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1、(10)申请公布号 CN 103146692 A (43)申请公布日 2013.06.12 CN 103146692 A *CN103146692A* (21)申请号 201310055122.6 (22)申请日 2013.02.21 C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人 丁虎 地址 430030 湖北省武汉市汉口解放大道 1095 号 303 栋 2 单元 6 楼 申请人 汪道文 (72)发明人 丁虎 汪道文 (74)专利代理机构 北京天奇智新知识产权代理 有限公司 11340 代理人 杨文录 (54) 发明名称 一种用于快速检测华法林。
2、个体化用药相关基 因 SNP 位点的试剂盒及其检测方法 (57) 摘要 本发明涉及一种用于快速检测华法林个体化 用药相关基因 SNP 位点的试剂盒及其检测方法， 属于生物医学领域临床检测技术中的基因检测 技术。本发明通过抽取人外周血 DNA， 通过 Taq man探针特异性PCR扩增后进行荧光信号分析， 对 CYP2C9*3（1061A/C） 和 VKORC1（-1639G/A） 两个 多态性位点进行快速精确基因分型。本发明提供 检测上述多态性位点的引物、 探针和试剂盒， 以及 该引物和探针制备试剂盒中的用途， 以及根据上 述多态性位点检测结果确定患者的华法林用量的 用途， 该用途能够有效的减。
3、少华法林用量相关不 良事件的发生和血栓性疾病的预防。可以用于临 床需要服用华法林的各类患者的辅助诊断、 治疗。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 7 页 序列表 2 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书7页 序列表2页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103146692 A CN 103146692 A *CN103146692A* 1/1 页 2 1. 一种引物， 其特征在于， 所述引物为下列序列所示的一对或者两对引物对 ： F 引物 5 -TGCAAGACAGGAGCCACATG-3（SEQ ID No 。
4、： 2） ， R 引物 5 -GGAGAACACACACTGCCAGACAC-3（SEQ ID No ： 3） 和 / 或 F 引物 5 -AACTCCTGACCTCAAGTGATCCA-3（SEQ ID No ： 4） ， R 引物 5 -TGGGAAGTCAAGCAAGAGAAGAC-3（SEQ ID No ： 5） 。 2. 一种探针， 其特征在于， 所述探针为下列序列所示的一组或者两组探针 ： HEX 探针 HEX-CAGAGATACCTTGACCTT-MGB ；（SEQ ID No ： 6） ， FAM 探针 FAM-AGAGATACATTGACCTTC-MGB（SEQ ID No 。
5、： 7） ， 和 / 或 HEX 探针 HEX-ACCGCACCTGGCCA-MGB ；（SEQ ID No ： 8） ， FAM 探针 FAM-ACCGCACCCGGCCA-MGB（SEQ ID No ： 9） 。 3. 如权利要求 2 所述的探针， 其中所述探针的 5 端标记有报告基因， 3 端标记有荧光 淬灭基团， 优选所述探针的 5 端标记的报告基因是 FAM 或 VIC， 3 端标记的荧光淬灭基团 是 TAMRA。 4. 权利要求 1 所述的引物或权利要求 2-3 的任一探针在制备检测 CYP2C9*3（1061A/ C） 和 / 或 VKORC1（-1639G/A） 多态性位点的试。
6、剂盒中的应用。 如权利要求 4 的应用， 所述 CYP2C9*3（1061A/C） 和 / 或 VKORC1（-1639G/A） 多态性位 点和华法林个体化用药相关。 5. 一种试剂盒， 其特征在于， 包括如权利要求 1 所述的引物。 6. 如权利要求 6 的试剂盒， 其进一步包括如权利要求 2-3 的任一探针。 7. 如权利要求 7 的试剂盒， 所述每个引物和探针的含量为 ： F 引物 0.5l， R 引物 0.5l， FAM 探针 0.1l， HEX 探针 0.1l。 8.权利要求6-8任一所述的试剂盒在检测CYP2C9*3 （1061A/C） 和/或VKORC1 （-1639G/ A） 。
