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1、(10)申请公布号 CN 103173427 A (43)申请公布日 2013.06.26 CN 103173427 A *CN103173427A* (21)申请号 201210240229.3 (22)申请日 2012.07.12 C12N 9/42(2006.01) C12R 1/685(2006.01) (71)申请人 北京伟嘉人生物技术有限公司 地址 100085 北京市海淀区上地三街嘉华大 厦 D-803 申请人 沈阳伟嘉牧业技术有限公司 北京伟嘉盛邦生物技术有限公司 (72)发明人 催栩 董建辉 刘玉荣 姚宏明 (54) 发明名称 一种利用黑曲霉发酵生产 - 甘露聚糖酶的 方法 。
2、(57) 摘要 本发明的目的是提供一种利用黑曲霉发酵 生产 - 甘露聚糖酶的方法。该方法所用的黑 曲霉在液体培养基中生长 96 小时， 能够分泌表 达 - 甘露聚糖酶。甘露聚糖酶的最适催化温度 为 40， 最适 pH 值在 2-6 之间， 在 70时， 保温 20 分钟， 酶的催化活性损失不超过 40， 具有较 好的耐热性。在摇瓶条件下， 发酵活力最高达到 1200U/mL， 具有用于饲料添加剂的潜在前景。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书3页 附图2页 (10)申请公布。
3、号 CN 103173427 A CN 103173427 A *CN103173427A* 1/1 页 2 1. 一种利用黑曲霉发酵生产 - 甘露聚糖酶的方法， 其特征在于， 所述黑曲霉发酵生 产 - 甘露聚糖酶方法的步骤如下 ： ( 一 ) 制备发酵菌种 ： 将斜面培养的黑曲霉 (Aspergillus niger)YM33182 经液体菌种 斜面菌种培养和一级液体培养后， 得到发酵菌种 ； 其具体过程是 ： 1) 斜面菌种 ： 使用土豆培养基， 将 4冰箱保存的菌种划线接种到培养基上， 在 30-35条件下， 摇瓶种子培养基培养 24-72 小时， 待孢子长满后， 用无菌冷却水洗下 ； 。
4、2) 一级液体培养 ： 用一支斜面试管用 10ml 无菌水， 制备孢子悬液， 使得孢子含量在 1108CFU/ml 以上， 取 1ml 孢子悬液接种到 250ml 种子培养基中， 在 25-35、 250rpm 条件 下瓶培养 8-48 小时， 获得种子发酵液 ； ( 二 ) 利用上述得到的菌种发酵生产 - 甘露聚糖酶 ： 3)、 利用得到的菌种发酵生产 - 甘露聚糖酶是采用液体发酵方法生产， 使用的发 酵培养基配方以重量份数计包括 ： 玉米粉 35-45 份、 豆粕 11-14 份、 硫酸铵 1-2 份、 K2HPO4 3.5-4.5 份， 魔芋粉 0.5-1.0g， 溶于 1000mL， 。
5、蒸馏水中， 调节 pH 值， 高压灭菌。 2. 根据权利要求 1 所述的一种利用黑曲霉发酵生产 - 甘露聚糖酶的方法， 其特征在 所述液体发酵培养基中测定甘露聚糖酶的活力在 60-84 小时， 酶活力最高 ； 所述液体发酵 培养基酶的最佳催化 pH 在 2-6.0 有较高的催化活力 ； 3. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于 ： 所述液体发酵培养基产生的酶在 60-70 度有较好的耐热性 ； 4. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于 ： 所述土豆培养基配方以重量份数计包 括 ： 土豆去皮切碎， 15-25 份 ； 蔗糖， 1.5-2.5 份 ； 琼脂 1-2.0 份 ； 自来。
