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1、(10)申请公布号 CN 103184267 A (43)申请公布日 2013.07.03 CN 103184267 A *CN103184267A* (21)申请号 201110446187.4 (22)申请日 2011.12.28 C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人 协和干细胞基因工程有限公司 地址 300384 天津市南开区华苑产业区梅苑 路 12 号 申请人 天津滨海协和基因科技有限公司 (72)发明人 韩俊领 杜宏伟 周毓玲 崔丽娟 (74)专利代理机构 天津才智专利商标代理有限 公司 12108 代理人 王晓红 (54) 发明名称 检测乙醇脱氢酶 1B 基因多态性。
2、的试剂盒及 其扩增方法和检测方法 (57) 摘要 本发明公开了一种利用单管双向等位基因特 异性扩增技术结合 SNP 敏感性分子开关技术检测 乙醇脱氢酶 1B 基因多态性的试剂盒及其扩增方 法和检测方法， 所述试剂盒对乙醇脱氢酶 1B 上 Arg47His(rs1229984) 位点进行分型。所述试剂 盒包含扩增缓冲液、 聚合酶、 细胞裂解液和甘油， 可在一个PCR反应中完成对上述SNP位点的分型， 从而了解受试者乙醇脱氢酶 1B 的基因型和其产 物活性。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利。
3、要求书1页 说明书4页 序列表2页 (10)申请公布号 CN 103184267 A CN 103184267 A *CN103184267A* 1/1 页 2 1. 一种检测乙醇脱氢酶 1B 基因多态性的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒在一个 PCR 反应中对 ADH1B 基因上 rs1229984SNP 位点进行分型。 2. 根据权利要求 1 所述的检测乙醇脱氢酶 1B 基因多态性的试剂盒， 其特征在于， 所述 试剂盒包括检测 ADH1B 基因 rs1229984SNP 位点的外侧双向引物和 2 条双向序列特异性引 物。 3. 根据权利要求 2 所述的检测乙醇脱氢酶 1B 基因多态性的试。
4、剂盒， 其特征在于， 所述 检测 ADH1B 基因 rs1229984SNP 的引物碱基序列如下所示 ： 外侧正向引物 ： AGGGTACAATACATGAGTGCCTGAATGCA 外侧反向引物 ： GTAGGGATTAGTAGCAAAACCCTCAAA 突变型引物 ： AACCACGTGGTCATCTGTGC 野生型引物 ： TAGGTGGCTGTAGGAATCTGTCA。 4. 一种权利要求 1 所述的检测乙醇脱氢酶 1B 基因多态性的试剂盒所采用的检测方 法， 其特征在于， 对受检样本 DNA 用扩增缓冲液进行扩增， 扩增后经凝胶电泳在紫外光下见 到根据片段大小区分开的产物条带， 扩增。
5、片段由大到小依次是 ： 内对照 459bp， 野生型产物 337bp 和突变产物 164bp， 根据条带的有无判断 SNP 位点的基因型。 5.一种采用权利要求1所述的检测乙醇脱氢酶1B基因多态性的试剂盒的扩增方法， 其 特征在于， 包括以下步骤 ： 预变性由 1 次循环构成， 其条件为 ： 温度为 94， 时间为 5 分钟 ； PCR 扩增由 30 次循环构成， 其条件为 ： 变性 ： 温度为 94， 时间为 30 秒 ； 退火 ： 温度为 56， 时间为 30 秒 ； 延伸 ： 温度为 72， 时间为 90 秒 ； 扩增结束后于 4保存至电泳检测。 权 利 要 求 书 CN 1031842。
6、67 A 2 1/4 页 3 检测乙醇脱氢酶 1B 基因多态性的试剂盒及其扩增方法和 检测方法 技术领域 0001 本发明涉及一种利用单管双向等位基因特异性扩增技术结合分子开关技术检测 乙醇脱氢酶 1B 基因多态性的试剂盒和检测方法， 特别涉及一种检测 ADH1B 基因 rs1229984 位点的单核苷酸多态性 (SNP) 的试剂盒以及 PCR 扩增方法， 属于生物医学领域。 背景技术 0002 乙醇脱氢酶 (alcohol dehydrogenase， ADH) 介导的氧化途径是酒精代谢的主要 途径， 其多态性可以影响个体对酒精的代谢能力。ADH1B 在第 3 外显子处发生 G143A 点突。