7、多态性位点中的应用。 9. 如权利要求 10 的应用， 所述 CYP2C9*3（1061A/C） 和 / 或 VKORC1（-1639G/A） 多态 性位点和华法林个体化用药相关。 权 利 要 求 书 CN 103146692 A 2 1/7 页 3 一种用于快速检测华法林个体化用药相关基因 SNP 位点的 试剂盒及其检测方法 技术领域 0001 本发明涉及一种能用于快速检测华法林个体化用药相关基因 SNP 位点的方法， 具 体说是通过抽取人外周血 DNA， 通过 Taq man 探针特异性 PCR 扩增后进行荧光信号分析， 对 CYP2C9*3（1061A/C） 和 VKORC1（-1639。
8、G/A） 两个多态性位点进行快速精确基因分型。该方 法可以用于临床需要服用华法林的各类患者的辅助诊断、 治疗， 属于生物医学领域临床检 测技术中的基因检测技术。 背景技术 0002 华法林是目前广泛应用的香豆素类口服抗凝药， 用于预防和治疗血栓栓塞性疾病 如 ： 人工瓣膜置换、 静脉血栓形成 ( 肺栓塞 )、 房颤等的口服抗凝治疗， 以及降低心肌梗死复 发及心肌梗死后血栓栓塞死亡的危险。但是华法林的剂量很难掌握， 因为不同病人的所需 用量可以相差十倍以上。目前， CYP2C9 和维生素 K 环氧化物还原酶 (VKOR) 基因多态性对 华法林代谢的影响逐渐被认识， 其中 CYP2C9*3（106。
9、1A/C） 和 VKORC1（-1639G/A） 与华法林 关系最为密切， 都与代谢酶的损伤有关， 从而导致个体间和民族间华法林用量的差异。因 此， 临床上一种快速准确的基因分型方法的应用将对需华法林治疗的患者提供个体化的医 疗方案。 0003 现在已经证实有 30 多种基因相互作用决定华法林代谢、 转运和药理作用。患者 不同的药物基因组学信息是导致华法林剂量差异的重要因素。与遗传因素相关的低凝血 酶原患者最常见的原因是 CYP2C9 代谢活性降低和药物靶标 VKORC1（vitamin K epoxide reductase complex1） 低表达。这两种基因的遗传多态性在全世界范围内可。
10、解释 15% 和 25的华法林剂量变异。 有研究显示基于这两种基因多态性的华法林使用剂量能够有效的 减少不良事件的发生和血栓性疾病的预防1,2。 因此美国FDA在2007年修改了华法林的 使用说明， 建议在使用华法林前进行基因分型。而且 CYP2C9、 VKORC1 基因多态性分析已经 成为国内外有条件的临床实验室重要检测项目。 0004 目前检测 CYP2C9*3（1061A/C） 和 VKORC1（-1639G/A） 遗传多态性的最简单的方 法是 PCR-RFLP， 其主要原理是通过应用特异性限制性内切酶消化 PCR 扩增产物， 并根据消 化位点是否消失来判断其变异存在与否。但该方法操作复。
11、杂， 样本量多时易造成 PCR 产物 的交叉污染且容易出现酶切不充分或酶切过度而出现假阴性或假阳性结果， 可靠性低。荧 光定量 PCR 和多重 PCR 方法尽管特异性有所提高， 但是这两种方法的原理仍然是基于普通 PCR 的原理， 荧光信号的强弱， 引物特异性以及低保真 Taq 酶等这些因素均可造成对结果的 影响。DNA 测序法价格相对昂贵且操作流程繁琐， 在人类后基因组时代突飞猛进的今天， 这 几种方法均不能满足当前对VKORC1(-1639G/A)和CYP2C9(1075A/C)SNP位点快速准确分析 的要求。 0005 Taqman 探针的方法采用特异性的荧光标记的探针， 特异性强， 灵。
12、敏度高且操作方 便， 快速。该方法同样被认为是 SNP 分型的金标准， 在临床应用的前景值得期待。其基本原 说 明 书 CN 103146692 A 3 2/7 页 4 理是 ： 应用一对双荧光标记的Taqman探针， 分别针对双等位SNP的不同基因型， 只有完全匹 配的探针扩增出各自的基因型 ； 用两种荧光染料 FAM,HEX(VIC) 分别标记这两种探针， 就可 以在一次 PCR 反应中完成对单个 SNP 位点的基因型判定。所以该方法中引物长度， 探针长 度， 引物特异性， 探针特异性对检测结果的特异性和敏感性非常重要。 发明内容 0006 本发明要解决的首要技术问题是提供一种能快速精确进。
