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1、10申请公布号CN101993497A43申请公布日20110330CN101993497ACN101993497A21申请号200910194424522申请日20090821C07K19/00200601C12N15/63200601C12N15/81200601C12P21/02200601C07K1/22200601C07K1/16200601A61K38/17200601A61K47/48200601A61P37/02200601C12R1/8420060171申请人复旦大学地址200433上海市邯郸路220号72发明人于敏莫炜宋后燕喻三见74专利代理机构上海正旦专利代理有限公司31。
2、200代理人吴桂琴54发明名称人增殖诱导配体阻断剂及其制备方法和应用57摘要本发明属生物技术领域，具体涉及一种人增殖诱导配体阻断剂BCMAFC设计及其制备方法和应用。本发明基于蛋白质分子空间构象，根据BCMA和增殖诱导配体的作用结构域，通过计算机蛋白质分子模拟技术，以增殖诱导配体为靶蛋白，以BCMA为目标结构，经过优化得到与增殖诱导配体具有高亲和力的BCMAFC融合蛋白；毕赤酵母表达上述融合蛋白，所得融合蛋白具有增殖诱导配体结合能力，并能有效抑制增殖诱导配体诱导的RAJIB淋巴细胞瘤增殖。同时具备免疫原性低，制备过程简便、安全，产品得率、纯度、活性高等特性。可进一步制备治疗自身免疫性疾病的新药。
3、。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书6页附图2页CN101993500A1/1页21一种人增殖诱导配体阻断剂，其特征在于，其包括BCMAFC融合蛋白。2按权利要求1所述的人增殖诱导配体阻断剂，其特征在于，所述的BCMAFC融合蛋白具有SEQIDNO1所示的氨基酸序列。3一种表达系统，其特征在于，其包括真核表达系统和原核表达系统。4按权利要求3所述的表达系统，其特征在于，所述的表达系统是毕赤酵母。5权利要求1所述的人增殖诱导配体阻断剂的制备方法，其特征在于，通过计算机蛋白质分子模拟技术，以增殖诱导配体为靶蛋白，以BCMA为目标结构，经优化得到与增殖。
4、诱导配体具有高亲和力的BCMAFC融合蛋白，包括如下方法和步骤1计算机辅助设计增殖诱导配体阻断剂BCMAFC；2BCMA胞外段基因与IGG1FC段基因融合；3BCMAFC表达；4BCMAFC纯化；5BCMAFC活性测定。6按权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤1的计算机辅助设计增殖诱导配体阻断剂BCMAFC是蛋白质结构数据库PDB数据库下载ID1XU2和ID2DTQ，得到BCMA，增殖诱导配体和IGG1FC结构；使用BIOPOLYMER构建BCMAFC融合蛋白，BCMA胞外段与IGG1FC段之间用GLASER连接，通过能量优化，得到能量最小化的BCMAFC结构；使用SUPERIMPOSE。
5、与BCMA胞外段进行比对。7按权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤3的BCMAFC表达系毕赤酵母表达。8按权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤4的BCMAFC纯化通过下述步骤毕赤酵母上清，通过SEPHACYLS100凝胶过滤，收集洗脱峰，上样RPROTEINASEPHAROSEFF，离子交换柱用002MPBPH80洗脱杂蛋白，然后用01MGLYCINEHCLPH30缓冲液洗脱，收集洗脱峰；冷冻干燥RPROTEINA亲和层析洗脱峰收集液，冻干粉于低温保存待用。9一种治疗自身免疫性疾病的药物，其特征在于含有有效剂量的权利要求2所述的融合蛋白，以及可药用载体。权利要求书CN1019934。
6、97ACN101993500A1/6页3人增殖诱导配体阻断剂及其制备方法和应用技术领域0001本发明属生物技术领域，具体涉及一种人B淋巴细胞刺激因子和增殖诱导配体阻断剂BCMAFC及其制备方法和应用。背景技术0002系统性红斑狼疮SYSTEMICLUPUSERYTHEMATOSUS，SLE、类风湿性关节炎RHEUMATOIDARTHRITIS，RA和干燥综合征SJOGRENSYNDROME，SS是严重的自身免疫性疾病，严重危害人类健康和生命。至今，这类疾病尚无特效治疗药物；临床治疗中，一般采用糖皮质激素和免疫抑制剂对症治疗，但，治疗实践表明疗效差，副作用大。0003研究表明，该类疾病的发病机理。