6、水 100 份， 水原料 1 0.015-0.2 ； 5. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于 ： 所述灭菌条件是 ： 115-125高压灭菌 15-25 分钟 ； 6. 根据权利要求 1 所述的一种利用黑曲霉发酵生产 - 甘露聚糖酶的方法， 其特征在 于利用黑曲霉发酵得到的酸性 - 甘露聚糖酶水解甘露聚糖。 7. 根据权利要求 6 所述的酸性 - 甘露聚糖酶水解甘露聚糖， 其特征在于 ： 所述甘露 聚糖为魔芋精粉和玉米粉。 权 利 要 求 书 CN 103173427 A 2 1/3 页 3 一种利用黑曲霉发酵生产 - 甘露聚糖酶的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种利用黑曲霉发。
7、酵生产 - 甘露聚糖酶的方法， 本发明还涉及一种 饲料添加剂。 背景技术 0002 玉米 - 豆粕型日粮是我国饲养单胃动物的主要日粮， 大豆中所含有的甘露聚糖有 很强的抗营养作用。目前， 我国每年大豆进口量为 4000 万吨左右， 其中 80以上用于饲料 工业。甘露聚糖是植物半纤维素的重要组分， 是由 -1， 4-D 吡喃甘露糖连接而成的线状多 糖， 豆粕中甘露聚糖的含量在 1.2以上。甘露聚糖具有高亲水性， 在单胃动物的消化道内 大量吸水， 增加了消化道内容物的粘度， 抵抗胃肠的蠕动， 直接影响动物对营养物质的消化 吸收， 排泄物中因含有较多的有机物而造成养殖场环境污染。 0003 甘露聚糖。
8、的完全酶解需要 - 甘露聚糖酶、 - 甘露糖苷酶、 - 葡糖苷酶等多种 酶的协同作用。其中 - 甘露聚糖酶能够高效降解甘露聚糖的粘度， 在饲料中的应用比较 广泛。 -甘露聚糖酶是一类能水解甘露聚糖的半纤维素酶类， 广泛存在于动植物和微生物 中。 0004 - 甘露聚糖酶能降解饲料中的甘露聚糖， 不仅可以消除甘露聚糖的抗营养作用， 同时生成的甘露寡糖在动物生产中起着重要的作用。试验证明 ： 甘露寡糖能提高仔猪日增 重和饲料转化率， 其原因可能是其提高了仔猪的免疫力， 抑制了病原菌在胃肠道的增殖。 另 外， 甘露寡糖还具有一定的免疫原性， 能够刺激机体免疫应答， 与病毒、 毒素结合， 减缓抗原 的。
9、吸收， 调节肠道的菌群平衡， 干扰病原菌的定植。研究还发现， 甘露寡糖能够显著提高无 菌仔猪血清和肠粘膜中 IgA、 IgG 和 IgM 的含量及血液中白细胞介素 -2 的水平， 增强 T 淋巴 细胞功能和小肠原始淋巴细胞的活性， 增强小肠内白细胞的吞噬能力和促进淋巴细胞释放 IFN- 细胞素。邵良平等报道， 甘露寡糖能极显著提高仔猪白细胞分化抗体 CD3 的水平。 近年来， 关于甘露寡糖吸附霉菌毒素的研究也越来越受到人们的重视， 甘露寡糖可结合玉 米赤霉烯酮， 通过物理吸附或直接结合霉菌毒素， 且不影响其他饲料成分。 发明内容 0005 本发明的目的是提供一种利用黑曲霉发酵生产 - 甘露聚糖。
10、酶的方法。 0006 该黑曲霉 (Aspergillus niger)YM33182， 直接接来源于曹云鹤处， 间接来源为陈 有为， 该菌种已于 2006 年 10 月 31 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心， 保藏 编号为 ： CCTCCNo M206113。 0007 一种利用黑曲霉发酵生产 - 甘露聚糖酶的方法， 其特征在于， 所述黑曲霉发酵 生产 - 甘露聚糖酶方法的步骤如下 ： 0008 ( 一 ) 制备发酵菌种 ： 将斜面培养的黑曲霉 (Aspergillus niger)YM33182 经液体 菌种斜面菌种培养和一级液体培养后， 得到发酵菌种 ； 其具体过程是。