13、行华法林个体化用药相 关 SNP 位点基因分型的方法。 0007 本发明要解决的另一个技术问题是提供一种快速能精确进行华法林个体化用药 相关 SNP 位点基因分型的试剂盒。 0008 为实现上述目的， 本发明采用以下技术方案 ： 0009 一种能快速精确进行华法林个体化用药相关 SNP 位点基因分型的方法， 该方法 通过提取人的外周血白细胞基因组 DNA， 采用 Taqman 探针的方法测定受试者的 CYP2C9*3 （1061A/C） 和 VKORC1（-1639G/A） 两个位点的基因型。 0010 一组能快速精确进行华法林个体化用药相关 SNP 位点基因分型的引物， 该引物能 特异性的扩。
14、增出 CYP2C9*3（1061A/C） 和 VKORC1（-1639G/A） 位点的扩增产物， 0011 一组能快速精确进行华法林个体化用药相关 SNP 位点基因分型的探针， 该探针能 特异性的结合在目的片段， 通过 PCR 扩增实现荧光信号的倍增。其核心是利用 Taq 酶的 3 -5 外切核酸酶活性， 切断探针， 产生荧光信号。 0012 具有序列表 SEQ ID No ： 1 到 10 所示的碱基序列 ： 其中 SEQ ID No ： 1 是 CYP2C9 3 （1061 A/C） ， SEQ ID No ： 10 是 VKORC1 （-1639G/A） ， SEQIDNo ： 2 和 。
15、3 所示序列为 CYP2C9*3 （1061 A/C） 位点 F 和 R 引物序列， SEQ ID No ： 4 和 5 所示序列为 VKORC1（-1639G/A） 位点 F 和 R 引物序列。SEQ ID No ： 6 和 7 所示序列为 CYP2C9*3（1061A/C） 位点 FAM 和 HEX 探针 序列， SEQ ID No ： 8 和 9 所示序列为 VKORC1（-1639G/A） 位点 FAM 和 HEX 探针序列。 0013 本发明提供第一组引物， 其特征在于， 所述引物为下列序列所示的引物对 ： 0014 F 引物 5-TGCAAGACAGGAGCCACATG-3（SEQ。
16、 ID No ： 2） 0015 R 引物 5-GGAGAACACACACTGCCAGACAC-3（SEQ ID No ： 3） 0016 本发明还提供第一组探针， 其特征在于， 所述探针为下列序列所示的探针 ： 0017 HEX 探针 HEX-CAGAGATACCTTGACCTT-MGB ；（SEQ ID No ： 6） ， 和 0018 FAM 探针 FAM-AGAGATACATTGACCTTC-MGB（SEQ ID No ： 7） 。 0019 进一步， 本发明的第一组探针的 5 端标记有报告基因， 3 端标记有荧光淬灭基团。 优选所述探针的 5 端标记的报告基因是 FAM 或 VIC，。
17、 3 端标记的荧光淬灭基团是 TAMRA。 0020 本发明还提供上述引物或者探针在制备检测 CYP2C9*3（1061A/C） 多态性位点的 试剂盒中的应用。所述 CYP2C9*3（1061A/C） 多态性位点优选和华法林个体化用药相关。 0021 本发明提供第一种试剂盒， 其特征在于， 包括上述检测 CYP2C9*3 （1061A/C） 多态性 位点的引物的核酸分子。 该试剂盒优选进一步包括上述任一探针， 更优选的是， 所述试剂盒 中引物和探针的含量为 F 引物 0.5l， R 引物 0.5l， FAM 探针 0.1l， HEX 探针 0.1l。 0022 本发明还提供一种上述试剂盒在检测。
18、 CYP2C9*3（1061A/C） 多态性位点中的应用， 优选的所述 CYP2C9*3（1061A/C） 多态性位点和华法林个体化用药相关。 说 明 书 CN 103146692 A 4 3/7 页 5 0023 本发明还提供第二组引物， 其特征在于， 所述引物为下列序列所示的引物对 ： 0024 F 引物 5-AACTCCTGACCTCAAGTGATCCA-3（SEQ ID No ： 4） 0025 R 引物 5-TGGGAAGTCAAGCAAGAGAAGAC-3（SEQ ID No ： 5） 。 0026 本发明还提供第二组探针， 其特征在于， 所述探针为下列序列所示的探针 ： 0027。
19、 HEX 探针 HEX-ACCGCACCTGGCCA-MGB ；（SEQ ID No ： 8） ， 和 0028 FAM 探针 FAM-ACCGCACCCGGCCA-MGB（SEQ ID No ： 9） 。 0029 进一步， 本发明的第二组探针的 5 端标记有报告基因， 3 端标记有荧光淬灭基团。 优选所述探针的 5 端标记的报告基因是 FAM 或 VIC， 3 端标记的荧光淬灭基团是 TAMRA。 0030 本发明提供一种上述第二组引物或者第二组任一探针在制备检测 VKORC1 （-1639G/A） 多态性位点的试剂盒中的应用。所述 VKORC1（-1639G/A） 多态性位点优选和华 法。
