对鳞翅目昆虫具有活性的新苏云金杆菌基因.pdf

本发明提供从苏云金杆菌菌株获得的编码具有对昆虫害虫（包括鳞翅目昆虫）的杀虫活性的多肽的核酸及其变体和片段。本发明的具体实施例提供编码杀虫蛋白的分离核酸、包含本发明实施例的核酸的杀虫组合物、DNA构建体及转化的微生物和植物。这些组合物可在防治害虫特别是植物害虫的方法中使用。

权利要求书一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子选自：
(a)  包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列的核酸分子；
(b)  编码包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽的核酸分子；以及
(c)  编码包含以与(b)的氨基酸序列具有至少95%序列同一性为特征的氨基酸序列的蛋白质的核酸分子；其中所述%同一性是基于整个序列并且通过GAP版本10分析在默认参数下确定。
根据权利要求1所述的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列是已被设计用来在植物中表达的合成序列。
一种DNA构建体，所述DNA构建体包含根据权利要求1所述的核酸分子。
根据权利要求3所述的DNA构建体，其还包含编码异源多肽的核酸分子。
一种宿主细胞，所述宿主细胞含有根据权利要求3所述的DNA构建体。
根据权利要求5所述的宿主细胞，其为细菌细胞。
根据权利要求5所述的宿主细胞，其为植物细胞。
一种转基因植物，所述转基因植物包含根据权利要求7所述的宿主细胞。
根据权利要求8所述的转基因植物，其中所述植物选自玉蜀黍、高粱、小麦、卷心菜、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒、马铃薯、棉花、水稻、大豆、糖用甜菜、甘蔗、烟草、大麦和油籽油菜。
根据权利要求9所述的植物的转化种子，其中所述种子包含所述DNA构建体。
一种具有杀虫活性的分离的多肽，所述分离的多肽选自：
(a)  包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽；
(b)  由SEQ ID NO:1的核苷酸序列编码的多肽；以及
(c)  与(a)或者(b)的多肽序列具有至少95%序列同一性的多肽；其中所述%同一性是基于整个序列并且通过GAP版本10分析在默认参数下确定。
根据权利要求11所述的多肽，其还包含异源氨基酸序列。
一种组合物，所述组合物包含根据权利要求11所述的多肽。
根据权利要求13所述的组合物，其中所述组合物选自散剂、粉剂、丸剂、颗粒剂、喷剂、乳剂、胶体和溶液。
根据权利要求13所述的组合物，其中所述组合物通过对苏云金杆菌细胞的培养物进行干燥、冻干、均质、提取、过滤、离心、沉淀或者浓缩而制备。
根据权利要求13所述的组合物，其包含约1重量%至约99重量%的所述多肽。
一种防治鳞翅目害虫群体的方法，所述方法包括使所述群体接触杀虫有效量的根据权利要求11所述的多肽。
一种杀灭鳞翅目害虫的方法，所述方法包括使所述害虫接触或者给所述害虫饲喂杀虫有效量的根据权利要求11所述的多肽。
一种生产具有杀虫活性的多肽的方法，所述方法包括将根据权利要求4所述的宿主细胞在编码所述多肽的核酸分子得以表达的条件下进行培养，所述多肽选自：
(a)  包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽；
(b)  由SEQ ID NO:1的核苷酸序列编码的多肽；以及
(c)  与(a)或者(b)的多肽序列具有至少95%序列同一性的多肽；其中所述%同一性是基于整个序列并且通过GAP版本10分析在默认参数下确定。
一种在其基因组中稳定掺入了包含编码具有杀虫活性的蛋白质的核苷酸序列的DNA构建体的植物，其中所述核苷酸序列选自：
(a)  包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列的核酸分子；
(b)  编码包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽的核酸分子；
(c)  编码包含以与(b)的氨基酸序列具有至少95%序列同一性为特征的氨基酸序列的蛋白质的核酸分子；其中所述%同一性是基于整个序列并且通过GAP版本10分析在默认参数下确定；以及
其中所述核苷酸序列与驱动编码序列在植物细胞中的表达的启动子有效连接。
根据权利要求20所述的植物，其中所述植物是植物细胞。
一种保护植物免遭害虫侵扰的方法，所述方法包括向所述植物或其细胞中引入至少一种包含编码杀虫多肽的核苷酸序列的表达载体，其中所述核苷酸序列选自：
(a)  包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列的核酸分子；
(b)  编码包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽的核酸分子；以及
(c)  编码包含以与(b)的氨基酸序列具有至少95%序列同一性为特征的氨基酸序列的蛋白质的核酸分子；其中所述%同一性是基于整个序列并且通过GAP版本10分析在默认参数下确定。
根据权利要求22所述的方法，其中所述植物产生对鳞翅目害虫具有杀虫活性的杀虫多肽。

说明书对鳞翅目昆虫具有活性的新苏云金杆菌基因
技术领域
本发明涉及从编码以昆虫害虫杀虫活性为特征的杀虫多肽的新苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)基因获得的天然和重组核酸。本发明的组合物和方法利用所公开的核酸及其编码的杀虫多肽来防治植物害虫。
背景技术
昆虫是造成全世界农作物损失的主要因素。例如，行军虫取食、黑地蚕损害或者欧洲玉米螟损害可对农业生产商造成经济上的破坏。单单是欧洲玉米螟侵袭非甜质玉米和甜玉米造成的昆虫害虫相关作物损失，一年就达大约十亿美元的损害和防治费用。
传统上，影响昆虫害虫群体的主要方法是施用广谱化学杀昆虫剂。但是，消费者和政府监管者都日益关注与合成化学杀虫剂的生产和使用相关的环境危害。由于这些关注，监管者禁止或者限制了一些危害比较大的杀虫剂的使用。因此，人们对于开发另类杀虫剂有很大的兴趣。
使用微生物剂如真菌、细菌或者另一种昆虫对具有农业意义的昆虫害虫进行生物防治，提供出具有环境友好性和商业吸引力的合成化学杀虫剂替代方案。一般而言，生物杀虫剂的使用造成的污染和环境危害的风险较低，并且生物杀虫剂能提供比传统广谱化学杀昆虫剂的特征性靶标特异性更高的靶标特异性。另外，生物杀虫剂的生产成本往往较低，因此能提高众多作物的经济产量。
已知芽孢杆菌属(Bacillus)微生物的某些种对于多种昆虫害虫具有杀虫活性，这些昆虫包括鳞翅目、双翅目、鞘翅目、半翅目害虫以及其他害虫。苏云金杆菌(Bt)和日本金龟芽孢杆菌(Bacillus papilliae)是至今为止发现的最成功的生物控制剂的代表。幼虫芽孢杆菌(B.larvae)、缓病芽孢杆菌(B.lentimorbus)、球形芽孢杆菌(B.sphaericus)的菌株（Harwook编辑，((1989)Bacillus(Plenum Press),306）和蜡状芽孢杆菌(B.cereus)的菌株(WO96/10083)也被指出具有昆虫病原性。杀虫活性似乎集中在类芽孢结晶蛋白包涵体中，不过从芽孢杆菌的营养生长期也分离到杀虫蛋白。有几种编码这些杀虫蛋白的基因已得到分离和表征（参见例如美国专利No.5,366,892和5,840,868）。
微生物杀昆虫剂特别是那些从芽孢杆菌菌株获得的微生物杀昆虫剂，在农业上作为害虫化学防治的替代方案已起到重要的作用。最近，农业科学家通过对作物进行遗传工程改造以产生来自芽孢杆菌的杀虫蛋白，开发出了抗虫性增强的作物。例如，已对玉米和棉花作物进行遗传工程改造以产生从Bt的菌株分离的杀虫蛋白（参见例如Aronson，(2002)，《细胞分子生命科学》(Cell Mol.Life Sci.)，59(3):417‑425；Schnepf等人(1998)，《微生物分子生物学评论》(Microbiol Mol Biol Rev.)，62(3):775‑806）。这些经遗传工程改造的作物目前在美国农业中广泛应用，给农场主提供了替代传统昆虫防治方法的环境友好的方案。另外，经遗传工程改造而含有杀虫Cry毒素的马铃薯已被出售给美国农场主。虽然这些经遗传工程改造的抗昆虫作物已证明在商业上十分成功，但它们对仅仅少数经济上重要的昆虫害虫具有抗性。
因此，仍然需要对昆虫害虫具有更大范围的杀昆虫活性的新Bt毒素，例如对更多种类的鳞翅目昆虫具有活性的毒素。另外，仍然需要对多种昆虫害虫具有活性的生物杀虫剂和需要具有改进的杀昆虫活性的生物杀虫剂。
发明内容
本发明提供用于影响昆虫害虫的组合物和方法。更具体而言，本发明的实施例涉及利用编码杀昆虫肽的核苷酸序列来产生能表达本发明实施例的杀昆虫多肽的转化微生物和植物从而影响昆虫的方法。在一些实施例中，所述核苷酸序列编码对至少一种属于鳞翅目的昆虫具有杀虫作用的多肽。
本发明实施例提供编码对昆虫害虫具有杀虫活性的多肽的核酸及其片段和变体（例如SEQ ID NO:1，其编码SEQ ID NO:2）。本发明实施例的获自Bt的野生型（例如天然）核苷酸序列编码一种新型杀昆虫肽。本发明实施例还提供所公开的核苷酸序列的编码生物活性（例如杀昆虫）多肽的片段和变体。
本发明实施例还提供由本发明实施例的天然或者经修饰的（例如经诱变或者经操纵的）核酸所编码的分离的杀虫（例如杀昆虫）多肽。具体举例，本发明实施例的杀虫蛋白包括从经诱变的核酸产生的全长蛋白质和多肽的片段，所述经诱变的核酸被设计用来将特定氨基酸序列引入到本发明实施例的多肽中。在具体的实施例中，所述多肽相对于衍生它们的天然多肽的杀虫活性具有增强的杀虫活性。
本发明实施例的核酸也可用于产生转基因的（例如转化的）单子叶植物或者双子叶植物，所述植物的特征在于其基因组包含至少一个被稳定掺入的核苷酸构建体，所述核苷酸构建体包含本发明实施例的编码序列和与其有效连接的驱动所编码的杀虫多肽的表达的启动子。因此，本发明还提供转化的植物细胞、植物组织、植物及其种子。
在一个具体的实施例中，可使用已被优化以使在宿主植物中的表达提高的核酸来产生转化植物。例如，可将本发明实施例的杀虫多肽之一进行反翻译，以产生包含为了在特定宿主中表达而优化的密码子的核酸，所述宿主例如是作物如玉米(Zea mays)作物。这种转化的植物（例如双子叶植物或者单子叶植物）表达编码序列将导致产生杀虫多肽并给植物赋予提高的抗虫性。一些实施例提供表达能在用于影响各种昆虫害虫的方法中使用的杀虫多肽的转基因植物。
本发明实施例还包括含有本发明实施例的杀昆虫多肽的杀虫或者杀昆虫组合物，并可任选包含另外的杀昆虫肽。本发明实施例涵盖将这种组合物应用于昆虫害虫的环境以影响昆虫害虫。
具体实施方式
本发明的实施例涉及用于影响昆虫害虫尤其是植物害虫的组合物和方法。更具体而言，本发明实施例的分离核酸及其片段和变体包含编码杀虫多肽（例如蛋白质）的核苷酸序列。所公开的杀虫蛋白对昆虫害虫具有生物活性（例如杀虫活性），所述昆虫害虫例如但不限于鳞翅目的昆虫害虫。目的昆虫害虫包括但不限于欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)。
本发明实施例的组合物包含编码杀虫多肽的分离核酸及其片段和变体、包含本发明实施例的核苷酸序列的表达盒、分离的杀虫蛋白以及杀虫组合物。一些实施例提供经修饰的杀虫多肽，其特征在于其对鳞翅目昆虫的杀昆虫活性相对于相应的野生型蛋白的杀虫活性而言得到改进。本发明实施例还提供用这些新核酸转化的植物和微生物，以及涉及将这种核酸、杀虫组合物、转化的生物体及其产物用于影响昆虫害虫的方法。
本发明实施例的核酸和核苷酸序列可用于转化任何生物体以产生所编码的杀虫蛋白。本发明提供涉及使用这种经转化的生物体来影响或者防治植物害虫的方法。本发明实施例的核酸和核苷酸序列也可用于转化细胞器如叶绿体（McBride等人，(1995)，《生物技术》(Biotechnology)，13:362‑365；以及Kota等人，(1999)，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，96:1840‑1845）。
本发明实施例还涉及鉴定天然编码序列的编码生物活性杀虫蛋白的片段和变体。本发明实施例的核苷酸序列可在用于影响害虫特别是昆虫害虫（如鳞翅目害虫）的方法中直接使用。因此，本发明实施例提供不依赖使用传统的合成化学杀昆虫剂而影响昆虫害虫的新方法。本发明实施例涉及到天然生物可降解杀虫剂及其编码基因的发现。
本发明实施例还提供天然编码序列的也编码生物活性（例如杀虫）多肽的片段和变体。本发明实施例的核酸涵盖已被优化以便由特定生物体的细胞表达的核酸或者核苷酸序列，例如已使用基于具有增强的杀虫活性的多肽的氨基酸序列的植物偏好密码子进行了反翻译（即逆翻译）的核酸序列。本发明实施例还提供能赋予本发明实施例的多肽改进的或者变更的性质的突变。参见例如美国专利7,462,760。
在下面的描述中，以广义方式使用到多个术语。提供以下定义以便理解本发明实施例。
单位、前缀和符号可以以其国际单位制(SI)接受的形式表示。除非另有规定，否则核酸以5'至3'的取向从左向右书写；而氨基酸序列以氨基到羧基的方向从左向右书写。数值范围包括限定该范围的数字。氨基酸在本文中可通过它们通常知道的三字母符号表示或通过IUPAC‑IUB生化命名委员会(IUPAC‑IUB Biochemical Nomenclature Commission)推荐的单字母符号表示。同样，核苷酸可通过它们通常接受的单字母密码表示。以上定义的术语通过参考本说明书整体而得到更完全的定义。
本文所用的“核酸”包括指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，并且除非另外限制，否则涵盖在以下方面具有天然核苷酸的基本性质的已知类似物（例如肽核酸）：其以与天然核苷酸相似的方式杂交至单链核酸。
本文所用的术语“编码”或“所编码的”在指定的核酸的语境中使用时，意指该核酸包含指导核苷酸序列翻译成指定蛋白质所必需的信息。据以编码蛋白质的信息是通过使用密码子来确定的。编码蛋白质的核酸可以包含在该核酸的翻译区内的非翻译序列（例如内含子）或者可以缺少这种居间的非翻译序列（例如，如在cDNA中）。
本文所用的指涉指定的多核苷酸或其所编码的蛋白质的“全长序列”，意指具有天然的（非合成的）内源序列的整个核酸序列或者整个氨基酸序列。全长多核苷酸编码指定蛋白质的全长催化活性形式。
本文所用的术语“反义”在核苷酸序列的取向的语境中使用时，指双链多核苷酸序列以反义链得以转录的取向有效连接到启动子。反义链与内源转录产物充分互补，使得内源转录产物的翻译常常被抑制。因此，在术语“反义”在特定核苷酸序列的语境中使用的情形中，这个术语指该参考转录产物的互补链。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基为相应的天然氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然氨基酸聚合物。
术语“残基”或“氨基酸残基”或“氨基酸”在本文中可互换使用，指整合进蛋白质、多肽或肽（统称“蛋白质”）中的氨基酸。氨基酸可以是天然氨基酸，并且除非另外进行限制，否则可涵盖可以以与天然氨基酸类似的方式发挥功能的天然氨基酸已知类似物。
本发明实施例的多肽可以从本文公开的核酸产生，或者通过使用标准的分子生物学技术产生。例如，本发明实施例的蛋白质可通过在适当的宿主细胞中表达本发明实施例的重组核酸来产生，或者作为另一种选择，通过离体(ex vivo)程序的组合来产生。
本文所用的术语“分离的”和“纯化的”可互换使用，指这样的核酸或者多肽或者它们的生物活性部分，所述核酸或者多肽实质上或者基本上不含通常在其天然环境中存在的与其相伴或者相互作用的成分。因此，分离的或者纯化的核酸或者多肽，当通过重组技术产生时实质上不含其他细胞物质或培养基，或者当通过化学法合成时实质上不含化学前体或其他化学品。
“分离的”核酸通常不含在该核酸的来源生物体的基因组DNA中天然位于该核酸的旁侧的序列（即位于该核酸的5'和3'末端的序列）（例如蛋白质编码序列）。例如，在各个实施例中，分离的核酸可含有少于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的在该核酸的来源细胞的基因组DNA中天然位于该核酸的旁侧的核苷酸序列。
本文所用的术语“分离的”或者“纯化的”在用来指本发明实施例的多肽时，意指该分离蛋白实质上不含细胞物质，包括具有小于约30%、20%、10%或者5%（以干重计）的污染性蛋白质的蛋白质制品。当本发明实施例的蛋白质或其生物活性部分用重组法生产时，培养基代表少于约30%、20%、10%或5%（以干重计）的化学前体或者非目的蛋白的化学品。
在本说明书通篇中，词语“包含”及其语法变体要被理解为暗示包括规定的元件、整数或步骤或者元件组、整数组或步骤组，但不排除任何其他元件、整数或步骤或者元件组、整数组或步骤组。
本文所用的术语“影响昆虫害虫”指在昆虫发育的任何阶段引起昆虫取食、生长和/或行为方面的变化，包括但不限于：杀死昆虫；迟滞生长；阻碍繁殖能力；拒食活性等。
本文所用的术语“杀虫活性”和“杀昆虫活性”同义地用来指某生物体或物质（例如蛋白质）的可以通过害虫在取食和暴露达适宜时间长度后害虫死亡率、害虫体重减轻、害虫排斥性和害虫其他行为和身体变化（但不限于通过这些方面）进行测量的活性。因此，具有杀虫活性的生物体或者物质不利地影响害虫健康状况的至少一个可测量参数。例如，“杀虫蛋白”是本身显示杀虫活性或者与其他蛋白质组合而显示杀虫活性的蛋白质。
本文所用的术语“杀虫有效量”表示某物质或者生物体的当在害虫的环境中存在时具有杀虫活性的量。对于每种物质或者生物体，杀虫有效量是针对在指定环境中受影响的每种害虫凭经验确定。类似地，当害虫是昆虫害虫时，“杀昆虫有效量”可用来指“杀虫有效量”。
本文所用的术语“重组工程改造的”或者“工程改造的”表示基于对蛋白质作用机制的了解和对被引入、缺失或者置换的氨基酸的考虑，利用重组DNA技术在蛋白质结构中引入（例如工程造出）变化。
本文所用的术语“突变核苷酸序列”或者“突变”或者“经诱变的核苷酸序列”表示这样的核苷酸序列，其已被诱变或者变更以包含一个或者多个在相应的野生型序列中不存在的核苷酸残基（例如碱基对）。这种诱变或者变更由核酸残基的一个或者多个添加、缺失或者置换或取代所组成。当突变是通过添加、移除或者取代蛋白水解位点的氨基酸作出时，这个添加、移除或者取代可在蛋白水解位点模体内或者靠近蛋白水解位点模体，只要达到突变的目的（即，只要该位点的蛋白水解被改变）。
突变核苷酸序列可编码表现出改进的或者降低的杀昆虫活性的突变杀昆虫毒素，或者编码这样的氨基酸序列，该氨基酸序列能赋予含有它的多肽改进的或者降低的杀昆虫活性。本文所用的术语“突变体”或者“突变”在蛋白质、多肽或者氨基酸序列的语境中是指这样的序列，其已被诱变或者变更以包含一个或者多个在相应的野生型序列中不存在的氨基酸残基。这种诱变或者变更由氨基酸残基的一个或者多个添加、缺失或者置换或取代所组成。突变多肽表现出改进的或者降低的杀昆虫活性，或者代表这样的氨基酸序列，该氨基酸序列能赋予含有它的多肽改进的杀昆虫活性。因此，术语“突变体”或者“突变”指突变核苷酸序列和所编码的氨基酸中的任一者或两者。突变体可单独使用，或者可与本发明实施例的其他突变体或者与其他突变体以任何相容的组合进行使用。“突变多肽”可相反地表现出杀昆虫活性的降低。在超过一个突变被添加到特定核酸或者蛋白质的情形中，各突变可同时添加或者依序添加；如果是依序添加，各突变可以按任何合适的顺序添加。
本文所用的术语“改进的杀昆虫活性”或者“改进的杀虫活性”指本发明实施例的杀昆虫多肽相对于其相应的野生型蛋白的杀昆虫活性具有增强的该活性，和/或杀昆虫多肽对更广范围的昆虫有效，和/或杀昆虫多肽对不易受野生型蛋白的毒性影响的昆虫具有特异性。改进的或者增强的杀虫活性的发现，要求证明相对于野生型杀昆虫多肽的针对同一昆虫靶标测定的杀虫活性而言，对该昆虫靶标的杀虫活性提高至少10%，或者至少20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、100%、150%、200%、或300%或者更高。
例如，如果相对于受野生型Bt毒素影响的昆虫范围而言受该多肽影响的昆虫范围更广或者更窄，则就提供了改进的杀虫或者杀昆虫活性。在需要通用性的情况下，更宽的影响范围可能是合乎需要的，而在例如有益昆虫可能反而会被该毒素的使用或者存在影响的情况下，较窄的影响范围可能是合乎需要的。虽然本发明实施例不受任何具体作用机制的约束，但也可通过多肽的一个或者多个特性的改变提供改进的杀虫活性；例如，多肽在昆虫肠道中的稳定性或者寿命可相对于相应的野生型蛋白的稳定性或者寿命得到提高。
本文所用的术语“毒素”指表现出杀虫活性或杀昆虫活性或者改进的杀虫活性或改进的杀昆虫活性的多肽。“Bt”或者“苏云金杆菌”毒素意指包括苏云金杆菌各个菌株中存在的较广类别的Cry毒素，包括诸如Cry1、Cry2或者Cry3的毒素在内。
术语“蛋白水解位点”或者“切割位点”指这样的氨基酸序列，其赋予对一类蛋白酶或者某种特定蛋白酶的敏感性，使得含有该氨基酸序列的多肽被该类蛋白酶或者该特定蛋白酶消化。蛋白水解位点据称对能识别该位点的蛋白酶“敏感”。本领域认识到，消化的效率会不同，而消化效率的降低可导致多肽在昆虫肠道中的稳定性或者寿命提高。因此，蛋白水解位点可赋予超过一种蛋白酶或者一类蛋白酶敏感性，但各种蛋白酶在该位点的消化的效率可不同。蛋白水解位点包括例如胰蛋白酶位点、胰凝乳蛋白酶位点和弹性蛋白酶位点。
研究已证实，鳞翅目昆虫肠道蛋白酶包括胰蛋白酶类、胰凝乳蛋白酶类和弹性蛋白酶类。参见例如Lenz等人，(1991)，《昆虫生物化学与生理学档案》(Arch.Insect Biochem.Physiol.)，16:201‑212；以及Hedegus等人，(2003)，《昆虫生物化学与生理学档案》(Arch.Insect Biochem.Physiol.)，53:30‑47。例如，在棉铃虫(Helicoverpa armigera)幼虫的中肠中发现了大约18种不同的胰蛋白酶类（参见Gatehouse等人，(1997)，《昆虫生物化学与分子生物学》(Insect Biochem.Mol.Biol.)，27:929‑944）。已研究了这些蛋白酶偏好的蛋白水解底物位点。参见例如Peterson等人，(1995)，《昆虫生物化学与分子生物学》(Insect Biochem.Mol.Biol.)，25:765‑774。
