对作物的生长发育具有重要的作用,但在玉米种子用作饲料时,由于单胃动物缺少水解植酸的酶类,不能对植酸磷进行很好的吸收和利用,所以植酸磷实际上是一种抗营养因子。此外,植酸盐排出动物体后,也会对水体环境产生负面影响。为降低动物排泄物中的植酸含量,保护生态环境,动物饲料中往往要添加植酸酶,用来降解植酸,但由此会带来成本提高。中国农科院生物技术研究所通过转基因在玉米种子中表达植酸酶,有望在饲料加工过程中对植酸进行降解,以实现降低饲料植酸的目的,该转基因玉米材料已经获得环境释放安全证书(农基安证字(2009)第074号)。通过育种手段降低作物中植酸的含量,是解决与植酸相关的营养和环保问题的新途径。
迄今为止,通过理化诱变等方法,在玉米、小麦、水稻、大豆等作物中获得了植酸含量较低的突变体,在这些突变体中,植酸含量均表现为下降,相应地无机磷以及肌醇磷酸盐含量上升。低植酸突变大多表现为隐性突变,并受单基因控制,其控制基因主要是参与或调控植酸的合成代谢。低植酸突变体有三种类型,分别命名为lpa1、lpa2和lpa3,其中lpa1和lpa2突变体的植酸含量下降66%和30%,lpa3的植酸含量介于二者之间(Raboy,Gerbasi等.PlantPhysiol 2000,124(1):355‑368.Shi,Wang等.Plant J,200542(5):708‑719)。
三种类型的低植酸突变在玉米中均有报道,它们分别受不同的基因控制,lpa1是由于玉米多药抗性蛋白4基因(Multidrug resistance‑associatedprotein 4,简写为ZmMRP4)的突变造成的,该突变使体内合成的植酸向胞外运输受阻,形成负反馈抑制,造成植酸的合成量降低;另外,植酸合成的关键酶肌醇磷酸合成酶(Myo‑inositol phosphate synthase,简写为MIPS)的表达量下降也会产生lpa1表型;lpa2是植酸合成途径下游的肌醇磷酸激酶(简写为ZmIpk)基因突变造成的,其中lpa2‑1是由于ZmIpk的插入失活造成的,lpa2‑2是由于玉米肌醇磷酸激酶(ZmIpk)中的一个核苷酸突变导致开放阅读框的提前终止,产生无功能的蛋白质造成的;lpa3是由于肌醇激酶(MIK)基因发生突变引起肌醇积累造成的(Shi,Wang等.Plant J.2005,42(5):708‑719)。lpa1和lpa2位点都定位于1号染色体短臂(Shi,Wang等.Nat Biotechnol.2007,25(8):930‑937.Pilu,Panzeri等.Heredity.2009,102(3):236‑245.Cerino Badone,Amelotti等.J Hered.2012 103(4):598‑605.),lpa3定位于1号染色体的长臂上(Shi,Wang等.Plant J.2005,42(5):708‑719)。
利用诱变处理,我国从玉米自交系黄C和X178中获得了6个低植酸突变体,与野生型相比,植酸磷下降了43‑79%(王雪艳等.核农学报.2006,20(1):404‑408)。河北农业大学从20份常用玉米自交系中,筛选到低植酸自交系齐319,将该自交系与Lpa241/lpa241杂交,通过8粒F1种子的分离结果,初步认为该低植酸性状受隐性单基因控制(王晖等.作物学报.2008,34(1):95‑99)。
专利《一种低植酸玉米品种的育种方法》(专利号为:ZL200710002627.0)公开了利用低植酸玉米自交系齐319选育低植酸玉米品种的方法,但是由于该低植酸性状受单隐性基因控制,因此每次杂交后需要自交一代,以便通过隐性性状纯合,再通过测定其无机磷含量对低植酸性状进行选择,该方法存在育种周期长,方法繁琐,成本高等缺点。
发明内容
本发明目的在于提供一种玉米低植酸基因的分子标记,利用该分子标记可对玉米低植酸基因进行分子标记辅助选择,从而对育种后代的隐性低植酸基因进行直接选择,而且不必进行自交,也不必对育种后代进行无机磷含量检测,育种周期短,育种效率高。