20、林个体化用药相关。 0031 本发明还提供第二种试剂盒， 其特征在于， 包括第二组引物的核酸分子。优选， 所 述试剂盒还包括上述任一第二组探针。进一步， 所述试剂盒中的核酸分子含量优选 F 引物 0.5l， R 引物 0.5l， FAM 探针 0.1l， HEX 探针 0.1l。 0032 本发明还提供上述第二种试剂盒在检测 VKORC1 （-1639G/A） 多态性位点中的应用。 优选的， 所述 VKORC1（-1639G/A） 多态性位点和华法林个体化用药相关。 0033 本发明还提供第三组引物， 其特征在于， 所述引物为第一组和第二组引物对 ： 0034 F 引物 5-TGCAAGACA。
21、GGAGCCACATG-3（SEQ ID No ： 2） 0035 R 引物 5-GGAGAACACACACTGCCAGACAC-3（SEQ ID No ： 3） ， 和 0036 F 引物 5-AACTCCTGACCTCAAGTGATCCA-3（SEQ ID No ： 4） 0037 R 引物 5-TGGGAAGTCAAGCAAGAGAAGAC-3（SEQ ID No ： 5） 0038 本发明还提供第三组探针， 其特征在于， 所述探针为第一组和第二组探针 ： 0039 HEX 探针 HEX-CAGAGATACCTTGACCTT-MGB ；（SEQ ID No ： 6） ， 0040 FAM。
22、 探针 FAM-AGAGATACATTGACCTTC-MGB（SEQ ID No ： 7） ， 和 0041 HEX 探针 HEX-ACCGCACCTGGCCA-MGB ；（SEQ ID No ： 8） ， 0042 FAM 探针 FAM-ACCGCACCCGGCCA-MGB（SEQ I D No ： 9） 。 0043 进一步， 本发明的第三组探针的 5 端标记有报告基因， 3 端标记有荧光淬灭基团。 优选所述探针的 5 端标记的报告基因是 FAM 或 VIC， 3 端标记的荧光淬灭基团是 TAMRA。 0044 本发明还提供上述第三组引物或者任一探针在制备联合检测 CYP2C9*3 （10。
23、61A/C） 多态性位点和 VKORC1（-1639G/A） 多态性位点的试剂盒中的应用。所述 CYP2C9*3（1061A/ C） 多态性位点和 VKORC1（-1639G/A） 多态性位点优选和华法林个体化用药相关。 0045 本发明提供第三种试剂盒， 其特征在于， 包括上述第三组引物的核酸分子。 该试剂 盒优选进一步包括上述第三组任一探针， 更优选的是， 所述试剂盒中每对引物和探针的含 量为 F 引物 0.5l， R 引物 0.5l， FAM 探针 0.1l， HEX 探针 0.1l。 0046 本发明还提供一种上述第三组试剂盒在联合检测 CYP2C9*3（1061A/C） 多态性位 点。
24、和 VKORC1（-1639G/A） 多态性位点中的应用， 优选的所述 CYP2C9*3（1061A/C） 多态性位 点和 VKORC1（-1639G/A） 多态性位点和华法林个体化用药相关。 0047 进一步， 一种能快速精确进行华法林个体化用药相关 SNP 位点基因分型的试剂盒 （10 人份） ， 由以下试剂组成 ： 说 明 书 CN 103146692 A 5 4/7 页 6 0048 Genotyping Master Mix28l， F 引物 0.5l， R 引物 0.5l， FAM 探针 0.1l， HEX 探针 0.1l， 余量为超纯水， 总体积为 50l。F 和 R 引物是序列。
25、表 SEQ ID No ： 2 和 3， 或 SEQ ID No ： 4 和 5 所示的碱基序列。FAM 和 HEX 探针是序列表 SEQ ID No ： 6 和 7， 或 SEQID No ： 8 和 9 所示的碱基序列。试剂盒保存温度为 -20 度。 0049 本发明具有以下优点 ： 使用了目前国际上普遍认同的 TaqMan 探针技术对 CYP2C9*3（1061A/C） 和 VKORC1（-1639G/A） 进行基因分型， 其原理主要是， 在 TaqMan 探针 法的 PCR 反应体系中， 包括一对 PCR 引物和一条探针。探针只与模板特异性地结合， 其结合 位点在两条引物之间。探针的 。