7、主要是由于B淋巴细胞刺激因子BLYS与增殖诱导配体过度表达增殖诱导配体，通过与其受体结合，使自反应性B细胞发生凋亡逃避，自反应性B细胞增殖，产生大量的自身抗体，发生组织损害，抗原抗体复合物的积聚会导致狼疮性肾炎并发症。此外B淋巴细胞刺激因子BLYS与增殖诱导配体过度表达，刺激B淋巴细胞过度增殖、分化，参与免疫应答。因此，有关研究人员推测，阻断BLYS与其受体结合可能形成治疗SLE、RA和SS的特效创新性药物。0004随着计算机科学的迅猛发展，近年来计算机辅助药物设计成为研究与开发新药的崭新技术，它大大加快了新药设计的速度和效率。蛋白质结构的不断解析，PDB数据不断增长，为计算机辅助设计蛋白质药。
8、物成为可能。基于蛋白质空间结构的蛋白质药物研究倍受重视。0005毕赤酵母表达系统，具备真核表达系统和原核表达系统的优点，蛋白质可以正确折叠，AOX强效启动子，外源基因基因产物表达量高。酵母培养，转化，高密度发酵等操作简单。另外，毕赤酵母可以分泌性表达，便于产物纯化。甲醇作为诱导物，生产成本低，适于工业化生产。目前毕赤酵母表达系统已经广泛应用于蛋白质药物的表达。发明内容0006本发明的目的是提供一种人增殖诱导配体阻断剂，尤其涉及人B淋巴细胞刺激因子和增殖诱导配体阻断剂BCMAFC设计及其制备方法。0007本发明基于蛋白质分子空间构象，根据BCMA和增殖诱导配体的作用结构域，通过计算机蛋白质分子模。
9、拟技术，以增殖诱导配体为靶蛋白，以BCMA为目标结构，经过优化得到与增殖诱导配体具有高亲和力的BCMAFC融合蛋白；毕赤酵母表达上述融合蛋白，所得融合蛋白具有增殖诱导配体结合能力，并能有效抑制增殖诱导配体诱导的RAJIB淋巴细胞瘤增殖。本发明的人增殖诱导配体阻断剂同时具备免疫原性低，制备过程简便、安全，产品得率、纯度、活性高等特性。0008具体而言，本发明通过计算机模拟构建BCMAFC蛋白质三维结构模型，通过分子对接预测BCMAFC具备增殖诱导配体结合能力。构建PPIC9K酵母表达载体，电转化毕赤酵母后，通过营养缺陷和G418抗性两步筛选，获得高表达转化子，使用毕赤酵母表达BCMAFC说明书C。
10、N101993497ACN101993500A2/6页4融合蛋白，经过超滤浓缩，分子筛和RPROTEINA亲和层析，得到BCMAFC融合蛋白，具有序列1的结构，产率为10MG/L，经活性检测证实BCMAFC具备配体增殖诱导配体结合能力，同分子对接的结果一致。本发明所述的BCMAFC在体内作为欺骗受体可以抑制增殖诱导配体的生物活性，有望成为治疗自身免疫性疾病的特效药物。0009本发明的目的通过下述技术方案实现，其包括如下方法和步骤00101计算机辅助设计增殖诱导配体阻断剂BCMAFC0011蛋白质结构数据库PDB数据库下载ID1XU2和ID2DTQ，得到BCMA，增殖诱导配体和IGG1FC结构。。
11、使用BIOPOLYMER构建BCMAFC融合蛋白，BCMA胞外段与IGG1FC段之间使用GLASER连接，通过能量优化，得到能量最小化的BCMAFC结构，使用SUPERIMPOSE与BCMA胞外段进行比对。IGG1FC段的融合不干扰BCMA与配体增殖诱导配体结合。00122BCMA胞外段基因与IGG1FC段基因融合00133BCMAFC的毕赤酵母表达0014本发明所述的BCMAFC不限于特定的表达系统，包括真核表达系统与原核表达系统。00154BCMAFC的纯化0016毕赤酵母上清，通过SEPHACYLS100凝胶过滤，收集洗脱峰。凝胶过滤洗脱峰上样于RPROTEINASEPHAROSEFF经。
12、002MPBPH70缓冲液平衡，离子交换柱用002MPBPH80洗脱杂蛋白，然后用01MGLYCINEHCLPH30缓冲液洗脱，收集洗脱峰。冷冻干燥RPROTEINA亲和层析洗脱峰收集液，冻干粉于低温保存待用。00175BCMAFC活性测定。0018本发明的进一步目的是提供所述阻断剂在治疗自身免疫性疾病治疗应用。0019本发明经活性检测证实，所述的BCMAFC具备配体增殖诱导配体结合能力，同分子对接的结果一致。本发明所述的BCMAFC在体内作为欺骗受体可以抑制增殖诱导配体的生物活性，可进一步制备治疗自身免疫性疾病的特效药物。附图说明0020图1，是BCMAFC蛋白质结构。0021图2，是BCM。