已试图了解Bt毒素的作用机制和对毒素进行工程改造使其具有改进的性质。已证实昆虫肠道蛋白酶可影响Bt Cry蛋白对昆虫的影响。一些蛋白酶会通过将Cry蛋白从“原毒素”形式加工成毒性形式或者“毒素”而将它们活化。参见Oppert，(1999)，《昆虫生物化学与生理学档案》(Arch.Insect Biochem.Phys.)，42:1‑12；以及Carroll等人，(1997)，《无脊椎动物病理学杂志》(J.Invertebrate Pathology)，70:41‑49。毒素的这个活化可包括从蛋白质去除N末端肽和C末端肽，也可包括蛋白质的内部切割。其他蛋白酶可降解Cry蛋白。参见Oppert，出处同上。
对具有不同特异性的Cry毒素的氨基酸序列的比较揭示出五个高度保守的序列块。在结构上，这些毒素包含三个不同的结构域，它们从N末端到C末端分别为：参与孔形成的一簇七个α螺旋（称为“结构域1”）、参与细胞结合的三个反平行β片层（称为“结构域2”）和β夹层（称为“结构域3”）。这些结构域的位置和性质是本领域技术人员知道的。参见例如Li等人，(1991)，《自然》(Nature)，305:815‑821；以及Morse等人，(2001)，《结构》(Structure)，9:409‑417。当指涉特定结构域如结构域1时，应理解，该结构域相对于特定序列的精确终点并不关键，只要该序列或其部分包括能提供至少某种归因于该特定结构域的功能的序列。因此，例如，当指涉“结构域1”时，意指特定序列包括一簇七个α螺旋，但该所使用的或者所指的序列的精确终点并不关键。本领域技术人员熟悉这种终点的确定和这种功能的评估。
为更好地表征和改进Bt活性，研究了Bt细菌的各种菌株。发现从Bt菌株的培养物制备的晶体制品具有抗多种鳞翅目害虫的杀虫活性（参见例如实验实例1）。已作出努力以从选定的菌株鉴定编码晶体蛋白的核苷酸序列，并且从这些细菌菌株分离出了本发明实施例的野生型（即天然）核酸，将其克隆到表达载体中并转化到大肠杆菌(E coli)中。认识到，取决于给定的制品的特性，有时需要进行胰蛋白酶预处理以活化杀虫蛋白才能表现出杀虫活性。因此，应理解，一些杀虫蛋白需要蛋白酶消化（例如通过胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等进行）进行活化，而其他蛋白质不用进行活化就具有生物活性（例如杀虫活性）。
这种分子可通过例如美国专利7,462,760所描述的手段进行变更。另外，可对核酸序列进行工程改造以编码含有额外的突变的多肽，所述额外的突变相对于天然多肽的杀虫活性赋予改进的或者变更的杀虫活性。这种经工程改造的核酸的核苷酸序列包含野生型序列中不存在的突变。
本发明实施例的突变多肽通常通过涉及以下步骤的方法制备：获得编码Cry家族多肽的核酸序列；基于考虑靶标结构域在该毒素作用模式中的所提议的功能，分析该多肽的结构，以鉴定用于对相应基因序列进行诱变的特定“靶标”位点；向该核酸序列中引入一个或者多个突变，以在所编码的多肽序列的一个或者多个氨基酸残基中产生所需的变化；以及分析所产生的多肽的杀虫活性。
许多Bt杀昆虫毒素由于它们的氨基酸序列和三级结构的相似性而有不同程度的相关性，并且获得Bt毒素的晶体结构的手段是公知的。Cry3A和Cry3B多肽的示例性高分辨率晶体结构解法在文献中可获得。Cry3A基因的已解出的结构（Li等人，(1991)，《自然》(Nature)，353:815‑821）使人们把握了毒素的结构与功能之间的关系。将已发表的Bt毒素结构分析与已报道的与特定结构、模体等相关的功能结合起来考虑，发现该毒素的特定区域与该毒素蛋白的特定功能和作用模式各分立步骤相关。例如，许多从Bt分离的毒素通常被描述为包含三个结构域：参与孔形成的七螺旋束、参与受体结合的三片层结构域以及β夹层模体（Li等人，(1991)，《自然》(Nature)，305:815‑821）。
如美国专利No.7,105,332和7,462,760中报道，可通过靶向位于Cry蛋白的结构域1的α螺旋3和4之间的区域来改进该毒素的毒性。这个理论以有关杀昆虫毒素的大量知识为前提，这些知识包括：1)已报道Cry3A毒素的结构域1的α螺旋4和5插入到易感昆虫的中肠的衬细胞的脂质双层中（Gazit等人，(1998)，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，95:12289‑12294）；2)本发明人知道野生型蛋白的氨基酸序列内胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶切割位点的位置；3)观察到在通过胰蛋白酶或者胰凝乳蛋白酶处理进行体外活化后野生型蛋白对某些昆虫的活性更高；以及4)有报道说从3'末端消化毒素导致了对昆虫的毒性降低。
可在多个背景序列中产生和置入一系列突变，以产生具有增强的或者变更的杀虫活性的新型多肽。参见例如美国专利7,462,760。这些突变包括但不限于：在位于结构域1的螺旋3和4之间的区域中添加至少一个对蛋白酶更敏感的位点（例如胰蛋白酶切割位点）；将野生型序列中的原始蛋白酶敏感位点用另一不同的蛋白酶敏感位点取代；在特定的位置中添加多个蛋白酶敏感位点；在蛋白酶敏感位点附近添加氨基酸残基以改变多肽的折叠从而增强多肽在蛋白酶敏感位点的消化；以及添加突变以保护多肽免遭会使毒性降低的降解性消化（例如作出一系列突变，其中野生型氨基酸被缬氨酸取代，以保护多肽免遭消化）。各突变可单独使用或者以任何组合使用以提供本发明实施例的多肽。
这样，本发明实施例提供包含多个突变的序列，例如包含位于所编码多肽结构域1的α螺旋3和4之间的额外或者另选的蛋白酶敏感位点的突变。属于额外或者另选的蛋白酶敏感位点的突变可对几类蛋白酶敏感，如丝氨酸蛋白酶（其包括胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶）或者诸如弹性蛋白酶的酶类。因此，可设计属于额外或者另选的蛋白酶敏感位点的突变，使得该位点容易被多种蛋白酶如哺乳动物蛋白酶或者昆虫蛋白酶识别和/或切割。也可将蛋白酶敏感位点设计成被已知在某种生物体中产生的特定类别的酶或者特定的酶切割，例如玉米穗虫(Heliothis zea)产生的胰凝乳蛋白酶（Lenz等人，(1991)，《昆虫生物化学与生理学档案》(Arch.Insect Biochem.Physiol.)，16:201‑212）。突变也可赋予对蛋白水解消化的抗性，例如对胰凝乳蛋白酶在肽C末端的消化的抗性。
在本发明实施例的核酸所编码的多肽的氨基酸序列中存在额外和/或另选的蛋白酶敏感位点，可改进该所编码的多肽的杀虫活性和/或特异性。因此，可将本发明实施例的核苷酸序列进行重组工程改造或者操纵，以产生与未经修饰的野生型毒素相比具有改进的或者变更的杀昆虫活性和/或特异性的多肽。另外，本文所公开的突变可置入其他核苷酸序列或者与其他核苷酸序列联用以提供改进的性质。例如，可将容易被昆虫胰凝乳蛋白酶（例如披肩粘虫或者玉米穗虫中存在的胰凝乳蛋白酶）切割的蛋白酶敏感位点（Hegedus等人，(2003)，《昆虫生物化学与生理学档案》(Arch.Insect Biochem.Physiol.)，53:30‑47；以及Lenz等人，(1991)，《昆虫生物化学与生理学档案》(Arch.Insect Biochem.Physiol.)，16:201‑212）置入Cry背景序列，以提供对该序列的改进的毒性。这样，本发明实施例提供具有改进的性质的毒性多肽。
例如，经诱变的Cry核苷酸序列可构成包含额外密码子的额外突变体，所述额外密码子将第二胰蛋白酶敏感氨基酸序列（天然胰蛋白酶位点之外的）引入到所编码的多肽中。本发明实施例的另选的添加突变体包含这样的额外密码子，其被设计用来将至少一个额外的不同蛋白酶位点引入到多肽中，所述位点例如紧邻天然胰蛋白酶位点的5'或者3'的胰凝乳蛋白酶敏感位点。作为另一种选择，可产生置换突变体，其中核酸的编码天然蛋白酶敏感位点的至少一个密码子被破坏，而另选的密码子被引入到核酸序列中，以提供另一不同的（例如置换的）蛋白酶敏感位点。也可将取代突变体加到Cry序列，其中所编码多肽中存在的天然胰蛋白酶切割位点被破坏，而在它的位置引入胰凝乳蛋白酶或者弹性蛋白酶切割位点。
认识到，可使用任何编码属于蛋白水解位点或者推定的蛋白水解位点的氨基酸序列（例如诸如NGSR、RR或者LKM的序列）的核苷酸序列，并且用来将任何这些切割位点引入到变体多肽中的密码子的准确种类可根据在特定植物物种中的使用（即表达）而变。还认识到，可将任何所公开的突变引入到本发明实施例的任何这样的多核苷酸序列中，所述多核苷酸序列包含提供作为修饰靶标的天然胰蛋白酶切割位点的氨基酸残基的密码子。因此，可将全长毒素或其片段的变体修饰成含有额外的或者另选的切割位点，并且这些实施例旨在被本文所公开的实施例的范围所涵盖。
本领域技术人员会认识到，可向本发明实施例的序列加入任何有用的突变，只要所编码的多肽保持杀虫活性。因此，还可将序列进行突变，使得所编码的多肽对胰凝乳蛋白酶的蛋白水解消化具有抗性。一个以上的识别位点可以以任何组合在特定位置加入，并且可以将多个识别位点加到毒素或者从毒素移除多个识别位点。因此，额外的突变可包含三个、四个或者更多个识别位点。要认识到，可在任何合适的多核苷酸序列中工程造出多个突变；因此，全长序列或其片段都可被修饰成含有额外或者另选的切割位点并且能抵抗蛋白水解消化。这样，本发明实施例提供含有能改进杀虫活性的突变的Cry毒素，以及用于使用其他Bt毒素影响害虫的改进的组合物和方法。
突变可保护多肽免遭蛋白酶降解，例如通过从不同区域移除推定的蛋白水解位点（如推定的丝氨酸蛋白酶位点和弹性蛋白酶识别位点）来保护。可将这种推定的位点中的一些或者全部进行移除或者变更，使得在原始位点的位置处的蛋白水解降低。可通过将某个突变多肽与野生型毒素进行比较，或者通过将在氨基酸序列有差异的各个突变毒素进行比较，来评估蛋白水解的变化。推定的蛋白水解位点以及蛋白水解位点包括但不限于以下序列：RR，为胰蛋白酶切割位点；LKM，为胰凝乳蛋白酶位点；和NGSR，为胰蛋白酶位点。这些位点可通过添加或者缺失任何数目和种类的氨基酸残基进行变更，只要多肽的杀虫活性提高。因此，由包含突变的核苷酸序列所编码的多肽相对于天然或者背景序列，将包含至少一个氨基酸变化或者添加，或者2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、32、35、38、40、45、47、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270或者280个或者更多个氨基酸变化或者添加。也可通过截短天然或者全长序列（这是本领域知道的）来改进多肽的杀虫活性。
本发明实施例的组合物包括编码杀虫多肽的核酸及其片段和变体。具体而言，本发明实施例提供包含编码SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的核苷酸序列的分离核酸分子或者编码所述氨基酸序列的核苷酸序列，例如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，以及它们的片段和变体。
还值得关注的是编码本发明实施例的杀虫蛋白的优化核苷酸序列。本文所用的词语“优化核苷酸序列”指经优化以在特定生物体例如植物中表达的核酸。可使用本领域知道的方法为任何目的生物体制备优化核苷酸序列。参见例如，美国专利No.7,462,760，该专利描述了编码所公开的杀虫蛋白的优化核苷酸序列。在这个例子中，核苷酸序列是这样制备的：将蛋白质的氨基酸序列进行反翻译，并改变核苷酸序列以包含玉蜀黍偏好的密码子而仍编码同一氨基酸序列。Murray等人，(1989)，《核酸研究》(Nucleic Acids Res.)，17:477‑498对这个程序作了更详细的描述。优化核苷酸序列可用于提高杀虫蛋白在植物中的表达，所述植物例如禾本科(Gramineae,Poaceae)的单子叶植物，例如玉蜀黍或者玉米植物。
本发明实施例还提供由本发明实施例的天然或者修饰的核酸编码的分离的杀虫（例如杀昆虫）多肽。更具体而言，本发明实施例提供包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽，以及由本文所述核酸（例如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，以及它们的片段和变体。
在具体的实施例中，本发明实施例的杀虫蛋白提供全长杀昆虫多肽、全长杀昆虫多肽的片段以及从被设计用来向本发明实施例的多肽中引入特定氨基酸序列的经诱变核酸所产生的变体多肽。在具体的实施例中，被引入到多肽中的氨基酸序列包含提供酶（如蛋白酶）的切割位点的序列。
本领域知道，Bt的杀虫活性通常是通过在昆虫肠道中由各种蛋白酶对该肽进行切割来活化。由于肽可能并不总是以十足的效率在昆虫肠道中被切割，因此全长毒素的片段与全长毒素本身相比可能具有增强的杀虫活性。因此，本发明实施例的多肽中的一些包括全长杀昆虫多肽的片段，并且所述多肽片段、变体和突变中的一些与衍生出它们的天然杀昆虫多肽相比具有增强的杀虫活性，特别是如果该天然杀昆虫多肽在进行活性筛选之前不用蛋白酶进行体外活化的话。因此，本申请涵盖序列的截短版本或者片段。
可将突变置入任何背景序列，包括这种截短的多肽，只要多肽保持杀虫活性。本领域技术人员使用本领域知道的或者本文别处描述的测定法，可容易地比较两个或者更多个蛋白质的杀虫活性。应认识到，本发明实施例的多肽可通过表达本文公开的核酸来产生，或者通过使用标准的分子生物学技术来产生。
认识到，杀虫蛋白可以是低聚体，并且在分子量、残基数目、组成肽、对特定害虫的活性以及其他特征方面会有不同。但是，通过本文给出的方法，可分离和表征对多种害虫具有活性的蛋白质。本发明实施例的杀虫蛋白可与其他Bt毒素或者其他杀昆虫蛋白组合使用，以增加昆虫靶标范围。此外，本发明实施例的杀虫蛋白与其他Bt毒素或者具有独特性质的其他杀昆虫成分组合使用，对于防止和/或管理昆虫抗性具有特殊的功效。其他杀昆虫剂包括蛋白酶抑制剂（丝氨酸类型和半胱氨酸类型）、α‑淀粉酶和过氧化物酶。
核苷酸和氨基酸序列及其所编码多肽的片段和变体也被本发明实施例涵盖。本文所用的术语“片段”指本发明实施例的多核苷酸的核苷酸序列的一部分或者多肽的氨基酸序列的一部分。核苷酸序列的片段可编码保持天然的或者相应的全长蛋白的生物活性从而具有杀虫活性的蛋白质片段。因此，确认到，本发明实施例的多核苷酸和氨基酸序列中的一些可正确地称为片段和突变体两者。
应认识到，术语“片段”在用于指本发明实施例的核酸序列时，也涵盖可用作杂交探针的序列。这类核苷酸序列通常不编码保持生物活性的片段蛋白。因此，核苷酸序列的片段长度可为至少约20个核苷酸、约50个核苷酸、约100个核苷酸直至编码本发明实施例的蛋白质的全长核苷酸序列。
编码本发明实施例的杀虫蛋白的生物活性部分的本发明实施例的核苷酸序列的片段，将编码至少15、25、30、50、100、200、300、400、500、600、650或者700个连续氨基酸或者直至本发明实施例的杀虫多肽中存在的氨基酸的总数（例如对于SEQ ID NO:2的709个氨基酸）。因此，应理解，本发明实施例还涵盖这样的多肽，其是本发明实施例的示例性杀虫蛋白的片段，且长度为至少15、25、30、50、100、200、300、400、500、600、650或者709个连续氨基酸或者直至本发明实施例的杀虫蛋白中存在的氨基酸的总数（例如对于SEQ ID NO:2的709个氨基酸）。本发明实施例的核苷酸序列的可用作杂交探针或者PCR引物的片段，通常不需要编码杀虫蛋白的生物活性部分。因此，本发明实施例的核酸的片段可编码杀虫蛋白的生物活性部分，或者它可以是可采用本文公开的方法用作杂交探针或者PCR引物的片段。杀虫蛋白的生物活性部分可如下制备：分离本发明实施例的核苷酸序列之一的一部分，表达杀虫蛋白的编码部分（例如通过体外重组表达），并评估杀虫蛋白的该编码部分的活性。
属于本发明实施例的核苷酸序列的片段的核酸包含至少16、20、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、1,000、1,200、1,400、1,600、1,800、1,900、2,000或者2,100个核苷酸或者直至本文公开的核苷酸序列中存在的核苷酸的数目（例如，对于SEQ ID NO:1的2,122个核苷酸）。具体的实施例预想到从本发明实施例的第一核酸衍生（例如产生）的片段，其中该片段编码以杀虫活性为特征的截短毒素。由本发明实施例的多核苷酸片段编码的截短多肽以这样的杀虫活性为特征，该杀虫活性与衍生该片段的第一核酸所编码的相应的全长多肽的活性相当或者得到改进。预想到，本发明实施例的这种核酸片段可在天然或者相应的全长编码序列的3'末端截短。核酸片段也可同时在天然或者相应的全长编码序列的5'和3'末端截短。
术语“变体”在本文中用来指实质上相似的序列。对于核苷酸序列而言，保守变体包括那些由于遗传密码的简并性而编码本发明实施例的杀虫多肽之一的氨基酸序列的序列。诸如这些的天然等位基因变体可用公知的分子生物学技术进行鉴定，所述分子生物学技术例如本文述及的聚合酶链反应(PCR)和杂交技术。
变体核苷酸序列也包括合成法衍生的核苷酸序列，如那些例如通过使用定点诱变产生但仍编码本发明实施例的杀虫蛋白（如突变毒素）的核苷酸序列。通常，本发明实施例的特定核苷酸序列的变体将与该特定核苷酸序列具有至少约70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或者更高的序列同一性，这通过本文别处描述的序列比对程序使用默认参数测定出。本发明实施例的核苷酸序列的变体可与该序列相差才1‑15个核苷酸、1‑10个如6‑10个、5个、4个、3个、2个或者甚至1个核苷酸。
本发明实施例的某个具体核苷酸序列（即某个示例性核苷酸序列）的变体，也可通过比较由变体核苷酸序列编码的多肽和参考核苷酸序列编码的多肽之间的序列同一性百分数来进行评估。因此，例如，公开了编码与SEQ ID NO:2的多肽具有给定的序列同一性百分数的多肽的分离核酸。任何两个多肽之间的序列同一性百分数可用本文别处描述的序列比对程序使用默认参数进行计算。在本发明实施例的任何给定的一对多核苷酸是通过比较它们编码的两个多肽所共有的序列同一性百分数来进行评估的情况中，这两个编码的多肽之间的序列同一性百分数为至少约40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%，通常至少约75%、80%、85%、至少约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%，或者至少约98%、99%或者更高的序列同一性。
本文所用的术语“变体蛋白”涵盖通过以下方式衍自天然蛋白质的多肽：在该天然蛋白质的N末端和/或C末端缺失（所谓的截短）或者添加一个或者多个氨基酸；在该天然蛋白质中的一个或者多个位点缺失或者添加一个或者多个氨基酸；或者在该天然蛋白质中的一个或者多个位点置换一个或者多个氨基酸。因此，术语“变体蛋白”涵盖天然蛋白质的这样的生物活性片段，其包含足够数量的连续氨基酸残基以保持天然蛋白质的生物活性，即具有杀虫活性。这种杀虫活性相对于天然蛋白质可以是不同的或者改进的，或者它可以是未改变的，只要杀虫活性得到保持。
本发明实施例所涵盖的变体蛋白具有生物活性，即它们继续具有天然蛋白质的所需生物活性，即本文所述的杀虫活性。这种变体可例如由遗传多态性或由人类操纵而得到。本发明实施例的天然杀虫蛋白的生物活性变体将与天然蛋白质的氨基酸序列具有至少约60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或者更高的序列同一性，这是通过用本文别处描述的序列比对程序使用默认参数测定的。本发明实施例的蛋白质的生物活性变体可与该蛋白质相差才1‑15个氨基酸残基，才1‑10个、6‑10个、5个、4个、3个、2个或者甚至1个氨基酸残基。
本发明实施例还涵盖转化了本发明实施例的至少一种核酸的微生物、转化了包含该核酸的表达盒的微生物或者转化了包含该表达盒的载体的微生物。在一些实施例中，该微生物是在植物上繁殖的微生物。本发明的一个实施例涉及包囊的(encapsulated)杀虫蛋白，其包含能够表达本发明实施例的至少一种杀虫蛋白的转化微生物。
本发明实施例提供包含本发明实施例的转化微生物的杀虫组合物。在这种实施例中，转化微生物通常以杀虫有效量与合适的载体一起存在于杀虫组合物中。本发明实施例还涵盖这样的杀虫组合物，其以杀昆虫有效量单独包含本发明实施例的分离蛋白或者包含本发明实施例的分离蛋白与本发明实施例的转化微生物和/或本发明实施例的包囊杀虫蛋白的组合，以及包含合适的载体。
本发明实施例还提供通过使用本发明实施例的杀虫蛋白与至少一种其他或者“第二”杀虫蛋白的组合来增加昆虫靶标范围的方法。本领域知道的任何杀虫蛋白都可应用于本发明实施例的方法中。这种杀虫蛋白包括但不限于Bt毒素、蛋白酶抑制剂、α‑淀粉酶和过氧化物酶。
本发明实施例还涵盖包含本发明实施例的至少一种核苷酸序列的转化植物或者转基因植物。在一些实施例中，该植物稳定转化了这样的核苷酸构建体，该构建体包含本发明实施例的至少一种核苷酸序列和与其有效连接的能驱动在植物细胞中的表达的启动子。本文所用的术语“转化植物”和“转基因植物”指在其基因组中包含异源多核苷酸的植物。通常，异源多核苷酸稳定整合在转基因植物或转化植物的基因组中，使得该多核苷酸被传递到后续各代。异源多核苷酸可单独整合进基因组中，或者作为重组表达盒的一部分整合进基因组中。
应理解，本文所用的术语“转基因”包括任何其基因型已因异源核酸的存在而被变更的细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，包括那些最初如此变更的转基因以及那些通过从最初的转基因进行有性杂交或无性繁殖而产生的转基因在内。本文所用的术语“转基因（的）”不涵盖通过常规植物育种方法或通过诸如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变之类的自然发生事件导致的基因组（染色体基因组或染色体外基因组）改变。
本文所用的术语“植物”包括指整个植株、植物器官（例如叶、茎、根等）、种子、植物细胞和它们的子代。转基因植物的部分落入本发明实施例的范围内，包括例如植物细胞、植物原生质体、可从中再生出植株的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物块(clump)、以及在植物或者诸如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、果仁、穗、穗轴、果壳、秆、根、根尖、花粉囊等的植物部分中完整的植物细胞，它们起源于之前转化了本发明实施例的DNA分子的转基因植物或其后代并因此至少部分地由转基因细胞组成。可用于本发明实施例的方法中的植物的类别通常与适于转化技术的高等植物的类别一样宽泛，包括单子叶植物和双子叶植物在内。
