N乙酰神经氨酸醛缩酶及其编码基因与应用.pdf

本发明公开了N-乙酰神经氨酸醛缩酶及其编码基因与应用。本发明所提供的N-乙酰神经氨酸醛缩酶是如下a)或b)的蛋白质：a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-乙酰神经氨酸醛缩酶活性的由a)衍生的蛋白质。本发明获得了一个编码N-乙酰神经氨酸醛缩酶的新基因SananA。将SananA基因克隆到原核表达载体6HisT-pRSET质粒上，在大肠杆菌中进行N-乙酰神经氨酸醛缩酶蛋白(SaNanA)的高效表达。本发明所获得的重组N-乙酰神经氨酸醛缩酶蛋白可以催化N-乙酰甘露糖胺和丙酮酸生成N-乙酰神经氨酸，具有较高的酶活性，具有较高的应用前景及开发价值。

权利要求书一种蛋白，是如下a)或b)的蛋白质：
a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有N‑乙酰神经氨酸醛缩酶活性的由a)衍生的蛋白质。
权利要求1所述蛋白的编码基因。
根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因为如下1)或2)或3)所示：
1)其核苷酸序列是序列表中序列1所示DNA分子；
2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白的DNA分子；
3)与1)或2)限定的DNA分子具有90％以上的同源性且编码权利要求1所述蛋白的DNA分子。
含有权利要求2或3所述编码基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌。
根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体为在载体6HisT‑pRSET的多克隆位点插入所述编码基因得到的重组表达载体。
根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌为将权利要求2或3所述的编码基因导入宿主菌得到的重组菌；所述权利要求2或3所述的编码基因是通过权利要求4或5所述的重组表达载体导入宿主菌中的。
扩增权利要求2或3所述编码基因全长或其任一片段的引物对，所述引物对中，一条引物序列如序列表中序列3所示，另一条引物序列如序列表中序列4所示。
权利要求1所述的蛋白、权利要求2或3所述的编码基因、权利要求4‑6中任一所述的重组表达载体、重组菌、表达盒或转基因细胞系在制备N‑乙酰神经氨酸中的应用。

说明书N‑乙酰神经氨酸醛缩酶及其编码基因与应用
技术领域
本发明涉及N‑乙酰神经氨酸醛缩酶及其编码基因与应用。
背景技术
唾液酸(Sialic acid)是一类神经氨酸的衍生物，目前已经发现的天然的唾液酸衍生物达40多种。其中最主要的是N‑乙酰神经氨酸(N‑acetyl‑D‑neuraminic acid，Neu5Ac)。Neu5Ac通常位于细胞表面糖蛋白和糖脂的糖链非还原末端，在许多与糖和蛋白相互作用有关的生理过程中起着很重要的作用：如细胞的粘附、信号传递、糖蛋白的稳定性、细菌致病性、病毒侵染、炎症和肿瘤的转移等。N‑乙酰神经氨酸的生物学功能多样化，在治疗流感、神经性疾病、炎症和肿瘤等方面具有重要的医药价值，特别是在流感(包括禽流感H5N1和2009年的H1N1)的预防和治疗方面有良好的效果。同时，N‑乙酰神经氨酸可促进神经突触的发育，对婴幼儿脑部发育非常重要，因此也被用于婴幼儿奶粉添加剂。无论是药用前景还是作为食品添加剂，N‑乙酰神经氨酸都具有较高的市场价值。
N‑乙酰神经氨酸可从以下几种途径获得：天然产物提取、化学合成、化学酶法、酶法合成等。N‑乙酰神经氨酸可从燕窝、牛奶或者禽蛋中提取，但由于量太少，提取纯化难，产量低(10‑20％)，纯度低。
化学合成法合成N‑乙酰神经氨酸，由于产物结构的复杂性，需要繁多的保护和去保护步骤。使用化学法合成N‑乙酰神经氨酸反应条件苛刻，需要铟等一些贵重金属作为催化剂，N‑乙酰神经氨酸得率低。因此，化学法常常和酶法结合使用。
N‑乙酰神经氨酸可通过酶法合成，N‑乙酰甘露糖胺(ManNAc)和丙酮酸在N‑乙酰神经氨酸醛缩酶(Neu5Ac aldolase or Neu5Ac lyase，NanA，EC4.1.3.3)作用下生成N‑乙酰神经氨酸。但ManNAc对于工业生产而言成本较高。化学酶法是一种更经济有效的生产N‑乙酰神经氨酸的方法，即在碱性条件下，使GlcNAc异构化生成ManNAc；然后采用N‑乙酰神经氨酸醛缩酶催化N‑乙酰甘露糖胺和丙酮酸生成N‑乙酰神经氨酸。或用双酶法合成：即用GlcNAc 2‑异构酶(GlcNAc 2‑epimerase，AGE，EC5.1.3.8)催化GlcNAc异构成ManNAc，然后ManNAc和丙酮酸在N‑乙酰神经氨酸醛缩酶的作用下缩合产生Neu5Ac。