11、 ： 0009 1) 斜面菌种 ： 使用土豆培养基， 将 4冰箱保存的菌种划线接种到培养基上， 在 说 明 书 CN 103173427 A 3 2/3 页 4 30-35条件下， 摇瓶种子培养基培养 24-72 小时， 待孢子长满后， 用无菌冷却水洗下 ； 0010 2) 一级液体培养 ： 用一支斜面试管用 10ml 无菌水， 制备孢子悬液， 使得孢子含量 在 1108CFU/ml 以上， 取 1ml 孢子悬液接种到 250ml 种子培养基中， 在 25-35、 250rpm 条 件下瓶培养 8-48 小时， 获得种子发酵液 ； 0011 ( 二 ) 利用上述得到的菌种发酵生产 - 甘露聚糖。
12、酶 ： 0012 3)、 利用得到的菌种发酵生产 - 甘露聚糖酶是采用液体发酵方法生产， 使用的 发酵培养基配方以重量份数计包括 ： 玉米粉 35-45 份、 豆粕 11-14 份、 硫酸铵 1-2 份、 K2HPO4 3.5-4.5 份， 魔芋粉 0.5-1.0g， 溶于 1000mL， 蒸馏水中， 调节 pH 值， 高压灭菌。 0013 2、 根据权利要求 1 所述的一种利用黑曲霉发酵生产 - 甘露聚糖酶的方法， 其特 征在所述液体发酵培养基中测定甘露聚糖酶的活力在 60-84 小时， 酶活力最高 ； 所述液体 发酵培养基酶的最佳催化 pH 在 2-6.0 有较高的催化活力 ； 0014 。
13、3、 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于 ： 所述液体发酵培养基产生的酶在 60-70 度有较好的耐热性 ； 0015 4、 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于 ： 所述土豆培养基配方以重量份数计 包括 ： 土豆去皮切碎， 15-25 份 ； 蔗糖， 1.5-2.5 份 ； 琼脂 1-2.0 份 ； 自来水 100 份， 水原料 1 0.015-0.2 ； 0016 5、 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于 ： 所述灭菌条件是 ： 115-125高压灭 菌 15-25 分钟 ； 0017 6、 根据权利要求 1 所述的一种利用黑曲霉发酵生产 - 甘露聚糖酶的方法， 其特。
14、 征在于利用 黑曲霉发酵得到的酸性 - 甘露聚糖酶水解甘露聚糖。 0018 7、 根据权利要求6所述的酸性-甘露聚糖酶水解甘露聚糖， 其特征在于 ： 所述甘 露聚糖为魔芋精粉和玉米粉。 0019 本发明的黑曲霉在液体培养基中生长 96 小时， 能够分泌表达 - 甘露聚糖酶。甘 露聚糖酶的最适催化温度为 40， 最适 pH 值在 2-6 之间， 在 70时， 保温 20 分钟， 酶的催 化活性损失不超过 40， 具有较好的耐热性。在摇瓶条件下， 发酵活力最高达到 1200U/mL， 具有用于饲料添加剂的潜在前景。 附图说明 0020 图 1 是发酵不同时间点的上清液甘露聚糖酶的酶活力 (U/ml。
15、) ； 0021 图 2 是不同温度条件下甘露聚糖酶的相对活力 ( 百分数 ) ； 0022 图 3 是甘露聚糖酶在不同 pH 条件下的相对催化活力 ( 百分数 ) ； 具体实施方式 0023 DNS 试剂的配制 ： 称取酒石酸钾钠 91.0g， 溶于 500mL 水中， 加入 3， 5- 二硝基水杨 酸3.15g、 NaOH 20.0g， 不超过50水浴溶解 ； 再加入苯酚2.5g、 无水亚硫酸钠2.5g， 搅拌溶 解， 冷却后定容至 1000mL ； 储存于棕色瓶中， 放置一周后使用。 0024 - 甘露聚糖酶酶活的测定 (DNS 法 ) ： 取待测溶液 1mL， 加入 1mL 0.8 (。
