一种抑制枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶活性的多肽及其筛选方法和应用.pdf

本发明涉及一种氨基酸序列为SEQ ID No:1的多肽在抑制枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶（枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶简称BTG）活性中的应用。本发明抑制枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶活性的多肽通过融合蛋白的形式抑制BTG的活性，抑制率可达到60%以上，可使细胞毒性较强的BTG先以活性受抑制的形式在宿主细胞中表达，然后在凝血因子Xa（Factor Xa）的作用下，去除抑制物，又使其活性得到恢复。

权利要求书氨基酸序列为SEQ ID No:1的多肽在抑制枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶活性中的应用。
根据权利要求1所述的应用，其特征在于：应用的方法步骤如下：
将所述多肽和凝血因子Xa可识别酶切位点序列连接，形成polypeptide‑I‑E‑G‑R，枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶基因再定向克隆到polypeptide‑I‑E‑G‑R的下游，形成polypeptide‑I‑E‑G‑R‑BTG片段；该多肽以融合蛋白的形式抑制BTG的活性，经凝血因子Xa酶切后去除此多肽，恢复枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶活性。
抑制枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶活性的多肽，其特征在于：所述多肽为将SEQ ID No:1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且抑制枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶活性的多肽。
一种筛选抑制枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶活性多肽的方法，其特征在于：步骤如下：
⑴选择来源不同的链霉菌的谷氨酰胺转胺酶前肽序列；
⑵通过重叠延伸PCR将来源不同的链霉菌谷氨酰胺转胺酶前肽克隆到枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶的N端，两者之间添加凝血因子Xa识别序列连接； 
⑶将全部编码序列克隆入pET‑28a(+)的NdeI与HindIII酶切识别位点之间；
⑷在E.Coli BL21（DE3）菌株中重组表达，亲和层析纯化得到HIS融合的编码序列的融合蛋白；
⑸通过荧光法检测融合蛋白的酶活，筛选对枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶活性抑制率最高的前肽序列，即得抑制枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶活性的多肽。 
根据权利要求4所述的筛选抑制枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶活性多肽的方法，其特征在于：所述步骤⑴中来源不同的链霉菌为S.cinnamoneus、S.caniferus、S.fradiae、S.hygroscopicus、S.mobaraense、S.netropsis和S.platensis。
根据权利要求4所述的筛选抑制枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶活性多肽的方法，其特征在于：所述步骤⑸中荧光法检测的具体步骤如下： 
将纯化浓缩后的蛋白液各取500μL，平分成两份，其中的一份用凝血因子 Xa酶切6h，获得去除了N端多肽序列的成熟枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶，测得各蛋白液的荧光强度，计算得出酶活，通过比较未经凝血因子 Xa酶切的酶活相对于切割后的酶活，得到各多肽序列对枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶活性的抑制率。
根据权利要求6所述筛选抑制枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶活性多肽的方法，其特征在于：所述荧光强度的检测步骤为：
反应体系的总体积1mL：N,N‑二甲基酪蛋白0.67g/L，丹磺尸胺(MDC)8.33μmol/L，Tris·HCl pH7.5 50 mmol/L，DTT 3mmol/L，酶液200μL；反应体系于37℃反应30min，加入10mmol/L(NH4)2SO4终止反应，于激发波长350nm和发射波长500nm下检测荧光强度。

