含在植物纤维或微生物不溶组分中的草酸降解酶的制备方法及用途.pdf

本发明公开了一类含在植物纤维或微生物不溶组分中的草酸降解酶的制备方法及具有该特征的草酸降解酶在制备低/无草酸盐饮料，食品和饲料；或制成食品添加剂或药物达到预防或治疗尿草酸过多及与尿草酸盐过多相关的病症中的用途。本发明制备的草酸降解酶因含在植物纤维或微生物不溶组分中，受到植物纤维或微生物不溶组分的保护而不被胃肠中蛋白酶降解；并且因其含在植物纤维或微生物不溶组分之中，制备工艺简单，成本低。由于来自植物或微生物，尤其是食用植物或微生物，无毒副作用，利于长期服用。

1.  含在植物纤维或微生物不溶组分中的草酸降解酶的用途：原料或制品中含有该特征的酶被用于降低饮用品、食品及饲料中的草酸盐或用于口服从而降解胃肠中食入物品中的草酸盐以及渗入胃肠中的由生理代谢产生的草酸盐，因而起到预防或治疗尿草酸盐过多和与尿草酸盐过多相关的人或动物的病症。

2.  如权利要求1中所述的用途，所述的植物纤维或微生物不溶组分中含有的草酸降解酶是草酸氧化酶，或草酸脱羧酶，或草酰辅酶A脱羧酶与甲酰辅酶A转移酶的组合，或为以上三种中的任意两种或两种以上的组合；这些酶为所采用植物或微生物具备的天然基因的表达产物或为通过转基因处理而获得的基因的表达产物。

3.  如权利要求1中所述的用途，所述的植物纤维或微生物不溶组分中含有的草酸降解酶，是指在破碎植物组织或微生物细胞后，分布于不溶的植物破碎组织中或不溶的破碎微生物细胞组分中的草酸降解酶。该不溶的植物破碎组织含大量纤维成分。该不溶的破碎微生物细胞组分主要来自细胞壁。草酸降解酶可能被包裹在植物或微生物不溶的破碎组分中或附在其上，受不溶组分保护而降低蛋白酶对其破坏作用。草酸降解酶因分布于植物或微生物不溶组分中，易于制备；在用于降低饮用品、食品及饲料中的草酸盐时，易于从加工品中分开。

4.  如权利要求1中所述的用途，所述的植物纤维或微生物不溶组分中含有的草酸降解酶活力应高于每克干重0.5单位。

5.  如权利要求1中所述的用途，所述的植物纤维或微生物不溶组分中的草酸降解酶的制品的形状为粉末或具有一定长度的纤维，具体视原料的来源和用途而定。

6.  如权利要求1中所述的用途，所述的植物纤维中的草酸降解酶制备方法具有以下的部分或全部特征：
a.植物的种植培养为有土种植或无土培养。
b.植物的各部位，如根，茎，叶，花，果，均可为原料，选材视草酸降解酶的含量与用途而定。
c.草酸降解酶的含量可通过适当的方法诱导而提高。提高酶含量的方法有：物理损伤，化学处理，植物激素诱导及微生物感染等。
d.制备过程对植物原料需进行破碎处理，并采用不溶的破碎组织加工成产品。
e.原材料为各种含有草酸降解酶基因的植物，该基因为天然具备的或转基因而获得的。

7.  如权利要求1中所述的用途，所述的微生物不溶组分中的草酸降解酶制备方法具有以下的部分或全部特征：
a.微生物的培养为发酵或菌类栽培。
b.草酸降解酶的含量可通过适当的方法诱导提高。提高酶含量的方法：光、热、化学诱导等。
c.制备过程对微生物原料需进行破碎处理，并采用不溶的破碎组分加工成产品。
d.原材料为各种含有草酸降解酶基因的微生物，该基因为天然具备的或由基因克隆而获得的。