在工业生产中多以GlcNAc为原料生产Neu5Ac，不论是采用化学酶法还是双酶法，都需要N‑乙酰神经氨酸醛缩酶。虽然N‑乙酰神经氨酸醛缩酶在高等动物及一些微生物中有存在，但是生物体中其含量极微，难以分离得到足够量的N‑乙酰神经氨酸醛缩酶。因此如何获得性质优良的N‑乙酰神经氨酸醛缩酶对N‑乙酰神经氨酸的生产非常重要。
发明内容
本发明的一个目的是提供N‑乙酰神经氨酸醛缩酶及其编码基因。
本发明所提供的N‑乙酰神经氨酸醛缩酶，名称为SaNanA，来源于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，是如下a)或b)的蛋白质：
a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有N‑乙酰神经氨酸醛缩酶活性的由a)衍生的蛋白质。
本发明所提供的N‑乙酰神经氨酸醛缩酶的编码基因，为如下1)或2)或3)所示：
1)其核苷酸序列是序列表中序列1所示DNA分子；
2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白的DNA分子；
3)与1)或2)限定的DNA分子具有90％以上的同源性且编码所述蛋白的DNA分子。
上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
序列表中的序列1由882个核苷酸组成，编码序列表中序列2所示的蛋白质。序列表中序列2由293个氨基酸残基组成。
含有所述N‑乙酰神经氨酸醛缩酶的编码基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。
所述重组表达载体为在载体6HisT‑pRSET的多克隆位点插入所述编码基因得到的重组表达载体。
所述重组菌为将所述编码基因导入宿主菌得到的重组菌；所述编码基因是通过所述的重组表达载体导入宿主菌中的；所述宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)。
扩增所述N‑乙酰神经氨酸醛缩酶编码基因全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。
所述引物对中，一条引物序列如序列表中序列3所示，另一条引物序列如序列表中序列4所示。
所述N‑乙酰神经氨酸醛缩酶、所述编码基因、所述重组表达载体或所述表达盒、转基因细胞系或重组菌在制备N‑乙酰神经氨酸中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明以金黄色葡萄球菌总DNA为模板，用PCR扩增获得一个编码N‑乙酰神经氨酸醛缩酶的新基因SananA。将SananA基因克隆到原核表达载体6HisT‑pRSET质粒上，在大肠杆菌中进行N‑乙酰神经氨酸醛缩酶蛋白(SaNanA)的高效表达。获得的重组N‑乙酰神经氨酸醛缩酶蛋白可以催化N‑乙酰甘露糖胺和丙酮酸生成N‑乙酰神经氨酸，具有较高的酶活性，具有较高的应用前景及开发价值。
附图说明
图1为SananA的PCR扩增结果。
图2为重组质粒pSananA的酶切鉴定结果。
图3为基因工程菌pSananA/BL21表达产物的SDS‑PAGE分析。
图4为SaNanA纯化后的SDS‑PAGE分析。
图5为转化产物的HPLC图谱。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、N‑乙酰神经氨酸醛缩酶的制备及功能验证
一、金黄色葡萄球菌基因组DNA的提取和SaNanA基因的PCR扩增
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(购自中国科学院微生物研究所菌种保藏中心，CGMCC 1.1529)，采用细菌基因组提取试剂盒(天根公司)提取金黄色葡萄球菌基因组DNA。以提取金黄色葡萄球菌基因组总DNA作为模板，以Sa‑F和Sa‑R为引物，用高保真pyrobest酶(Takara公司)PCR扩增SaNanA基因。引物序列如下：
Sa‑F：5’‑GCGCGACCATATGAACAAAGATTTAAAAGG‑3’(下划线表示NdeI酶切位点)，
Sa‑R：5’‑GCGGGATCCCTATAAATCGTATTTTGCAATG‑3’(下划线表示BamHI酶切位点)。
PCR程序为：

PCR扩增出882bp左右的片段(图1)，回收后经过NdeI/BamHI双酶切后连接到克隆载体上，筛选鉴定阳性克隆，并进行序列测定；测序结果表明，克隆得到的DNA序列如序列表中序列1所示，序列表中的序列1由882个核苷酸组成，编码序列表中序列2所示的蛋白质。序列表中序列2由293个氨基酸残基组成。将该基因命名为SaNanA，将其编码的蛋白命名为SaNanA。
二、含有SaNanA的重组表达载体的构建