13、AFC表达纯化图。0022图3，是BCMAFC活性测定。具体实施方式0023实施例10024BCMAFC蛋白质结构模型构建0025蛋白质结构数据库PDB数据库下载ID1XU2和ID2DTQ，得到BCMA，增殖诱导配体和IGG1FC结构。使用INSIGHTII软件BIOPOLYMER模块构建BCMAFC融合蛋白，BCMA胞外段与IGG1FC段之间使用GLASER连接，通过能量优化，得到能量最小化的BCMAFC结构，使用SUPERIMPOSE与BCMA胞外段进行比对。0026BCMA胞外段基因与IGG1FC段基因融合0027使用OVERLAPPCR进行BCMA胞外段与IGG1FC段融合。说明书CN。
14、101993497ACN101993500A3/6页50028BCMAF5ATAGAATTCTCAACCCGGAGACAGGECORI0029BCMAR5CGGTGGGCATGTGGATCCTTAATTCGTTCCTTTCAC0030IGG1FCF5GAAAGGAACGAATTAAGGATCCACATGCCCACCGTG0031IGG1FCR5ATAGTTTAGCGGCCGCTCAACCCGGAGACAGNOTI00321使用BCMAF和BCMAR扩增BCMA胞外段后胶回收。00332使用IGG1FCF和IGG1FCR扩增IGG1FC后胶回收。00343使用BCMAF和IGG1FCR引物以1，。
15、2扩增的BCMA和IGG1FC为模板扩增得到BCMAFC0035BCMAFC的表达0036将毕赤酵母购买自美国INVITREGIN公司诱导表达质粒PPIC9KBCMAFC转化GS115菌株GS115菌株，PPIC9K质粒购买自美国INVITREGIN公司，采用电穿孔法转化，02CM规格的电转化杯，电压1500V，场强7500V/CM，脉冲时间10MS，筛选HIS转化子。用G418筛选在GS115的AOX1基因位点发生多拷贝交换重组的转化克隆。划YPD平板备用并制备甘油菌保存。0037从上述YPD平板上挑取表达菌株接种于BMGY培养基中扩增培养约24小时后，测OD6000206，离心，收集菌体，。
16、换BMMY诱导培养基，用甲醇作为碳源诱导表达7296H。离心后收集上清。0038BCMAFC的纯化0039凝胶过滤层析0040SEPHACRYLS100层析柱10100CM用002MPH74PB缓冲液平衡。毕赤酵母表达上清上样于凝胶层析柱，002MPH74PB缓冲液洗脱，流速5ML/MIN。分部收集洗脱峰，15SDSPAGE鉴定目的蛋白分布，合并含目的蛋白收集液。0041RPROTEINA亲和层析0042RPROTEINASEPHAROSEFF层析柱15CM先后用10倍柱床体积002MPH70PB缓冲液平衡。样品1ML/MIN上样后002MPH70PB缓冲液平衡洗至基线，01MGLYCINEH。
17、CLPH30缓冲液洗脱，收集洗脱峰。SDSPAGE分析目的蛋白分布，并以BRADFORD法BIORAD测定蛋白浓度。纯化后的目的蛋白分装，冷冻抽干。0043BCMAFC生物活性的测定0044分别以GSTPULLDOWN、细胞增殖抑制实验测定。0045GSTPULLDOWN00461100LGSHBEADS载有GST增殖诱导配体融合蛋白，同前制备重悬。00472加入100L50NG/LBCMAFC约5G，4混匀过夜。50L空GSHBEADS，004850LGSHBEADS载有GST，分别加入50LBCMAFC作为对照。00493用100倍体积预冷PBS洗净上述BEADS。00504各取10L上述。
18、BEADS，电泳，BCMA抗体WESTERNBLOT检测。0051CCK8细胞增殖测定00521制备细胞悬液，血细胞计数板细胞计数。悬浮细胞密度为10000/ML。00532加入96孔板，每孔内加入增殖诱导配体终浓度为200NG/ML，同时加入BCMAFC浓度为200NG/ML，400NG/ML，600NG/ML，800NG/ML，1000NG/ML，等体积培养基作为对照，每一说明书CN101993497ACN101993500A4/6页6浓度做三个复孔，加入药物后37培养箱培养。00543培养24小时后加入10LCCK8。00554培养5小时。00565测定450NM吸光度。0057活性检测。
19、的结果表明，使用毕赤酵母表达的BCMAFC具有增殖诱导配体结合活性，并可以抑制增殖诱导配体诱导的RAJIB淋巴瘤细胞增殖，可进一步制备治疗自身免疫性疾病的药物。0058SEQUENCELISTING0059复旦大学0060人增殖诱导配体阻断剂BCMAFC设计及其制备方法和应用006111006250063PATENTINVERSION310064100652770066PRT0067人类006810069METLEUGLNMETALAGLYGLNCYSSERGLNASNGLUTYRPHEASPSER00701510150071LEULEUHISALACYSILEPROCYSGLNLEUARGC。