说明书一种抑制枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶活性的多肽及其筛选方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其是一种抑制枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶(枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶简称BTG)活性的多肽及其筛选方法和应用。
背景技术
谷氨酰胺转胺酶(transglutaminase，EC2.3.2.13，简称TG)，是一种催化酰基转移反应的酶，能催化蛋白质分子内、分子间以及蛋白质与氨基酸之间形成ε‑(γ‑Glu)‑Lys异肽键使其共价交联聚合，从而直接改变蛋白质本身以及蛋白质所附着的细胞、组织等的结构与功能，因而该酶在食品工业和医药工业中具有广泛的应用。TG的生产方法有动植物组织提取法和微生物发酵法两种。TG的早期生产采用动物组织提取法，但由于动物组织来源少、提取工艺复杂、回收率低、产品成本过于昂贵的缘故，酶的生产应用一直受到很大限制。微生物来源的TG因其酶活性不依赖Ca2+，且最有希望实现工业生产，引起了广泛关注，目前仅茂源链霉菌来源的TG实现了商业化生产应用在食品加工中。链霉菌属来源的TG具有信号肽和前肽，由于前肽的作用，使得链霉菌来源的TG在细胞内没有活性，而不损害细胞，然后通过信号肽分泌到细胞外，实现TG的生产。
和链霉菌来源的TG相比，枯草芽孢杆菌来源的TG研究要少得多，1996年才由Kobayashi等首次在枯草芽孢杆菌中发现了TG，其没有信号肽和前肽，只存在于芽孢上，交联芽孢表面蛋白，防止其被蛋白酶降解，从而起到保护芽孢的作用。由于TG具有蛋白交联的活性，对宿主细胞具有毒性作用，因此，虽然2007年葡萄牙Placido等实现BTG在大肠杆菌中表达，但是在不同的诱导和培养条件下酶得率都非常低。目前，仍难以大量制备枯草芽孢杆菌来源的BTG。
通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献：
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种抑制枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶活性的多肽及其筛选方法和应用，该多肽使BTG能够在宿主细胞低活性表达，减轻BTG对宿主细胞的毒性作用，而经过蛋白酶简单处理后其活性又能得到恢复，为BTG的高效表达奠定了基础。
本发明采取的技术方案是：
氨基酸序列为SEQ ID No:1的多肽在抑制枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶活性中的应用。
而且，应用的方法步骤如下：
将所述多肽和凝血因子Xa可识别酶切位点序列连接，形成polypeptide‑I‑E‑G‑R，枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶基因再定向克隆到polypeptide‑I‑E‑G‑R的下游，形成polypeptide‑I‑E‑G‑R‑BTG片段；该多肽以融合蛋白的形式抑制BTG的活性，经凝血因子Xa酶切后去除此多肽，恢复枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶活性。
抑制枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶活性的多肽，所述多肽为将SEQ ID No:1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且抑制枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶活性的多肽。
一种筛选抑制枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶活性多肽的方法，步骤如下：
(1)选择来源不同的链霉菌的谷氨酰胺转胺酶前肽序列；
(2)通过重叠延伸PCR将来源不同的链霉菌谷氨酰胺转胺酶前肽克隆到枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶的N端，两者之间添加凝血因子Xa识别序列连接；
(3)将全部编码序列克隆入pET‑28a(+)的NdeI与HindIII酶切识别位点之间；
(4)在E.Coli BL21(DE3)菌株中重组表达，亲和层析纯化得到HIS融合的编码序列的融合蛋白；
(5)通过荧光法检测融合蛋白的酶活，筛选对枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶活性抑制率最高的前肽序列，即得抑制枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶活性的多肽。