26、5 端标记有报告基因， 如 FAM,VIC 等， 3 端标记有荧光淬灭 基团， 如 TAMRA 等。当探针完整的时候， 报告基因所发射的荧光能量被淬灭基团吸收， 仪器 检测不到信号。随着 PCR 的进行， Taq 酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针， 其 3 -5 外切核酸酶活性就会将探针切断， 报告基团远离淬灭基团， 其能量不能被吸收， 即产生荧光 信号。 附图说明 0050 图 1CYP2C9*3（1061A/C） 和 VKORC1（-1639G/A） 各基因型的 TaqMan 基因分型图 谱。 图中红点代表等位基因X， 绿点代表等位基因XY， 蓝点代表等位基因Y。 A图为CYP2C9*。
27、3 （1075 A/C）（rs1057910） 探针分型结果， 绿点为 CYP2C9*1/*3, 红点为 CYP2C9*1/*1 ； B 图为 VKORC1 （-1639A/G） （rs9923231） 探针分型结果， 红点为 VKORC1 （-1639A/A） ， 蓝点为 VKORC1 （-1639G/G） ， 绿点为 VKORC1（-1639A/G） 0051 图 2CYP2C9*3（1061A/C） 和 VKORC1（-1639G/A） 各基因型的 DNA 测序图谱。 0052 a 图为 VKORC1（-1639G/A） 位点的 DNA 测序图， 共有三种基因型分别是 -1639A/ A。
28、,-1639G/A 和 -1639G/G ； b 图为 CYP2C9*1/*3 位点的 DNA 测序图， 共有两种基因型分别是 CYP2C9*1/*1 和 CYP2C9*1/*3。 0053 下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明， 并非对发明的限定， 依照本领域 公知的现有技术， 本发明的实施方式并不限于此， 因此凡依照本公开内容所作出的本领域 的等同替换， 均属于本发明的保护范围。 具体实施方式 0054 实施例 0055 一种能用于快速精确华法林个体化用药相关基因 SNP 位点基因分型的试剂盒 0056 一、 试剂盒成分、 使用方法及结果 0057 1.PCR 扩增试剂 ： 10 人份。
29、量 说 明 书 CN 103146692 A 6 5/7 页 7 0058 0059 0060 F 引物 5 -TGCAAGACAGGAGCCACATG-3（SEQ ID No ： 2） 和 0061 R 引物 5 -GGAGAACACACACTGCCAGACAC-3（SEQ ID No ： 3） ， 或者 0062 F 引物 5 -AACTCCTGACCTCAAGTGATCCA-3（SEQ ID No ： 4） 和 0063 R 引物 5 -TGGGAAGTCAAGCAAGAGAAGAC-3（SEQ ID No ： 5） 。 0064 HEX 探针 HEX-CAGAGATACCTTGACCT。
30、T-MGB ；（SEQ ID No ： 6） 和 0065 FAM 探针 FAM-AGAGATACATTGACCTTC-MGB（SEQ ID No ： 7） ， 或者 0066 HEX 探针 HEX-ACCGCACCTGGCCA-MGB ；（SEQ ID No ： 8） 和 0067 FAM 探针 FAM-ACCGCACCCGGCCA-MGB（SEQ ID No ： 9） 0068 检测 CYP2C9 3（1061A/C） 和 VKORC1（-1639G/A） 的 F,R 引物以及探针可以单 独或者联合应用制成检测试剂盒。 0069 2.PCR 反应参数 ： 0070 PCR 反应条件为第一步。
31、 ： 50预热 2 分钟 ； 第二步 ： 95 C 预变性 10 分钟 ； 第三 步 :95 C 变性 15 秒 ； 第四步 ： 60 C 延伸 1 分钟。然后第三步到第四步重复 45 个循环。 图示如下 ： 0071 0072 7900 型 384 孔荧光定量 PCR 仪 ： ABI Prism7900HT 型荧光定量 PCR 仪 （Applied Biosystems， 美国应用生物技术有限公司） 0073 3. 试验结果 0074 PCR 反应结束后， 在 7900HT 型荧光定量 PCR 仪上启动等位基因分型程序， 应用 SDS2.3软件 （Applied Biosystems， 美国。
