一种空间屎肠球菌LCTEF258菌株.pdf

本发明涉及一株太空环境下屎肠球菌LCT-EF258菌株的生物学特性、基因组DNA序列、转录组和差异蛋白组学，特别是同地面屎肠球菌比较分析鉴定出的功能序列和分子在阐明空间环境对微生物的作用及其用途，可获得全面、准确的空间环境下屎肠球菌菌株突变的基因、差异表达基因和蛋白质。

权利要求书一种空间屎肠球菌LCT‑EF258，其保藏号为：CGMCC NO.6525。
根据权利要求1所述的一株屎肠球菌，其特征在于：革兰氏染色阳性，呈单个、链状、聚团排列；同地面对照株的抗生素耐受性相比，对抗生素丁胺卡那(阿米卡星)、环丙沙星更加耐受；无生长速度的差异；能利用γ‑氨基丁酸和L‑苹果酸为碳源，而不能利用对羟基苯乙酸。
根据权利要求1所述的屎肠球菌LCT‑EF258菌株，进行全基因组测序和比较基因组学分析得出突变基因。
根据权利要求1所述的屎肠球菌LCT‑EF258菌株，进行转录组测序得出差异表达基因。
根据权利要求1所述的屎肠球菌LCT‑EF258菌株，进行差异蛋白组学分析得出差异表达蛋白分子。
根据权利要求1所述的屎肠球菌LCT‑EF258菌株，可应用于筛选和鉴定临床抗生素耐药靶点。

说明书一种空间屎肠球菌LCT‑EF258菌株 
技术领域
本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及屎肠球菌及其生物学特性、全基因组学测序、转录组测序和差异蛋白组学分析。 
背景技术
随着人类航天活动日益增多和我国载人航天计划逐渐实施，航天员的健康是航天医学保障的一个关键问题，其中预防细菌感染是一个重要方面。有研究发现在模拟微重力条件下沙门氏菌对小鼠感染的毒力会增强，同时航天活动中机体的免疫力下降，从而导致更易感染。目前，在空间站中已检出包括肠球菌在内的多种细菌，因此针对空间细菌变异的研究是太空微生物研究的一个重要课题。目前，有关空间诱变微生物的资源非常缺乏，严重阻碍了该领域的发展。 
屎肠球菌早期被认为属于D群链球菌属，随着分子生物学各项技术的发展，通过基因DNA的同源性检测，发现其属于肠球菌属。肠球菌是人体内的一种正常菌群，但在人体免疫力下降时同样可以致病，因此是一种条件性致病菌，常可导致多个系统发生感染，例如人体生殖系统、泌尿系统、腹腔感染、伤口表明感染等，同时也是引起院内感染的常见菌群之一。近年来，随着各种有创性检查和治疗手段的实施以及免疫抑制剂的和抗生素的大量使用，使肠球菌的感染越来越多。由于该种菌群常天然耐药，对头孢菌素、大环内酯类、磺胺类、氨基糖苷类均具有耐药性，近年耐受万古霉素类的肠球菌株增多，临床上使得医生常常无计可施。目前在难治性屎肠球菌感染方面的研究已经入瓶颈期，没有很好的研究切入点。 
对空间条件下屎肠球菌相关生物学性状(如毒力和耐药等)改变的研究，分析其变化的分子机理是解决航天活动中细菌感染和临床治疗中耐药问题 的有效手段。近年来，基因组、转录组、蛋白组学和生物信息学等系统生物学研究手段不断出现，使得开展空间环境下屎肠球菌突变的分子机理研究更易进行。一方面可为空间生物安全评估提供理论基础，另一方面可为临床难治性感染的研究提供思路。 
发明内容
本发明的一个目的提供一株空间环境的屎肠球菌LCT‑EF258菌株 
本发明提供的该菌株，其保藏号为CGMCC NO.6525。 
一株屎肠球菌，革兰氏染色阳性，呈单个、链状、聚团排列；同地面对照株的抗生素耐受性相比，对抗生素丁胺卡那(阿米卡星)、环丙沙星更加耐受；无生长速度的差异；能利用γ‑氨基丁酸和L‑苹果酸为碳源，而不能利用对羟基苯乙酸。 
所述的屎肠球菌LCT‑EF258菌株，进行全基因组测序和比较基因组学分析得出突变基因，见表1，空间环境导致LCT‑EF258菌株基因组上SNP的变化，包括SNP在基因组上的位置，突变位点及编码蛋白以及注释出的基因；表2为空间环境导致LCT‑EF258菌株基因组上的插入和缺失，包括InDel位置和发生的区域。 
表1空间环境导致LCT‑EF258菌株基因组上纯合SNP的变化 
SNP位置    突变碱基    参考基因ID    注释库ID    突变蛋白Scaffold3_60853    C→A    LCT‑EF90GL001983  gi|293570275    S→I 
表2空间环境导致LCT‑EF258菌株基因组上的插入和缺失 