而且，所述步骤(1)中来源不同的链霉菌为S.cinnamoneus、S.caniferus、S.fradiae、S.hygroscopicus、S.mobaraense、S.netropsis和S.platensis。
而且，所述步骤(5)中荧光法检测的具体步骤如下：
将纯化浓缩后的蛋白液各取500μL，平分成两份，其中的一份用凝血因子Xa酶切6h，获得去除了N端多肽序列的成熟枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶，测得各蛋白液的荧光强度，计算得出酶活，通过比较未经凝血因子Xa酶切的酶活相对于切割后的酶活，得到各多肽序列对枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶活性的抑制率。
而且，所述荧光强度的检测步骤为：
反应体系的总体积1mL：N,N‑二甲基酪蛋白0.67g/L，丹磺尸胺(MDC)8.33μmol/L，Tris·HClpH7.550mmol/L，DTT3mmol/L，酶液200μL；反应体系于37℃反应30min，加入10mmol/L(NH4)2SO4终止反应，于激发波长350nm和发射波长500nm下检测荧光强度。
本发明的优点和积极效果是：
1、本发明抑制枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶活性的多肽通过融合蛋白的形式抑制BTG的活性，抑制率可达到60%以上，可使细胞毒性较强的BTG先以活性受抑制的形式在宿主细胞中表达，然后在凝血因子Xa(Factor Xa)的作用下，去除抑制物，又使其活性得到恢复。
2、本发明多肽由于可特异性抑制BTG的活性，而且可随时去除，解除抑制效应，可以应用于抑制枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶活性中，以及应用于制备枯草芽孢杆菌来源的谷氨酰胺转胺酶中。
3、本发明多肽的筛选方法如链霉菌来源的TG，在BTG的N端加上一段多肽，先通过多肽来抑制BTG的活性，使其低活性表达，继而通过蛋白酶的切割，去除多肽，解除对BTG的抑制，充分发挥其生物活性，从而减轻其对宿主细胞的毒性作用，为其能够实现在宿主细胞中的高效表达奠定基础。
附图说明
图1为本发明五种融合蛋白的纯化后浓缩图，泳道1‑5依次为his‑proCan‑I‑E‑G‑R‑BTG、his‑proFra‑I‑E‑G‑R‑BTG、his‑proHyg‑I‑E‑G‑R‑BTG、his‑proNet‑I‑E‑G‑R‑BTG、his‑proPla‑I‑E‑G‑R‑BTG；
图2为本发明另两种融合蛋白的纯化后浓缩图，泳道1‑2依次为his‑proMob‑I‑E‑G‑R‑BTG、his‑proCin‑I‑E‑G‑R‑BTG；
图3为本发明七种融合蛋白对BTG活性的抑制效果图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。
链霉菌属来源的TG具有信号肽和前肽，由于前肽的作用，使得链霉菌来源的TG在细胞内没有活性，无法起到交联蛋白的作用，从而不损害细胞。但是枯草芽孢杆菌来源的BTG没有信号肽和前肽，只有具有活性的成熟肽，因此希望通过链霉菌属TG的前肽来抑制BTG的活性。
选择与比较了来源于7种不同的链霉菌(S.cinnamoneus、S.caniferus、S.fradiae、S.hygroscopicus、S.mobaraense、S.netropsis、S.platensis)TG前肽序列，分别记为proCin、proCan、proFra、proHyg、proMob、proNet、proPla，与BTG结合及其抑制BTG的情况。主要通过重叠延伸PCR将来源不同的链霉菌TG前肽克隆到BTG的N端，两者之间添加FactorXa识别序列(ATCGAGGGAAGG)连接。再将全部编码序列克隆入pET‑28a(+)的NdeI与HindIII酶切识别位点之间，从而去除pET‑28a(+)载体上的T7·Tag，防止其对多肽抑制效应的干扰。在E.Coli BL21(DE3)菌株中重组表达，亲和层析纯化得到HIS融合的编码7种序列的融合蛋白his‑proCin‑I‑E‑G‑R‑BTG、his‑proCan‑I‑E‑G‑R‑BTG、his‑proFra‑I‑E‑G‑R‑BTG、his‑proHyg‑I‑E‑G‑R‑BTG、his‑proMob‑I‑E‑G‑R‑BTG、his‑proNet‑I‑E‑G‑R‑BTG、his‑proPla‑I‑E‑G‑R‑BTG。
本发明通过荧光法检测酶活，分析筛选得到了抑制作用较强的S.caniferus来源的TG前肽序列(序列表中序列1)。
一、抑制BTG活性的多肽的设计合成与活性筛选
1、多肽编码序列的设计合成
首先设计出7种不同多肽的编码序列，分别由A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7表示，该序列依次为7种TG前肽序列(proCin、proCan、proFra、proHyg、proMob、proNet、proPla)，Factor Xa特异识别序列以及BTG的N端31bp序列。由生物公司合成并克隆在pUC57的NdeI与HindIII酶切识别位点之间，质粒保存于E.Coli Top10中。(基因委托苏州金唯智生物科技有限公司合成)；