虽然本发明实施例并不依赖于特定的生物机制来提高植物对植物害虫的抗性，但本发明实施例的核苷酸序列在植物中的表达可导致本发明实施例的杀虫蛋白的产生和植物对植物害虫的抗性的提高。本发明实施例的植物可在农业中在用于影响昆虫害虫的方法中使用。某些实施例提供可在用于影响植物的昆虫害虫（如鳞翅目害虫）的方法中使用的转化作物（例如玉蜀黍植物）。
“受试植物或植物细胞”是其中已针对所关注基因进行了遗传变更（如转化）的植物或植物细胞，或者是从经如此变更的植物或细胞遗传下来并包含该变更的植物或植物细胞。“对照”或“对照植物”或“对照植物细胞”提供测量受试植物或植物细胞的表型变化的参考点。
对照植物或植物细胞可例如包括：(a)野生型植物或细胞，即具有与用于进行遗传变更的起始材料相同的基因型的植物或细胞，该遗传变更会得到受试植物或细胞；(b)具有与起始材料相同的基因型但已用无效构建体（即，用对目的性状不具有已知效果的构建体，如包含标记基因的构建体）转化的植物或植物细胞；(c)为受试植物或植物细胞的子代中的非转化分离子的植物或植物细胞；(d)在遗传上与受试植物或者植物细胞相同但不暴露于会引起目的基因的表达的条件或者刺激因素的植物或者植物细胞；或者(e)处于目的基因不被表达的条件下的受试植物或者植物细胞本身。
本领域技术人员会容易认识到，分子生物学领域的进展如位点特异性诱变和随机诱变、聚合酶链反应方法和蛋白质工程技术，可提供适用于对具有农业意义的蛋白质的氨基酸序列和相应遗传序列两者进行变更或者工程改造的广泛工具和方案集合。
因此，发明实施例的蛋白质可通过多种方式（包括氨基酸置换、缺失、截短和插入）进行变更。这类操纵的方法是本领域公知的。例如，可通过向合成的核酸（例如DNA分子）中引入突变来制备杀虫蛋白的氨基酸序列变体。诱变和核酸变更的方法是本领域公知的。例如，可使用寡核苷酸介导的定点诱变技术来引入经设计的变化。参见例如，Kunkel，(1985)，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，82:488‑492；Kunkel等人，(1987)，《酶学方法》(Methods in Enzymol.)，154:367‑382；美国专利No.4,873,192；Walker和Gaastra编辑，(1983)，《分子生物学技术》(Techniques in Molecular Biology)，纽约麦克米兰出版公司(MacMillan Publishing Company,New York)；以及其中引用的参考文献。
可对本发明实施例的经诱变的核苷酸序列进行修饰，以改变所编码的多肽的一级序列中存在的约1、2、3、4、5、6、8、10、12个或者更多个氨基酸。作为另一种选择，可对天然序列引入甚至更多的变化，使得所编码的蛋白质与相应的野生型蛋白质相比可具有至少约1%或者2%或者约3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%或者甚至约13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%或者20%、21%、22%、23%、24%或者25%、30%、35%或者40%或者更多的密码子被变更或者以别的方式被修饰。以同样的方式，所编码的蛋白质与相应的野生型蛋白质相比可具有至少约1%或者2%或者约3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%或者甚至约13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%或者20%、21%、22%、23%、24%或者25%、30%、35%或者40%或者更多的添加的密码子。应理解，本发明实施例的经诱变的核苷酸序列旨在涵盖具有杀虫活性的生物功能性等同肽，所述杀虫活性例如由对欧洲玉米螟幼虫的拒食性质所确定的改进的杀虫活性。这种序列可由于已知在核酸序列及其编码的蛋白质内天然出现的密码子冗余性和功能等同性而产生。
本领域技术人员会认识到，氨基酸添加和/或置换通常是基于氨基酸侧链取代基的相对形似性，如它们的疏水性、电荷、大小等。考虑了前述各个特征的示例性的氨基酸置换组是本领域技术人员公知的，包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
有关不会影响目的蛋白质的生物活性的适当氨基酸置换的指导可在以下文献所述的模型中找到：Dayhoff等人，(1978)，《蛋白质序列和结构图表集》(Atlas of Protein Sequence and Structure)，美国国家生物医学研究基金会，华盛顿特区(Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C.)，将该文献以引用方式并入本文。可作出保守置换，如将一个氨基酸用另一具有相似性质的氨基酸进行交换。
因此，本发明实施例的基因和核苷酸序列包括天然序列和突变形式两者。同样，本发明实施例的蛋白质涵盖天然蛋白质和变异（例如截短多肽）及其修饰（例如突变）形式。这种变体将继续具有所需的杀虫活性。显然，要在编码该变体的核苷酸序列中作出的突变必须不将该序列置于阅读框外，并且通常不会生成可能会产生二级mRNA结构的互补区。参见专利申请公布EP75,444。
本文所涵盖的蛋白质序列的缺失、插入和置换预期不会造成该蛋白质特性的根本变化。然而，当在进行置换、缺失或者插入之前难以预测置换、缺失或者插入的确切效应时，本领域技术人员会认识到将通过常规的筛选测定法（如昆虫取食测定法）来评价该效应。参见例如，Marrone等人，(1985)，《经济昆虫学杂志》(J.Econ.Entomol.)，78:290‑293；以及Czapla和Lang，(1990)，《经济昆虫学杂志》(J.Econ.Entomol.)，83:2480‑2485，将这两篇文献以引用方式并入本文。
变体核苷酸序列和蛋白质还涵盖源自诱变和引起重组的程序（如DNA改组）的序列和蛋白质。用这种程序，可操纵一个或多个不同的编码序列以产生具有所需性质的新的杀虫蛋白。这样，从一群相关的序列多核苷酸产生重组多核苷酸的文库，所述相关的序列多核苷酸包含具有实质的序列同一性且可以在体外或体内发生同源重组的序列区。例如，使用这个方法，可将本发明实施例的核苷酸序列的全长编码序列、编码目的结构域的序列模体或者任何片段在本发明实施例的核苷酸序列和其他已知Cry核苷酸序列的相应部分之间进行改组(shuffle)，以获得编码具有改进的目的性质的蛋白质的新基因。
目的性质包括但不限于每单位杀虫蛋白的杀虫活性、蛋白稳定性以及对非靶标物种如人类、牲畜和表达本发明实施例的杀虫多肽的植物和微生物的毒性。本发明实施例不受具体的改组策略的局限，只要本发明实施例的至少一种核苷酸序列或其部分参与这个改组策略。改组可仅涉及本文公开的核苷酸序列，或者可另外涉及本领域知道的其他核苷酸序列的改组。DNA改组的策略是本领域知道的。参见例如，Stemmer，(1994)，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，91:10747‑10751；Stemmer，(1994)，《自然》(Nature)，370:389‑391；Crameri等人，(1997)，《自然生物技术》(Nature Biotech.)，15:436‑438；Moore等人，(1997)，《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.)，272:336‑347；Zhang等人，《美国国家科学院院刊》((1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，94:4504‑4509；Crameri等人，(1998)，《自然》(Nature)，391:288‑291；以及美国专利No.5,605,793和5,837,458。
本发明实施例的核苷酸序列也可用于从其他生物体分离相应的序列，所述生物体具体而言为其他细菌，更具体而言为其他芽孢杆菌属菌株。这样，可将诸如PCR、杂交等之类的方法用于基于这类序列与本文所述序列的序列同源性来鉴别这类序列。基于它们与本文所述的完整序列或其片段的序列同一性而选择的序列，为本发明实施例所涵盖。这类序列包括为所公开的序列的直系同源物的序列。术语“直系同源物”指衍自共同祖先基因并且由于物种形成而存在于不同物种中的基因。当其核苷酸序列和/或其所编码的蛋白质序列如本文其他地方所定义的具有实质性的同一性时，存在于不同物种中的基因被认为是直系同源物。直系同源物的功能在各种物种中常常是高度保守的。
在PCR方法中，可设计寡核苷酸引物用于PCR反应，以从提取自任何目的生物体的cDNA或者基因组DNA扩增相应的DNA序列。设计PCR引物和PCR克隆的方法是本领域公知的，在以下文献中有公开：Sambrook等人，(1989)，《分子克隆实验指南》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)，第2版，冷泉港实验室出版社，纽约普莱恩维尤(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview,New York)，下文称“Sambrook”。另参见Innis等人编辑，(1990)，《PCR方案：方法和应用指南》(PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications)，学术出版社，纽约(Academic Press,New York)；Innis和Gelfand编辑，(1995)，《PCR策略》(PCR Strategies)，学术出版社，纽约(Academic Press,New York)；以及Innis和Gelfand编辑，(1999)，《PCR方法手册》(PCR Methods Manual)，学术出版社，纽约(Academic Press,New York)。已知的PCR方法包括但不限于利用成对引物、巢式引物、单一特异引物、简并引物、基因特异性引物、载体特异性引物、部分错配引物等的方法。
在杂交技术中，将已知的核苷酸序列的全部或一部分用作探针，该探针与来自所选生物体的一群克隆的基因组DNA片段或cDNA片段（即基因组或cDNA文库）中存在的其他对应核苷酸序列选择性杂交。杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其他寡核苷酸，并且可用诸如32P之类的可检测基团或任何其他可检测标记物进行标记。因此，例如，杂交用探针可通过对基于本发明实施例的序列的合成寡核苷酸进行标记来制备。制备杂交用探针和构建cDNA和基因组文库的方法是本领域公知的，在“Sambrook”中有公开。
例如，本文所公开的整个序列或其一个或者多个部分可用作能够与相应的序列和信使RNA特异性杂交的探针。为实现在各种条件下的特异性杂交，这种探针包括对本发明实施例的序列独特并且长度通常为至少约10个或者20个核苷酸的序列。这种探针可用于通过PCR从选定的生物体扩增相应的Cry序列。这个技术可用于从所需生物体分离另外的编码序列，或者用作诊断测定法以确定编码序列在生物体中的存在。杂交技术包括对平板(plated)DNA文库（噬菌斑或菌落；参见例如，Sambrook）的杂交筛选。
这类序列的杂交可在严格条件下进行。本文所用的术语“严格条件”或者“严格杂交条件”指探针与其靶序列杂交的程度将比它与其他序列杂交的程度可检测地更高（例如，比背景高至少2倍、5倍或者10倍）的条件。严格条件是序列依赖性的，在不同的环境中将会不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可鉴定与探针100%互补的靶标序列（同源探测）。或者，可调节严格性条件以允许序列中有一些错配，以使得检测到较低程度的相似性（异源探测）。通常，探针的长度小于约1000或者500个核苷酸。
通常，严格条件将为那些其中盐浓度低于约1.5M钠离子，通常为约0.01至1.0M钠离子浓度（或其他盐），pH为7.0至8.3，对短探针（例如，10至50个核苷酸）而言温度为至少30℃，对长探针（例如超过50个核苷酸）而言温度为至少约60℃的条件。严格条件还可通过添加去稳定剂如甲酰胺来实现。示例性的低严格性条件包括在37℃下用30‑35%甲酰胺、1M NaCl、1%SDS（十二烷基硫酸钠）的缓冲溶液杂交，并在50‑55℃下在1X‑2X SSC（20X SSC=3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠）中洗涤。示例性的中等严格性条件包括在40%至45%甲酰胺、1.0M NaCl、1%SDS中在37℃下杂交和在0.5X至1X SSC中在55℃至60℃下洗涤。示例性的高严格性条件包括在50%甲酰胺、1M NaCl、1%SDS中在37℃下杂交和在0.1X SSC中在60‑65℃下最终洗涤至少约20分钟。任选地，洗涤缓冲液可包含约0.1%至约1%SDS。杂交的时间通常小于约24小时，往往为约4至约12小时。
特异性通常决定于杂交后的洗涤，关键因素为最终洗涤溶液的离子强度和温度。对于DNA‑DNA杂交体，可根据Meinkoth和Wahl，(1984)，《分析生物化学》(Anal.Biochem.)，138:267‑284的公式估计Tm（热解链温度）：Tm=81.5℃+16.6(log M)+0.41(%GC)‑0.61(%form)‑500/L；其中M为单价阳离子的摩尔浓度，%GC为DNA中鸟嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸的百分比，%form为杂交溶液中甲酰胺的百分比，L为杂交体的长度（单位为碱基对）。Tm为50%的互补靶标序列与完美匹配的探针杂交时的温度（在确定的离子强度和pH下）。洗涤通常至少进行至达到平衡和获得低的杂交背景水平为止，例如2小时、1小时或者30分钟。
Tm因每1%错配下降约1℃；因此，可以调节Tm、杂交和/或洗涤条件以与具有所需同一性的序列杂交。例如，如果寻求具有≥90%同一性的序列，则Tm可降低10℃。通常，将严格条件选择为比特定序列及其互补序列在确定的离子强度和pH下的Tm低约5℃。然而，极严格条件可以利用比Tm低1、2、3或4℃的杂交和/或洗涤；中等严格条件可以利用比Tm低6、7、8、9或10℃的杂交和/或洗涤；低严格条件可以利用比Tm低11、12、13、14、15或20℃的杂交和/或洗涤。
利用该公式，杂交和洗涤组成以及所需的Tm，普通技术人员将认识到，杂交和/或洗涤溶液的严格性的变化固有地得到了描述。如果所需的错配程度导致Tm低于45℃（水溶液）或32℃（甲酰胺溶液），则可增加SSC浓度以使得可使用较高的温度。有关核酸杂交的详尽指导见Tijssen，(1993)，《生物化学和分子生物学实验技术—核酸探针杂交》(Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology—Hybridization with Nucleic Acid Probes)，第I部分，第2章，纽约爱思唯尔出版社(Elsevier,New York)；以及Ausubel等人编辑，(1995)，《分子生物学实验手册》(Current Protocols in Molecular Biology)，第2章，纽约Greene Publishing and Wiley‑Interscience。另参见“Sambrook”。因此，编码本发明实施例的Cry蛋白并在严格条件下与本文公开的Cry序列或其片段杂交的分离序列，为本发明实施例所涵盖。
如下术语用于描述两条或更多条核酸或多肽之间的序列关系：(a)“参考序列”、(b)“比较窗口”、(c)“序列同一性”、(d)“序列同一性百分比”和(e)“实质上相同”。
(a)本文所用的“参比序列”是用作序列比较的基础的确定的序列。参考序列可以是指定序列的子集或全部；例如，为全长cDNA或基因序列的区段或者完整的cDNA或基因序列。
(b)本文所用的“比较窗口”是指多核苷酸序列的连续的和指定的区段，其中该比较窗口中的该多核苷酸序列相比于参考序列（不包含添加或缺失）可包含添加或缺失（即空位），以便两条序列进行最佳比对。通常，比较窗口长度为至少20个连续的核苷酸，任选可为30、40、50、100个或更长。本领域技术人员认识到，为避免由于在多核苷酸序列中加入空位所致的与参考序列的高度相似性，通常引入空位罚分并从匹配数扣除空位罚分。
将序列进行比对以作比较的方法是本领域公知的。因此，对任何两个序列之间的序列同一性百分数的确定，可使用数学算法来完成。此类数学算法的非限制性例子是Myers和Miller，(1988)，CABIOS4:11‑17的算法；Smith等人，(1981)，《应用数学进展》(Adv.Appl.Math.)，2:482的局部比对算法；Needleman和Wunsch，(1970)，《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.)，48:443‑453的全局比对算法；Pearson和Lipman，(1988)，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.)，85:2444‑2448的搜索局部比对方法；Karlin和Altschul，(1990)，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，872264的算法，在Karlin和Altschul，(1993)，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，90:5873‑5877中作了修正。
可利用这些数学算法的计算机执行进行序列的比较，从而确定序列同一性。此类程序包括但不限于：PC/Gene程序（可获自Intelligenetics公司，加利福尼亚州山景城(Mountain View,California)）中的CLUSTAL；GCG Wisconsin Genetics Software Package版本10（可获自Accelrys Inc.，地址：9685Scranton Road,San Diego,California,USA）中的ALIGN程序（版本2.0）和GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。使用这些程序的序列比对可用默认参数来进行。以下文献对CLUSTAL程序进行了详细描述：Higgins等人，(1988)，《基因》(Gene)，73:237‑244(1988)；Higgins等人，(1989)，CABIOS5:151‑153；Corpet等人，(1988)，《核酸研究》(Nucleic Acids Res.)，16:10881‑90；Huang等人，(1992)，CABIOS8:155‑65；以及Pearson等人，(1994)，《分子生物学方法》(Meth.Mol.Biol.)，24:307‑331。ALIGN程序是基于Myers和Miller(1988)（出处同上）的算法。当比较氨基酸序列时，ALIGN程序可使用PAM120加权残基表(weight residue table)、空位长度罚分12和空位罚分4。Altschul等人，(1990)，《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.)，215:403的BLAST程序是基于Karlin和Altschul(1990)（出处同上）的算法。BLAST核苷酸搜索可用BLASTN程序、score(得分)=100、wordlength(字长)=12来进行，以获得与编码本发明实施例的蛋白质的核苷酸序列同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可用BLASTX程序、score(得分)=50、wordlength(字长)=3来进行，以获得与本发明实施例的蛋白质或者多肽同源的氨基酸序列。为出于比较目的获得带空位的比对，可如Altschul等人，(1997)，《核酸研究》(Nucleic Acids Res.)，25:3389中所述使用Gapped BLAST（在BLAST2.0中）。或者，可使用PSI‑BLAST（在BLAST2.0中）来进行迭代搜索，该搜索可检测分子之间的远源关系。参见Altschul等人，(1997)，出处同上。当采用BLAST、Gapped BLAST、PSI‑BLAST时，可使用各个程序的默认参数（例如BLASTN用于核苷酸序列，BLASTX用于蛋白质）。参见美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)网站(www.ncbi.nlm.nih.gov)。还可以以手动方式通过检查来进行比对。
除非另外指明，否则本文提供的序列同一性/相似性值指使用采用如下参数的GAP版本10或其任何等同程序获得的值：核苷酸序列的%同一性和%相似性采用GAP权重50和长度权重3以及nwsgapdna.cmp打分矩阵；氨基酸序列的%同一性和%相似性采用GAP权重8和长度权重2以及BLOSUM62打分矩阵。或其任何等同程序。本文所用术语的“等同程序”指任何这样的序列比较程序，其对于任何两个所考虑的序列，相比于GAP版本10所产生的相应比对，能产生出具有相同的核苷酸或氨基酸残基匹配和相同的序列同一性百分数的比对。
GAP利用Needleman和Wunsch(1970)（出处同上）的算法来寻找两个完整序列的能使匹配数最大而使空位数最小的比对。GAP会考虑所有可能的比对和空位位置，并产生具有最大数目的匹配碱基和最少的空位的比对。其允许提供以匹配碱基数为单位的空位产生罚分和空位延伸罚分。GAP对于其插入的每个空位，都必须利用匹配的空位产生罚分数。如果选择大于零的空位延伸罚分，GAP对于每个插入的空位必须另外利用空位长度乘以空位延伸罚分。对于蛋白质序列，GCG Wisconsin Genetics Software Package的版本10中的默认空位产生罚分值和空位延伸罚分值分别为8和2。对于核苷酸序列，默认空位产生罚分为50，而默认空位延伸罚分为3。空位产生罚分和空位延伸罚分可以以选自0‑200的整数来表示。因此，例如，空位产生罚分和空位延伸罚分可为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或更大。