所述的屎肠球菌LCT‑EF258菌株，进行转录组测序得出差异表达基因(FDR≤0.001和|log2Ratio|≥2)见附表1。 
所述的屎肠球菌LCT‑EF258菌株，进行差异蛋白组学分析得出差异表达蛋白分子(蛋白丰度差异倍数超过2倍以上时；经统计检验其p‑value值小于0.05；三次重复中至少两次重复中达到上述要求)见附表2。 
附图说明
图1屎肠球菌LCT‑EF258菌株革兰氏染色结果 
图2屎肠球菌LCT‑EF258菌株生理生化鉴定结果 
图3屎肠球菌LCT‑EF258菌株生长曲线 
图4屎肠球菌LCT‑EF90菌株生长曲线 
图5LCT‑EF258菌株的GC含量与Depth关联分析图 
图6LCT‑EF258菌株和地面对照组LCT‑EF90的二维共线性图 
图7LCT‑EF258菌株的转录组测序基因覆盖度图 
图8转录组测序鉴定的差异表达基因数量 
图9差异蛋白组学鉴定的差异表达蛋白质数量 
附件说明 
附件1屎肠球菌LCT‑EF258菌株转录组测序分析的差异表达基因信息 
附件2屎肠球菌LCT‑EF258菌株定量蛋白组学分析的差异表达蛋白信息 
具体实施方式
下述实施实例中所用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。 下述实施实例中所用的材料、试剂，如无特殊说明，均可从商业途径获得。 
实施实例一：屎肠球菌LCT‑EF258菌株的革兰氏染色 
取50ul样品离心，弃上清，加入无菌水50ul，吸取20ul于载玻片上进行固定；初染，吸取革兰氏染色I(结晶紫)2滴于载玻片样品上进行初染1min，然后用自来水冲洗染液；媒染，吸取革兰氏染色II(碘液)2滴覆盖涂面染约1min，然后用自来水冲洗染液，用吸水纸吸取涂面上的水分；脱色，吸取革兰氏染色III(酒精)2滴滴在涂面上约30s，用水冲洗载玻片，用吸水纸吸取涂面上的水分；复染，吸取革兰氏染色IV(番红)2滴滴在涂面上约1min，用水冲洗载玻片，用吸水纸吸取涂面上的水分；观察，先用显微镜低倍镜找到目标视野，然后再用油镜(100×)进行观察，判定并记录结果、拍照，见图1，革兰氏染色阳性，呈单个、链状、聚团排列。 
实施实例二：屎肠球菌LCT‑EF258菌株的抗生素敏感性检测 
配制LB固体培养基25L，灭完菌后倒1500个平板，晾干，备用；菌悬液的制备，取出这些单菌的斜面，并准备盛有1ml无菌生理盐水的1.5ml离心管，用灭菌的竹签从斜面上蘸取适量菌种于1.5ml离心管中，混匀，调菌浓度约107～108；稀释涂布，吸取备好的菌悬液100μl进行涂布，尽可能地涂布均匀，每株单菌涂6个平板，每涂完一株菌，就进行下一步(粘贴药敏片)；粘贴药敏片，选择抗生素进行药敏试验，以筛选出抗药性突变的菌株；贴完药敏片后，将平板放置在37℃下培养18～24h；观察结果，将平板培养18～24h，取出观察平板上药敏片的抑菌情况，并记录抑菌圈的大小(直径cm)，其中药敏片直径约为0.6cm。对丁胺卡那(阿米卡星)和环丙沙星耐受，无抑菌圈，而地面对照组的抑菌圈分别为1.2cm和1.4cm。 
实施实例三：屎肠球菌LCT‑EF258菌株的生理生化鉴定实验 
菌悬液制备，取出菌株的斜面，用灭菌竹签蘸取菌种接种在LB液体培 养基中(4ml体系)，培养24h。然后取2ml菌液6000r/s离心5min，弃上清培养基，留下离心的菌体，然后用灭菌的生理盐水洗涤菌体，6000r/s离心5min，再次弃去上清，再用Biolog接种液进行悬浮菌体，最后再转至15ml的接种液中。调至浓度约107～108；接种，将以上菌悬液倒至接种皿中，震荡均匀，用12道(或8道)排枪进行加样，每个Biolog板孔加样100ul，共96孔，加完样后，盖上Biolog板盖，放置在37℃下培养，24h和48h进行观察，并记录结果，见图2和表3，从图中和表中可看出主要差别为LCT‑EF258能利用γ‑氨基丁酸和L‑苹果酸为碳源，而不能利用对羟基苯乙酸。 
表3：LCT‑EF258菌株的生理生化鉴定结果 
  编号   底物   LCT‑EF258菌株   对照LCT‑EF90菌株   B8   N‑乙酰‑D‑半乳糖胺   +/‑   ‑   C8   L‑鼠李糖   +/‑   ‑   D4   肌醇   +/‑   ‑   E9   L‑丝氨酸   ‑   +/‑   F3   半乳糖酸内酯   +/‑   ‑   F4   D‑葡萄糖酸   ‑   +/‑   F6   葡糖醛酰胺   ‑   +/‑   G1   对‑羟基‑苯乙酸   ‑   +   G3   D‑乳酸甲酯   +/‑   ‑   G5   柠檬酸   ‑   +/‑   G8   L‑苹果酸   +   ‑   H2   γ‑氨基丁酸   +   ‑
实施实例四：屎肠球菌LCT‑EF258菌株的生长曲线 
活化菌株，在15ml试管(4ml培养基)中培养1d，然后接种至100孔蜂窝板中，在Bioscreen中进行生长曲线的测定，测定24h，读取数据；将每株菌所得到的OD值进行平均值的计算，然后再绘制曲线，见图3和图4，从图中可看出空间环境下LCT‑EF258菌株同地面LCT‑EF90菌株生长曲线无差异。 
实施实例五：屎肠球菌LCT‑EF258菌株的基因组测序和比较基因组分析 
培养屎肠球菌并提取基因组DNA，首先采用超声法将检测合格的DNA样品随机打断，得到一系列DNA片段，经T4DNA聚合酶、Klenow DNA聚合酶和T4多聚核苷酸激酶等处理后，回收目的片段，得到测序文库，利用Illumina的Genome Analyzer II测序；测序结束后得到的reads，经过滤处理后进行组装和分析；采用Glimmer3.0软件注释基因并分析SNP、Indel、基因重排和结构变异等。发现的纯合SNP突变见表1，Indel分析未发现明显变化。测序的质控即GC含量与Depth关联分析统计图见图5，其中横坐标是GC含量，纵坐标是平均深度。以500bp为窗口无重复的计算其GC含量和平均深度，该散点图近似于泊松分布，即测序过程中GC无明显偏向性。共线性及重排分析见图6的二维共线性图，图中横轴是参考序列基因组，纵轴是所测基因组，颜色较浅的水平或垂直的直线表示各个Scaffold之间的分割，红色线条表示所测基因组的核酸序列在正链，蓝色表示所测基因组的核酸序列在负链。 
实施实例六：屎肠球菌LCT‑EF258菌株的转录组测序分析 
提取屎肠球菌LCT‑EF258菌株总RNA后，用试剂盒去除rRNA后。加入fragmentation buffer将mRNA打断成短片段，以mRNA为模板，用六碱基随机引物(random hexamers)合成第一条cDNA链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成第二条cDNA链，在经过QiaQuick PCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱之后做末端修复、加polyA并连接测序接头，然后用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，最后进行PCR扩增，建好的测序文库用Illumina HiSeqTM2000进行测序。将原始序列数据去除杂质数据后统计rRNA统计、评价Reads在基因组上的分布基因覆盖度、统计基因表达量差异、分析差异表达基因等，见表3、表4、图7和 图8，差异表达基因详见附表1，下调基因497个，上调基因20个。图7为基因测序覆盖度指每个基因被reads覆盖的百分比，其值等于基因中unique mapping reads覆盖的碱基数跟基因编码区所有碱基数的比值。 
表3：样品LCT‑EF258和参考基因组比对的统计结果 