将上述步骤一得到的PCR扩增片段用NdeI和BamHI酶切，回收目的片段；同时用NdeI和BamHI酶切载体6HisT‑pRSET(公众可从中国科学院微生物所获得，记载过该材料的非专利文献是：TAO，Y.，Guermah，M.，Martinez，E.，T.，Hasegawa，S.，Takada，R.，Yamamoto，T.，Horikoshi，M.and Roeder，R.G.(1997)Specific Interactions and Potential Functions of Human TAFII100.Journal of Biological Chemistry272：6714‑6721.)，回收载体大片段；将回收的目的片段与回收的载体大片段16℃连接，得到目的质粒。将目的质粒用CaCl2法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(购自Takara，产品目录号为D9057A)。将其均匀涂布于含氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养16小时。单菌落振荡培养过夜，提取质粒用NdeI和BamHI进行双酶切鉴定，鉴定结果如图2所示，从图中可见，获得了2917bp和882bp的酶切片段。将酶切验证正确的质粒进行测序，测序结果表明，在载体载体6HisT‑pRSET的NdeI和BamHI酶切位点间插入了序列表中序列1所示的SaNanA基因片段，证明质粒构建正确，将重组载体命名为pSananA。
三、重组表达SaNanA蛋白的基因工程菌的构建及SaNanA蛋白的表达
将重组质粒pSananA用氯化钙法转化大肠杆菌BL21(DE3)(购自天根公司，目录号CB105‑02)，得到基因工程菌pSananA/BL21。氨苄青霉素筛选培养，挑取单克隆，以Sa‑F和Sa‑R为引物PCR鉴定阳性克隆后，挑取单菌落37℃振荡培养过夜以获得饱和培养物，以1％接种于含氨苄青霉素(50μg/ml)的LB培养基中，37℃继续培养到OD600为0.6‑0.8时，加入终浓度为0.8mmol/L的IPTG诱导5小时后，离心收集菌体，PBS重悬菌体后进行超声波破碎细胞，制样后进行SDS‑PAGE电泳，结果如图3(图3中，泳道S为细胞破碎上清，泳道P为细胞破碎沉淀，泳道全菌为全细胞)所示，从图中可见，SaNanA在大肠杆菌中得到高效表达，且蛋白以可溶的形式表达，大小约32kDa。同时以转入空载体6HisT‑pRSET的大肠杆菌作为对照，结果对照菌中没有得到目的蛋白。
四、SaNanA蛋白的纯化
将基因工程菌pSananA/BL21以1％接种量接种至3瓶100ml含有氨苄抗性的自诱导培养基ZYM中，30℃，250rpm条件下进行诱导，20h后4℃，12000rpm离心，收集菌体。将菌体悬浮于30ml Binding Buffer(20mM Tris；300mM NaCl；20％甘油)中，冰浴，超声波破碎细胞(超声功率400W，破碎5s，间歇10s，总时长60分钟)。将破碎后的菌液于4℃，12000rpm离心20分钟，取上清，用0.22μm滤膜过滤后，用镍柱进行纯化获得单一条带的SaNanA蛋白(图4，泳道1为细胞破碎上清，泳道2为纯化后的蛋白)。将纯化后的蛋白用透析袋除去咪唑，获得纯化的SaNanA蛋白。
含有氨苄抗性的自诱导培养基自诱导培养基ZYM配方如下：100mL A+2mL B+2mL C+200μL D+100μL E(以下均为质量百分比浓度)；
A.ZY：1％胰蛋白胨，0.5％酵母粉；
B.50×M：1.25M Na2HPO4，1.25M KH2PO4，2.5M NH4Cl和0.25M Na2SO4；
C.50×5052：25％甘油，2.5％葡萄糖，10％乳糖；
D.1M MgSO4；
E.1000×微量元素：50Mm FeCl3，20mM CaCl2，10mM MnCl2，10mM ZnSO4，CoCl2、NiCl2、Na2Mo4、Na2SeO3和H3BO3各2mM。
五、SaNanA蛋白的酶活性测定
对SaNanA蛋白进行酶活测定，反应体系为：50mM Tris‑HCl pH7.0，10mM N‑乙酰甘露糖胺(ManNAc)，8.75mM丙酮酸(pyruvic acid，pH7.0)，纯化的SaNanA蛋白1mg，反应体系为100μl。37℃反应30分钟后煮沸2分钟终止反应。实验设三次重复，结果取平均值。酶活单位定义为37℃条件下每分钟产生1μmol N‑乙酰神经氨酸所需要的酶量为一个单位(U)。
用HPLC来检测生成的N‑乙酰神经氨酸，色谱条件为：色谱柱：Aminex‑87Hcolumn；流动相：6mM H2SO4；流动相流速：0.55mL/min；检测器：UV 210nm；进样量：10μl；温度：65℃。HPLC结果如图5所示，图5中A为N‑乙酰神经氨酸标准品(购自sigma公司)的HPLC图谱，从图中可见，N‑乙酰神经氨酸标准品的保留时间为8.565；图5中B为转化产物的HPLC图谱，从图中可见，保留时间为8.617处为N‑乙酰神经氨酸(Neu5Ac)的峰(1)；10.047min处为pyruvate的峰(2)；11.848min处为ManNAc的峰(3)。此结果说明SaNanA蛋白具有催化N‑乙酰甘露糖胺和丙酮酸生成N‑乙酰神经氨酸的酶活性，酶活力为0.3U/mg。