GAP给出具有最好的比对的家族中的一个成员。这个家族可能存在许多成员，但其他成员没有更好的品质。GAP显示用于比对的四个优值因子：品质、比率、同一性和相似性。品质是为了比对序列而被最大化的指标(metric)。比率是品质除以较短区段中的碱基数。同一性百分数是实际匹配的符号的百分数。相似性百分数是相似的符号的百分数。将对应于空位的符号忽略。当一对符号的打分矩阵值大于或等于0.50（相似性阈值）时，对相似性打分。GCG Wisconsin Genetics Software Package的版本10中使用的记分矩阵为BLOSUM62（参见Henikoff和Henikoff，(1989)，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，89:10915）。
(c)在两条核酸或多肽序列的情形中，本文所用的“序列同一性”或“同一性”是指当在指定的比较窗口上进行比对以获得最大对应时该两条序列中相同的残基。当序列同一性百分数针对蛋白质使用时，应认识到，不相同的残基位置往往差别在于保守氨基酸置换，其中氨基酸残基被其他具有相似的化学性质（例如电荷或疏水性）的氨基酸残基置换，因此不会改变分子的功能性质。当序列差别在于保守置换，则可上调百分比序列同一性以校正置换的保守性质。差异在于这种保守置换的序列被称为具有“序列相似性”或“相似性”。作出这个调整的方法是本领域技术人员所熟知的。通常，这涉及将保守置换打分为部分错配而不是完全错配，从而提高序列同一性百分数。因而，例如，如果相同的氨基酸给予1分，非保守置换给予0分，则保守置换给予0至1之间的分数。保守置换的打分是例如如在程序PC/GENE(Intelligenetics,Mountain View,California)中所执行那样进行计算。
(d)本文所用的“序列同一性百分数”意指通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列所确定的数值，其中多核苷酸序列在比较窗口中的部分与参比序列（不包含添加或缺失）相比可包含添加或缺失（即空位），以便两个序列的最佳比对。该百分数是这样计算的：确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以得到匹配的位置的数目，将匹配的位置的数目除以比较窗口中的位置的总数目，然后将结果乘以100以得到序列同一性百分数。
(e)(i)多核苷酸序列的“实质同一性”这个术语意指在使用所描述的比对程序之一采用标准的参数与参考序列进行比较时，多核苷酸序列包含具有至少70%、80%、90%或者95%或者更高的序列同一性的序列。本领域技术人员将会认识到，可通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、阅读框定位等等适当调整这些值以确定两条核苷酸序列所编码的蛋白质的相应同一性。出于这些目的，氨基酸序列的实质同一性通常意指序列同一性为至少60%、70%、80%、90%或者95%或者更高的序列同一性。
核苷酸序列基本上相同的另一指示是两个分子在严格条件下是否彼此杂交。通常，将严格条件选择为比特定序列在确定的离子强度和pH下的Tm低约5℃。但是，严格条件涵盖在比Tm低约1℃至约20℃的范围内的温度，取决于本文另外限定的所需严格性程度。在严格条件下不互相杂交的核酸，如果它们编码的多肽是实质上相同的，则它们仍是实质上相同的。例如，当利用遗传密码所允许的最大密码子简并性产生一个核酸拷贝时，这可能会发生。两条核酸序列实质上相同的一个指示是，第一核酸编码的多肽与第二核酸编码的多肽发生免疫交叉反应。
(e)(ii)在肽的情形中，术语“实质同一性”指肽包含这样的序列，在指定比较窗口上该序列与参考序列具有至少70%、80%、85%、90%、95%或者更高的序列同一性。出于这些目的的最佳比对可用Needleman和Wunsch(1970)（出处同上）的全局比对算法来进行。两条肽序列是基本上相同的指示是，一种肽可与针对第二种肽产生的抗体发生免疫反应。因而，例如，如果某种肽与第二种肽差别仅在于保守置换的话，则这两种肽实质上相同。“实质上相似的”肽共有如上所述的序列，例外的是不相同的残基位置差别可能在于保守氨基酸变化。
本文中术语“核苷酸构建体”的使用无意于将本发明实施例限于包含DNA的核苷酸构建体。本领域普通技术人员将认识到，核苷酸构建体，特别是由核糖核苷酸以及核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的组合构成的多核苷酸和寡核苷酸，也可在本文公开的方法中应用。本发明实施例的核苷酸构建体、核酸和核苷酸序列另外涵盖这类构建体、分子和序列的互补形式。此外，本发明实施例的核苷酸构建体、核苷酸分子和核苷酸序列涵盖所有可在本发明实施例的方法中应用以转化植物的核苷酸构建体、分子和序列，包括但不限于那些由脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸以及它们的组合所构成的核苷酸构建体、分子和序列。这种脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸既包括天然的分子也包括合成的类似物。本发明实施例的核苷酸构建体、核酸和核苷酸序列还涵盖所有形式的核苷酸构建体，包括但不限于单链形式、双链形式、发夹结构、茎‑环结构等。
又一个实施例涉及转化的生物体，如选自植物和昆虫细胞、细菌、酵母、杆状病毒、原生动物、线虫和藻类的生物体。转化的生物体包含：本发明实施例的DNA分子、包含所述DNA分子的表达盒或者包含所述表达盒的载体，它们可稳定掺入到转化的生物体的基因组中。
本发明实施例的序列在用于在目的生物体中表达的DNA构建体中提供。该构建体将包括有效连接到本发明实施例的序列的5'和3'调节序列。本文所用的术语“有效连接”指启动子与第二序列之间的功能性连接，其中启动子序列引发并介导与第二序列对应的DNA序列的转录。一般来讲，可操作地连接意指被连接的核酸序列是连续的，并且如果有必要连接两个蛋白质编码区的话，是连续的且在相同的阅读框内。该构建体可另外含有至少一个待共转化到该生物体中的额外基因。作为另一种选择，所述额外基因可在多个DNA构建体上提供。
这种DNA构建体提供有多个限制位点，以使Cry毒素序列的插入处于调节区的转录调节之下。DNA构建体可另外含有选择性标记基因。
按5'至3'的转录方向，DNA构建体将包括：转录和翻译起始区（即启动子）、本发明实施例的DNA序列和在充当宿主的生物体中具有功能的转录和翻译终止区（即终止区）。转录起始区（即启动子）相对于宿主生物体和/或相对于本发明实施例的序列可以是天然的、类似的、外来的或者异源的。另外，启动子可以是天然序列或备选地是合成序列。本文所用的术语“外来的”表示启动子在引入启动子的天然生物体中不存在。如果启动子相对于本发明实施例的序列是“外来的”或者“异源的”，则意指启动子不是所有效连接的本发明实施例的序列的天然或自然存在的启动子。本文所用的嵌合基因包含与转录起始区有效连接的编码序列，该转录起始区对于该编码序列是异源的。如果启动子是天然或者自然的序列，则所有效连接的序列的表达相比野生型表达被变更，导致表型的变更。
终止区可以是对于转录起始区而言是天然的，可以对于所有效连接的目的DNA序列而言是天然的，可以对于植物宿主而言是天然的，或者可以衍自另一来源（即对于该启动子、目的序列、植物宿主或者它们的任何组合而言是外来的或异源的）。
便利的终止区可获自根瘤农杆菌(A.tumefaciens)的Ti质粒，如章鱼氨酸合酶和胭脂氨酸合酶终止区。另参见Guerineau等人，(1991)，《分子遗传学与普通遗传学》(Mol.Gen.Genet.)，262:141‑144；Proudfoot，(1991)，《细胞》(Cell)，64:671‑674；Sanfacon等人，(1991)，《基因与发育》(Genes Dev.)，5:141‑149；Mogen等人，(1990)，《植物细胞》(Plant Cell)，2:1261‑1272；Munroe等人，(1990)，《基因》(Gene)，91:151‑158；Ballas等人，(1989)，《核酸研究》(Nucleic Acids Res.)，17:7891‑7903；以及Joshi等人，(1987)，《核酸研究》(Nucleic Acid Res.)，15:9627‑9639。
如适当，可将核酸进行优化以提高在宿主生物体中的表达。因此，如果宿主生物体是植物，则可用植物偏好的密码子合成出合成的核酸以改进表达。有关宿主偏好的密码子用法的讨论，参见例如Campbell和Gowri，(1990)，《植物生理学》(Plant Physiol.)，92:1‑11。例如，尽管本发明实施例的核酸序列在单子叶植物物种和双子叶植物物种中都可表达，但可对序列进行修饰以解决单子叶植物或双子叶植物的特定密码子偏好性和GC含量偏好性，因为这些偏好性已被证实不同（Murray等人，(1989)，《核酸研究》(Nucleic Acids Res.)，17:477‑498）。因此，特定氨基酸的玉蜀黍偏好密码子可由来自玉蜀黍的已知基因序列得出。关于来自玉蜀黍植物的28个基因的玉蜀黍密码子使用在Murray等人（出处同上）的表4中列出。本领域有用来合成植物偏好的基因的方法。参见例如，美国专利No.5,380,831和5,436,391，以及Murray等人，(1989)，《核酸研究》(Nucleic Acids Res.)，17:477‑498，以引用方式并入本文。
已知有另外的序列修饰可增强在细胞宿主中的基因表达。这些包括消除以下序列：编码假聚腺苷酸化信号、外显子‑内含子剪接位点信号的序列、转座子样重复序列以及其他得到充分表征的可能对基因表达有害的序列。可将序列的GC含量调整到给定的细胞宿主的平均水平，这通过参考在宿主细胞中表达的已知基因计算得到。本文所用的术语“宿主细胞”指含有载体并支持该表达载体的复制和/或表达的细胞。宿主细胞可以是原核细胞如大肠杆菌或者真核细胞如酵母、昆虫、两栖动物或者哺乳动物细胞，或者单子叶或者双子叶植物细胞。单子叶植物宿主细胞的一个例子是玉蜀黍宿主细胞。当可能时，对序列进行修饰以避免出现预测的发夹二级mRNA结构。
表达盒可另外含有5'前导序列。此类前导序列可起到增强翻译的作用。翻译前导序列是本领域已知的并且包括：微小RNA病毒前导序列，例如EMCV前导序列（脑心肌炎病毒5'非编码区）（Elroy‑Stein等人，(1989)，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，86:6126‑6130）；马铃薯Y病毒前导序列，例如TEV前导序列（烟草蚀纹病毒）（Gallie等人，(1995)，《基因》(Gene)，165(2):233‑238）；MDMV前导序列（玉米矮花叶病毒）；人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)（Macejak等人，(1991)，《自然》(Nature)，353:90‑94）；来自苜蓿花叶病毒的外壳蛋白mRNA(AMV RNA4)的非翻译前导序列（Jobling等人，(1987)，《自然》(Nature)，325:622‑625）；烟草花叶病毒前导序列(TMV)（Gallie等人，(1989)，《RNA的分子生物学》(Molecular Biology of RNA)，Cech编辑，(Liss,New York)，第237‑256页）；以及玉蜀黍枯黄斑点病毒前导序列(MCMV)（Lommel等人，(1991)，《病毒学》(Virology)，81:382‑385）。另参见Della‑Cioppa等人，(1987)，《植物生理学》(Plant Physiol.)84:965‑968。
在制备表达盒时，可对多个DNA片段进行操纵，以提供处于正确取向的DNA序列，且适当时提供处于正确的阅读框的DNA序列。为此目的，可应用衔接子或接头将DNA片段连接在一起，或者可涉及其他的操纵以提供便利的限制位点、去除多余的DNA、去除限制位点等。出于这个目的，可涉及到体外诱变、引物修复、限制性酶切、退火、再置换（例如转换和易位）。
有多种启动子可用于本发明实施例的实施。启动子可基于所需的结果来选择。可将核酸与组成型启动子、组织偏好启动子、诱导型启动子或其他启动子进行组合，以在宿主生物体中表达。适用于植物宿主细胞的组成型启动子包括例如WO99/43838和美国专利No.6,072,050中公开的Rsyn7启动子和其他组成型启动子的核心启动子；核心CaMV35S启动子（Odell等人，(1985)，《自然》(Nature)，313:810‑812）；水稻肌动蛋白（McElroy等人，(1990)，《植物细胞》(Plant Cell)，2:163‑171）；遍在蛋白（Christensen等人，(1989)，《植物分子生物学》(Plant Mol.Biol.)，12:619‑632，以及Christensen等人，(1992)，《植物分子生物学》(Plant Mol.Biol.)，18:675‑689）；pEMU（Last等人，(1991)，《理论与应用遗传学》(Theor.Appl.Genet.)，81:581‑588）；MAS（Velten等人，(1984)，《欧洲分子生物学组织杂志》(EMBO J.3:2723‑2730）；ALS启动子（美国专利No.5,659,026）等。其他的组成型启动子包括例如以下各个美国专利中讨论的那些：5,608,149、5,608,144、5,604,121、5,569,597、5,466,785、5,399,680、5,268,463、5,608,142和6,177,611。
取决于所需的结果，可能有利的是从诱导型启动子表达基因。对于调节本发明实施例的核苷酸序列在植物中的表达特别有意义的是损伤诱导启动子。这种损伤诱导启动子可响应昆虫取食所引起的损害，包括马铃薯蛋白酶抑制剂(pin II)基因（Ryan，(1990)，《植物病理学年鉴》(Ann.Rev.Phytopath.)，28:425‑449；Duan等人，(1996)，《自然生物技术》(Nature Biotechnology)，14:494‑498）；wun1和wun2，美国专利No.5,428,148；win1和win2（Stanford等人，(1989)，《分子遗传学与普通遗传学》(Mol.Gen.Genet.)，215:200‑208）；系统素（McGurl等人，(1992)，《科学》(Science)，225:1570‑1573）；WIP1（Rohmeier等人，(1993)，《植物分子生物学》(Plant Mol.Biol.)，22:783‑792；Eckelkamp等人，(1993)，FEBS Letters，323:73‑76）；MPI基因（Corderok等人，(1994)，《植物杂志》(Plant J.)，6(2):141‑150）；等等，将这些文献以引用方式并入本文。
另外，病原体诱导启动子可在本发明实施例的方法和核苷酸构建体中使用。这种病原体诱导启动子包括那些来自致病相关蛋白（PR蛋白）的在病原体感染后被诱导的启动子；例如PR蛋白、SAR蛋白、β‑1,3‑葡聚糖酶、几丁质酶等。参见例如Redolfi等人，(1983)，《荷兰植物病理学杂志》(Neth.J.Plant Pathol.)，89:245‑254；Uknes等人，(1992)，《植物细胞》(Plant Cell)，4:645‑656；以及Van Loon，(1985)，《植物分子病毒学》(Plant Mol.Virol.)，4:111‑116。另参见WO99/43819，将该文献以引用的方式并入本文。
在病原体感染位点处或附近局部表达的启动子值得关注。参见例如，Marineau等人，(1987)，《植物分子生物学》(Plant Mol.Biol.)，9:335‑342；Matton等人，(1989)，《分子植物‑微生物相互作用》(Molecular Plant‑Microbe Interactions)，2:325‑331；Somsisch等人，(1986)，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，83:2427‑2430；Somsisch等人，(1988)，《分子遗传学与普通遗传学》(Mol.Gen.Genet.)，2:93‑98；以及Yang，(1996)，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，93:14972‑14977。另参见Chen等人，(1996)，《植物杂志》(Plant J.)，10:955‑966；Zhang等人，(1994)，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，91:2507‑2511；Warner等人，(1993)，植物杂志》(Plant J.)，3:191‑201；Siebertz等人，(1989)，《植物细胞》(Plant Cell)，1:961‑968；美国专利No.5,750,386（线虫诱导型）；以及其中引用的参考文献。特别值得关注的是玉蜀黍PRms基因的诱导型启动子，其表达由病原体串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)诱导（参见例如，Cordero等人，(1992)，《生理与分子植物病理学》(Physiol.Mol.Plant Path.)，41:189‑200）。
可将化学调节启动子用于通过施加外源化学调节剂来调控基因在植物中的表达。取决于目标，启动子可以是化学诱导型启动子，其中施用化学物质可诱导基因表达，或者是化学抑制型启动子，其中施用化学物质可抑制基因表达。化学诱导型启动子是本领域已知的，包括但不限于玉蜀黍In2‑2启动子（其通过苯磺酰胺除草剂安全剂激活）、玉蜀黍GST启动子（其通过用作前突生(pre‑emergent)除草剂的疏水性亲电化合物激活）和烟草PR‑1a启动子（其通过水杨酸激活）。其他值得关注的化学调节启动子包括类固醇响应型启动子（参见例如，糖皮质类固醇诱导型启动子，载于Schena等人，(1991)，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，88:10421‑10425；以及McNellis等人，(1998)，《植物杂志》(Plant J.)，14(2):247‑257）和四环素诱导型和四环素阻遏型启动子（参见例如，Gatz等人，(1991)，《分子遗传学与普通遗传学》(Mol.Gen.Genet.)，227:229‑237；以及美国专利No.5,814,618和5,789,156），这些文献和专利以引用方式并入本文。
组织偏好的启动子可用来使增强的杀虫蛋白表达瞄准在特定的植物组织内。组织偏好的启动子包括以下文献中描述的那些启动子：Yamamoto等人，(1997)，《植物杂志》(Plant J.)，12(2)255‑265；Kawamata等人，(1997)，《植物细胞生理学》(Plant Cell Physiol.)，38(7):792‑803；Hansen等人，(1997)，《分子遗传学与普通遗传学》(Mol.Gen Genet.)，254(3):337‑343；Russell等人，(1997)，《转基因研究》(Transgenic Res.)，6(2):157‑168；Rinehart等人，(1996)，《植物生理学》(Plant Physiol.)，112(3):1331‑1341；Van Camp等人，(1996)，《植物生理学》(Plant Physiol.)，112(2):525‑535；Canevascini等人，(1996)，《植物生理学》(Plant Physiol.)，112(2):513‑524；Yamamoto等人，(1994)，《植物细胞生理学》(Plant Cell Physiol.)，35(5):773‑778；Lam，(1994)，《细胞分化的结果与问题》(Results Probl.Cell Differ.)，20:181‑196；Orozco等人，(1993)，《植物分子生物学》(Plant Mol Biol.)，23(6):1129‑1138；Matsuoka等人，(1993)，《美国国家科学院院刊》(Proc Natl.Acad.Sci.USA)，90(20):9586‑9590；以及Guevara‑Garcia等人，(1993)，《植物杂志》(Plant J.)，4(3):495‑505。如有必要，可对这种启动子进行修饰以用于弱表达。
叶优选的启动子是本领域已知的。参见例如，Yamamoto等人，(1997)，《植物杂志》(Plant J.)，12(2):255‑265；Kwon等人，(1994)，《植物生理学》(Plant Physiol.)，105:357‑67；Yamamoto等人，(1994)，《植物细胞生理学》(Plant Cell Physiol.)，35(5):773‑778；Gotor等人，(1993)，《植物杂志》(Plant J.)，3:509‑18；Orozco等人，(1993)，《植物分子生物学》(Plant Mol.Biol.)，23(6):1129‑1138；以及Matsuoka等人，(1993)，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，90(20):9586‑9590。