含在植物纤维或微生物不溶组分中的草酸降解酶的制备方法及用途
技术领域
本发明涉及降解人或动物饮食制品中的，或食入胃肠中的，以及渗入胃肠中的生理代谢产生的草酸盐，以减少人或动物从饮食制品中吸收草酸盐以及降解生理代谢产生的草酸盐，因而起到预防或治疗尿草酸盐过多和与尿草酸盐过多相关的人或动物的病症。该发明产品有两种基本应用途径：一、使用本发明的草酸降解酶在饮食品加工过程中降低或完全除去饲料、饮料及食品中的草酸盐；二、直接口服以该草酸降解酶为组分的制品以降解食入胃肠中的以及渗入胃肠中的由生理代谢产生的草酸盐。
发明背景
人体内的草酸盐主要来源于从饮食中吸收和生理代谢产生这两种途径。正常人生理代谢产生的草酸盐量的多少变化范围不大。因生理代谢产生过量草酸盐的人数量极少，是由缺少有关代谢的酶造成。从饮食中吸收的草酸盐的量因人而异，可占总量的10-70％。草酸钙结石病人从饮食中吸收的草酸盐比正常人平均多50％。(R.Holmes等，Urol.Res.，32：311-316，2004)。体内的草酸盐主要由肾脏过滤、浓缩、经过尿液排出体外。尿液中草酸盐排除量是衡量由于尿草酸盐过量产生的各种病症的一个重要指标。
体内草酸盐过多与多种病症有关。如：肾草酸钙结石，尿道及膀胱结石，肾功能衰退，妇女的阴道触发性痛(vulvodyna)，儿童的孤僻症(Autism)，以及因草酸盐过多导致的关节炎等。仅结石一项，每年给全球数以千万的人带来痛苦以及导致上百亿美元的经济损失。据美国的国家卫生研究院的统计资料(M.Litwin等，Urologic Disease in America，NIHpublication 07-5512：3-7，2007)，仅2000年，结石给美国带来的经济损失为21亿美元。
目前还没有一种简单有效的办法来降低这些尿草酸盐过多的病人从食品中吸收草酸盐。仅为收集信息的目的，这里介绍这些正在进行早期研究中的各种可能方法：
1.将草酸氧化酶(PCT/US2006/023115)或草酸脱羧酶(美国专利申请US11/833082)制成蛋白晶体再用戊二醛交联提高其稳定性，然后将这些晶体制成口服药剂用于降解胃肠中的草酸盐；
2.口服稀土金属盐从胃肠中吸收草酸盐(CN100438866C)；
3.口服微生物如多种芽孢杆菌和双歧杆菌的混合物制品。
为了预防从饮食中吸收草酸盐，病人需要每餐服用药品或食品添加剂，终生坚持。方法1，2长期服用可能有毒副作用。方法3中的微生物制剂临床效果不明显，因为这些微生物可以不用草酸盐而生存(D.Goldfarb等，CLIN.J.Am.Soc.Nephrol.，2：745-749，2007)。
对于这些尿草酸盐吸收过多的人群，医生往往建议食用低草酸盐食物。但是可供选择的低草酸盐饮食材料有限，而且草酸盐在这些食物中的含量受植物生长环境、气候、季节、产地等诸多因素的影响而增加这些人群选择食品难度与可靠性。而且，既使能够坚持食用这些低草酸盐食品，每餐也会大约摄入20-50毫克草酸盐。另外，这些人群可能会因为可选择的食品有限而导致营养不良。因而，这不是解决问题的安全有效的办法。市场上极为需要一种安全，价廉，可靠的方法来降低食品中或体内的草酸盐以达到预防和治疗作用，本发明因此而产生。通过使用本发明而生产的制品，不仅可以降低胃肠从食入品中吸收草酸盐，还可能因降低了胃肠中草酸盐浓度而促使人体代谢产生的草酸盐通过主动运输，被动运输等生理过程渗入胃肠。渗入胃肠的草酸盐得到草酸降解酶降解而进一步降低血液中的尿草酸盐含量，进而降低尿草酸盐含量。
发明概述
一、草酸降解酶