本发明另一目的在于提供上述玉米低植酸基因的分子标记在低植酸玉米育种上的应用。
本发明第三目的在于提供利用上述玉米低植酸基因的分子标记培育低植酸玉米品种的方法。
本发明第四目的在于提供用于扩增上述玉米低植酸基因分子标记的引物对。
本发明第五目的在于提供含有玉米低植酸基因分子标记的检测试剂盒。
本发明玉米低植酸基因的分子标记,所述的分子标记为两个,扩增该2个分子标记的引物对分别为IDP7818和IDP7635,其中引物对IDP7818由SEQ IDNo:1和SEQ ID No:2所示的核苷酸序列组成,即:
上游引物:5’GATTACCTGAACGGGAAGGG 3’(SEQ ID No:1),
下游引物:5’CGTGGTTGTTAAGGTAGGGC 3’(SEQ ID No:2);
引物对IDP7635由SEQ ID No:3和SEQ ID No:4所示的核苷酸序列组成,即:
上游引物:5’ACCACCACCTCAACTTCTCG 3’(SEQ ID No:3),
下游引物:5’AGCACCCTCTTGTAGAACGG 3’(SEQ ID No:4)。
上述分子标记中所述的玉米低植酸基因位于玉米第2号染色体的长臂上,命名为lpa319;利用引物对IDP7818扩增所得的分子标记与Lpa319的遗传距离为0.6cM,利用引物对IDP7635扩增所得的分子标记与lpa319的遗传距离为1.9cM,两个分子标记分别位于lpa319的两侧。因以前所报道的玉米低植酸基因lpa1、lpa2、lpa3都位于玉米第1号染色体上,而本发明的玉米低植酸基因lpa319位于玉米第2号染色体上,因此推断lpa319为新的玉米低植酸基因。
上述分子标记,利用引物对IDP7818进行PCR扩增所得的特异片段大小约为410bp。
上述分子标记,利用引物对IDP7635进行PCR扩增所得的特异片段大小约为230bp。
上述分子标记,可以是以齐319的总DNA为模板,经过PCR扩增而得。
上述玉米低植酸基因的分子标记在低植酸玉米育种上的应用;所述的低植酸基因是lpa319,lpa319位于玉米第2号染色体的长臂上。
利用上述低植酸基因的分子标记培育低植酸玉米品种的方法,包括以具有低植酸基因lpa319的玉米品种为亲本之一,通过回交、杂交或组织培养的方法培育低植酸玉米自交系,主要是在后代中选择同时具有低植酸基因lpa319的两个分子标记、并且农艺性状优良的后代,连续进行4‑5代,即可获得低植酸玉米自交系;其中所述的两个分子标记是在苗期提取的叶片总DNA为模板,然后分别以IDP7818和IDP7635为引物进行PCR扩增而得的大小分别为410bp和230bp的特异片段。
上述培育低植酸玉米品种的方法中所述的具有低植酸基因lpa319的玉米品种可以是齐319或带有低植酸基因lpa319的衍生系。
上述培育低植酸玉米品种的方法中所述的农艺性状优良属于本领域技术人员熟知的概念。
利用上述玉米低植酸基因的分子标记培育低植酸玉米品种的回交育种方法,包括以带有低植酸基因lpa319的玉米自交系为非轮回亲本,以另一不带有低植酸基因的农艺性状优良的自交系为轮回亲本进行杂交和回交,在回交后代中选择同时带有低植酸基因lpa319的两个分子标记、并且农艺性状优良的植株;重复回交4‑5次,最后对于同时具有2个分子标记的后代,再自交1次,即可获得低植酸基因lpa319纯合的新的低植酸玉米自交系;所述的两个分子标记是在以苗期提取的叶片总DNA为模板,分别以IDP7818和IDP7635为引物进行PCR扩增而得的大小分别为410bp和230bp的特异片段。
上述方法中所述的带有低植酸基因lpa319的玉米自交系是指齐319或带有低植酸基因lpa319的衍生系。
上述育种方法中所述的农艺性状优良属于本领域技术人员熟知的概念。
本发明用于扩增上述玉米低植酸基因的分子标记的引物对,所述的引物对分别为IDP7818和IDP7635,其中引物对IDP7818由SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示的核苷酸序列组成;引物对IDP7635由SEQ ID No:3和SEQ ID No:4所示的核苷酸序列组成。