根偏好启动子或者根特异性启动子是已知的，可选自许多可从文献得到的启动子，或者从各种相容的物种从头分离。参见例如，Hire等人，(1992)，《植物分子生物学》(Plant Mol.Biol.)，20(2):207‑218（大豆根特异性谷氨酰胺合成酶基因）；Keller和Baumgartner，(1991)，《植物细胞》(Plant Cell)，3(10):1051‑1061（法国菜豆的GRP1.8基因中的根特异性控制元件）；Sanger等人，(1990)，《植物分子生物学》(Plant Mol.Biol.)，14(3):433‑443（根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的甘露氨酸合酶(MAS)基因的根特异性启动子）；以及Miao等人，(1991)，《植物细胞》(Plant Cell)，3(1):11‑22（编码细胞溶胶谷氨酰胺合成酶(GS)的全长cDNA克隆，其在大豆的根和根瘤中表达）。另参见Bogusz等人，(1990)，《植物细胞》(Plant Cell)，2(7):633‑641，其中描述了从来自固氮非豆科植物榆科山黄麻(Parasponia andersonii)和相关的非固氮非豆科植物鸡屎藤山麻黄(Trema tomentosa)的血红蛋白基因分离的两个根特异性启动子。将这些基因的启动子连接至β‑葡糖醛酸酶报道基因并引入到非豆科植物烟草(Nicotiana tabacum)和豆科植物百脉根(Lotus corniculatus)二者中，在这两种情况中根特异性启动子活性得以保持。Leach和Aoyagi(1991)描述了他们对毛根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的高度表达的rolC和rolD根诱导基因的分析（参见Plant Science(Limerick)79(1):69‑76）。他们得出结论认为，增强子和组织偏好的DNA决定子在那些启动子中是分离的。Teeri等人(1989)使用与lacZ的基因融合，表明编码章鱼氨酸合酶的农杆菌T‑DNA基因在根尖的表皮中特别活跃，且TR2'基因在完整植物中是根特异性的并且通过叶组织中的创伤刺激，这是用于杀昆虫或杀幼虫基因的特别理想的特性组合（参见《欧洲分子生物学组织杂志》(EMBO J.)，8(2):343‑350）。与nptII（新霉素磷酸转移酶II）融合的TR1'基因显示了相似的特性。另外的根偏好启动子包括VfENOD‑GRP3基因启动子（Kuster等人，(1995)，《植物分子生物学》(Plant Mol.Biol.)，29(4):759‑772）；以及rolB启动子（Capana等人，(1994)，《植物分子生物学》(Plant Mol.Biol.)，25(4):681‑691）。另参见以下美国专利：5,837,876、5,750,386、5,633,363、5,459,252、5,401,836、5,110,732和5,023,179。
“种子优选的”启动子包括“种子特异性”启动子（那些启动子在种子发育期间活跃，例如种子贮藏蛋白的启动子）以及“种子萌发”启动子（那些启动子在种子萌发期间活跃）。参见Thompson等人，(1989)，《生物学论文集》(BioEssays)，10:108（以引用方式并入本文）。这类种子偏好启动子包括但不限于Cim1（细胞分裂素诱导信息）；cZ19B1（玉蜀黍19kDa玉米蛋白）；和milps（肌醇‑1‑磷酸合酶）（参见美国专利No.6,225,529，以引用方式并入本文）。γ‑玉米醇溶蛋白和Glob‑1是胚乳特异性启动子。对于双子叶植物而言，种子特异性启动子包括但不限于菜豆β‑菜豆素基因启动子、油菜籽蛋白(napin)基因启动子、β‑伴球蛋白基因启动子、大豆凝集素基因启动子、十字花科蛋白基因启动子等。对于单子叶植物，种子特异性启动子包括但不限于玉蜀黍15kDa玉米醇溶蛋白、22kDa玉米醇溶蛋白、27kDa玉米醇溶蛋白、g‑玉米醇溶蛋白、waxy、shrunken1、shrunken2、球蛋白1等。另参见WO00/12733，其中公开了来自end1和end2基因的种子偏好启动子；将该专利以引用方式并入本文。在特定组织中具有“偏好”表达的启动子在该组织中表达的程度高于在至少一种其他植物组织中表达的程度。一些组织偏好启动子几乎专门在特定组织中显示表达。
如果需要低水平表达，则要使用弱启动子。一般而言，本文所用的术语“弱启动子”指以低水平驱动编码序列的表达的启动子。所谓“低水平表达”意指处于约1/1000个转录物至约1/100,000个转录物至约1/500,000个转录物的水平。作为另一种选择，认识到术语“弱启动子”还涵盖仅在少数细胞中而不在其他细胞中驱动表达从而造成总表达水平较低的启动子。如启动子以不可接收的高水平驱动表达，则可缺失或者修饰启动子序列的一些部分以降低表达水平。
这种弱组成型启动子包括例如Rsyn7启动子的核心启动子（WO99/43838和美国专利No.6,072,050）、核心35S CaMV启动子等。其他组成型启动子包括例如以下美国专利中描述的那些启动子：5,608,149、5,608,144、5,604,121、5,569,597、5,466,785、5,399,680、5,268,463、5,608,142和6,177,611，将该专利以引用方式并入本文。
一般而言，表达盒将包含用于选择转化细胞的选择标记基因。选择性标志物基因被利用于转化细胞或组织的选择。选择性标志物基因包括编码抗生素抗性的基因，如那些编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的基因，以及赋予对除草化合物的抗性的基因，所述除草化合物为例如草铵膦、溴苯腈、咪唑啉酮和2,4‑二氯苯氧基乙酸(2,4‑D)。合适的选择性标记基因的另外例子包括但不限于：编码对氯霉素的抗性的基因（Herrera Estrella等人，(1983)，《欧洲分子生物学组织杂志》(EMBO J.)，2:987‑992）；甲氨喋呤（Herrera Estrella等人，(1983)，《自然》(Nature)，303:209‑213；以及Meijer等人，(1991)，《植物分子生物学》(Plant Mol.Biol.)，16:807‑820）；链霉素（Jones等人，(1987)，《分子遗传学与普通遗传学》(Mol.Gen.Genet.)，210:86‑91）；壮观霉素（Bretagne‑Sagnard等人，(1996)，《转基因研究》(Transgenic Res.)，5:131‑137）；博来霉素（Hille等人，(1990)，《植物分子生物学》(Plant Mol.Biol.)，7:171‑176）；磺酰胺（Guerineau等人，(1990)，《植物分子生物学》(Plant Mol.Biol.)，15:127‑136）；溴苯腈（Stalker等人，(1988)，《科学》(Science)，242:419‑423）；草甘膦（Shaw等人，(1986)，《科学》(Science)，233:478‑481；以及美国专利No.7,709,702和7,462,481)）；膦丝菌素（DeBlock等人，(1987)，《欧洲分子生物学组织杂志》(EMBO J.)，6:2513‑2518）。主要参见：Yarranton，(1992)，《生物技术新观点》(Curr.Opin.Biotech.)，3:506‑511；Christopherson等人，(1992)，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，89:6314‑6318；Yao等人，(1992)，《细胞》(Cell)，71:63‑72；Reznikoff，(1992)，《分子微生物学》(Mol.Microbiol.)，6:2419‑2422；Barkley等人，(1980)，《操纵子》(The Operon)，第177‑220页；Hu等人，(1987)，《细胞》(Cell)，48:555‑566；Brown等人，(1987)，《细胞》(Cell)，49:603‑612；Figge等人，(1988)，《细胞》(Cell)，52:713‑722；Deuschle等人，(1989)，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，86:5400‑5404；Fuerst等人，(1989)，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，86:2549‑2553；Deuschle等人，(1990)，《科学》(Science)，248:480‑483；Gossen，(1993)，海德尔堡大学博士论文；Reines等人，(1993)，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，90:1917‑1921；Labow等人，(1990)，《分子细胞生物学》(Mol.Cell.Biol.)，10:3343‑3356；Zambretti等人，(1992)，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，89:3952‑3956；Baim等人，(1991)，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，88:5072‑5076；Wyborski等人，(1991)，《核酸研究》(Nucleic Acids Res.)，19:4647‑4653；Hillenand‑Wissman，(1989)，《分子结构生物学主题》(Topics Mol.Struc.Biol.)，10:143‑162；Degenkolb等人，(1991)，《抗微生物剂化学疗法》(Antimicrob.Agents Chemother.)，35:1591‑1595；Kleinschnidt等人，(1988)，《生物化学》(Biochemistry)，27:1094‑1104；Bonin，(1993)，海德尔堡大学博士论文；Gossen等人，(1992)，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，89:5547‑5551；Oliva等人，(1992)，《抗微生物剂化学疗法》(Antimicrob.Agents Chemother.)，36:913‑919；Hlavka等人，(1985)，《实验药理学手册》(Handbook of Experimental Pharmacology)，第78卷，柏林施普林格出版社(Springer‑Verlag,Berlin)；以及Gill等人，(1988)，《自然》(Nature)，334:721‑724。将这些公开内容以引用的方式并入本文。
上面关于选择性标志物基因的列表并不意指是限制性的。任何选择性标记基因都可用于本发明实施例。
本发明实施例的方法涉及将多肽或者多核苷酸引入到植物中。“引入”意在指以使得多核苷酸或者多肽的序列得以进入植物细胞的内部的方式将多核苷酸或者多肽呈送到植物。本发明实施例的方法不依赖于将多核苷酸或者多肽引入植物中的具体方法，只要多核苷酸或多肽可进入植物的至少一个细胞的内部即可。将多核苷酸或多肽引入植物中的方法是本领域已知的，包括但不限于稳定转化方法、瞬时转化方法和病毒介导的方法。
“稳定转化”旨在意指被引入到植物中的核苷酸构建体整合到了植物的基因组中，并能够被其后代遗传。“瞬时转化”旨在意指多核苷酸被引入到植物中但没有整合到植物的基因组中，或者多肽被引入到植物中。
转化规程以及将核苷酸序列引入植物中的规程，可根据要进行转化的植物或植物细胞的类型（即单子叶植物或双子叶植物）而异。将核苷酸序列引入到植物细胞中并随后插入到植物基因组中的合适方法包括：微注射（Crossway等人，(1986)，《生物技术》(Biotechniques)，4:320‑334）、电穿孔（Riggs等人，(1986)，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，83:5602‑5606）、农杆菌介导的转化（美国专利No.5,563,055和5,981,840）、直接基因转移（Paszkowski等人，(1984)，《欧洲分子生物学组织杂志》(EMBO J.)，3:2717‑2722）以及弹道粒子加速（参见例如美国专利No.4,945,050、5,879,918、5,886,244和5,932,782；Tomes等人，(1995)，《植物细胞、组织和器官培养：基本方法》(Plant Cell,Tissue,and Organ Culture:Fundamental Methods)，Gamborg and Phillips编辑，柏林施普林格出版社(Springer‑Verlag,Berlin)；以及McCabe等人，(1988)，《生物技术》(Biotechnology)，6:923‑926）；以及Lecl转化(WO00/28058)。对于马铃薯转化，参见Tu等人，(1998)，《植物分子生物学》(Plant Molecular Biology)，37:829‑838；以及Chong等人，(2000)，《转基因研究》(Transgenic Research)，9:71‑78。另外的转化程序可见于Weissinger等人，(1988)，《遗传学年度评论》(Ann.Rev.Genet.)，22:421‑477；Sanford等人，(1987)，《颗粒科学与技术》(Particulate Science and Technology)，5:27‑37（洋葱）；Christou等人，(1988)，《植物生理学》(Plant Physiol.)，87:671‑674（大豆）；McCabe等人，(1988)，《生物技术》(Bio/Technology)，6:923‑926（大豆）；Finer和McMullen，(1991)，《体外细胞发育生物学》(In Vitro Cell Dev.Biol.)，27P:175‑182（大豆）；Singh等人，(1998)，《理论与应用遗传学》(Theor.Appl.Genet.)，96:319‑324（大豆）；Datta等人，(1990)，《生物技术》(Biotechnology)，8:736‑740（水稻）；Klein等人，(1988)，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，85:4305‑4309（玉蜀黍）；Klein等人，(1988)，生物技术》(Biotechnology)，6:559‑563（玉蜀黍）；美国专利No.5,240,855、5,322,783和5,324,646；Klein等人，(1988)，《植物生理学》(Plant Physiol.)，91:440‑444（玉蜀黍）；Fromm等人，(1990)，《生物技术》(Biotechnology)，8:833‑839（玉蜀黍）；Hooykaas‑Van Slogteren等人，(1984)，《自然》（伦敦）(Nature(London))，311:763‑764；美国专利No.5,736,369（谷类）；Bytebier等人，(1987)，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，84:5345‑5349（百合科）；De Wet等人，(1985)，《胚珠组织的实验操纵》(The Experimental Manipulation of Ovule Tissues)，Chapman等人编辑，纽约朗文出版社(Longman,New York)，第197‑209页（花粉）；Kaeppler等人，(1990)，《植物细胞报道》(Plant Cell Reports)，9:415‑418；以及Kaeppler等人，(1992)，《理论与应用遗传学》(Theor.Appl.Genet.)，84:560‑566（颈须介导的转化）；D'Halluin等人，(1992)，《植物细胞》(Plant Cell)，4:1495‑1505（电穿孔）；Li等人，(1993)，《植物细胞报道》(Plant Cell Reports)，12:250‑255；以及Christou和Ford，(1995)，《植物学年刊》(Annals of Botany)，75:407‑413（水稻）；Osjoda等人，(1996)，《自然生物技术》(Nature Biotechnology)，14:745‑750（玉蜀黍，通过根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)）；所有这些文献以引用方式并入本文。
在具体的实施例中，本发明实施例的序列可用多种瞬时转化方法提供给植物。这种瞬时转化方法包括但不限于直接向植物中引入Cry毒素蛋白或其变体和片段，或者向植物中引入Cry毒素转录物。这类方法包括例如微注射或粒子轰击。参见例如Crossway等人，(1986)，《分子遗传学与普通遗传学》(Mol Gen.Genet.)，202:179‑185；Nomura等人，(1986)，《植物科学》(Plant Sci.)，44:53‑58；Hepler等人，(1994)，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.)，91:2176‑2180；以及Hush等人，(1994)，《细胞科学杂志》(The Journal of Cell Science)，107:775‑784；所有这些文献以引用方式并入本文。作为另一种选择，可使用本领域知道的技术将Cry毒素多核苷酸瞬时转化到植物中。这类技术包括病毒载体系统以及将多核苷酸以避免该DNA随后释放的方式进行的沉淀。因此，从粒子结合的DNA可发生转录，但它释放出来而整合到基因组中的频率则大大降低。这种方法包括使用包被有聚乙基亚胺(PEI;Sigma#P3143)的粒子。
用于将多核苷酸定向插入在植物基因组中的特定位置的方法是本领域已知的。在一个实施例中，将多核苷酸插入所需的基因组位置是用位点特异性重组系统来实现的。参见（例如）WO99/25821、WO99/25854、WO99/25840、WO99/25855和WO99/25853，将这些文献都以引用方式并入本文。简单而言，可将本发明实施例的多核苷酸包含在转移盒中，该转移盒侧接着两个不相同的重组位点。将转移盒引入到在其基因组中稳定掺入了这样的靶标位点的植物中，该靶标位点侧接着两个对应于该转移盒的所述位点的不相同重组位点。提供适当的重组酶，将该转移盒整合在该靶标位点处。所关注的多核苷酸因此整合在植物基因组中的特定染色体位置。
可根据常规方式将已转化的细胞培育成植株。参见例如，McCormick等人，(1986)，《植物细胞报道》(Plant Cell Reports)，5:81‑84。然后可栽培这些植株并用同一转化株系或不同的株系进行授粉，并鉴定出具有所需表型特征的组成型或者诱导型表达的所得子代。可培养两代或更多代以确保所需表型特征的表达得到稳定保持和遗传，然后收获种子以确保所需表型特征的表达已得到实现。
本发明实施例的核苷酸序列可通过使植物与病毒或者病毒核酸接触而提供给植物。通常，这种方法涉及将目的核苷酸构建体掺入在病毒DNA或者RNA分子内。认识到，本发明实施例的重组蛋白可最初作为病毒聚蛋白的一部分来合成，其以后可通过体内或体外蛋白水解加工而产生所需的杀虫蛋白。还认识到，这种包含本发明实施例的杀虫蛋白的氨基酸序列的至少一部分的病毒聚蛋白可具有所需的杀虫活性。这种病毒聚蛋白及其编码核苷酸序列为本发明实施例所涵盖。给植物提供核苷酸构建体并在植物中产生所编码的蛋白质的方法（涉及病毒DNA或者RNA分子）是本领域知道的。参见例如，美国专利No.5,889,191、5,889,190、5,866,785、5,589,367和5,316,931；将该专利以引用方式并入本文。
本发明实施例还涉及本发明实施例的转化植物的植物繁殖材料，包括但不限于种子、块茎、球茎、鳞茎、叶、以及根和苗的插条。
本发明实施例可用于转化任何植物物种，包括但不限于单子叶植物和双子叶植物。目的植物的例子包括但不限于玉米、芸苔属(Brassica sp.)（例如，卷心菜型油菜(B.napus)、芜菁(B.rapa)、芥菜(B.juncea），特别是可用作种子油来源的那些芸苔属植物；苜蓿(Medicago sativa)、水稻(Oryza sativa)、黑麦(Secale cereale)、高粱(Sorghum bicolor,Sorghum vulgare)、小米（例如珍珠粟(Pennisetum glaucum),黄米(Panicum miliaceum)、谷子(Setaria italica)、龙爪稷(Eleusine coracana)）、向日葵(Helianthus annuus)，红花(Carthamus tinctorius)、小麦(Triticum aestivum)，大豆(Glycine max)、烟草(Nicotiana tabacum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、落花生(Arachis hypogaea)、棉花（海岛棉(Gossypium barbadense)、陆地棉(Gossypium hirsutum)）、甘薯(Ipomoea batatus)、木薯(Manihot esculenta)、咖啡(Coffea spp.)、椰子(Cocos nucifera)、菠萝(Ananas comosus)、柑橘(Citrus spp.)、可可(Theobroma cacao)、茶(Camellia sinensis)、香蕉(Musa spp.)、鳄梨(Persea americana)、无花果(Ficus casica)、番石榴(Psidium guajava)、芒果(Mangifera indica)、橄榄(Olea europaea)、木瓜(Carica papaya)、腰果(Anacardium occidentale)、澳洲坚果(Macadamia integrifolia)、杏树(Prunus amygdalus)、糖用甜菜(Beta vulgaris)、甘蔗(Saccharum spp.)、燕麦、大麦、蔬菜、观赏植物和针叶树。
蔬菜包括番茄(Lycopersicon esculentum)、莴苣（例如Lactuca sativa）、青豆(Phaseolus vulgaris)、利马豆(Phaseolus limensis)、豌豆(Lathyrus spp.)和黄瓜属(Cucumis)的成员如黄瓜(C.sativus)、香瓜(C.cantalupensis)和香甘瓜(C.melo)。观赏植物包括杜鹃花(Rhododendron spp.)、八仙花(Macrophylla hydrangea)、朱槿(Hibiscus rosasanensis)、玫瑰(Rosa spp.)、郁金香(Tulipa spp.)、水仙花(Narcissus spp.)、矮牵牛花(Petunia hybrida)、康乃馨(Dianthus caryophyllus)、一品红(Euphorbia pulcherrima)和菊花。可应用于实施各个实施例的针叶树包括例如松树如火炬松(Pinus taeda)、沼泽松(Pinus elliotii)、美国黄松(Pinus ponderosa)、黑松(Pinus contorta)和蒙特利松(Pinus radiata)；花旗松(Pseudotsuga menziesii)；西铁杉(Tsuga canadensis)；北美云杉(Picea glauca)；红杉(Sequoia sempervirens)；枞树(true firs)如银枞(Abies amabilis)和胶枞(Abies balsamea)；以及雪松如西方红雪松(Thuja plicata)和阿拉斯加黄雪松(Chamaecyparis nootkatensis)。各实施例的植物包括作物植物，包括但不限于：玉米、苜蓿、向日葵、芸苔、大豆、棉花、红花、花生、高粱、小麦、小米、烟草、甘蔗等。