20、YSSERSERASNTHR00722025300073PROPROLEUTHRCYSGLNARGTYRCYSASNALASERVALTHRASNSER00743540450075VALLYSGLYTHRASNGLYSERTHRCYSPROPROCYSPROALAPROGLU00765055600077LEULEUGLYGLYPROSERVALPHELEUPHEPROPROLYSPROLYSASP0078657075800079THRLEUMETILESERARGTHRPROGLUVALTHRCYSVALVALVALASP00808590950081VALSERHISGLUASPPROGLUV。
21、ALLYSPHEASNTRPTYRVALASPGLY00821001051100083VALGLUVALHISASNALALYSTHRLYSPROARGGLUGLUGLNTYRASN00841151201250085SERTHRTYRARGVALVALSERVALLEUTHRVALLEUHISGLNASPTRP00861301351400087LEUASNGLYLYSGLUTYRLYSCYSLYSVALSERASNLYSALALEUPRO0088145150155160说明书CN101993497ACN101993500A5/6页70089ALAPROILEGLULYSTHRILESERLYS。
22、ALALYSGLYGLNPROARGGLU00901651701750091PROGLNVALTYRTHRLEUPROPROSERARGASPGLULEUTHRLYSASN00921801851900093GLNVALSERLEUTHRCYSLEUVALLYSGLYPHETYRPROSERASPILE00941952002050095ALAVALGLUTRPGLUSERASNGLNGLNPROGLUASNASNTYRLYSTHR00962102152200097THRPROPROVALLEUASPSERASPGLYSERPHEPHELEUTYRSERLYS0098225230235240009。
23、9LEUTHRVALASPLYSSERARGTRPGLNGLNGLYASNVALPHESERCYS01002452502550101SERVALMETHISGLUALALEUHISASNHISTYRTHRGLNLYSSERLEU01022602652700103SERLEUSERPROGLY0104275010520106250107PRT0108人类010920110ALATHRALAGLYALAALATHRTHRCYSTHRCYSALAALACYSCYSCYS01111510150112GLYGLYALAGLYALACYSALAGLYGLY01132025011430115360116PR。
24、T0117人类011830119CYSGLYGLYTHRGLYGLYGLYCYSALATHRGLYTHRGLYGLYALATHR01201510150121CYSCYSTHRTHRALAALATHRTHRCYSGLYTHRTHRCYSCYSTHRTHR01222025300123THRCYSALACYS012435012540126360127PRT说明书CN101993497ACN101993500A6/6页80128人类012940130GLYALAALAALAGLYGLYALAALACYSGLYALAALATHRTHRALAALA01311510150132GLYGLYALATHRCYS。
25、CYSALACYSALATHRGLYCYSCYSCYSALACYS01332025300134CYSGLYTHRGLY013535013650137310138PRT0139人类014050141ALATHRALAGLYTHRTHRTHRALAGLYCYSGLYGLYCYSCYSGLYCYS01421510150143THRCYSALAALACYSCYSCYSGLYGLYALAGLYALACYSALAGLY0144202530说明书CN101993497ACN101993500A1/2页9图1图2说明书附图CN101993497ACN101993500A2/2页10图3说明书附图CN101993497A。