表4：样品LCT‑EF258和参考基因比对的统计结果 

上述表格各列含义如下： 

实施实例七：屎肠球菌LCT‑EF258菌株的差异蛋白组学分析 
从屎肠球菌LCT‑EF258样品中提取蛋白；对提取后的蛋白样品进行还原烷基化处理，打开二硫键以便后续充分酶解蛋白；用GE公司的2D quant kit法进行蛋白质的浓度测定；等体积进行SDS(十二烷基磺酸钠)电泳；酶解蛋白；用iTRAQ试剂标记肽段；将标记后的肽段进行等量混合；对混合后的肽段使用强阳离子交换色谱(Strong Cation Exchange Choematography，SCX)进行预分离；进行液相串联质谱(liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry，LC‑MS/MS)分析。对质谱下机的原始文件，进行峰识别，得到峰列表；建立参考数据库，进行肽段及蛋白质的鉴定；最后比较各蛋白在各样品之间的相对含量的关系(蛋白丰度差异倍数超过2倍以上时；经统计检验其p‑value值小于0.05；三次重复中至少两次重复中达到上述要求)，从而获得一些感兴趣的重要蛋白，差异蛋白详见附表2，上调下调蛋白统计见图9，上调蛋白25个，下调蛋白57个。 
所述的屎肠球菌LCT‑EF258菌株，可根据抗生素耐药性的改变及分子机理，应用于筛选和鉴定临床抗生素耐药靶点，为开发临床难治性屎肠球菌感染的诊治产品提供参考。 
关于保藏的LCT‑EF258菌株的说明 
A.菌种的保藏单位名称和地址 
名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所 
B.交机构保藏的日期 
2012年9月5日 
C.保藏机构给予的保藏号 
CGMCC No.6525 
D.分类命名屎肠球菌Enterococcus Faecium 
附件1 










附件2