7、 变形成 ADH1B*2， 使得其编码的亚单位 1 的第 47 位的精氨酸被组氨酸替代， 形成 2。 ADH1B*2/*2 等位基因编码的酶活性是 ADH1B*1/*1 等位基因编码的酶活性的 40 倍， 加速了 乙醇向乙醛的转化， 在短时间内乙醛即大量累积。ADH1B 基因多态性在不同种族存在差异， 在亚洲人和白种人中， ADH1B*2 等位基因频率分别为 60 80和 0 10。 0003 乙醇脱氢酶 1B 的多态性对个体的饮酒行为和多种疾病易感性有着重要的影响。 具有 *2/*2 基因型个体由于饮酒后血中乙醛含量迅速升高， 其拟交感神经毒副作用刺激 神经组织释放出儿茶酚胺作用于心血管系统。
8、和神经系统， 诱发脸红、 恶心、 头痛等反应， 这 类反应引发的主观不适感降低了个体对饮酒的兴趣， 促其主动放弃继续饮酒而阻抑过度 饮酒的发生， 因而此基因型被认为是饮酒的天然 “抑制因子” 。Muramatsu 等对上海人和 Thomasson 等对中国台湾人的研究发现非饮酒者 ADH1B*2 等位基因频率高于饮酒者。 0004 饮酒不仅能引起许多社会问题， 而且对机体也产生一定的损害， 长期酗酒可诱发 一系列心脑血管疾病， 机体某些组织器官的损伤， 对身体产生严重的损害甚至引起肿瘤的 发生。 饮酒的健康危害主要由酒精及其中间代谢物乙醛引起， 国外动物学研究证实， 酒精的 中间代谢产物乙醛是。
9、一种肯定性的致癌剂。ADH1B*2 等位基因携带饮酒者有显著的肝脏酶 (如碱性磷酸酶， r一谷氨酰转移酶， 丙氨酸转氨酶)水平的升高， 而这些酶与酒精性肝脏疾 病的发生有关 ； 酒精中毒是导致心脏非缺氧性损伤的主要因素， 乙醛的加速生成可造成心 肌细胞损伤引起一系列心脑血管疾病 ； 持续性饮酒者唾液中乙醛水平升高， 还可导致上消 化道肿瘤的发生。 发明内容 0005 人乙醇脱氢酶 1B 基因遗传多态性直接或间接影响患者饮酒行为和多种疾病的发 生。 本发明提供一种利用单管双向等位基因特异性扩增技术结合分子开关技术检测乙醇脱 氢酶 1B 基因多态性的试剂盒及其扩增方法和检测方法。 0006 本发明。
10、采用的技术方案 ： 一种检测乙醇脱氢酶 1B 基因多态性的试剂盒， 所述试剂 盒在一个 PCR 反应中对 ADH1B 基因上 rs1229984SNP 位点进行分型。 0007 所述试剂盒包括检测 ADH1B 基因 rs1229984SNP 位点的外侧双向引物和 2 条双向 序列特异性引物。 说 明 书 CN 103184267 A 3 2/4 页 4 0008 所述检测 ADH1B 基因 rs1229984SNP 的引物碱基序列如下所示 ： 0009 外侧正向引物 ： AGGGTACAATACATGAGTGCCTGAATGCA 0010 外侧反向引物 ： GTAGGGATTAGTAGCAAA。
11、ACCCTCAAA 0011 突变型引物 ： AACCACGTGGTCATCTGTGC 0012 野生型引物 ： TAGGTGGCTGTAGGAATCTGTCA。 0013 所述的检测乙醇脱氢酶 1B 基因多态性的试剂盒所采用的检测方法， 对受检样本 DNA 用扩增缓冲液进行扩增， 扩增后经凝胶电泳在紫外光下见到根据片段大小区分开的产 物条带， 扩增片段由大到小依次是 ： 内对照 459bp， 野生型产物 337bp 和突变产物 164bp， 根 据条带的有无判断 SNP 位点的基因型。 0014 所述的检测乙醇脱氢酶 1B 基因多态性的试剂盒的扩增方法， 包括以下步骤 ： 0015 预变性由。
12、 1 次循环构成， 其条件为 ： 0016 温度为 94， 时间为 5 分钟 ； 0017 PCR 扩增由 30 次循环构成， 其条件为 ： 0018 变性 ： 温度为 94， 时间为 30 秒 ； 0019 退火 ： 温度为 56， 时间为 30 秒 ； 0020 延伸 ： 温度为 72， 时间为 90 秒 ； 0021 扩增结束后于 4保存至电泳检测。 0022 本发明与现有技术相比具有下列优点和效果 ： 0023 (1) 本发明采用单管双向等位基因特异性扩增技术， 在一次 PCR 反应中即可判断 SNP 位点的基因型， 提高检测效率降低检测成本。 0024 (2) 本发明采用 SNP 敏。
13、感性分子开关技术， 使 3 端不能与模板互补的引物所引发 的扩增非成熟性终止， 无法形成产物， 避免假阳性结果的产生。 0025 (3) 引入内参， 为阴性结果的判读提供依据， 避免假阴性结果的产生。 0026 (4) 本发明扩增后只需通过 DNA 凝胶电泳及凝胶成像系统即可完成检测， 不需添 置贵重设备， 快速， 准确， 灵敏， 特异， 重复性好， 大幅降低了检测成本和操作复杂程度， 适合 临床和科研使用。 0027 (5) 无需 DNA 提取， 只需裂解全血细胞， 将细胞裂解后的悬液加入反应体系即可完 成扩增， 免去 DNA 提取的步骤和成本并避免气溶胶污染。 0028 (6) 本发明的试。