16、 质量百 分含量)甘露聚糖溶液， 恒温水浴中反应20min， 然后加入2.5mL DNS试剂(终止反应)。 沸 水浴煮 5min， 然后冷却至室温， 用蒸馏水定容至 12.5mL， 测 OD540。 说 明 书 CN 103173427 A 4 3/3 页 5 0025 在 pH6.0 和 37条件下， 每分钟从底物半乳甘露聚糖 (Sigma， G0753) 中水解产生 1mol 的甘露糖的所需的酶量定义为 1 个酶活单位， 用 U 表示。 0026 实施例 1 ： 制备黑曲霉发酵菌种 0027 斜面培养基 ： 土豆培养基 ( 土豆去皮切碎， 20g ； 蔗糖， 2.0g ； 琼脂 1.5g 。
17、； 自来水 100mL， 120高压灭菌 20 分钟 ) ； 摇瓶种子培养基 ： 土豆培养基 ( 不含琼脂 )。将 4冰箱 保藏的菌种接种于斜面培养基， 30培养 48hr， 待孢子长满后， 用无菌冷却水洗下。一支斜 面试管用 10ml 无菌水， 制备孢子悬液， 孢子的含量在 108CFU/ml 以上。在 250mL 种子培养 基中接种 1mL 孢子悬液。30、 250rpm 摇瓶培养 20hr， 获得种子发酵液。 0028 实施例 2 ： 黑曲霉摇瓶发酵生产 - 甘露聚糖酶工艺 0029 发酵培养基配方 ： 玉米粉 40g、 豆粕 12.5g、 硫酸铵 1.5g、 K2HPO4 4.0g， 。
18、魔芋粉 0.75g， 溶于 1000mL， 蒸馏水中， 调节 pH 值至 6.2， 120高压灭菌 20 分钟。500mL 摇瓶装液 量 60mL。按照 1 1000 的比例接种种子液， 30、 250rpm 连续震荡培养 96hr， 每隔 12hr 取发酵液1mL， 12000rpm离心， 取上清液在pH6.0和37条件下测定甘露聚糖酶的活力。 结 果见图 1。 0030 实施例 3 ： - 甘露聚糖酶的酶学性质 0031 1、 最适温度的测定 ： 分别在 20、 30、 40、 50、 60和 70条件下测定酶的 相对催化活力。酶的最佳催化温度为 40， 在 30-60范围内， 均保持在最。
19、佳催化活性的 60以上。结果见图 2。 0032 2、 最适催化 pH 值的测定 ： 分别在 2.0、 3.0、 4.0、 5.0、 6.0、 7.0 缓冲液中， 测定酶的 催化活性。酶的最佳催化 pH4.0， 在 2.0-5.0 范围内都有较高的催化活力。结果见图 3。 0033 3、 温度稳定性的测定 ： 把粗酶液分别在 60、 70和 80保温 20 分钟， 然后在最 适催化条件下测定剩余酶。与未经加热处理的酶的活力相比较， 计算残余酶活。该甘露聚 糖酶在 70保温 20 分钟还有 55的残余酶活， 该酶具有较好的耐热性。结果见表 1。 0034 表 1、 甘露聚糖酶的耐热性 0035 。
20、处理温度 ( ) 30 60 70 80 残余酶活 ( ) 100 82 55 27 0036 实施例 4 ： 粗酶液酶解魔芋粉制备甘露寡糖 0037 准确称取 10g 魔芋粉， 溶于灭菌水中， 定容至 100mL， 边加热边搅拌， 使之充分溶 解， 制备 10溶液。将 50mL 魔芋粉溶液与 10mL 发酵上清液 ( 酶活力 1000U/mL) 混合， 置于 40水浴中保温 5 小时， 期间每隔 10 分钟搅拌 1 次。另外 50mL 魔芋粉溶液中加入 10mLNa2HPO4- 柠檬酸缓冲液 (pH6.0) 为空白对照。反应完成后， 取样品测定甘露寡糖的含 量。结果表明， 约 70的甘露聚糖降解成甘露寡糖。 说 明 书 CN 103173427 A 5 1/2 页 6 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103173427 A 6 2/2 页 7 图 3 说 明 书 附 图 CN 103173427 A 7 。