草坪草包括但不限于：一年生蓝草(Poa annua)；一年生黑麦草(Lolium multiflorum)；加拿大蓝草(Poa compressa)；紫羊茅(Festuca rubra)；细弱剪股颖(Agrostis tenuis)；匍匐翦股颖(Agrostis palustris)；光穗冰草(Agropyron desertorum)；扁穗冰草(Agropyron cristatum)；硬羊茅(Festuca longifolia)；肯塔基蓝草(Poa pratensis)；果园草(Dactylis glomerata)；多年生黑麦草(Lolium perenne)；紫羊茅(Festuca rubra)；红顶草(Agrostis alba)；粗茎蓝草(Poa trivialis)；羊茅(Festuca ovina)；无芒雀麦草(Bromus inermis)；高羊茅(Festuca arundinacea)；梯牧草(Phleum pratense)；绒毛剪股颖(Agrostis canina)；碱茅(Puccinellia distans)；西方冰草(Agropyron smithii)；百慕达草(Cynodon spp.)；圣奥古斯丁草(Stenotaphrum secundatum)；结缕草(Zoysia spp.)；美洲雀稗(Paspalum notatum)；地毯草(Axonopus affinis)；百足草(Eremochloaophiuroides)；狼尾草(Pennisetum clandesinum)；海滨雀稗(Paspalum vaginatum)；蓝格兰马草(Bouteloua gracilis)；野牛草(Buchloe dactyloids)；垂穗草(Bouteloua curtipendula)。
目的植物包括谷物植物（提供目的种子）、油籽植物和豆科植物。目的种子包括谷物种子，如玉米、小麦、大麦、大米、高粱、黑麦、小米等。油籽植物包括棉花、大豆、红花、向日葵、芸苔属、玉蜀黍、苜蓿、棕榈、椰子、亚麻、蓖麻、橄榄等。豆科植物包括豆类(beans)和豌豆。豆类(beans)包括瓜尔豆、槐豆、胡芦巴、大豆、四季豆、豇豆、绿豆、利马豆、蚕豆、小扁豆、鹰嘴豆等。
在某些实施例中，本发明实施例的核酸序列可与目的多核苷酸序列的任何组合进行堆叠(stack)，以产生具有所需表型的植物。例如，本发明实施例的多核苷酸可与任何其他编码具有杀虫和/或杀昆虫活性的多肽的多核苷酸进行堆叠，所述多肽例如其他Bt毒蛋白（描述于美国专利No.5,366,892、5,747,450、5,736,514、5,723,756、5,593,881；以及Geiser等人，(1986)，《基因》(Gene)，48:109）、五邻体(pentin)（描述于美国专利No.5,981,722）等。所产生的组合还可包括目的多核苷酸中的任何一者的多个拷贝。本发明实施例的多核苷酸也可与任何其他基因或者基因组合进行堆叠，以产生具有多种所需的性状组合的植物，所述性状包括但不限于动物饲料所需的性状如高油基因（例如美国专利No.6,232,529）；平衡的氨基酸（例如hordothionins（美国专利No.5,990,389、5,885,801、5,885,802和5,703,049）；大麦高赖氨酸（Williamson等人，(1987)，《欧洲生物化学杂志》(Eur.J.Biochem.)，165:99‑106；和WO98/20122）以及高甲硫氨酸蛋白（Pedersen等人，(1986)，《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)，261:6279；Kirihara等人，(1988)，《基因》(Gene)，71:359；和Musumura等人，(1989)，《植物分子生物学》(Plant Mol.Biol.)，12:123)）；消化性提高（例如经修饰的贮藏蛋白（美国专利6,858,778）；和硫氧还蛋白（美国专利No.7,009,087）；将这些文献和专利的公开内容以引用方式并入本文。
本发明实施例的多核苷酸也可与疾病或者杀虫剂抗性所需的性状进行堆叠（例如伏马毒素脱毒基因（美国专利No.5,792,931）；无毒性和疾病抗性基因（Jones等人，(1994)，《科学》(Science)，266:789；Martin等人，(1993)，《科学》(Science)，262:1432；以及Mindrinos等人，(1994)，《细胞》(Cell)，78:1089）；导致除草剂抗性的乙酰乳酸合成酶(ALS)突变体，例如S4和/或Hra突变；谷氨酰胺合酶的抑制剂如膦丝菌素或者basta（例如bar基因）；以及草甘膦抗性（EPSPS基因和GAT基因，美国专利No.7,709,702和7,462,481中公开）；以及加工或者过程产物所需的性状，如高油（例如美国专利No.6,232,529）；经修饰的油（例如脂肪酸去饱和酶基因（美国专利No.5,952,544；WO94/11516））；经修饰的淀粉（例如ADPG焦磷酸化酶（AGP酶）、淀粉合酶(SS)、淀粉分支酶(SBE)和淀粉脱支酶(SDBE)）；以及聚合物或者生物塑料（例如美国专利No.5,602,321；β‑酮基硫解酶、聚羟基丁酸合酶和乙酰乙酰基‑CoA还原酶（Schubert等人，(1988)，《细菌学杂志》(J.Bacteriol.)，170:5837‑5847）有利于聚羟基链烷酸酯(PHA)的表达），将上述文献中的公开内容以引用的方式并入本文。还可以将本发明实施例的多核苷酸与提供诸如雄性不育（例如参见美国专利No.5.583,210）、茎秆强度、开花时间之类的农学性状或者诸如细胞周期调控或基因打靶（例如WO99/61619、WO00/17364；WO99/25821）之类的转化技术性状的多核苷酸组合，以上公开内容以引用的方式合并入本文。
这些堆叠的组合可通过任何方法来产生，包括但不限于通过任何常规方法或顶交方法或者遗传转化来对植物进行杂交育种。如果性状是通过遗传转化植株来堆叠，则目的多核苷酸序列可在任何时间以任何顺序进行组合。例如，可将包括一种或多种期望性状的转基因植物用作靶标，通过后续的转化引入更多性状。可以用共转化规程将性状与目的多核苷酸同时引入，所述多核苷酸由转化盒的任何组合提供。例如，如果将要引入两条序列，则可将该两条序列包含在分别的转化盒中（反式）或包含在同一转化盒中（顺式）。可通过相同启动子或不同启动子驱动序列表达。在某些情况中，可能期望引入会抑制目的多核苷酸的表达的转化盒。这可以与其他抑制盒或超表达盒的任何组合进行组合以在植物中生成期望的性状组合。进一步认识到可使用位点特异性重组体系在期望的基因组位置堆叠多核苷酸序列。参见（例如）WO99/25821、WO99/25854、WO99/25840、WO99/25855和WO99/25853，将这些文献都以引用方式并入本文。
本发明实施例的组合物可用于以多种方式保护植物、种子和植物产物。例如，所述组合物可在涉及通过选自喷雾、喷粉、广播或者种子涂覆的程序将有效量的杀虫组合物置于害虫的环境中的方法中使用。
在植物繁殖材料（果实、块茎、鳞茎、球茎、谷粒、种子），但尤其是种子，作为商品出售之前，其通常用保护剂涂料进行处理，所述保护剂涂料包含除草剂、杀昆虫剂、杀真菌剂、杀细菌剂、杀线虫剂、杀软体动物剂或者这些制品中的几种的混合物，如果需要的话还进一步加上制剂领域常用的载体、表面活性剂或促施用助剂，以提供对抗细菌、真菌或动物害虫造成的损害的保护。为了处理种子，可通过如下方法将保护剂涂料施用至种子：用液体制剂浸渍块茎或谷粒，或用组合的湿或干制剂对种子进行涂覆。另外，在特殊的情况中，其他施用至植物的方法也是可能的，例如针对芽或果实进行的处理。
包含编码本发明实施例的杀虫蛋白的核苷酸序列的本发明实施例的植物种子，可用包含种子处理化合物的种子保护剂涂料进行处理，所述种子处理化合物例如克菌丹、萎锈灵、福美双、methalaxyl、甲基嘧啶磷以及其他常用于种子处理的化合物。在一个实施例中，包含本发明实施例的杀虫组合物的种子保护剂涂料单独使用或者与常用于种子处理的种子保护剂涂料之一组合使用。
认识到，可用编码杀虫蛋白的基因来转化昆虫病原生物体。这种生物体包括杆状病毒、真菌、原生动物、细菌和线虫。
可通过合适的载体将编码本发明实施例的杀虫蛋白的基因引入到微生物宿主中，并将所述宿主施放到环境或者植物或者动物。在将核酸插入细胞中的语境中的术语“引入”，意指“转染”或“转化”或“转导”，包括指涉核酸掺入到真核或原核细胞中，其中该核酸可掺入到细胞的基因组（例如染色体、质粒、质体或线粒体DNA）中、转化成自主复制子或者瞬时表达（例如转染的mRNA）。
可选择已知会占领一种或者多种目的作物的“植物圈”（叶面、叶圈、根际和/或根面）的微生物宿主。选择这些微生物以便能够在特定环境中成功地与野生型微生物竞争，提供表达杀虫蛋白的基因的稳定保持和表达，并且理想地提供该杀虫剂的改进的保护使其不受环境降解和失活。
这种微生物包括细菌、藻类和真菌。特别值得关注的是诸如以下的微生物：细菌，例如假单胞菌属(Pseudomonas)、欧文氏菌属(Erwinia)、沙雷氏菌属(Serratia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、根瘤菌属(Rhizobium)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、Methylius、土壤杆菌属(Agrobacterium)、醋杆菌属(Acetobacter)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、固氮菌属(Azotobacter)、明串珠菌属(Leuconostoc)、以及产碱菌属(Alcaligenes)，真菌，特别是酵母，例如酵母菌属(Saccharomyces)、隐球菌属(Cryptococcus)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、掷孢酵母属(Sporobolomyces)、红酵母属(Rhodotorula)和短梗霉属(Aureobasidium)。特别值得关注的是诸如以下的植物圈细菌物种：丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、木醋杆菌(Acetobacter xylinum)、农杆菌(Agrobacteria)、球形红假单胞菌(Rhodopseudomonas spheroides)、野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)、苜蓿根瘤菌(Rhizobium melioti)、富营养产碱菌(Alcaligenes entrophus)、木质棍状杆菌(Clavibacter xyli)和维涅兰德固氮菌(Azotobacter vinelandii)，以及诸如以下的植物圈酵母物种：深红酵母(Rhodotorula rubra)、粘红酵母(R.glutinis)、海滨红酵母(R.marina)、橙黄红酵母(R.aurantiaca)、浅白色隐球酵母(Cryptococcus albidus)、流散隐球酵母(C.diffluens)、罗伦隐球酵母(C.laurentii)、罗斯酵母(Saccharomyces rosei)、S.pretoriensis、酿酒酵母(S.cerevisiae)、粉红掷孢酵母(Sporobolomyces roseus)、香气掷孢酵母(S.odorus)、Kluyveromyces veronae和茁芽短梗霉(Aureobasidium pollulans)。特别值得关注的是有色素微生物。
有多种方式可用来将表达杀虫蛋白的基因引入到处于容许该基因的稳定维持和表达的条件下的微生物宿主中。例如，可构建出这样的表达盒，其包括目的核苷酸构建体及为了该核苷酸构建体的表达该核苷酸构建体所有效连接的转录和翻译调节信号、与宿主生物体中的序列同源的核苷酸序列（据此将发生整合）和/或在宿主中具有功能的复制系统（据此将发生整合或者稳定维持）。
转录和翻译调节信号包括但不限于启动子、转录起始位点、操纵子、活化子、增强子、其他调节元件、核糖体结合位点、起始密码子、终止信号等。参见例如，美国专利No.5,039,523和4,853,331；EPO0480762A2；Sambrook；Maniatis等人，冷泉港实验室出版社，纽约冷泉港(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York)；Davis等人编辑，(1980)，《高级细菌遗传学》(Advanced Bacterial Genetics)，冷泉港实验室出版社，纽约冷泉港(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York)；以及其中引用的参考文献。
如果含杀虫蛋白的细胞要被进行处理以延长当将经处理的细胞施用于靶标害虫的环境时杀虫蛋白在细胞中的活性，则合适的宿主细胞可包括原核生物或者真核生物，通常限于那些不会产生对高等生物体（如哺乳动物）有毒的物质的细胞。但是，如果毒素不稳定或者施用水平足够低以避免对哺乳动物宿主的毒性的任何可能性，则可以使用会产生对高等生物体有毒的物质的生物体。作为宿主，特别值得关注的将是原核生物和低等真核生物如真菌。示例性的原核生物（革兰氏阴性和革兰氏阳性）包括肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，如埃希氏菌属(Escherichia)、欧文氏菌属(Erwinia)、志贺氏菌属(Shigella)、沙门氏菌属(Salmonella)和变形菌属(Proteus)；芽孢杆菌科(Bacillaceae)；根瘤菌科(Rhizobiaceae)，如根瘤菌属(Rhizobium)；螺菌科(Spirillaceae)，如发光细菌(photobacterium)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、沙雷氏菌属(Serratia)、气单胞菌属(Aeromonas)、弧菌属(Vibrio)、脱硫弧菌属(Desulfovibrio)、螺菌属(Spirillum)；乳杆菌科(Lactobacillaceae)；假单胞菌科(Pseudomonadaceae)，如假单胞菌属(Pseudomonas)和醋杆菌属(Acetobacter)；固氮菌科(Azotobacteraceae)和硝化杆菌科(Nitrobacteraceae)。真核生物有真菌，如藻菌纲(Phycomycetes)和子囊菌纲(Ascomycetes)，其包括酵母如酵母菌属(Saccharomyces)和裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)；担子菌纲(Basidiomycetes)酵母，如红酵母属(Rhodotorula)、短梗霉属(Aureobasidium)、掷孢酵母属(Sporobolomyces)等。
在为了杀虫蛋白生产目的而选择宿主细胞时特别值得关注的特征包括杀虫蛋白基因向宿主中引入的便利性、表达系统的可获得性、表达的效率、蛋白质在宿主中的稳定性以及辅助遗传能力的存在。对于作为杀虫剂微胶囊使用特别值得关注的特征包括杀虫剂的保护质量，如厚细胞壁、色素沉着以及包涵体的胞内包装或者形成；叶亲和力；哺乳动物毒性的缺乏；对害虫取食的吸引力；在不对毒素造成损害的情况下杀灭和固定的容易性；等。其他考虑因素包括配制和操作容易性、经济性、保藏稳定性等。
特别值得关注的宿主生物体包括酵母如红酵母属(Rhodotorula spp.)、短梗霉属(Aureobasidium spp.)、酵母菌属(Saccharomyces spp.)如酿酒酵母(S.cerevisiae)、掷孢酵母属(Sporobolomyces spp.)，叶面生物体如假单胞菌属(Pseudomonas spp.)如铜绿假单胞杆菌(P.aeruginosa)、荧光假单胞菌(P.fluorescens)、欧文氏菌属(Erwinia spp.)和黄杆菌属(Flavobacterium spp.)以及其他此类生物体，包括苏云金杆菌(Bt)、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等。
可将编码本发明实施例的杀虫蛋白的基因引入到植物上繁殖的微生物（体表寄生菌）中，以将杀虫蛋白递送到潜在的靶标害虫。体表寄生菌例如可以是革兰氏阳性或者革兰氏阴性细菌。
根棲细菌例如可通过本领域知道的方法从目的植物分离。具体而言，可从植物的根分离出根棲的蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)菌株（参见例如，Handelsman等人，(1991)，《应用与环境微生物学》(Appl.Environ.Microbiol.)，56:713‑718）。可通过本领域知道的标准方法将编码本发明实施例的杀虫蛋白的基因引入到根棲蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)中。
可通过电转化手段将编码杀虫蛋白的基因例如引入到根棲芽孢杆菌中。具体而言，可将编码杀虫蛋白的基因克隆到穿梭载体如pHT3101中（Lerecius等人，(1989)，《欧洲微生物学会联合会微生物学快报》(FEMS Microbiol.Letts.)，60:211‑218。含有特定杀虫蛋白基因的编码序列的穿梭载体pHT3101可例如通过电穿孔手段转化到根棲芽孢杆菌中（Lerecius等人，(1989)，《欧洲微生物学会联合会微生物学快报》(FEMS Microbiol.Letts.)，60:211‑218）。
可设计表达系统，使得杀虫蛋白被分泌到革兰氏阴性细菌（如大肠杆菌）的细胞质之外。分泌杀虫蛋白的好处是：(1)避免所表达的杀虫蛋白的潜在细胞毒性作用；和(2)改进杀虫蛋白的纯化效率，包括但不限于提高每体积细胞培养液的蛋白质回收和纯化效率和降低每单位蛋白质的回收和纯化时间和/或成本。
可例如通过将适当的大肠杆菌信号肽与杀虫蛋白的氨基末端融合，使杀虫蛋白在大肠杆菌中分泌。被大肠杆菌识别的信号肽可存在于已知在大肠杆菌中分泌的蛋白质，例如OmpA蛋白（Ghrayeb等人，(1984)，《欧洲分子生物学组织杂志》(EMBO J,)，3:2437‑2442）。OmpA是大肠杆菌外膜的主要蛋白，因此它的信号肽据认为在易位过程中有效。另外，在加工前不需要对OmpA信号肽进行修饰，而其他信号肽例如脂蛋白信号肽则需要（Duffaud等人，(1987)，《酶学方法》(Meth.Enzymol.)，153:492）。
可在细菌宿主中发酵本发明实施例的杀虫蛋白，并且将所得的细菌加工并以与Bt菌株用作杀昆虫喷剂相同的方式用作微生物喷剂。在杀虫蛋白从芽孢杆菌分泌的情况中，用本领域知道的程序将分泌信号移除或者突变。这种突变和/或缺失能防止杀虫蛋白在发酵过程中分泌到生长培养基中。杀虫蛋白保持在细胞内，然后将细胞进行加工以得到包囊的杀虫蛋白。任何合适的微生物都可用于这个目的。已用假单胞菌属将Bt毒素表达为包囊蛋白，并且将所得的细胞进行加工并作为杀虫剂喷施（Gaertner等人，(1993)，见：《高级工程化杀虫剂》(Advanced Engineered Pesticides)，Kim编辑）。
作为另一个选择，通过将异源基因引入到细胞宿主中来产生杀菌蛋白。异源基因的表达直接或者间接导致该杀虫剂的胞内产生和维持。然后将这些细胞在能延长当将细胞施用于靶标害虫的环境时该产生的毒素在细胞中的活性的条件下进行处理。所得的产物保持该毒素的毒性。然后可按照常规技术配制这些天然包囊的杀虫蛋白以便施用于靶标害虫的寄生环境，例如土壤、水和植物的叶。参见例如EP0192319以及其中引用的参考文献。
在本发明实施例中，可将转化的微生物（其包括完整生物体、细胞、孢子、杀虫蛋白、杀虫组分、害虫影响组分、突变体、活的或者死的细胞和细胞组分，包括活的或者死的细胞和细胞组分的混合物在内，和包括破碎的细胞和细胞组分在内）或者分离的杀虫蛋白与可接受的载体一起配制成例如以下杀虫组合物：悬浮液、溶液、乳液、撒粉、可分散颗粒或丸、可润湿粉末以及可乳化浓缩物、气溶胶或喷雾、浸渍颗粒、助剂、可涂覆糊、胶体还有例如在聚合物物质中的包囊物。这种配制的组合物可通过诸如将包含该多肽的细胞的培养物进行干燥、冻干、均质、提取、过滤、离心、沉淀或者浓缩的常规手段进行制备。
以上所公开的这类组合物可通过加入以下物质来获得：表面活性剂、惰性载体、防腐剂、保湿剂、取食刺激剂、引诱剂、包囊剂、粘合剂、乳化剂、染料、紫外保护剂、缓冲剂、流动剂(flow agent)或者肥料、微量营养物供体或者其他能影响植物生长的制品。可将包括但不限于除草剂、杀昆虫剂、杀真菌剂、杀细菌剂、杀线虫剂、杀软体动物剂、杀螨剂、植物生长调节剂、收获助剂和肥料的一种或多种农业化学品与常用于配制领域的载体、表面活性剂或者助剂进行组合，以便于产品操作和施用于特定的靶标害虫。合适的载体和助剂可以是固体或者液体，并对应于通常用于配制技术的物质，例如天然或者再生的矿物质、溶剂、分散剂、湿润剂、增粘剂、粘合剂或者肥料。本发明实施例的活性成分通常以组合物的形式施用，并且可以施用于待处理的作物区、植物或者种子。例如，本发明实施例的组合物可以在粮仓或者青贮塔(silo)等中在准备贮藏时或者在贮藏过程中施用于谷物。本发明实施例的组合物可以与其他化合物同时或者相继施用。施用含有至少一种通过本发明实施例的细菌菌株产生的杀虫蛋白的本发明实施例的活性成分或者本发明实施例的农业化学组合物的方法，包括但不限于施用于叶子、涂覆种子和施用于土壤。施用次数和施用速度取决于相应害虫侵扰的强度。