含有上述玉米低植酸基因分子标记的检测试剂盒,包括用于PCR扩增的引物对IDP7818和IDP7635;其中引物对IDP7818由SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示的核苷酸序列组成;引物对IDP7635由SEQ ID No:3和SEQ ID No:4所示的核苷酸序列组成。
与现有技术相比,本发明具有的优点和有益效果为:(1)、本发明玉米低植酸基因的分子标记为在分子水平上对玉米低植酸性状进行辅助选择提供了有效手段,利用本发明的分子标记对玉米低植酸基因进行选择准确可靠;(2)、与现有技术相比,利用本发明的分子标记可对育种的后代的低植酸基因直接进行选择,不必像传统方法那样需要自交使隐性性状表达后再进行选择,因而利用本发明分子标记具有育种周期短、育种效率高等优点;(3)、本发明分子标记选择仅是进行PCR扩增,可直接在在分子水平上进行选择,方法简单快速,成本低,适于在育种中大规模群体选择应用;而传统方法则需要对籽粒进行进行染色鉴定,方法繁琐、准确性差、费时费力,成本高,育种规模受到限制。
附图说明
图1.为用引物对IDP7818进行PCR扩增所得的电泳图谱;其中1为Marker;2为齐319;3为Lpa241;4为F1代。
图2.用引物对IDP7635进行PCR扩增所得的电泳图谱;其中1为Marker;2为齐319;3为Lpa241;4为F1代。
图3.为用引物对IDP7818进行PCR扩增所得F2个体的电泳图谱;其中1为齐319,2为Lpa241,3~15为F2个体。
图4.为用引物对IDP7635进行PCR扩增所得F2个体的电泳图谱;其中1为齐319,2为Lpa241,3~15为F2个体。
图5.为低植酸基因lpa319与分子标记在染色体上的相对位置示意图。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明作进一步的说明,但是对本发明的保护范围不构成任何限制。
实施例1 玉米低植酸F2分离群体的构建及低植酸性状遗传分析
按照如下方法进行:
(1)在河北省保定市河北农业大学玉米试验田中以自交系Lpa241(Lpa241不含低植酸基因)为母本,以低植酸自交系齐319为父本杂交,收获得F1代种子;
(2)次年种植F1代并套袋自交,获得F2代种子;
(3)对F2代种子采用钼酸铵定磷比色法检测无机磷含量,确定低植酸的个体;用χ2=∑(实得数‑预期数)2/预期数检验F2代群体的分离结果;统计分析依据《遗传学》(刘祖洞.1999,遗传学.北京:高等教育出版社)中的方法进行。
钼酸铵定磷比色法测定玉米籽粒的无机磷含量的方法为:取待测籽粒,按单粒称重,磨碎(留一部分用于提取总DNA),置于96孔V型酶标板,然后按样品质量每毫克加入10μL的0.4mol/L盐酸,4℃下过夜提取,次日取提取液10μL于新的酶标板,加入蒸馏水90μL和新鲜配制的显色剂(3mol/L浓硫酸∶2.5%(W/V)的钼酸铵∶10%(W/V)的抗坏血酸∶蒸馏水=1∶1∶1∶2)100μL,室温下静置1h,然后进行比色测定;每个酶标板上设置5个用磷酸氢二钾配制的标准磷,容积均为200μL,含磷量分别为0μg、0.15μg、0.46μg、0.93μg和1.39μg,显色后呈现不同深度的蓝色,与标准磷样品的颜色对比,可对F2代种子的无机磷含量进行定性检测。通过对8个F1后代的2184个F2代籽粒进行钼酸铵显色分析,发现有509个籽粒表现高无机磷(低值酸)性状,其余1675个籽粒表现低无机磷性状(表1)。经卡方测验表明,F2代的分离符合3∶1的分离比例,单独对不同F1后代的F2籽粒分别进行卡方测验,也都符合3∶1的比率,说明该低植酸性状受单一隐性基因的控制。
表1 F2代籽粒低植酸性状检测和遗传分析结果