14、剂盒， 提供 2 扩增缓冲液， 使用者只需加入全血裂解悬液和聚合 酶即可进行扩增， 减少了操作步骤， 提高劳动速率， 可以实现高效率检测。 0029 (7) 本发明的试剂盒所提供的 2 扩增缓冲液， 加入了扩增指示染料和高分子沉 降剂， 扩增后即可直接进行凝胶电泳， 无需加入 loading buffer， 避免人为错误。 具体实施方式 0030 本发明的检测乙醇脱氢酶 1B 基因多态性的试剂盒， 所述试剂盒可对 ADH1B 基因 rs1229984SNP 位点进行扩增分型检测， 以外引物扩增产物为内参来检测扩增条件 ； 2 缓 冲包含 SNP 位点的野生型和突变型序列特异性引物、 外侧序列上。
15、下游引物， 通过扩增后 DNA 电泳条带的有无判断是否携带 SNP 位点的基因型表型 ； 当其中野生型所对应的片段长度条 带在扩增中得出阳性结果， 突变型对应位置条带为阴性时判读为野生纯合型， 相反为突变 说 明 书 CN 103184267 A 4 3/4 页 5 纯合型， 野生型和突变型对应片段长度位置都出现阳性条带其结果为杂合型， 通过 DNA 凝 胶电泳综合分析确认受试者的基因型。 0031 所述检测 ADH1B 基因 rs1229984SNP 的引物碱基序列如下所示 ： 0032 F( 外侧正向引物 ) ： AGGGTACAATACATGAGTGCCTGAATGCA 0033 R( 。
16、外侧反向引物 ) ： GTAGGGATTAGTAGCAAAACCCTCAAA 0034 M( 突变型引物 ) ： AACCACGTGGTCATCTGTGC 0035 W( 野生型引物 ) ： TAGGTGGCTGTAGGAATCTGTCA 0036 本发明试剂盒的组分和含量包括 ： 0037 细胞裂解液， 2 扩增缓冲混合液， 聚合酶， 液体石蜡油。 0038 本试剂盒共 40 人份检测应用， 试剂盒的保存温度为 -20。 0039 下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。 下列实施例中未注明具体条件 的试验方法， 通常按照常规条件， 或按照厂商所建议的条件。 0040 实施例检测试剂盒的。
17、使用 0041 步骤 1 ： 全血基因组 DNA 的提取 0042 取受检者外周静脉血 300l， 加入 700l 细胞裂解液， 颠倒混匀 5 次， 12000rpm 离心1分钟， 倒去上清， 并将离心管倒置在干净的吸水纸上停留2分钟， 确保沉淀在管中， 加 入 300l 双蒸水， 涡旋震荡混匀成细胞裂解悬液。 0043 步骤 2 ： PCR 扩增反应 0044 配置反应体系 ： PCR管内加入细胞裂解悬液4.8l、 加入5l 2扩增缓冲液和 0.2l 聚合酶 (2.5U/l) 混合构成独立的反应体系， 加样后充分混匀， 短暂离心， 最后沿 管壁轻轻加入 20l 液体石蜡油封闭体系， 具体见下。
18、表 ： 0045 2 扩增缓冲溶液 5l 细胞裂解悬液 4.8l 聚合酶 (2.5U/l) 0.2l 液体石蜡油 20l 0046 进行 PCR 反应， PCR 程序见下表 ： 说 明 书 CN 103184267 A 5 4/4 页 6 0047 0048 步骤 3 ： 扩增产物凝胶电泳 0049 配置 1.5琼脂糖电泳凝胶， 取扩增产物 6-8l 直接加入加样孔内， 每行另选一 孔加入100bp Ladder Marker为分子量对照进行电泳， 电泳条件为稳压6V/cm胶长， 时间40 分钟。 0050 步骤 4 ： 观测结果 0051 应用紫外成像系统观察电泳条带有无及位置。 0052 。
19、四条区带由大到小依次是 ： 内对照459bp， 野生型产物337bp和突变产物164bp， 根 据条带的有无判断 SNP 位点的基因型。 0053 如果出现 459bp 和 337bp 两条产物带， 则判读为野生型 ； 出现 459bp 和 164bp 两条 产物带则判读为突变纯合型 ； 如果三条带都出现则判读为杂合型。 0054 综上所述， 本发明的内容并不局限在上述的实施例中， 相同领域内的有识之士可 以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例， 但这种实施例都包括在本发 明的范围之内。 说 明 书 CN 103184267 A 6 1/2 页 7 0001 序 列 表 CN 103184267 A 7 2/2 页 8 0002 序 列 表 CN 103184267 A 8 。