合适的表面活性剂包括但不限于阴离子化合物如金属的羧酸盐；长链脂肪酸的羧酸酯；N‑酰基肌氨酸盐；磷酸与脂肪醇乙氧基化物的单酯或者二酯或者这类酯的盐；脂肪醇硫酸盐如十二烷基硫酸钠、十八烷基硫酸钠或者十六烷基硫酸钠；乙氧基化脂肪醇硫酸盐；乙氧基化烷基苯酚硫酸盐；木质素磺酸盐；石油磺酸盐；烷基芳基磺酸盐如烷基苯磺酸盐或者低级烷基萘磺酸盐，例如丁基萘磺酸盐；磺化的萘‑甲醛缩合物的盐；磺化的苯酚‑甲醛缩合物的盐；更复杂的磺酸盐如酰胺磺酸盐，例如油酸和N‑甲基牛磺酸的磺化缩合产物；或者二烷基磺基琥珀酸盐，例如琥珀酸二辛酯的磺酸钠。非离子剂包括脂肪酸酯、脂肪醇、脂肪酸酰胺或者脂肪烷基或烯基取代的苯酚与环氧乙烷的缩合产物，多元醇醚的脂肪酸酯例如脱水山梨糖醇脂肪酸酯，这种酯类与环氧乙烷的缩合产物例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯，环氧乙烷和环氧丙烷的嵌段共聚物，炔二醇如2,4,7,9‑四乙基‑5‑癸炔‑4,7‑二醇，或者乙氧基化的炔二醇。阳离子表面活性剂的例子包括例如脂肪族单胺、二胺或聚胺如乙酸盐、环烷酸盐或者油酸盐；或者含氧胺如聚氧乙烯烷基胺的氧化胺；通过羧酸与二胺或聚胺的缩合制备的酰胺连接的胺；或者季铵盐。
惰性材料的例子包括但不限于无机矿物质如高岭土、页硅酸盐、碳酸盐、硫酸盐、磷酸盐或者植物材料如软木、粉末玉米穗轴、花生壳、稻壳和胡桃壳。
本发明实施例的组合物可以为适于直接施用的形式，或者作为初级组合物的浓缩物，在施用前需要用适量的水或者其他稀释剂稀释。杀虫浓度将随具体配方的性质而异，具体而言，随它是浓缩物还是直接施用而异。组合物含有1‑98%的固体或者液体惰性载体和0‑50%或者0.1‑50%的表面活性剂。这些组合物将以商业产品的标示比率施用，例如当为干燥形式时约0.01磅至5.0磅每英亩，当为液体形式时约0.01品脱至10品脱每英亩。
在又一个实施例中，本发明实施例的组合物以及转化的微生物和杀虫蛋白可在配制前先进行处理，以延长当施用于靶标害虫的环境时的杀虫活性，只要预处理对杀虫活性无害。这种处理可通过化学和/或物理手段进行，只要处理不会有害地影响组合物的性质。化学试剂的例子包括但不限于卤化剂；醛类如甲醛和戊二醛；抗感染剂如氯化苯甲烃铵；醇类如异丙醇和乙醇；以及组织固定剂如Bouin固定剂和Helly固定剂（参见例如，Humason，(1967)，《动物组织技术》(Animal Tissue Techniques)（W.H.Freeman and Co.公司）。
在其他实施例中，可能有利的是用蛋白酶例如胰蛋白酶处理Cry毒素多肽以活化该蛋白质，然后再将本发明实施例的杀虫蛋白组合物施用于靶标害虫的环境。通过丝氨酸蛋白酶活化原毒素的方法是本领域公知的。参见例如Cooksey，(1968)，《生物化学杂志》(Biochem.J.)，6:445‑454；以及Carroll和Ellar，(1989)，《生物化学杂志》(Biochem.J.)，261:99‑105，将这些文献的教导内容以引用方式并入本文。例如，合适的活化方案包括但不限于将待活化的多肽例如纯化的新型Cry多肽（例如具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列）与胰蛋白酶以1/100的蛋白质/胰蛋白酶重量比在20nM NaHCO3(pH8)中组合，并在36℃下消化样品3小时。
组合物（包括本发明实施例的转化微生物和杀虫蛋白）可通过例如以下方式施用于昆虫害虫的环境：喷雾、雾化、撒粉、分散、涂覆或者倾倒、引入土壤中或者引到土壤上、引入灌溉水中、在害虫已开始出现时或者在害虫出现前进行种子处理或者一般施用或者散粉作为保护措施。例如，可将本发明实施例的杀虫蛋白和/或转化微生物与谷物混合以在贮藏过程中保护谷物。通常重要的是在植物生长的早期阶段获得对害虫的良好防治，因为这是植物可能受到最严重损害的时期。本发明实施例的组合物可便利地含有另一杀昆虫剂，如果认为这有必要的话。在一个实施例中，在种植时将组合物直接施用于土壤，施用的形式为载体与芽孢杆菌菌株或者本发明实施例的转化微生物的死细胞的组合物的颗粒形式。另一个实施例是包含农业化学品例如除草剂、杀昆虫剂、肥料、惰性载体与芽孢杆菌菌株或者本发明实施例的转化微生物的死细胞的组合物的颗粒形式。
本领域技术人员会认识到，并不是所有的化合物都对所有的害虫同等有效。实施例的化合物显示出对昆虫害虫的活性，这些昆虫害虫可包括经济上重要的农艺害虫、森林害虫、温室害虫、苗圃害虫、观赏植物害虫、食物和纤维害虫、公共健康和动物健康害虫、家庭和商业设施害虫、居室害虫和仓储害虫。昆虫害虫包括选自以下各目的昆虫：鞘翅目(Coleoptera)、双翅目(Diptera)、膜翅目(Hymenoptera)、鳞翅目(Lepidoptera)、食毛目(Mallophaga)、同翅目(Homoptera)、半翅目(Hemiptera)、直翅目(Orthoptera)、缨尾目(Thysanoptera)、革翅目(Dermaptera)、等翅目(Isoptera)、虱目(Anoplura)、蚤目(Siphonaptera)、毛翅目(Trichoptera)等，特别是鞘翅目和鳞翅目。
鳞翅目的昆虫包括但不限于行军虫、地蚕、尺蠖和夜蛾科(Noctuidae)的heliothine类Agrotis ipsilon Hufnagel（黑地蚕）；A.orthogonia Morrison（西部地蚕）；A.segetum Denis&Schiffermüller)（蔓青蛾）；A.subterranea Fabricius（粒肤地蚕）；Alabama argillacea Hübner（棉叶虫）；Anticarsia gemmatalis Hübner（黎豆毛虫）；Athetis mindara Barnes and McDunnough（粗皮地蚕）；Earias insulana Boisduval（多刺螟蛉）；E.vittella Fabricius（斑点螟蛉）；Egira(Xylomyges)curialis Grote（柑橘地蚕）；Euxoa messoria Harris（黑边地蚕）；Helicoverpa armigera Hübner（美洲螟蛉）；H.zea Boddie（玉米穗虫或玉米螟蛉）；Heliothis virescens Fabricius（烟青虫）；Hypena scabra Fabricius（苜蓿绿叶蛾）；Mamestra configurata Walker（披肩粘虫）；M.brassicae Linnaeus（甘蓝夜蛾）；Melanchra picta Harris（斑马纹夜蛾）；Pseudaletia unipuncta Haworth（行军虫）；Pseudoplusia includens Walker（大豆尺蠖）；Richia albicosta Smith（西方豆地蚕）；Spodoptera frugiperda JE Smith（秋夜蛾）；S.exigua Hübner（甜菜夜蛾）；S.litura Fabricius（烟草地蚕，簇毛虫）；Trichoplusia ni Hübner（卷心菜尺蠖）；来自螟蛾科(Pyralidae)和草螟科(Crambidae)的钻心虫、鞘蛾、结网虫、球果蛾和雕叶虫，如Achroia grisella Fabricius)（小蜡螟）；Amyelois transitella Walker（脐橙螟蛾）；Anagasta kuehniella Zeller（地中海粉蛾）；Cadra cautella Walker（杏仁蛾）；Chilo partellus Swinhoe（斑点茎秆钻心虫）；C.suppressalis Walker（条纹茎/水稻钻心虫）；C.terrenellus Pagenstecher（甘蔗茎钻心虫）；Corcyra cephalonica Stainton（米蛾）；Crambus caliginosellus Clemens（玉米根网虫）；C.teterrellus Zincken（蓝草网虫）；Cnaphalocrocis medinalis Guenée（稻卷叶虫）；Desmia funeralis Hübner（葡萄卷叶虫）；Diaphania hyalinata Linnaeus（甜瓜虫）；D.nitidalis Stoll（泡菜虫）；Diatraea grandiosella Dyar（西南玉米钻心虫），D.saccharalis Fabricius（甘蔗钻心虫）；Elasmopalpus lignosellus Zeller（小玉米茎钻心虫）；Eoreuma loftini Dyar（墨西哥水稻钻心虫）；Ephestia elutella Hübner（烟草（可可）蛾）；Galleria mellonella Linnaeus（大蜡蛾）；Hedylepta accepta Butler（甘蔗卷叶虫）；Herpetogramma licarsisalis Walker（草地网虫）；Homoeosoma electellum Hulst（向日葵蛾）；Loxostege sticticalis Linnaeus（甜菜网虫）；Maruca testulalis Geyer（豆荚钻心虫）；Orthaga thyrisalis Walker（茶树网蛾）；Ostrinia nubilalis Hübner（欧洲玉米钻心虫）；Plodia interpunctella Hübner（印度谷蛾）；Scirpophaga incertulas Walker（黄茎钻心虫）；Udea rubigalis Guenée（芹菜叶虫）；以及卷蛾科(Tortricidae)的卷叶虫、蚜虫、种实虫以及果实虫Acleris gloverana Walsingham（西部黑头蚜虫）；A.variana Fernald（东部黑头蚜虫）；Adoxophyes orana Fischer von （夏季果实卷叶蛾）；黄卷蛾属(Archips spp.)包括A.argyrospila Walker（果树卷叶虫）和A.rosana Linnaeus（欧洲卷叶虫）；条卷蛾属(Argyrotaenia spp.)；Bonagota salubricola Meyrick（巴西苹果卷叶虫）；色卷蛾属(Choristoneura spp.)；Cochylis hospes Walsingham（向日葵带蛾）；Cydia latiferreana Walsingham（榛树虫）；C.pomonella Linnaeus（苹果蠹蛾）；Endopiza viteanaClemens（葡萄浆果蛾）；Eupoecilia ambiguella Hübner（葡萄树蛾）；Grapholita molesta Busck（东方果实蛾）；Lobesia botrana Denis & Schiffermüller(European grape vine moth)；Platynota flavedana Clemens（杂色卷叶蛾）；P.stultana Walsingham（杂食卷叶虫）；Spilonota ocellana Denis&Schiffermüller(eyespotted bud moth)；和Suleima helianthana Riley（向日葵蚜蛾）。
鳞翅目中选择的其他农艺学害虫包括但不限于Alsophila pometaria Harris（秋尺蠖）；Anarsia lineatella Zeller（桃树枝钻心虫）；Anisota senatoria J.E.Smit（橙色条纹橡树虫）；Antheraea pernyi Guérin‑Méneville（中国橡树丝蛾）；Bombyx mori Linnaeus（蚕）；Bucculatrix thurberiella Busck（棉叶潜蛾）；Colias eurytheme Boisduval（苜蓿毛虫）；Datana integerrima Grote&Robinson)(walnut caterpillar)；Dendrolimus sibiricus Tschetwerikov（西伯利亚丝蛾），Ennomos subsignaria Hübner（榆树尺蠖）；Erannis tiliaria Harris（椴树尺蠖）；Erechthias flavistriata Walsingham（甘蔗蚜蛾）；Euproctis chrysorrhoea Linnaeus（褐尾蛾）；Harrisina americana Guérin‑Méneville（葡萄叶雕叶虫）；Heliothis subflexa Guenée；Hemileuca oliviae Cockrell（牧场毛虫）；Hyphantria cunea Drury（秋天网虫）；Keiferia lycopersicella Walsingham（番茄蛲虫）；Lambdina fiscellaria fiscellaria Hulst（东部铁杉尺蠖）；L.fiscellaria lugubrosa Hulst（西部铁杉尺蠖）；Leucoma salicis Linnaeus（缎蛾）；Lymantria dispar Linnaeus（舞毒蛾）；天幕毛虫属(Malacosoma spp.)；Manduca quinquemaculata Haworth（五斑天蛾，番茄天蛾幼虫）；M.sexta Haworth（番茄天蛾幼虫，烟草天蛾幼虫）；Operophtera brumata Linnaeus（冬蛾）；古毒蛾属(Orgyia spp.)；Paleacrita vernata Peck（春尺蠖）；Papilio cresphontes Cramer（巨燕尾蝶，橙狗(orange dog)）；Phryganidia californica Packard（加州橡树虫）；Phyllocnistis citrella Stainton（柑橘潜叶虫）；Phyllonorycter blancardella Fabricius（斑点幕形潜叶虫）；Pieris brassicae Linnaeus（大白蝴蝶）；P.rapae Linnaeus（小白蝴蝶）；P.napi Linnaeus（绿脉纹白蝴蝶）；Platyptilia carduidactyla Riley（朝鲜蓟羽蛾）；Plutella xylostella Linnaeus（菱纹背蛾）；Pectinophora gossypiella Saunders（粉色螟蛉）；Pontia protodice Boisduval&Leconte)(Southern cabbageworm)；Sabulodes aegrotata Guenée（杂食尺蠖）；Schizura concinna J.E.Smith（红驼背毛虫）；Sitotroga cerealella Olivier（安古木瓦谷蛾）；Thaumetopoea pityocampa Schiffermuller（松树列队毛虫）；Tineola bisselliella Hummel（结网衣蛾）；Tuta absoluta Meyrick（番茄潜叶虫）和Yponomeuta padella Linnaeus（巢蛾）。
值得关注的是鞘翅目的幼虫和成体，其包括来自长角象科(Anthribidae)、豆象科(Bruchidae)和象甲科(Curculionidae)的象鼻虫，包括但不限于：Anthonomus grandis Boheman（棉籽象鼻虫）；Cylindrocopturus adspersus LeConte（向日葵茎象鼻虫）；Diaprepes abbreviatus Linnaeus（蔗根象鼻虫）；Hypera punctata Fabricius（三叶草叶象）；Lissorhoptrus oryzophilus Kuschel（稻水象鼻虫）；Metamasius hemipterus hemipterus Linnaeus（西印度蔗象鼻虫）；M.hemipterus sericeus Olivier（丝蔗象鼻虫）；Sitophilus granarius Linnaeus（谷象鼻虫）；S.oryzae Linnaeus（米象鼻虫）；Smicronyx fulvus LeConte（红向日葵籽象鼻虫）；S.sordidus LeConte（灰向日葵籽象鼻虫）；Sphenophorus maidis Chittenden（玉蜀黍喙甲）；Rhabdoscelus obscurus Boisduval（新几内亚甘蔗象鼻虫）；叶甲科(Chrysomelidae)的跳甲、黄瓜叶甲、根虫、叶甲、马铃薯叶甲以及潜叶虫，包括但不限于：Chaetocnema ectypa Horn（沙漠玉米跳甲）；C.pulicaria Melsheimer（玉米跳甲）；Colaspis brunnea Fabricius（葡萄肖叶甲）；Diabrotica barberi Smith&Lawrence（北方玉米根虫）；D.undecimpunctata howardi Barber（南方玉米根虫）；D.virgifera virgifera LeConte（西方玉米根虫）；Leptinotarsa decemlineata Say（科罗拉多马铃薯甲虫）；Oulema melanopus Linnaeus（谷物叶甲虫）；Phyllotreta cruciferae Goeze（玉米跳甲）；Zygogramma exclamationis Fabricius（向日葵甲虫）；来自瓢甲科(Coccinellidae)的甲虫，包括但不限于：Epilachna varivestis Mulsant（墨西哥豆甲虫）；来自金龟科(Scarabaeidae)的金龟子和其他甲虫，包括但不限于：Antitrogus parvulus Britton（Childers蔗蚧螬）；Cyclocephala borealis Arrow（北方隐金龟子，白蚧螬）；C.immaculata Olivier（南方隐金龟子，白蚧螬）；Dermolepida albohirtum Waterhouse（灰背蔗甲虫）；Euetheola humilis rugiceps LeConte（甘蔗甲虫）；Lepidiota frenchi Blackburn（法国蔗蚧螬）；Tomarus gibbosus De Geer（胡萝卜甲虫）；T.subtropicus Blatchley（甘蔗蚧螬）；Phyllophaga crinita Burmeister（白蛴螬）；P.latifrons LeConte（六月甲虫）；Popillia japonica Newman（日本甲虫）；Rhizotrogus majalis Razoumowsky（欧洲金龟子）；来自皮蠹科(Dermestidae)的地毯圆皮蠹(carpet beetle)；来自以下各科属的线虫：伪金针虫属(Eleodes spp.)，纹叩甲属(Melanotus spp.)，包括M.communis Gyllenhal（线虫）；宽胸叩头虫属(Conoderus spp.)；丘胸叩甲属(Limonius spp.)；细胸叩甲属(Agriotes spp.)；Ctenicera spp.；Aeolus spp.；来自小蠹科(Scolytidae)的小蠹(bark beetle)；来自拟步甲科(Tenebrionidae)的甲虫；来自天牛科(Cerambycidae)科的甲虫，例如但不限于Migdolus fryanus Westwood（长角甲虫）；和来自吉丁虫科(Buprestidae)的甲虫，包括但不限于Aphanisticus cochinchinae seminulum Obenberger（潜叶吉丁虫）。
双翅目(Diptera)的成体和未成熟体是值得关注的，包括潜叶虫Agromyza parvicornis Loew（玉米斑潜叶虫）；摇蚊，包括但不限于：Contarinia sorghicola Coquillett（高粱摇蚊）；Mayetiola destructor Say（黑森蝇）；Neolasioptera murtfeldtiana Felt（向日葵籽摇蚊）；Sitodiplosis mosellana Géhin（小麦摇蚊）；果实蝇（实蝇科(Tephritidae)）、Oscinella frit Linnaeus（麦秆蝇）；蛆，包括但不限于：地种蝇属(Delia spp.)，包括Delia platura Meigen（玉米种蛆）；D.coarctata Fallen（麦种蝇）；Fannia canicularis Linnaeus,F.femoralis Stein（小家厕蝇）；Meromyza americana Fitch（麦秆蛆）；Musca domestica Linnaeus（家蝇类）；Stomoxys calcitrans Linnaeus（厩蝇类）；面蝇、角蝇、丽蝇、金蝇属(Chrysomya spp.)；伏蝇属(Phormia spp.)；和其他蝇类(muscoid fly)害虫、马蝇类虻属(Tabanus spp.)；肤蝇类胃蝇属(Gastrophilus spp.)；狂蝇属(Oestrus spp.)；牛蝇类皮蝇属(Hypoderma spp.)；鹿蝇类(Chrysops spp.)；Melophagus ovinus Linnaeus（虱蝇类）；和其他短角亚目(Brachycera)、蚊类伊蚊属(Aedes spp.)；按蚊属(Anopheles spp.)；库蚊属(Culex spp.)；黑蝇类原蚋属(Prosimulium spp.)；蚋属(Simulium spp.)；蠓、沙蝇、尖眼蕈蚊和其他长角亚目(Nematocera)。
作为目的昆虫，包括半翅目的那些昆虫，例如但不限于以下科：球蚜科(Adelgidae)、粉虱科(Aleyrodidae)、蚜科(Aphididae)、链蚧科(Asterolecaniidae)、沫蝉科(Cercopidae)、叶蝉科(Cicadellidae)、蝉科(Cicadidae)、菱飞虱科(Cixiidae)、软介壳虫科(Coccidae)、缘蝽科(Coreidae)、胭蚧科(Dactylopiidae)、飞虱科(Delphacidae)、盾蚧科(Diaspididae)、毡蚧科(Eriococcidae)、蛾蜡蝉科(Flatidae)、蜡蝉科(Fulgoridae)、圆飞虱科(Issidae)、长蝽科(Lygaeidae)、硕蚧科(Margarodidae)、角蝉科(Membracidae)、盲蝽科(Miridae)、旌介壳虫科(Ortheziidae)、蝽科(Pentatomidae)、刺葵介壳虫科(Phoenicococcidae)、根瘤蚜科(Phylloxeridae)、粉蚧科(Pseudococcidae)、木虱科(Psyllidae)、红蝽科(Pyrrhocoridae)和网蝽科(Tingidae)。