然后利用质粒小提试剂盒从E.ColiTop10中提取质粒，80μL体系双酶切3‑4h。
按以下次序，将各成分在灭菌薄壁离心管内混合，
反应组分                加入量
质粒                     50μL；
10×K Buffer             8μL；
NdeI                     2μL；
HindIII                  2μL；
ddH2O                    18μL；
总体积                   80μL。
最后全部经琼脂糖凝胶电泳及切胶回收得到上述多肽基因A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7，作为重叠PCR的上游基因。
2、BTG基因的获得
从本实验室保存的B.subtilis168中提取基因组作为模板，PCR获得BTG基因，作为重叠PCR的下游基因B。
上游引物P1：5’‑ATGATTATTGTATCAGGACAATTGCTCCGT‑3’
下游引物P2：5’‑CCCAAGCTTTTAGCGGACGATGCGG‑3'
按以下次序，将各成分在灭菌薄壁离心管内混合，
反应组分                   加入量
10×Probest buffer         5μL；
dNTP                       5μL；
上游引物P1(10pmol/L)       2μL；
下游引物P2(10pmol/L)       2μL；
质粒                       2μL；
Probest高保真酶            0.2μL；
ddH2O                      33.8μL；
总体积                     50μL。
扩增条件：95℃5min，1个循环；94℃40s,52℃40s，72℃60s，30个循环；72℃10min，1个循环。
其中上游引物P15’端不含酶切位点，下游引物P25’端含HindIII酶切识别位点。
3、基因的拼接串联
分别以基因A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7和基因B作为模板，进行重叠延伸PCR。
上游引物F1：5'‑CGCCATATGGGCGATGGGGAAGAGA‑3'
上游引物F2：5’‑CGCCATATGGCCAGCGGCGG‑3’
上游引物F3：5’‑CGCCATATGGCCGACAGCGGC‑3’
上游引物F4：5’‑CGCCATATGGCTAGCGGTGACGACG‑3’
上游引物F5：5’‑CGCCATATGGACAATGGCGCGGG‑3’
上游引物F6：5’‑CGCCATATGGCCGACGCCGG‑3’
上游引物F7：5’‑CGCCATATGGCCAGCCGCGG‑3’
下游引物R1：5’‑CCCAAGCTTTTAGCGGACGATGCGG‑3'
其中所有的上游引物5’端都含NdeI酶切位点，下游引物5’端含HindIII酶切位点。
按以下次序，将各成分在灭菌薄壁离心管内混合，
反应组分                      加入量
10×Probest buffer            5μL；
dNTP                          5μL；
上游引物(10pmol/L)            2μL；
下游引物(10pmol/L)            2μL；
基因A                      2μL；
基因B                      2μL；
Probest高保真酶0.2μL；
ddH2O                       31.8μL；
总体积                       50μL。
(1)PCR1
扩增条件：95℃5min，1个循环；94℃40s，57.4℃40s，72℃60s，30个循环；72℃10min，1个循环。
以基因A2和基因B为模板，引物F2和R1为引物；基因A3和基因B为模板，引物F3和R1为引物；基因A4和基因B为模板，引物F4和R1为引物；基因A6和基因B为模板，引物F6和R1为引物；基因A7和基因B为模板，引物F7和R1为引物，在上述体系与条件下进行PCR1扩增。然后经琼脂糖凝胶电泳及切胶回收得到proCan‑I‑E‑G‑R‑BTG、proFra‑I‑E‑G‑R‑BTG、proHyg‑I‑E‑G‑R‑BTG、proNet‑I‑E‑G‑R‑BTG、proPla‑I‑E‑G‑R‑BTG五种基因。
(2)PCR2
扩增条件：95℃5min，1个循环；94℃40s，52.6℃40s，72℃60s，30个循环；72℃10min，1个循环。
以基因A1和基因B为模板，引物F1和R1为引物；基因A5和基因B为模板，引物F5和R1为引物，在上述体系与条件下进行PCR2扩增。然后通过琼脂糖凝胶电泳及切胶回收获得proCin‑I‑E‑G‑R‑BTG、proMob‑I‑E‑G‑R‑BTG两种基因。