32、应用生物技术有限公司） 进行分析， 结果如图所示 ： 图中红点代表等位基因 X， 绿点代表等位基因 XY， 蓝点代表等位基因 Y。A 图为 CYP2C9*3 （1075A/C） （rs1057910）探针分型结果， 绿点为 CYP2C9*1/*3（见 A 图上方） , 红点为 CYP2C9*1/*1（见 A 图右下方） ； B 图为 VKORC1（-1639A/G） （rs9923231） 探针分型结果， 红 说 明 书 CN 103146692 A 7 6/7 页 8 点为 VKORC1（-1639A/A） （见 B 图右下方） ， 蓝点为 VKORC1（-1639G/G） （见 B 图左上。
33、方） ， 绿 点为 VKORC1（-1639A/G） （见 B 图中上方） 。( 详见附图 1) 0075 基因型的判断 ： 0076 依据本发明技 TaqMan 探针方法共可分辨出 5 种基因型 ： VKORC1 基因 3 种多态性 ； CYP2C9 基因 2 种多态性 （CYP2C9 第三种基因多态性在中国人群中不存在或频率罕见， 最小 等位基因频率 1， 无临床检测意义） 。具体如下 ： 在经过 7900HT 型荧光定量 PCR 仪分析 后依据基因分型图谱的形状以及本说明书附图的说明， 可判断所测样本的基因型 ； 0077 二、 敏感性和特异性分析 ： 0078 对该技术的敏感性和特异性。
34、， 我们选取了 100 例临床标本进行 DNA 测序验证。100 例临床标本的分析结果示 ： VKORC1（-1639A/A） 野生型有 73 例 ； 而 VKORC1（-1639G/A） 和 VKORC1（-1639G/G） 基因型分别有 23 例和 4 例。CYP2C9*3（1061A/C） 和 CYP2C9*3（1061A/ A） 基因型分别有 94 例和 6 例。敏感性和特异性分析显示敏感性和特异性都达到了 100 以上， 可靠性高 （表 1） 。相关测序图谱见附图 2。 0079 三、 根据所测基因型确定华法林用量 0080 在成功获取每位患者 CYP2C9*3（1061A/C） 和。
35、 VKORC1（-1639G/A） 两位点的基因 型后， 根据患者的相关临床资料 （如年龄、 性别、 身高、 体重等） ， 利用在线网站提供的数据公 式 ： 0081 表 1.HRM 方法对 100 例临床标本进行基因分型的敏感性和特异性分析 0082 0083 http:/www.warfarindosing.org， 可以精确计算出该患者所需要的华法林使用 起始剂量 3。需要注意的是 ： 每个个体的两个多态性位点 ： CYP2C9*3 （1061A/C） 和 VKORC1 （-1639G/A） ， 必须要同时准确获取， 二者缺一不可。 缺少任意一个基因型都将导致最后华法 林使用剂量的不准确。
36、， 可能会导致相关临床事件的发生。 0084 四、 敏感性分析所用人群基本资料 0085 检测对象为华中科技大学同济医学院附属同济医院2009年至2010年间收治需华 法林治疗的 100 例患者， 包括心房颤动 36 例， 深静脉血栓形成和肺栓塞 24 例， 换瓣或支架 植入术后 11 例， 风湿性心脏病 9 例， 冠心病及其他病例 20 例。其中男 48 例， 女 52 例， 年龄 21-83 岁 (5816 岁 )， 所有患者均为汉族。所有对象均采集外周静脉血， K3-EDTA 抗凝管 保存， -80冻存备用。该研究通过了同济医院伦理委员会审查。 0086 本发明具有实用性的例证 0087。
37、 1） 本发明的检测方法可用于分析 CYP2C9*3（1061A/C） 和 VKORC1（-1639G/A） 两 位点的多态性， 应用在对需要服用华法林的患者身上， 以减少不良事件的发生和利于血栓 性相关疾病的早期干预和治疗。 说 明 书 CN 103146692 A 8 7/7 页 9 0088 2） 本发明建立的检测 CYP2C9*3（1061A/C） 和 VKORC1（-1639G/A） 两位点多态性 的方法， 可高灵敏度、 高特异性地应用于需服用华法林患者易感基因诊断用的试剂盒。 0089 本发明叙述了与服用华法林剂量相关的多态性位点， 并提供了一种快速准确低成 本的测定方法， 可以应用于相关疾病基因多态性的基因筛查， 便于基层医疗机构相关技术 的开展及应用。 说 明 书 CN 103146692 A 9 1/2 页 10 0001 0002 序 列 表 CN 103146692 A 10 2/2 页 11 序 列 表 CN 103146692 A 11 1/1 页 12 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103146692 A 12 。