实施例2 玉米低植酸基因的分子标记的筛选和确定
详细步骤如下:
(1)以齐319和Lpa241的苗期新鲜叶片为材料,采用CTAB法(步骤参见文献Plant Mol Biol Rep,1983,1(4):19‑21)提取总DNA。
(2)从玉米数据库(http://www.maizegdb.org)选择简单重复序列(SSR)分子标记的400多对引物,分别以齐319和Lpa241的总DNA为模板进行PCR扩增,PCR反应体系(总体积为20μL)为:10μmol/L引物、Es Taq MasterMix和50ng模板DNA。在Biometra PCR仪上进行扩增,引物由上海生工生物工程技术服务公司合成。PCR反应程序为:94℃4min;94℃45s,55℃45s,72℃1min,35个循环;72℃10min。扩增产物用5%‑8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,经溴化乙锭染色后在凝胶成像仪(北京六一仪器厂)上观察并拍照。共筛选出在两个亲本间有多态性的引物140对。
(3),按照玉米基因组的连锁区域,从在两亲本间有多态性的140对引物中选择46对引物开展进一步的连锁分析,从1到10号染色体上的选择有多态引物数目依次为:8、9、5、5、4、2、5、3、2和3个,平均每条染色体4.6对引物基本覆盖整个玉米基因组。
(4)从Lpa241×齐319的F2群体中随机挑取12个表现低值酸的隐性个体(实施例1中检测),以两亲本齐319和Lpa241以及F1代为对照,利用所选的46对多态性引物进行PCR扩增,结果发现在2号染色体长臂上的IDP488和umc2205标记引物扩增时,分别有11和10个F2个体的带型与低值酸亲本齐319的带型一致,说明它们与本发明的低植酸基因是连锁的,由此推断本发明的低植酸基因位于玉米的第2号染色体上,而此前所报道的低植酸基因都是在玉米的第1号染色体上(Shi,Wang等.Nat Biotechnol.2007,25(8):930‑937;Pilu,Panzeri等.Heredity.2009,102(3):236‑245.;Shi,Wang等.Plant J.2005,42(5):708‑719),因此推断本发明的低植酸基因是一个新发现的玉米低植酸基因,命名为lpa319。
(5)为了进一步精细定位该基因,选择位于玉米第2号染色体长臂上IDP488和umc2205之间的6对IDP引物进行PCR扩增,所述的6对IDP引物为:IDP7426、IDP4142、IDP7818、IDP7635、IDP7292和IDP8999,结果其中的标记引物IDP7818和IDP7635在亲本间显示多态性(见图1和图2);其中以引物对IDP7818进行PCR扩增所得的特异性DNA片段大小为410bp;以引物对IDP7635进行PCR扩增所得的特异性DNA片段大小为230bp。
(6)用Lpa241×齐319的F2群体中随机挑取78个表现低值酸的隐性个体(实施例1中鉴定)通过上述(5)中的6个引物对进行PGR扩增,其中分别利用引物对IDP7818和引物对IDP7635进行PCR扩增所得DNA片段,分别有78和74个F2个体与低值酸亲本齐319的带型一致(见图3和图4),进一步证明了本发明的低植酸基因位于玉米的第2号染色体上。
(7)利用MAPMAKER/EXP 3.0软件进行连锁分析和遗传距离计算,结果以IDP7818和IDP7635分别为引物所得的两个分子标记与低植酸基因lpa319连锁,其遗传距离分别是0.6cM和1.9cM;根据玉米数据库(http://www.maizegdb.org)最终将该基因定位在第2染色体BAC号为AC191023.2和AC190771.2之间约80.0kb的区间内(见图5)。
从以上结果可以得出,本发明中涉及的玉米低植酸基因位于玉米第2号染色体上,与以前所报道的位于第1号染色体上的玉米低植酸基因不同,是一个新的低植酸基因。本发明以IDP7818和IDP7635引物对扩增产生的分子标记与低植酸基因lpa319连锁紧密,可用于鉴定筛选新的玉米低植酸材料,以及在低植酸育种中进行辅助选择,较之常规的方法准确、可靠,育种效率高,育种周期短,并且省时,省力,成本低。

玉米低植酸基因的分子标记及其应用.pdf_第1页
第1页 / 共12页
玉米低植酸基因的分子标记及其应用.pdf_第2页
第2页 / 共12页
玉米低植酸基因的分子标记及其应用.pdf_第3页
第3页 / 共12页
点击查看更多>>
资源描述

《玉米低植酸基因的分子标记及其应用.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《玉米低植酸基因的分子标记及其应用.pdf(12页珍藏版)》请在专利查询网上搜索。

本发明公开了属于作物分子标记领域的玉米低植酸基因的两个分子标记,扩增该两个分子标记的引物对分别为IDP7818和IDP7635,其中引物对IDP7818由SEQIDNo:1和SEQIDNo:2所示的核苷酸序列组成;引物对IDP7635由SEQIDNo:3和SEQIDNo:4所示的核苷酸序列组成。本发明还公开了利用低植酸基因的分子标记培育低植酸玉米品种的方法以及检测试剂盒等。本发明玉米低植酸基因的分。

展开阅读全文
相关资源
猜你喜欢
相关搜索

当前位置:首页 > 化学;冶金 > 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程


copyright@ 2017-2020 zhuanlichaxun.net网站版权所有
经营许可证编号:粤ICP备2021068784号-1