目前已发现的草酸降解酶有草酸氧化酶(EC1.2.3.4)，草酸脱羧酶(EC4.1.1.2)及草酰辅酶A脱羧酶(EC4.1.1.8)。草酰辅酶A脱羧酶需甲酰辅酶A转移酶(EC2.8.3.16)先将草酸盐与辅酶A合成草酰辅酶A后而进行降解。有关这些酶的结构，反应机理及其在自然中的分布已有详细叙述(D.Svedruzic等，Arch.Biochem.Biophys.，433，176-192，2005)。
草酸氧化酶催化的反应是：
HOOC-COOH+O₂→2CO₂+H₂O₂
草酸脱羧酶催化的反应为：
HOOC-COOH→CO₂+HCOOH
草酰辅酶A脱羧酶及甲酰辅酶A转移酶催化的反应是：
甲酰辅酶A转移酶：
HCO-C₀A+HOOC-COOH→HCOOH+HOOCCOC₀A
草酰辅酶A脱羧酶：
HOOCOC₀A→HCOC₀A+CO₂
草酸氧化酶存在于许多种植物与微生物中，如各种谷物的幼根及受损伤的叶子，香蕉皮，九重葛，苔藓，甜菜，食用菌等。在破碎植物或微生物并离心后，植物或微生物中的草酸氧化酶有的溶解在上清液中，有的却分布在不溶的破碎组分中。植物不溶的破碎组分主要为纤维。微生物不溶的破碎组分主要为细胞壁成分。同种植物或微生物中已发现有二种或二种以上同工酶。一些不表达草酸氧化酶的植物，通过转基因处理而获得该酶基因并成功地进行表达(X.Hu等，Plant Physiol.133：170-181，2003)。一些不表达草酸氧化酶的微生物，通过基因克隆处理而获得该酶基因并进行表达(D.Svedruzic等，Arch.Biochem.Biophys.，433，176-192，2005)。
草酸脱羧酶存在于多种真核与原核微生物中。真菌的草酸脱羧酶基因被转移到植物，如烟草中，并已成功地在烟草中表达了草酸脱羧酶(M.Kesarwani et al.，J.Biol.Chem.275：7230-7238，2000)。与草酸氧化酶相同，植物或微生物中的草酸脱羧酶有的溶解在上清液中，有的却分布在植物纤维或不溶的微生物破碎组分中。
草酰辅酶A脱羧酶及甲酰辅酶A转移酶的组合发现主要存于微生物中，如：Pseudomonasoxalaticus与Oxabacter formigenes等(D.Svedruzic等，Arch.Biochem.Biophys.，433，176-192，2005)。
二、植物与微生物原材料
原则上讲，任何植物与微生物的全部或特定部位，如果其不溶组分(植物纤维或不溶的微生物破碎组分)中含有大量的草酸降解酶，均是可选原材料。但是，无毒、可食及容易生产与加工都是选择因素。培养方法因原材料而异，选择培养方式取决于生产成本与生产条件。植物的培养种植方法可以是有土种植或无土培养；微生物的培养可选发酵或栽培。草酸降解酶的产量取决于植物的生长条件与时间和微生物的发酵或栽培条件及时间。在不溶组分中草酸降解酶含量最高的期间收获。以无土，自来水，温度在20℃左右培养春小麦苗为原料制备的草酸氧化酶为例：从麦粒发芽之日起草酸氧化酶即开始表达，但是随着麦芽长大成麦苗，麦苗长大成小麦株，草酸氧化酶总含量也在提高。大约在发芽起第10-14天，酶含量与产量均达到最大值。这时，麦粒种子中的储备养分也基本耗尽，可以收获麦苗来制备草酸氧化酶。草酸氧化酶分布于整个植株，但根中含量最高。根和整个麦苗皆可作为原料，但以根为原料制成的中草酸氧化酶含量每克干重最高。
草酸氧化酶含量可以进一步被诱导提高。如果在麦苗发芽第8-10天时，对麦苗进行机械损伤或微生物感染处理，3-4后天收获，草酸氧化酶产量可提高20-300％。如果在麦苗发芽第8-10天时对其进行化学处理，如将根浸泡在一定浓度的草酸盐、铝盐或其他化合物溶液中1-3天，或向麦苗喷洒这些化合物溶液，也可以提高草酸氧化酶产量10-240％。
微生物的草酸降解酶的产量受发酵或栽培条件影响。可以改变发酵或栽培条件或进行物理或化学诱导提高草酸降解酶产量。
三、植物纤维或微生物不溶组分中草酸降解酶的制备