来自半翅目的农艺学上重要的成员包括但不限于：Acrosternum hilare Say（绿蝽象）；Acyrthisiphon pisum Harris（豌豆蚜虫）；球蚜属(Adelges spp.)物种（球蚜类）；Adelphocoris rapidus Say（苜蓿褐盲蝽(rapid plant bug)）；Anasa tristis De Geer（南瓜虫）；Aphis craccivora Koch（豇豆蚜虫）；A.fabae Scopoli（黑豆蚜虫）；A.gossypii Glover（棉花蚜虫，甜瓜蚜虫）；A.maidiradicis Forbes（玉米根蚜虫）；A.pomi De Geer（苹果蚜虫）；A.spiraecola Patch（绣线菊蚜虫）；Aulacaspis tegalensis Zehntner（甘蔗介壳虫）；Aulacorthum solani Kaltenbach（毛地黄蚜虫）；Bemisia tabaci Gennadius（烟草粉虱，甘薯粉虱）；B.argentifolii Bellows&Perring)(silverleaf whitefly)；Blissus leucopterus leucopterus Say（麦长蝽）；负子蝽科(Blostomatidae)物种；Brevicoryne brassicae Linnaeus（卷心菜蚜虫）；
Cacopsylla pyricola Foerster（梨木虱）；Calocoris norvegicus Gmeli（马铃薯盲蝽）；Chaetosiphon fragaefolii Cockerell（草莓蚜虫）；臭虫科(Cimicidae spp.)；缘蝽科(Coreidae)物种；Corythuca gossypii Fabriciu（棉花网蝽）；Cyrtopeltis modesta Distant（蝽）；C.notatus Distant（吸蝇(suckfly)）；Deois flavopicta （吹沫虫）；Dialeurodes citri Ashmead（柑橘粉虱）；Diaphnocoris chlorionis Say（皂荚树蝽）；Diuraphis noxia Kurdjumov/Mordvilko（俄罗斯小麦蚜虫）；Duplachionaspis divergens Green（盾介壳虫）；Dysaphis plantaginea Paaserini（红苹果蚜虫）；Dysdercus suturellus （棉蝽）；Dysmicoccus boninsis Kuwana（灰甘蔗粉蚧）；Empoasca fabae Harris（马铃薯叶蝉）；Eriosoma lanigerum Hausmann（苹绵蚜）；葡萄斑叶蝉属(Erythroneoura spp.)（葡萄斑叶蝉）；Eumetopina flavipes Muir（岛屿甘蔗飞虱）；扁盾蝽属(Eurygaster)物种；Euschistus servus Say（褐椿象）；E.variolarius Palisot de Beauvois（一斑蝽象）；长蝽属(Graptostethus)物种（长蝽系群(complex of seed bugs)）；和Hyalopterus pruni Geoffroy（桃大尾蚜）；Icerya purchasi Maskell（吹绵蚧）；Labopidicola allii Knight（洋葱蝽）；Laodelphax striatellus Fallen（灰飞虱）；Leptoglossus corculus Say（松叶根蝽）；Leptodictya tabida Herrich‑Schaeffer（甘蔗网蝽）；Lipaphis erysimi Kaltenbach（芜箐蚜虫）；Lygocoris pabulinus Linnaeus（通绿盲蝽）；Lygus lineolaris Palisot de Beauvois（牧草盲蝽）；L.Hesperus Knight（西部牧草盲蝽）；L.pratensis Linnaeus（普通牧场蝽）；L.rugulipennis Poppius（欧洲牧草盲蝽）；Macrosiphum euphorbiae Thomas（马铃薯蚜虫）；Macrosteles quadrilineatus Forbes（翠菊叶蝉）；Magicicada septendecim Linnaeus（周期蝉）；Mahanarva fimbriolata（甘蔗吹沫虫）；Melanaphis sacchari Zehntner（甘蔗蚜虫）；Melanaspis glomerataGreen（黑介壳虫）；Metopolophium dirhodum Walker（玫瑰粮食蚜虫）；Myzus persicae Sulzer（桃‑马铃薯蚜虫，绿桃蚜虫）；Nasonovia ribisnigri Mosley（莴苣蚜虫）；Nephotettix cinticeps Uhler（绿叶蝉）；N.nigropictus（水稻叶蝉）；Nezara viridula Linnaeus（南方绿蝽象）；Nilaparvata lugens（褐飞虱）；Nysius ericae Schilling（假臭虫）；Nysius raphanus Howard（假臭虫）；Oebalus pugnax Fabricius（稻蝽象）；Oncopeltus fasciatus Dallas（大马利筋蝽）；Orthops campestris Linnaeus；瘿绵蚜属(Pemphigus spp.)（根蚜和瘿蚜）；Peregrinus maidis Ashmead（玉米飞虱）；Perkinsiella saccharicida Kirkaldy（甘蔗飞虱）；Phylloxera devastatrix Pergande（美洲山核桃葡萄根瘤蚜）；Planococcus citri Risso（柑橘粉蚧）；Plesiocoris rugicollis Fallen（苹果盲蝽）；Poecilocapsus lineatus Fabricius（四线盲蝽）；Pseudatomoscelis seriatus Reuter（棉盲蝽）；粉蚧属(Pseudococcus spp.)（其他的粉蚧系群）；Pulvinaria elongata Newstead（羊胡子草介壳虫）；Pyrilla perpusilla Walker（甘蔗叶蝉）；红蝽属(Pyrrhocoridae spp.)；Quadraspidiotus perniciosus Comstock（梨园蚧）；锥蝽属(Reduviidae spp.）；Rhopalosiphum maidis Fitch（玉米叶蚜虫）；R.padi Linnaeus（禾谷缢管蚜）；Saccharicoccus sacchari Cockerell （粉色甘蔗粉蚧）；Schizaphis graminum Rondani（麦二叉蚜）；Sipha flava Forbes（黄色甘蔗蚜虫）；Sitobion avenae Fabricius（麦长管蚜）；Sogatella furcifera Horvath（白背飞虱）；Sogatodes oryzicola Muir（水稻飞虱）；Spanagonicus albofasciatus Reuter（白斑盲蝽）；Therioaphis maculata Buckton（斑点苜蓿蚜）；谷蛾科(Tinidae)物种；Toxoptera aurantii Boyer de Fonscolombe（黑色柑橘蚜虫）；和T.citricida Kirkaldy（褐色柑橘蚜虫）；Trialeurodes abutiloneus（纹翅粉虱）和T.vaporariorum Westwood （温室粉虱）；Trioza diospyri Ashmead（柿木虱）；和Typhlocyba pomaria McAtee（白色苹果叶蝉）。
另外，包括蜱螨目(Acari)（螨类）的成体和幼虫，如Aceria tosichella Keifer（小麦卷叶螨）Panonychus ulmi Koch（欧洲红螨）；Petrobia latens Müller（褐色小麦螨）；Steneotarsonemus bancrofti Michael（甘蔗茎蟎）；叶螨科(Tetranychidae)的蜘蛛螨和红螨、Oligonychus grypus Baker&Pritchard、O.indicus Hirst（甘蔗叶蟎）、O.pratensis Banks（班克斯草螨）、O.stickneyi McGregor（甘蔗蜘蛛螨）；Tetranychus urticae Koch（二斑蜘蛛螨）；T.mcdanieli McGregor（McDaniel螨）；T.cinnabarinus Boisduval（红蜘蛛螨）；T.turkestani Ugarov&Nikolski)（草莓蜘蛛螨）、细须螨科(Tenuipalpidae)的扁平螨类、Brevipalpus lewisi McGregor（柑橘扁平螨）；瘿螨科(Eriophyidae)中的锈螨和芽瘿螨以及其他食叶螨和对人类和动物健康重要的螨，即表皮螨科(Epidermoptidae)的尘螨、蠕形螨科(Demodicidae)的毛囊螨、食甜螨科(Glycyphagidae)的谷螨，硬蜱科(Ixodidae)的蜱类。Ixodes scapularis Say（鹿蜱）；I.holocyclus Neumann（澳洲寄生蜱）；Dermacentor variabilis Say（美洲犬蜱）；Amblyomma americanum Linnaeus（美洲钝眼蜱）；以及痒螨科(Psoroptidae)、蒲螨科(Pyemotidae)和疥螨科(Sarcoptidae)的痒螨和疥螨。
缨尾目(Thysanura)的昆虫害虫是值得关注的，如Lepisma saccharina Linnaeus（蠹虫）；Thermobia domestica Packard（小灶衣鱼）。
所涵盖的其他节肢害虫包括：蜘蛛目(Araneae)中的蜘蛛，如Loxosceles reclusa Gertsch&Mulaik(brown recluse spider)；和Latrodectus mactans Fabricius（黑寡妇蜘蛛）；和蚰蜓目(Scutigeromorpha)的多足类如Scutigera coleoptrata Linnaeus（蚰蜒）。此外，等翅目(Isoptera)的昆虫害虫是值得关注的，包括白蚁科(termitidae)的那些昆虫害虫，例如但不限于Cylindrotermes nordenskioeldi Holmgren和Pseudacanthotermes militaris Hagen（甘蔗白蚁）。缨翅目(Thysanoptera)的昆虫也是值得关注的，包括但不限于蓟马类，如Stenchaetothrips minutus van Deventer（甘蔗蓟马）。
可在昆虫害虫的早期发育阶段（例如作为幼虫或者其他发育未完全的形式）对昆虫害虫测试本发明实施例的组合物的杀虫活性。可将昆虫在完全黑暗中在约20℃至约30℃和约30%至约70%相对湿度下饲养。可如以下文献中所述进行生物测定：Czapla和Lang，(1990)，《经济昆虫学杂志》(J.Econ.Entomol.)，83(6):2480‑2485。饲养昆虫幼虫和进行生物测定的方法是本领域普通技术人员公知的。
有多种生物测定技术为本领域技术人员所知。一般程序包括将实验化合物或者生物体添加到密闭容器中的食物源。然后在取食和暴露适当的一段时间后，通过（但不限于）死亡率变化、体重减轻、吸引、排斥和其他行为和物理变化来测量杀虫活性。本文所述的生物测定可用于幼虫阶段或者成虫阶段的任何取食昆虫害虫。
以下实例以举例说明的方式给出，而非限制本发明。
实验
实例1：用于测试苏云金杆菌(B.thuringiensis)毒素对选定的昆虫的杀虫活性的生物测定
进行生物测定，以评估SEQ ID NO:2所示的Bt杀昆虫毒素肽对表1中所示的多种鳞翅目昆虫害虫的作用。在含有杀昆虫蛋白的人工食物上进行饲喂测定。用鳞翅目昆虫特异性人工食物局部施用杀昆虫蛋白。该毒素以0.3μg/25μL样品/孔的比率施用，并让其干燥。该蛋白质在pH10的10mM碳酸盐缓冲液中。每孔放入一只新生幼虫，随意饲喂取食5天。对于幼虫反应如发育迟缓和/或死亡，结果表示为阳性。如果幼虫与饲喂只加入上述缓冲液的食物的阴性对照相似，则结果表示为阴性。
表1：SEQ ID NO:2饲喂生物测定结果
受试昆虫结果欧洲玉米钻心虫(Ostrinia nubilalis)+
玉米穗虫(Helicoverpa zea)‑黑地蚕(Agrotis ipsilon)‑秋夜蛾(Spodoptera frugiperda)‑
实例2：粒子轰击转化玉蜀黍及转基因植物的再生
将来自温室供体植物的不成熟玉蜀黍胚用含有毒素核苷酸序列（例如SEQ ID NO:1）的DNA分子进行轰击，该毒素核苷酸序列有效连接到遍在蛋白启动子和赋予对双丙氨膦除草剂的抗性的选择性标记基因PAT（Wohlleben等人，(1988)，《基因》(Gene)，70:25‑37）。作为另一种选择，该选择性标志物基因在单独的DNA分子上提供。如下进行转化。培养基配方见下文。
靶标组织的制备
将穗去壳并在30%CLOROXTM漂白剂加0.5%Micro洗涤剂中进行表面灭菌20分钟，然后用无菌水漂洗两次。将未成熟胚切下，并以胚轴一侧朝下（盾片一侧朝上）放置，每板25个胚，在560Y培养基上放置4小时，然后在2.5cm靶区内排成一行准备进行轰击。
DNA的制备制备包含与遍在蛋白启动子有效连接的毒素核苷酸序列（例如SEQ ID NO:1）的质粒载体。例如，合适的转化载体包含来自玉米的UBI1启动子、来自UBI1的5'UTR、UBI1内含子以及PinII终止子。该载体另外含有由CAMV35S启动子驱动的PAT选择性标记基因并包括CAMV35S终止子。任选地，该选择性标记可存在于单独的载体上。采用CaCl2沉淀程序如下将包含毒素核苷酸序列及PAT选择性标记的DNA分子沉淀到1.1μm（平均直径）钨丸上。
100μL制备的钨粒子水溶液
10μL(1μg)DNA/Tris EDTA缓冲液（1μg总DNA）
100μL2.5M CaC12
10μL0.1M亚精胺
将每种试剂依序加到钨粒子悬浮液，同时保持在复式管涡旋机上。将最终的混合物进行短暂超声处理，让其在恒定漩涡混合下温育10分钟。在沉淀期后，将各管进行短暂离心，除去液体，用500ml100%乙醇洗涤，离心30秒。再次移除液体，将105μl 100%乙醇加至最终的钨粒子小球。对于粒子枪轰击，将钨/DNA粒子进行短暂超声处理，并取10μl点滴到每个巨载体(macrocarrier)的中央上，让其干燥约2分钟后进行轰击。
粒子枪处理
将样品板在粒子枪#HE34‑1或者#HE34‑2的#4位进行轰击。所有样品接受650PSI的单次射击，每管的制备粒子/DNA共取十个等分试样。
后续处理
在轰击之后，将胚保持在560Y培养基上2天，然后转移到含有3mg/L双丙氨膦的560R选择培养基，每隔2星期进行分培。在进行大约10个星期的选择后，将抗选择的愈伤组织克隆转移到288J培养基以引发植物再生。在体细胞胚成熟后（2‑4个星期），将发育良好的体细胞胚转移到培养基中进行发芽并转移到有光照的培养室。大约7‑10天后，将发育的小植株转移到管中的272V无激素培养基7‑10天，直到小植株完全长好。然后将植株转移到含有盆栽土的浅箱嵌块(inserts in flats)（相当于2.5英寸盆），在生长室中生长1个星期，随后在温室中另外生长1‑2个星期，然后转移到典型的600个盆（1.6加仑）并生长至成熟。通过本领域知道的测定法或者如上所述监测植株并对毒素表达进行评分。
轰击法和培养基
轰击培养基(560Y)包含4.0g/L N6基础盐(SIGMA C‑1416)、1.0mL/L Eriksson维生素混合物(1000x SIGMA‑1511)、0.5mg/L盐酸硫胺、120.0g/L蔗糖、1.0mg/L2,4‑D和2.88g/L L‑脯氨酸（用KOH调至pH5.8后用去离子水定容）；2.0g/L GelriteTM（在用去离子水定容后加入）；及8.5mg/L硝酸银（在将培养基灭菌并冷却到室温后加入）。选择培养基(560R)包含4.0g/LN6基础盐(SIGMA C‑1416)、1.0mL/L Eriksson维生素混合物(1000x SIGMA‑1511)、0.5mg/L盐酸硫胺、30.0g/L蔗糖和2.0mg/L2,4‑D（用KOH调至pH5.8后用去离子水定容）；3.0g/L GelriteTM（在用去离子水定容后加入）；及0.85mg/L硝酸银和3.0mg/L双丙氨膦（两者均在将培养基灭菌并冷却到室温后加入）。
植物再生培养基(288J)包含4.3g/L MS盐(GIBCO11117‑074)、5.0ml/LMS维生素原液（0.100g烟酸、0.02g/L盐酸硫胺、0.10g/L盐酸吡哆辛和0.40g/L甘氨酸，用精制去离子水定容）（Murashige和Skoog，(1962)，《植物生理学》(Physiol.Plant.)，15:473）、100mg/L肌醇、0.5mg/L玉米素、60g/L蔗糖和1.0mL/L0.1mM脱落酸（调至pH5.6后用精制去离子水定容）；3.0g/L GelriteTM（在用去离子水定容后加入）；及1.0mg/L吲哚乙酸和3.0mg/L双丙氨膦（在将培养基灭菌并冷却到60℃后加入）。
无激素培养基(272V)包含4.3g/L MS盐(GIBCO11117‑074)、5.0mL/LMS维生素母液（0.100g/L烟酸、0.02g/L盐酸硫胺素、0.10g/L盐酸吡哆辛和0.40g/L甘氨酸，用精制去离子水定容）、0.1g/L肌醇和40.0g/L蔗糖（在调至pH5.6后用精制去离子水定容）；及6g/L Bacto琼脂（在用精制去离子水定容后加入），灭菌并冷却至60℃。
实例3：农杆菌介导的玉蜀黍转化以及转基因植物的再生
为用毒素核苷酸序列（例如SEQ ID NO:1）进行农杆菌介导的玉蜀黍转化，可使用Zhao的方法（美国专利No.5,981,840和PCT专利公布WO98/32326；这两个专利的内容以引用方式并入本文）。简单而言，从玉蜀黍分离不成熟胚，并使胚与农杆菌悬浮液在该细菌能够将毒素核苷酸序列(SEQ ID NO:1)转移到至少一个不成熟胚的至少一个细胞的条件下进行接触（步骤1：感染步骤）。在这个步骤中，可将未成熟胚浸入农杆菌悬浮液中以引发接种。将胚与农杆菌共培养一段时间（步骤2：共培养步骤）。在该感染步骤之后，可将不成熟胚在固体培养基上进行培养。在这个共培养期之后，设想到任选的“静息”步骤。在这个静息步骤中，将胚在至少一种已知能抑制农杆菌生长的抗生素的存在下进行温育，不添加植物转化体的选择剂（步骤3：静息步骤）。可将未成熟胚在含有抗生素但无选择剂的固体培养基上培养，为了消除农杆菌以及为了受感染细胞的静息阶段。接着，将经接种的胚在含有选择剂的培养基上进行培养，回收生长出的转化愈伤组织（步骤4：选择步骤）。将未成熟胚在固体培养基上与选择剂一起进行培养，从而导致转化细胞的选择性生长。然后将愈伤组织再生为植株（步骤5：再生步骤），将在选择性培养基上生长的愈伤组织在固体培养基上进行培养以再生出植株。
实例4：大豆胚的转化
如下所述，用含有与pinII启动子有效连接的SEQ ID NO:1毒素核苷酸序列的质粒对大豆胚进行轰击。为了诱导体细胞胚，从适当的大豆栽培种的经表面灭菌的未成熟种子解剖出长3‑5mm的子叶，然后将其在适当的琼脂糖培养基上于26℃在光照或黑暗中培养六至十个星期。然后切取产生次级胚的体细胞胚并置于合适的液体培养基中。在反复选择作为早期球状阶段的胚繁殖的体细胞胚的簇之后，如下所述维持悬浮物。
大豆胚发生悬浮培养物可在旋转振荡器上在150rpm、26℃下维持在35ml液体培养基中，以荧光灯按16:8小时白日/黑夜时间表进行维持。每隔两周，通过将大约35mg的组织接种到35ml的液体培养基中，将培养物进行传代培养。
然后可通过粒子枪轰击方法（Klein等人，(1987)，《自然》（伦敦）(Nature(London))，327:70‑73；美国专利No.4,945,050）转化大豆胚发生悬浮培养物。可使用Du Pont Biolistic PDS1000/HE仪器（氦改型）进行这些转化。
可用于促进大豆转化的选择性标记基因是由以下组分组成的转基因：来自花椰菜花叶病毒的35S启动子（Odell等人，(1985)，《自然》(Nature)，313:810‑812）、来自质粒pJR225的潮霉素磷酸转移酶基因（来自大肠杆菌；Gritz等人，(1983)，《基因》(Gene)，25:179‑188）和来自根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的Ti质粒的T‑DNA的胭脂氨酸合酶基因3'区。包含与pinII启动子有效连接的毒素核苷酸序列（例如SEQ ID NO:1）的表达盒可作为限制性片段分离。然后可将这个片段插入携带标志物基因的载体的独特限制性酶切位点中。
向50μL的60mg/ml1μm金粒子悬浮液加入（按顺序）：5μl DNA(1μg/μl)、20μl亚精胺(0.1M)和50μl CaCl2(2.5M)。然后将粒子制备物搅动三分钟，在微量离心机中离心10秒，移除上清液。然后将DNA包被的粒子在400μl70%乙醇中洗涤一次并再悬浮于40μl无水乙醇中。可将DNA/粒子悬浮液超声处理三次，每次1秒。然后将五微升DNA包被的金粒子加载至每个巨载体盘上。
将大约300‑400mg的两周龄悬浮培养物置于空的60×15mm培养皿中，用移液管从组织移除残余液体。对于每次转化实验，通常轰击大约5‑10个组织平板。将膜破裂压力设定为1100psi，将室抽至28英寸汞柱的真空。将组织距离阻滞屏(retaining screen)大约3.5英寸放置，轰击三次。轰击后，可将组织一分为二并放回进液体中，如上所述进行培养。
轰击后五至七天，可将液体培养基用新鲜培养基更换，轰击后十二天用含有50mg/ml潮霉素的新鲜培养基更换。可每周更新这个选择培养基。轰击后七至八周，可观察到绿色的转化组织从未转化的坏死的胚发生簇长出来。移出分离的绿色组织并接种进单独的烧瓶中以产生新的、克隆繁殖的、转化的胚发生悬浮培养物。可将每一新品系当作独立的转化事件。然后可将这些悬浮物传代培养，并作为未成熟胚簇维持或者通过使各单独体细胞胚成熟和发芽而再生成完整植株。
本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请指示了本发明所属领域的技术人员的水平。所有出版物、专利和专利申请均以引用方式并入本文，所引用的程度就如同每个单独的出版物、专利或者专利申请被具体地和独立地指出以引用方式并入本文一样。
虽然为了清楚地理解起见已经通过举例说明和实例较详细地描述了本发明，但显然可以在权利要求书范围内实施一些改变和修饰。