4、重组表达载体的构建
(1)将上述所获得的7种基因用NdeI和HindIII双酶切，酶切产物经DNA纯化试剂盒(该试剂盒购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司)纯化。
(2)将pET‑28a(+)质粒用NdeI和HindIII双酶切、纯化后分别与第(1)步纯化产物在16℃的条件下连接12h，得到7种重组质粒。
(3)将4μL的重组质粒化转40μLE.Coli DH5α感受态细胞，涂布在含卡那霉素(50μg/ml)的平板上，从平板上挑选转化子，验证正确后提取质粒，再化转入E.Coii BL21(DE3)中，保存验证正确的阳性转化子。
二、融合蛋白his‑proCin‑I‑E‑G‑R‑BTG、his‑proCan‑I‑E‑G‑R‑BTG、his‑proFra‑I‑E‑G‑R‑BTG、his‑proHyg‑I‑E‑G‑R‑BTG、his‑proMob‑I‑E‑G‑R‑BTG、his‑proNet‑I‑E‑G‑R‑BTG、his‑proPla‑I‑E‑G‑R‑BTG的分离纯化
将37℃培养过夜的阳性转化子，按1%(v：v)的接种量转接于800mL含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，振荡培养至OD600为0.8时，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，在16℃、160r/min条件下诱导表达16h。离心收集细胞，高压匀浆破碎细胞，经Ni2+‑NTA Agarose介质(购自GE公司)亲和纯化，再通过超滤管(购自Millipore公司)浓缩后(如图1和图2)，得到带有组氨酸标签的融合蛋白his‑proCin‑I‑E‑G‑R‑BTG、his‑proCan‑I‑E‑G‑R‑BTG、his‑proFra‑I‑E‑G‑R‑BTG、his‑proHyg‑I‑E‑G‑R‑BTG、his‑proMob‑I‑E‑G‑R‑BTG、his‑proNet‑I‑E‑G‑R‑BTG、his‑proPla‑I‑E‑G‑R‑BTG。
三、荧光法检测proCin、proCan、proFra、proHyg、proMob、proNet、proPla对BTG活性的抑制情况。
将纯化浓缩后的蛋白液各取500μL，平分成两份，其中的一份用FactorXa酶切6h，获得去除了N端多肽序列的成熟BTG。通过三次重复实验，比较未经Factor Xa酶切的酶活相对于切割后的酶活，可得知多肽序列对BTG活性的抑制情况。
具体方法如下：
总体积1mL：N,N‑二甲基酪蛋白0.67g/L，丹磺尸胺(MDC)8.33μmol/L，Tris.HCl(pH7.5)50mmol/L，DTT3mmol/L，酶液200μL。反应体系于37℃反应30min，加入10mmol/L(NH4)2SO4终止反应，于激发波长350nm和发射波长500nm下检测荧光强度。
(2)酶活定义
每分钟催化1nmol/L的MDC插入到N,N‑二甲基酪蛋白所需的酶量定义为一个活力单位。
(3)酶活计算

其中ΔI为反应体系荧光强度的增加值，即ΔI=I‑I0，I为产物的荧光强度，I0为不加酶液时对照反应荧光强度，[MDC]为反应体系中MDC的浓度。
产物的荧光强度(I)为不加酶液时对照反应荧光强度(I0)的13倍,如果[MDC]全部被插入到N,N‑二甲基酪蛋白中，则体系的荧光强度应为13×I0，测出反应体系荧光强度的增加值ΔI(=I‑I0)，可以求出MDC的插入量。
结果如图3所示，融合蛋白his‑proCan‑I‑E‑G‑R‑BTG在Factor Xa切割前酶活相对于切割后酶活比值最低，表明S. caniferus来源的TG前肽序列(序列表中序列1)对BTG活性抑制最强。
经检测，本发明的多肽通过融合蛋白的形式抑制BTG的活性，抑制率可达到60%以上。
由于该多肽可特异性抑制BTG的活性，而且可随时去除，解除抑制效应，可以应用于抑制枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转胺酶活性中，最终为BTG在宿主细胞的高效表达奠定基础，因此可以应用于制备枯草芽孢杆菌来源的谷氨酰胺转胺酶中。
SEQ ID No:1的氨基酸序列
Ala Ser Gly Gly Asp Glu Glu Trp Glu Gly Ser Tyr Ala Ala Thr His Gly Leu Thr Ala
1           5              10              15             20
Glu Asp Val Lys Asn Ile Asn Ala Leu Asn Lys Arg Ala Leu Thr Ala Gly Gln Pro Gly
25              30             35             40
Asn Phe Pro Ala Glu Leu Pro Pro Ser Ala Thr Ala Leu Phe Arg Ala Pro Asp
45             50             55