这里以无土培养的春小麦苗为例。以其他植物为原材料的制备方法相似。取在20℃左右、自来水培养到第10-14天的麦苗去掉老的种子空壳，洗净，榨干以取纤维部分，冲洗纤维，切割成0.1-0.5厘米长，用巴氏消毒(对于热不稳定的酶，可用其它方法消毒)，干燥，分装即成。如制成粉末，在切成0.1-0.5厘米长以后进行粉碎处理并在干燥后过筛获取一定大小的粉末。
从微生物不溶组分制备草酸降解酶的方法与以植物为原料的制备方法除培养方法不同外，其他部分相似。微生物的栽培或发酵方法根据原材料的不同而定，可选用现有的或经改进的方法。将微生物原料如食用菌收获后，洗净，切片，用巴氏法消毒(对于热不稳定的酶，可用其它方法消毒)，然后干燥，粉碎，过筛获取一定大小的粉末，分装即成。
四、用途
几乎所有的以植物为原材料的食品，饮料，中药制剂以及饲料均含有草酸盐，其中绿叶蔬菜，巧克力，可可，花生及花生制品，黄豆及豆制品，茶叶及含茶饮料，咖啡，各种麦类谷物等中含量很高。在加工或制备这些制品时，可用草酸降解酶降低或完全除去草酸盐，以提供低草酸盐(甚至无草酸盐)的饮食品给需要的人群或动物群。
草酸降解酶也可制成食品添加剂或药品与食品一起食入，在胃肠中降解食入的饮食品中的草酸盐以降低草酸盐被胃肠吸收。另外，还可能因降低了胃肠中草酸盐浓度而促使人体代谢产生的草酸盐通过主动运输，被动运输等生理过程渗入胃肠。渗入胃肠的草酸盐可得到草酸降解酶降解而进一步降低血液中的尿草酸盐含量，进而降低尿草酸盐含量。
本发明制备的草酸降解酶受植物纤维或微生物不溶组分保护而不受胃肠蛋白酶破坏，且在酸性，中性及碱性环境下均能找到稳定并具有高活性的草酸降解酶，因而十分适合于制成口服制品在胃肠中降解草酸盐与用在各种低草酸盐(甚至无草酸盐)的饮食品的加工或制备。
实例
实施例1分析方法
草酸HPLC测定方法：采用文献报道的方法(C.Clausen^★等，InternationalBiodeterioration&Biodegradation 62：372-375，2008)。
草酸比色法测定：采用美国Trinity Biotech的试剂盒(St.Louis，Mo.)。
草酸氧化酶活力测定：将0.9ml 2mM草酸盐溶液(其中含50mM柠檬酸盐缓冲液，pH3.5，或50mM磷酸盐缓冲液，pH5.5)，在37℃预热10分种，然后加入0.1ml含草酸氧化酶的悬浮液以开始反应。反应30分钟后，迅速离心2分钟并取上清液，用HPLC测定残留草酸盐浓度。一个酶活力单位(U)为在此条件下，每分钟降解1个微摩尔草酸盐所需的酶量。
草酸脱羧酶活力测定，将0.8ml 10mM草酸盐溶液(其中含50mM柠檬酸盐缓冲液，pH3.5)，在37℃预热10分钟后，加入0.1ml含草酸脱羧酶的悬浮液开始反应。反应30分钟后，加入0.1ml 1N盐酸使酶失活。迅速离心并取上清液，用HPLC测定残留草酸盐浓度。一个酶活力单位(U)为在此条件下，每分钟降解1个微摩尔草酸盐所需的酶量。
实施例2在各种植物中的草酸氧化酶
草酸氧化酶存在于多种植物中。这里给出一些实例。将荞麦(buckwheat)、长粒麦(kamut)、裸麦(rye)、黑小麦(triticale)、大麦(barley)、冬小麦(winter wheat)、春小麦(springwheat)、燕麦(oat)、苋菜(amaranth)、小米(millet)、玉米(corn)、高粱(sorghum)等种子用水浸泡3-15小时后，包在温布中发芽24小时。然后将发芽的种子放在不锈钢网上，网下则为清洁自来水，水位保持在刚刚触网。
在室温下培养6-10天。收获这些全苗时，去掉老种子壳，洗净。另采用有土种植的甜菜茎(Beta vulgaris)与九重葛(Bougainvillea)的叶子，洗净作为原料。将收获
表1